JPH0324985B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、支持体中に電気泳動分離された生体
成分の高感度検出方法に関する。更に詳しくは、
支持体中に電気泳動分離されたタンパク質あるい
は、核酸のような生体成分を微量でも検出可能と
する方法に関する。 〔従来の技術〕 血漿、尿、脳脊髄液、羊水等の体液中のタンパ
ク質や、DNA、RNA等の核酸などの検出及び同
定には、支持体を用いた電気泳動法が広く利用さ
れており、生化学、生物学、及び臨床医学の分野
の研究に大きな貢献をしてきた。 通常、支持体としては、ゼラチン、寒天ゲル、
紙、デンプンゲル、セルロースアセテート膜、
ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル等が用
いられ、電気泳動法には、ゲル電気泳動、SDS電
気泳動、等電点電気泳動、免疫電気泳動等があ
る。また、二次元電気泳動により、血漿タンパク
のような複雑な組成のタンパク質混合物からの分
離も可能となつた。 電気泳動分離されたタンパク質を検出する方法
として、従来色素により染色して行つていた。最
も普通に用いられている染料は、クーマツシーブ
リリアントブルーであり、その他に、アシドブラ
ツク、クリスタルバイオレツト及びフアストグリ
ーン等が使用されている。また、電気泳動分離さ
れたDNAやRNAは、エチジウムプロマイドによ
る染色が行われている。しかし、これらの染色法
では、検出感度が低いため、尿や脳脊髄液のよう
なタンパク質濃度の低い試料を分析する場合に
は、泳動前に濃縮操作が必要であり、そのため分
析の操作が煩雑となり、また、濃縮時に、成分の
変化を伴うという欠点がある。 また、高感度検出という点から、ラジオアイソ
トープによる標識をして、検出することが行わ
れ、オートラジオグラフイーとして用いられてい
るが、放射性物質を取扱うことから、実験操作上
の危険性、複雑さに加えて、アイソトープの廃棄
の問題等容易に行える技術とは、いい難い。 近年、電気泳動により分離されたタンパク質及
び核酸等の高感度検出方法として例えば銀染色法
が開発された。銀染色法の工程は、主に支持体中
で分離されたタンパク質あるいは核酸を固定する
工程、銀イオン又は銀錯イオン溶液に浸漬して、
銀と結合させる工程、及び還元剤で処理する工程
からなる。その例としては、クリニカル ケミス
トリー アクタ（Clinical Chemistry Acta）第
38巻第465〜467頁（1972）、アナリチカル バイ
オケミストリー（Analytical Biochemistry）第
98巻第231〜237頁（1979）、エレクトロフオレシ
ス（Electrophoresis）第２巻第135頁及び第141
頁（1981）、及び同第３巻第17〜23頁（1982）等
の文献に記載された諸方法があり、また「生化
学」第52巻第411〜413頁（1980）、「臨床検査」第
26巻第213〜222頁（1982）及び「蛋白質・核酸・
酵素」第72巻第1277〜1279頁（1982）等の総説が
ある。 〔発明が解決しようとする問題点〕 これらの銀染色法は、前記の色素染色による検
出方法に比べると高感度であるが、いまだ十分な
検出力があるとはいい難い。 本発明の目的は、電気泳動により分離された生
体成分、特にタンパク質及び核酸を金属染色法に
より染色した後、高感度な検出を可能とする検出
方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明は分離タンパク質
又は核酸の高感度検出方法に関する発明であつ
て、電気泳動により分離された支持体中のタンパ
ク質又は核酸を金属染色法により染色する工程、
及び得られた金属核に、酸化反応により色変化を
呈する物質の存在下、補力剤を作用させて、該金
属核上で検知可能な化合物を形成させる工程の各
工程を包含することを特徴とする。 本発明方法における金属染色法で用いる金属塩
の例には、硝酸銀、アンモニア性硝酸銀、シユウ
酸銀、塩化第二金酸、塩化白金酸、塩化パラジウ
ム酸、塩化ロジウム酸、塩化イリジウム酸、塩化
銅、臭化ニツケル、塩化クロム及び塩化鉄のよう
な、銀、白金、金、パラジウム、イリジウム、ロ
ジウム、ルテニウム、オスミウム、銅、ニツケ
ル、クロム及び鉄よりなる群から選択した少なく
とも１種の金属を含む水溶性金属塩がある。ま
た、金属染色法により染色する工程は、支持体中
で分離されたタンパク質又は核酸を固定する工
程、金属塩の水溶液中に浸漬して該金属イオンと
結合させる工程、及び還元剤で処理する工程の各
工程を包含するものである。 本発明でいう酸化反応とは、酸化反応を受けて
それ自身が色変化を呈して検知可能な物質を形成
する反応のみならず、ある種の化合物が酸化反応
を受けた後、該酸化体が更にある種の発色剤とカ
ツプリング反応をして検知可能な化合物を形成す
る反応をも包含する。本発明において検知可能な
化合物としての好ましい例は色素である。したが
つて以下の説明では色素を例にとつて説明する
が、これらに限定されるものではない。 金属による染色後に、酸化反応により色変化を
呈する物質（以後、色素前駆体と称する。）を含
浸させ、次に補力剤を作用させると、金属核上で
色素前駆体が酸化を受け、色素が形成され、結果
として、タンパク質及び核酸を金属プラス色素に
より染色することができる。 本発明でいう補力剤の１例としては、米国特許
第3674490号、同第3765890号、同第3776730号各
明細書等に記載されている過酸化物、例えば、過
酸化水素、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過硫酸塩等の
無機過酸化物及び、過酸化ベンゾイル等の有機過
酸化物が挙げられる。また、米国特許第3765891
号、同第3826652号、同第3834907号、同第
3748138号各明細書及び特開昭52−7728号公報等
に記載されているコバルト（）錯体が挙げられ
る。コバルト原子に配位している配位子として
は、ほとんどすべてのルイス塩基がコバルト錯体
の配位子となり得るが、特に有用な配位子として
は、エチレンジアミン（en）、ジエチレントリア
ミン（dien）、トリエチレンテトラミン（trien）、
アンミン（NH₃）、ナイトレート、ナイトライ
ト、アジド、クロライド、チオシアネート、イソ
チオシアネート、水、カーボネート、及びエチレ
ンジアミン四酢酸等から選ばれる。例えば、下記
に示したコバルト錯体が利用できる。 〔Co（NH₃）₅H₂O〕Ｘ、〔Co（NH₃）₅CO₃〕Ｘ、
〔Co（NH₃）₅Cl〕Ｘ、〔Co（NH₃）₄CO₃〕Ｘ、〔Co
（en）₃〕Ｘ、シス−〔Co（en）₂（N₃）₂〕Ｘ、トラン
ス−〔Co（en）₂Cl（NCS）〕Ｘ、トランス−〔Co
（en）₂（N₃）₂〕Ｘ、シス−〔Co（en）₂（NH₃）N₃〕
Ｘ、シス−〔Co（en）₂Cl₂〕Ｘ、トランス−〔Co
（en）₂Cl₂〕Ｘ、〔Co（en）₂（SCN）₂〕Ｘ、〔Co（en
）₂
（NCS）₂〕Ｘ、〔Co（trien）₃〕Ｘ、〔Co（trien）₂
（en）〕Ｘ、〔Co（trien）（en）₂〕Ｘ、〔（H₃N）₅Co
−Ｏ−Ｏ−Co（NH₃）₅）Ｘ、〔Co（en）₂（dien）〕Ｘ （ここでＸは、電荷を中和するのに必要な、１
個又はそれ以上の数のアニオンを表わす。） 更に、補力剤としては、特開昭51−53826号、
同51−99022号各公報に記載されている亜塩素酸、
亜塩素酸塩、亜臭素酸、亜臭素酸塩及び二酸化塩
素水が挙げられる。また、特開昭52−76925号公
報に記載されている

【式】又は

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 実施例 １ ネーチヤー（Nature）第227巻第680頁（1970）
に示された方法を基に、SDS−電気泳動により、
タンパク質の分離を行つた。10％ポリアクリルア
ミドゲル（16cm×12cm）、厚さ１mmを作成して、
電気泳動分離を行つた後、エレクトロフオレシス
（Electropho−resis）第２巻第141頁（1981）の
方法に従つて、銀染色法により染色を行つた。す
なわち、ゲルを50％メタノール／10％酢酸水溶液
200mlに30分間浸漬し、次に15％メタノール水溶
液200mlに10分ずつ３回浸漬後、６％グルタルア
ルデヒド200mlに30分間浸漬、15％メタノール水
溶液浸漬、更に水洗して、メルカプトエタノー
ル、ラウリル硫酸ナトリウムなどの除去及びタン
パク質の固定化を行つた。次に、アンモニア性硝
酸銀溶液（0.02N NaOH160mlに25％アンモニア
水６mlと20％硝酸銀８mlを加え、水で200mlにす
る）に10分間（25℃）浸漬し、水洗後、0.005％
クエン酸200mlに37％ホルマリン0.1mlを加えた溶
液に、銀像スポツトが現れるまで約10分間浸漬
し、水洗して銀染色したゲルを得た。 次に、この銀染色したゲルを用いて、色素形成
による高感度染色を行つた。 まず、下記の組成の液(1)に、ゲルを、２分間
（室温）浸漬し、色素前駆体を含浸させた。 液組成(1) （使用直前に調製した） Γ炭酸カリウム 6.0ｇ Γ炭酸水素ナトリウム 0.5ｇ Γ亜硫酸ナトリウム 1.0ｇ Γ臭化ナトリウム 0.25ｇ Γヒドロキシルアミン硫酸塩 0.5ｇ Γ塩化ナトリウム 0.1ｇ Γ水酸化カリウム 0.25ｇ Γ４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−メタンスルホンアミドエチル）アニリ
ン硫酸塩 1.0ｇ Γ１−ヒドロキシ−２−〔β−（ｏ−アセチルア
ミノ）フエニルエチル〕ナフトアミド 1.5ｇ 水を加えて、200mlとする。 次にゲルを室温で１分間水洗し、下記の組成の
液(2)に浸漬した。 液組成 (2) Γ30％過酸化水素水 5.5ml Γ酢酸ナトリウム 2.0ｇ 水を加えて、200mlとする。 浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了した。
タンパク質としてオボアルブミン（ovalbumin）
を使用し、段階希釈して濃縮ゲルの溝に、それぞ
れ10nｇ、5nｇ、1nｇ、0.5nｇ、0.1nｇを加え、
SDS−電気泳動後、銀染色処理をした。その結
果、1nｇのオボアルブミンは検出できたが、0.5n
ｇのものは検出できなかつた。 次に、銀染色ゲルで本発明による処理を行つた
ところ、0.1nｇのオボアルブミンを検出すること
ができた。 同様に、ホスホリラーゼＢ（phosphorylase
Ｂ）を用いて検出を行つたところ、目視により銀
染色法では、5nｇのホスホリラーゼＢしか検出
できなかつたが、本発明による処理を加えること
により、0.5nｇのホスホリラーゼＢを検出するこ
とができた。 また、液(1)と液(2)を等量混合した液を用いて、
銀染色後のゲルを処理したところ、同様の結果が
得られ、１回の処理によつても、高感度な検出を
行うことができた。 このようにして本発明により、従来の銀染色後
に、簡単な処理操作を付加することにより、タン
パク質を高感度検出することができた。 実施例 ２ 血漿タンパク質を、一次元目を等電点電気泳動
（4.5％ポリアクリルアミドゲル、PHグラジエント
3.5〜9.5）分離し、二次元目を、SDS電気泳動
（10％ポリアクリルアミドゲル、ゲル厚１mm）分
離した。このゲルを実施例１で用いた銀染色法に
従つて、染色を行つた。 こうして得られた銀染色ゲルを、下記の組成の
液(3)に室温で２分間浸漬した。 液組成(3) （使用直前に調製した。） Γ炭酸カリウム 2.0ｇ Γ炭酸水素ナトリウム 0.5ｇ Γ亜硫酸ナトリウム 1.0ｇ Γ臭化ナトリウム 0.3ｇ Γヒドロキシルアミン硫酸塩 0.5ｇ Γ水酸化ナトリウム 0.25ｇ Γ４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン硫酸塩
1.0ｇ Γｍ−アミノフエノール 1.5ｇ 水を加えて、200mlとする。 次にゲルを室温で１分間水洗し、下記の組成の
液(4)に浸漬した。 液組成 (4) 過ホウ酸ナトリウム 2.5ｇ 水で200mlにする。 浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了した。 このように、二次元電気泳動においても、高感
度染色を行うことができた。 実施例 ３ ８％ポリアクリルアミドゲル（厚さ0.7mm）を
作成し、バクテリオフアージλ（CI857Sam7）の
DNAをE_CORI制限酵素で処理したDNA断片を、
量を変えて電気泳動法により展開し、実施例１で
示した銀染色法により染色を行つた。 次に、下記の組成の液(5)に室温で２分間浸漬し
た。 液組成(5) （使用直前に調製した。） Γ炭酸カリウム 2.5ｇ Γ炭酸水素ナトリウム 0.5ｇ Γ亜硫酸ナトリウム 1.0ｇ Γヒドロキシルアミン硫酸塩 0.25ｇ Γ水酸化ナトリウム 0.25ｇ Γ４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン硫酸塩
1.0ｇ Γ３−メチル−１−フエニル−５−ピラゾロン
1.0ｇ 水を加えて200mlとする。 次に、ゲルを室温で１分間水洗し、実施例１で
用いた過酸化水素液(2)に浸漬した。浸漬後、すぐ
に発色し始め、数分で終了した。 DNA断片の100nｇ、50nｇ、10nｇ、5nｇ、1n
ｇを電気泳動により展開した後、目視で銀染色後
では、10nｇのDNA断片しか検出できなかつた
が、本発明による処理を加えると、5nｇのDNA
断片を検出することができた。 実施例 ４ 実施例１で示したのと同様の方法で、SDS−電
気泳動後銀染色したゲルを作成した。次にこの銀
染色したゲルを用いて、下記の組成の液(6)にゲル
を２分間（室温）浸漬し、色素を形成させた。 液組成(6) （使用直前に調製した） Γ４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−メタンスルホンアミドエチル）アニリ
ン硫酸塩 1.0ｇ Γ〔Co（NH₃）₆〕Cl₃ 0.3ｇ Γ１−フエニル−３−メチル−５−ピラゾロン
1.0ｇ Γ無水亜硫酸ナトリウム 1.0ｇ Γ炭酸カリウム 15ｇ Γ臭化カリウム 0.5ｇ 水を加えて200mlとした。 浸漬後発色し始め、高感度に染色することがで
きた。 タンパク質としてオボアルブミンを使用し、段
階希釈して濃縮ゲルの溝に、それぞれ10nｇ、5n
ｇ、1nｇ、0.5nｇ、0.1nｇを加え、SDS−電気泳
動後、銀染色処理をした。その結果、1nｇのオ
ボアルブミンは検出できたが、0.5nｇのものは検
出できなかつた。 次に、銀染色ゲルで本発明による処理を行つた
ところ、0.1nｇのオボアルブミンを検出すること
ができた。 同様に、ホスホリラーゼＢを用いて検出を行つ
たところ、目視により銀染色法では、5nｇのホ
スホリラーゼＢしか検出できなかつたが、本発明
による処理を加えることにより、0.5nｇのホスホ
リラーゼＢを検出することができた。 このようにして本発明により従来の銀染色後に
簡単な処理操作を付加することによりタンパク質
を高感度検出することができた。 実施例 ５ 実施例２と同様にして、二次元電気泳動後、銀
染色したゲルを作成した。次に、この銀染色した
ゲルを用いて、下記の組成の液(7)にゲルを２分間
（室温）浸漬し、色素を形成させた。 液組成(7) （使用直前に調製した） Γ４−アミノ−３−メチル−Ｎ，Ｎ−ジエチル
アニリン塩酸塩 1.0ｇ Γ〔Co（en）₂（dien）〕Cl₂・HCl 0.4ｇ Γ１，５−ジヒドロキシナフタレン 1.0ｇ Γ無水亜硫酸ナトリウム 1.0ｇ Γ炭酸カリウム 1.0ｇ Γ臭化カリウム 0.5ｇ 水を加えて200mlとした。 浸漬後、すぐに発色し始め、数分で終了した。 このようにして、二次元電気泳動において高感
度染色を行うことができた。 実施例 ６ 実施例１で示したのと同様の方法で、SDS−電
気泳動後、銀染色したゲルを作成した。次に、こ
の銀染色したゲルを用いて、下記の組成の液(8)
に、ゲルを２分間（室温）浸漬し、色素を形成さ
せた。 液組成(8) （使用直前に調製した） Γ４−アミノ−３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−
（β−ヒドロキシエチル）アニリン硫酸塩
1.0ｇ Γ亜臭素酸ナトリウム 3.5ｇ Γ３−エトキシカルボニル−１−フエニル−５
−ピラゾロン 1.0ｇ Γ無水亜硫酸ナトリウム 0.5ｇ Γ臭化カリウム 0.1ｇ Γ炭酸ナトリウム 6.0ｇ Γベンジルアルコール ２ml 水を加えて200mlとした。 浸漬後発色し始め、高感度に染色できた。 実施例 ７ 実施例１で示したのと同様の方法で、SDS−電
気泳動後、銀染色したゲルを作成した。次に、こ
の銀染色したゲルを用いて、下記の組成の液(9)
に、ゲルを２分間（室温）浸漬し、色素前駆体を
含浸させた。 液組成(9) （使用直前に調製した） Γ炭酸カリウム 6.0ｇ Γ亜硫酸ナトリウム 0.8ｇ Γヒドロキシルアミン硫酸塩 0.4ｇ Γベンジルアルコール ３ml ΓＮ−エチル−Ｎ−（β−メトキシエチル）−３
−メチル−ｐ−フエニレンジアミン−ｐ−ト
ルエンスルホネート 1.0ｇ Γ３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−４−メ
チルアセトアニリド 1.0ｇ 水を加えて200mlとする。 次に、ゲルを30秒間水洗し、下記の組成の液(10)
に浸漬した。 液組成(10) （使用直前に調製した） ΓクロラミンＴ 2.0ｇ Γ炭酸ナトリウム 6.0ｇ Γエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム 1.0ｇ Γベンゾトリアゾール 20mg 水を加えて200mlとした。 浸漬後発色し始め、高感度に染色することがで
きた。 実施例 ８ ８％ポリアクリルアミドゲル（厚さ0.7mm）を
作成し、バクテリオフアージλ（cI857Sam7）の
DNAをE_CORI制限酵素で処理したDNA断片を、
量を変えて電気泳動法により展開し、実施例４で
示した銀染色法により染色を行つた。 次に、下記の組成の液(11)に室温で２分間浸漬し
た。 液組成(11)は実施例４の液(6)で１−フエニル−３
−メチル−５−ピラゾロンを１−ナフトール1.2
ｇに代えた以外は液組成は同じである。 DNA断片の100nｇ、50nｇ、10nｇ、5nｇ、1n
ｇを電気泳動により展開し、銀染色後では、10n
ｇのDNA断片しか検出できなかつたが、本発明
による処理を加えると、5nｇのDNA断片を検出
することができた。 〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明の方法によれば、
金属染色法による染色法に色素形成の簡単な操作
を付加することによつて、電気泳動分離されたタ
ンパク質及び核酸の染色濃度が増強されて、高感
度の染色を行うことができた。また、金属染色法
では可視化できない微量の上記成分の検出が可能
となつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 電気泳動により分離された支持体中のタンパ
   ク質又は核酸を金属染色法により染色する工程、
   及び得られた金属核に、酸化反応により色変化を
   呈する物質の存在下、補力剤を作用させて、該金
   属核上で検知可能な化合物を形成させる工程の各
   工程を包含することを特徴とする分離タンパク質
   又は核酸の高感度検出方法。