JPH0769314B2 - 生体試料の分析方法および分析装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体試料の分析方法および分析装置に係り、
特に被検成分を誘導体化した後に成分分離する分析方法
および分析装置に関する。

〔従来の技術〕

液体クロマトグラフは、溶液状態で成分を分離した後、
特定成分を選択的に分析できるのが特徴で、臨床検査の
分野においても重要な分析項目が多い。しかし、一方に
おいて分析手段が複雑で分析に時間がかかるものが多
く、それが臨床検査など多数の検体を限られた時間内で
処理しなければならないルチーンワークの業務における
分析検体数の増加をはばんでおり、この種の自動機の普
及が遅れている原因になつている。

このようなルチーンワークへの適用が遅れている分析項
目としてカテコールアミン類の分析やグリコヘモグロビ
ンの分析が挙げられる。これらの分析項目を液体クロマ
トグラフイーで分離分析する場合には、試料と誘導体化
用蛍光ラベル剤を反応させ、蛍光光度計によつて測定す
るのが一般的である。ラベル化の方法としては、分離カ
ラムによる成分分離の前にラベル剤と反応させるプレラ
ベル法と分離カラムによつて成分分離した後にラベル剤
と反応させるポストラベル法が知られているが、ポスト
ラベル法では分離カラム溶出後の成分の拡散が大となる
ので高感度検出が困難であり、生体試料中の微量成分を
測定する場合にはプレラベル法が有利である。

カテコールアミン類をプレラベル法によつてラベル化
（誘導体化）し、クロマトグラフイー分析する先行技術
として、特開昭61−88148号、特開昭60−143766号およ
び特開平１−126544号に記載された方法が知られてい
る。

この内、特開昭61−88148号では、試料にアルミナを添
加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ、吸着中
にダンシル・クロリドを反応させてカテコールアミンを
誘導体化している。次いでアルミナから誘導体化された
試料を脱離させ液を蒸発濃縮する。このようにして準備
された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注入して成
分分離し蛍光を検出する。

特開昭60−143766号では、生体試料を流路内に注入した
あと、第１反応部においてフエリシアン化カリウム溶液
と反応させ、次に第２反応部においてアスコルビン酸溶
液と反応させ、続いて第３反応部において水酸化ナトリ
ウム溶液と反応させてカテコールアミンをトリヒドロキ
シインドールに変換している。その後生成されたトリヒ
ドロキシインドールを含む液を酸性の緩衝液で濃縮用逆
相カラムへ導いて濃縮した後、分離カラムで成分分離し
て蛍光分析する構成が示されている。

さらに、特開平１−126544号では、生体試料をイオン交
換樹脂からなる吸着剤を充填した吸着カラムへ導き、酸
性状態でカテコールアミンを吸着させ、次に吸着カラム
に誘導体化試薬を供給してカテコールアミンを吸着させ
た状態のまま誘導体化している。続いて吸着カラムを弱
酸性の調整液で洗浄して分解成分等を排出し、その後中
性の脱着液を吸着カラムに導入してカテコールアミンの
吸着状態を解除して分離カラムに導き、成分分離して蛍
光測定することが示されている。

一方、カテコールアミンをプレラベル化せずに濃縮だけ
を行つて分離分析することが特開昭55−51354号に示さ
れている。この先行技術では、試料を濃縮カラムに注入
してカテコールアミンを吸着させ濃縮したあと、吸着さ
れているカテコールアミンを酸性緩衝液を用いて濃縮カ
ラムから脱離し、分離カラムで成分分離してカテコール
アミンの自己蛍光を検出している。この特開昭55−5135
4号では、濃縮カラムをカテコールアミンの濃縮だけの
ために用いており、吸着用充填剤として硼酸を含有する
グリコールゲルが好ましいと指摘している。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述した先行技術の内、特開昭61−88148号による方法
では、液体クロマトグラフの流路内に注入すべき試料を
準備するための操作に時間がかかり、且つ自動化が困難
なために臨床検査などのルチーンワークには不向きであ
る。

また、特開昭60−143766号による方法では、ラベル化反
応を３種類の反応コイル内に試料を流通しながら行うの
で構造が複雑であり、また分析結果の再現性も良好では
ない。特開平１−126544号による方法では、生体試料中
の蛋白質等の妨害成分による影響を排除する点に難点が
あり、誘導体化反応を再現性良く行わせることが困難で
ある。また、特開昭55−51354号はカテコールアミンの
自己蛍光を測定するものであるため高感度測定が困難で
ある。

また、プレラベルは高感度化の方法として近年多用され
ているが、目的とする反応以外に副反応が発生したり、
共存する成分による反応の妨害といつた問題がある。

本発明の目的は、被検生化学成分をクロマトグラフイー
分離する前に誘導体化する場合であつても、被検生化学
成分の分解を低減して高い再現性を有する測定結果を得
ることができ、被検生化学成分含有量が微量であつても
高感度測定できる生体試料の分析方法および分析装置を
提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に基づく生体試料の分析方法では、前処理カラム
としてフエニル硼酸を導入した親水生ゲルを充填したも
のを用い、この前処理カラムを成分吸着と誘導体化反応
に利用する。この分析方法の操作では、前処理カラムへ
生体試料を供給し、被検生化学成分を吸着せしめるこ
と、上記前処理カラム内に上記被検生化学成分が吸着さ
れている状態で上記前処理カラム内を誘導体化試薬液で
満たすこと、上記前処理カラム内における液の流れを停
止させた状態で上記前処理カラム内の被検生化学成分と
誘導体化試薬を反応させ、誘導体化反応に伴つて上記被
検生化学成分を上記充填剤から吸着解除せしめること、
誘導体化された生化学成分を含む液を上記前処理カラム
から分離カラムへ移送すること、および上記分離カラム
によつて上記誘導体化された生化学成分を分離するこ
と、を特徴とする。

本発明に基づく生体試料の分析装置は、生体試料を分析
し得るように構成された液体クロマトグラフから成り、
上述の分析方法を実行し得るように構成されている。

〔作用〕

本発明は、生化学成分特にカテコールアミンを特定の前
処理カラムに吸着させておいて特定の誘導体化試薬を作
用させると、その生化学成分の分解がそれほど促進され
ずに誘導体することができることを発明者らが見い出し
たことに基づいている。

本発明において用いられる前処理カラムは、フエニル硼
酸を導入した親水生ゲルが固定相充填剤として充填され
ている。この前処理カラムにおける生化学成分の吸着お
よび誘導体化反応について第３図の模式図を参照して説
明する。第３図（ａ）は吸着現象を示しており、第３図
（ｂ）は誘導体化反応を示している。

第３図（ａ）において、親水生ゲル母材201にはフエニ
ル硼酸202が導入されている。このような充填剤を充填
した前処理カラム内の液性を弱アルカリ性（pH8〜９）
に保ち、カテコールアミンの如き生化学成分を含む生体
試料を導入すると、カテコールアミン204は充填剤に吸
着される。すなわち、フエニル硼酸202の水酸基とカテ
コール核のシスージオール（Cis−Diol）がキレートを
形成することによつて、カテコールアミンが充填剤に固
定化される。

しかしながら、生体試料（例えば血清，尿）中の蛋白
質，アミノ酸およびペプチドの大部分はシスージオール
を有していないので、充填剤への吸着が行われない。だ
から、前処理カラムに弱アルカリ性の前処理液を生体試
料の導入に続いて所定時間流すことにより吸着されなか
つた成分を前処理カラムから排出することができる。つ
まり、シスージオールを有する生化学成分が選択的に前
処理カラムにトラツプされ、被検成分の誘導体化反応を
阻害する成分が前処理カラムから除去される。一般にカ
テコールアミンのような生化学成分は時間経過に伴てつ
分解が進むが、分解されやすい官能基が吸着の際に充填
剤と結合されるので、結果として官能基を分解から保護
することができる。

前処理カラムから反応妨害成分を排出した後、生化学成
分を吸着している前処理カラムに誘導体化試薬液を供給
する。第３図（ｂ）では誘導体化試薬として蛍光試薬で
ある1,2−ジフエニルエチレンジアミン（DPE）205を例
示してある。前処理カラム内が誘導体化試薬液で満たさ
れると、直ちに送液ポンプを停止したり流路を弁で閉塞
することによつて前処理カラム内の液の流れを停止させ
る。これにより誘導体化反応が開始されるが、このとき
の前処理カラム内の液性は中性（pH6.5〜7.5）である。

吸着されていたカテコールアミンは、DPEと縮合閉環反
応をし、誘導体化生成物206となる。この反応に伴い、
カテコールアミンは充填剤から拘束を解かれ離脱され
る。それ故、誘導体化反応の間、前処理カラム内の液を
流出させないように維持する。誘導体化生成物206がフ
リーとなるのは、DPEとカテコールアミンとの結合の安
定度定数が、充填剤へのカテコールアミンの吸着の安定
度定数よりも高いからと考えられるが明らかではない。
前処理カラムを30〜60℃の温度に維持すれば、所定時間
後（10分以内）に誘導体化反応を完了させることができ
る。

次に、前処理カラムと分離カラムを連通し、溶離液又は
前処理液を送液して誘導体化された生化学成分を分離カ
ラムへ導入する。分離カラムには、好ましくは逆相型充
填剤を充填したものが用いられる。溶離液の供給に伴い
分離カラムによつてクロマトグラフイー分離された成分
は、検出器（例えば蛍光検出器）によつて検出される。

〔実施例〕

カテコールアミン類の誘導体化試薬としての蛍光ラベル
剤には、例えば1,2−ジフエニルエチレンジアミン（DP
E）を用いることができ、準備される蛍光ラベル剤溶液
には、60mMのDPE,2mMのフエリシアン化カリウム,40％の
アセトニトリルなどが含まれる。この誘導体化試薬液の
液性は中性（pH6.5〜7.5）である。またカテコールアミ
ン類を分離するために分離カラムに供給される溶離液
は、例えばアセトニトリルとメタノールと水溶液を5:2:
4の割合で含む液が使用される。この場合水溶液には、
0.1Mのリン酸水素ナトリウムと10mMのドデシル硫酸ナト
リウムが含有されている。この溶離液の液性は酸性（例
えばpH3.0）である。

本発明を適用した分析装置に採用される前処理カラムに
は、フエニル硼酸を導入した親水性ゲルからなる充填剤
が充填される。この固定相充填剤は好ましくはポリマー
ゲルがよいが、これに限定されるものではなく、シリカ
ゲルでもよい。また分離カラムには逆相型充填剤（例え
ばシリカ−ODSなど）が充填される。カテコールアミン
のような被検生化学成分を前処理カラムに吸着させ、か
つアルブミン，グロブリン，アミノ酸等を排出させるた
めに前処理カラムに流す前処理液としては、弱塩基性
（pH8〜９）の緩衝液が用いられる。

本発明を適用したカテコールアミン自動分析装置の例を
図面を参照して以下に説明する。

第１図は、カテコールアミン自動分析装置の全体構成を
示す概略図である。この装置は、各種容器や分注機構を
備えたオートサンプラ26と、流路系内で試料の濃縮動作
や分離動作を行う濃縮・分離部44を有する。以下では、
濃縮・分離部44を便宜上分析部と称する。

オートサンプラ26のサンプルステージ28には、サンプル
ラツク27が装填される。サンプルラツク27は、血漿試料
を収容した複数の試料容器を保持している。またサンプ
ルラツク27には、蛍光ラベリング用の誘導体化試薬容器
30,内部標準液容器31,標準サンプル容器32が配置されて
いる。このオートサンプル26では、サンプルステージ28
に近接した固定位置に、混合容器33,ノズル洗浄槽34,ド
レインポート35,注入ポート36が設けられている。

分注ノズル38は、試料や試薬を注入ポート36へ移す働き
をする。駆動機構37はX,Y,Z方向の駆動機能を有し、分
注ノズル38を縦横上下自在に駆動して、前記サンプラ上
の容器やポートの位置に移動させることが出来る。分注
ノズル38を保持しているスライダ５は横移動をもたら
す。分注ノズル38の上端はプラスチツクチユーブなどの
細管39により三方弁40を介して、分注ポンプ41、および
洗浄液槽42に連結されている。分注ポンプ41はパルスモ
ーターで駆動されるシリンジポンプを使用している。ま
たサンプルステージ28にはサンプルラツク27上のサンプ
ルや試薬を、分析中低温に保つよう冷却装置が組込まれ
ている。

分析部44はサンプルの濃縮と蛋白質などの不要物除去を
行なう前処理カラム流路系，サンプル成分の分離を行な
う分離カラム流路系、および測定演算部からなる。前処
理カラム流路系では、前処理液槽45の前処理液がポンプ
46により一定流速で送液され、試料導入弁47を経由して
前処理カラム48に流れている。試料導入弁47にはオート
サンプラの注入ポート36から注入されたサンプル液を所
定量計量して分析部に導入するための計量管49が設けら
れている。

分離カラム流路系では溶離液槽50の溶離液がポンプ51に
より一定流速で送液され、流路切換弁52を経由して単一
の分離カラム53に流れている。流路切換弁52を切換える
ことにより溶離液は前処理カラム48を経由して流れ、前
処理カラム48で誘導体化された生化学成分を含む液を分
離カラム53に移送する。測定演算部は分離カラム53から
溶出するサンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光光度計
54および測定結果の演算処理および表示を行なうための
A/D変換部55,制御部56,プリンター57,CRT58などからな
り、蛍光光度計54はフローセル59を有する。切換弁60,6
1はポンプ46,51内の液を必要時にパージ出来るよう設け
られている。前処理カラム48は恒温装置43により30〜60
℃の内の所定温度に維持され、安定した誘導体化反応を
行い得るように構成される。

第４図に、第１図の分析装置における制御系統図を示
す。分析制御は、操作パネル77からの入力により制御部
56を中心に行われる。先ずパワースイツチをONすると温
度制御装置78が動作すると共に、蛍光光度計54の光源が
点灯する。つぎに分析準備のスイツチをONするとポンプ
46,ポンプ51が送液を開始する。オートサンプラ26にサ
ンプルラツク27を装着した後、分析開始スイツチをONに
すると、オートサンプラ26,試料導入弁47,流路切換弁52
が動作開始し、所定の分析手順に従つて分析操作が行わ
れる。測定結果は蛍光光度計54からの信号をA/D変換器5
5を経由して制御部内でデータ処理され、プリンタ57に
打出すと共にCRT58に表示される。

第１図の分析装置による分析操作は、（１）オートサン
プラ上で生体試料を分注ノズル内に採取し、その採取し
た試料を計量管内に注入する工程、 （２）前処理カラムに計量管内の試料を緩衝液で移送
し、被検生化学成分を前処理カラムに吸着させると共
に、前処理カラムに緩衝液を流して蛋白質等を排出し、
その後前処理カラムに誘導体化試薬液を供給して生化学
成分の誘導体化を行う工程、 （３）誘導体化された生化学成分を分離カラムで分離
し、各成分を測定する工程、の順序で行われる。

これらの三つの工程は並行して行われ、各工程において
異なつたタイミングで流路内に導入される試料に対して
順次実行される。

第１図の分析装置による分析操作を第２図のフローチヤ
ートを参照して説明する。

サンプル計量 分析動作が開始されると、ステツプ101において分注ノ
ズル38による試料分注動作が行われる。分注ノズル38を
次に分析すべき試料容器29の位置に移動し、分注ノズル
内に所定量のサンプルを吸入保持した後、ノズル38を注
入ポート36の位置へ移動する。試料導入弁47を第１図に
図示の状態にしておきノズル38からサンプル液を押し出
して試料計量管49内へ注入する。サンプルに内部標準液
を混合させたい場合には、混合容器をサンプルステージ
28上に設けておき、所定量のサンプルと内部標準液を分
注ノズル38で一旦混合容器内に移し混合させておき、そ
の混合容器から注入ポート36へ分注ノズル38によつて混
合液を注入するように動作させる。標準物質としてはイ
ソプロテノールを用いることができる。

ノズル洗浄 ステツプ102では、ノズル38を洗浄する。この場合、ノ
ズル38をドレインポート35に移動し、洗浄液（通常は純
水）を吐出して、サンプルによるノズルの内壁の汚れを
洗い出した後、ノズルを洗浄槽34に移動して槽内に降下
させ、洗浄液を吐出してノズル38の先端外側を洗浄す
る。廃液はドレイン80から排出される。

前処理カラムへのサンプル導入 ステツプ103では、計量管49内の生体試料を前処理カラ
ム48へ供給する。計量管49がサンプル液で満たされた後
試料導入弁47を切換えると、切換弁47のポートに接続さ
れている計量管49は、流路62と流路63の間に接続され、
弱アルカリ生の前処理液（pH8.7）の流れにより所定量
のサンプル液が前処理カラム48へ移送される。前処理カ
ラムの大きさは、内径40mm,長さ30mmである。

濃縮・除蛋白・精製 ステツプ104では、前処理カラム48において生体試料中
のカテコールアミンの吸着捕捉が行われ、除蛋白が行わ
れる。前処理液槽45からの前処理液は、計量管49内のサ
ンプル液をすべて前処理カラム48へ送り終つた後も引き
続き前処理カラム48に送液される。前処理液を流し続け
る時間は約10分間である。この間に、カテコールアミン
は吸着捕捉され前処理カラム内に蓄積されて濃縮され
る。同時に、測定の妨害となる蛋白質成分や誘導体化反
応阻害成分を前処理液の流れによつてドレイン64から系
外へ排出する。

前処理液は、送液ポンプ46により1ml/minの流量で送液
される。前処理液は、0.2Mのリン酸水素二アンモニウム
と10mMのEDTAを含むpH8.7の緩衝液からなる。前処理カ
ラム48内の充填剤母材に結合されているフエニル硼酸は
弱アルカリ性の液性では負に荷電しており、硼酸の水酸
基とカテコール核のシスージオールがキレートを形成し
て吸着が生じる。一方、アルブミン，グロブリン等は充
填剤に吸着されないので、前処理カラム48から排出さ
れ、吸着されたカテコールアミンが精製される。このよ
うな吸着によりカテコールアミンの官能基は保護され
る。

試薬分注 ステツプ105では、サンプルラツク27上の誘導体化試薬
液を計量管49内に採取する。サンプルラツク27上に設置
された試薬容器30内には、60mMの1,2−ジフエニルエチ
レンジアミンと2mMのフエリシアン化カリウムと40％の
アセトニトリル（CH₃CN）を含む誘導体化試薬溶液が収
容されており、この試薬溶液はpH7.0に調製されてい
る。

分注ノズル38は、制御部56からの制御信号に基づき試薬
容器30上に移動され、その試薬容器30内に降下されて分
注ポンプ41の吸入動作により分注ノズル38内に所定量の
誘導体化試薬液を吸入保持する。続いて分注ノズル38は
注入ポート36の位置に移動され、分注ポンプ41の押出動
作により注入ポート36から流路系内へ保持していた試薬
液を押し出し、容量200μの計量管49内を誘導体化試
薬液で満たす。このときの試料導入弁47の状態は第１図
に図示の状態である。

誘導体化反応 ステツプ106では、被検生化学成分の誘導体化反応が前
処理カラム48内で行われる。前処理カラム48は、温度制
御された恒温ブロツク43によつて常時50℃に保たれてい
る。第１図に図示の状態から試料導入弁を角度60度回転
すると流路の接続状態が切換わり、流路62からの前処理
液により計量管49内の誘導体化試薬液が押し出されて、
流路63および切換弁52を経て前処理カラム48に導入され
る。誘導体化試薬液の導入開始時には、前処理カラム48
内の充填剤にカテコールアミンが吸着されたままであ
る。誘導体化試薬液の移送動作を1ml/minの流量で15秒
間続けると、前処理カラム48内は誘導体化試薬液で満た
される。

前処理カラム48が誘導体化試薬液によつて満たされたタ
イミング（弁47の切換から15秒後）で、制御部56からの
制御信号により送液ポンプ46の送液動作を停止させ、こ
の停止状態を３分間継続する。この間に、充填剤に吸着
されていたカテコールアミンがDPEと第３図（ｂ）の如
き反応をし、誘導体化がなされる。50℃で３分間の条件
により吸着されていたカテコールアミンがほぼ完全に誘
導体化され、充填剤との吸着状態が解除される。前処理
カラム48内には、誘導体化反応を阻害する蛋白質やSH化
合物等が存在していないので、反応効率は極めて高い。

分離カラムへのサンプル移送 ステツプ107では、誘導体化された被検生化学成分を含
む液を前処理カラム48から分離カラム53へ移送する。送
液ポンプ46を３分間の停止状態から再び送液状態にする
と、前処理液が前処理カラム48内の誘導体化されたカテ
コールアミンを含む液を押し出す。このカテコールアミ
ンを含む液が流路切換弁52に到達する前に流路切換弁52
の角度を60度回転し流路接続状態を変える。これにより
カテコールアミンを含む液は溶離液槽50からの溶離液に
よつて分離カラム53へ移送される。

成分分離 ステツプ108では、分離カラム53による成分分離が行わ
れる。分離カラム53内には、逆相型充填剤であるシリカ
ーODS（粒径３μｍ）が充填されている。この分離カラ
ム53は、内径4.6mmで長さ60mmである。溶離液はアセト
ニトリルとメタノールを含むリン酸緩衝液（pH3.0）で
ある。

前処理カラム48から流出した誘導体化された成分を含む
液が分離カラム53に到達したときに、制御部56からの制
御信号により流路切換弁52を切り換え第１図に図示の実
線状態にする。この状態で溶離液槽50からの溶離液を分
離カラム53に流し続ける。この溶離液の送液によつてカ
テコールアミンが成分分離され、ノルエピネフリン（N
E），エピネフリン（Ｅ），ドーパミン（DA）が成分バ
ンドを形成して分離カラム53から溶出される。成分分離
後、分離カラム53は再生処理される。

前処理カラム再生 ステツプ108の成分分離の開始に伴つて流路切換弁52が
切り換わることにより、前処理カラム48に前処理液が通
液される。これがステツプ109である。この前処理液の
通液により前処理カラム48は次の生体試料を受け入れら
れる状態に復元される。ステツプ109のの時間は、ステ
ツプ108の時間に比べて短い。

測 定 ステツプ110では、分離カラム53からの溶出液がフロー
セル59に流れ、蛍光光度計54によつて観測される。誘導
体化されている各成分の蛍光強度が測定され、各成分ピ
ークの面積から濃度が演算される。蛍光光度計の励起波
長は345nm,蛍光波長は485nmである。

データ表示・出力 ステツプ111では、ステツプ110で得たデータをプリタ5
7,CRT58などに出力する。プリンタ57においては、プリ
ント用紙上に各生体試料毎にクロマトグラムの図形と被
検各成分の濃度値の数値が表示される。CRT58の画面上
にも同様の表示を行うことができる。ステツプ112で
は、オートサンプラ26上の試料がすべて処理されたかど
うかが判断され、まだ残つていればステツプ101に戻つ
て２個後の試料のサンプリングを行う。すべて処理され
ていれば、装置の分析動作が終了する。

第２図のフローチヤートでは、説明の簡略化のために、
１つの生体試料の分析操作の流れだけを示しているが、
第１図の分析装置では、同時に３つの生体試料が試理さ
れる。これらの試料は操作工程が重ならないようにずれ
て処理される。すなわち、特定の試料が前処理カラム48
で処理されている間に、この特定の試料より１つ先行し
て導入された試料は分離カラム53によつて分離され、ま
たその間に、前記特定の試料より１つ遅れて導入された
試料はオートサンプラ26内での処理および計量管49への
導入処理が行われる。

例えば、第１番目の試料に関して、分離カラム53による
成分分離工程と分離カラム53の再生工程を15分で実行す
る場合、並行して第２番目の試料と第３番目の試料も処
理されている。この場合、前処理カラム48に関しては、
前処理液による再生、第２番目の試料の受入と吸着，誘
導体化試薬液の受入と反応，誘導体化された成分の分離
カラムへの移送などが行われる。同じ15分の期間内に、
サンプラ26および計量管49に関しては、第２番目の試料
用の試薬液の計量管49への導入と前処理カラム48への試
薬液供給，計量管内洗浄，第３番目の試料の分注ノズル
38による採取，第３番目の試料の計量管49内への導入な
どが行われる。

第５図は、第１図の実施例によつて得られた生体試料の
分析例を示すクロマトグラムである。第５図において、
NEはノルエピネフリン、Ｅはエピネフリン、DAはドーパ
ミンのカテコールアミン成分を示す。IPは内標準物質と
して加えたイソプロテノールである。第５図はこれらの
各成分が共に50ピコグラム（pg）前処理カラム48に供給
されるようにして得た結果である。従来は高感度測定が
困難とされていたドーパミンも定量し得る十分な感度で
検出されている。第５図における数値はリテンシヨンタ
イムを示す。

次に、本発明による分析方法と従来技術による分析方法
とで測定した実施例を説明する。

実験例 生体試料として健常者のプール血漿を用いた。従来技術
の分析手順は、特開平１−126544号に示されたペルラベ
ル化法を用いる分析方法に準じたが、誘導体化試薬液は
本発明の実施例と同じものを使用した。

上述のプール血漿を本発明の実施例による方法（本実施
例法）および従来技術に準ずる方法（従来法）によつて
10回ずつ測定し、測定の再現性を調べた。結果を表１に
示す。表１に示すように、ノルエプネフリン（NE）およ
びドーパミン（DA）に関し、本実施例法が著しく優れた
標準偏差率（CV）が得られた。

次に、上述のプール血漿に、ノルエピネフリン（NE），
エピネフリン（Ｅ）、およびドーパミン（DA）をそれぞ
れ50pg/ml含んだ液を添加し、本実施例法および従来法
による回収率を求めた。結果を表２に示す。表２の如
く、本実施例法に基づけば、従来法に比較し高い回収率
が得られた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、分析操作中における被検生化学成分の
分解が少なく、被検生化学成分を高い効率で誘導体化で
きるので、高感度測定と正確な測定を行うことができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を適用した一実施例の分析装置の概略構
成図、第２図は第１図の分析装置による分析動作を説明
するための操作手順を示すフローチヤート、第３図は前
処理カラムにおける生化学成分の吸着および誘導体化反
応を説明するための模式図、第４図は第１図の分析装置
における制御系統図、第５図は第１図の分析装置によつ
て得られた分析例を示すクロマトグラムである。 26……オートサンプラ、29……試料容器、30……誘導体
化試薬液容器、36……注入ポート、38……分注ノズル、
47……試料導入弁、48……前処理カラム、49……計量
管、52……流路切換弁、53……分離カラム、54……蛍光
光度計、56……制御部、201……親水性ゲル母材、202…
…フエニル硼酸、204……カテコールアミン、205……DP
E。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フエニル硼酸を導入した親水性ゲルを充填
   剤として充填した前処理カラムへ生体試料を供給し、被
   検生化学成分を吸着せしめること、上記前処理カラム内
   に上記被検生化学成分が吸着されている状態で上記前処
   理カラム内を誘導体化試薬液で満たすこと、上記前処理
   カラム内における液の流れを停止させた状態で上記前処
   理カラム内の被検生化学成分と誘導体化試薬を反応さ
   せ、誘導体化反応に伴つて上記被検生化学成分を上記充
   填剤から吸着解除せしめること、誘導体化された生化学
   成分を含む液を上記前処理カラムから分離カラムへ移送
   すること、および上記分離カラムによつて上記誘導体化
   された生化学成分を分離すること、を特徴とする生体試
   料の分析方法。
2. 【請求項２】請求項第１項記載の分析方法において、上
   記被検生化学成分を上記前処理カラムに吸着せしめると
   きの液性は弱アルカリ性であり、上記誘導体化反応時の
   液性は中性であることを特徴とする生体試料の分析方
   法。
3. 【請求項３】請求項第１項記載の分析方法において、上
   記誘導体化試薬液は、1,2−ジフエニルエチレンジアミ
   ンを含む液であることを特徴とする生体試料の分析方
   法。
4. 【請求項４】試料容器内から試料を分注ノズルによつて
   採取し流路切換弁に接続されている計量管内に上記分注
   ノズル内に採取した試料を供給する第１の工程と、フエ
   ニル硼酸を導入した親水性ゲルを充填剤として充填した
   前処理カラムへ上記計量管内の試料を緩衝液によつて移
   送して上記試料中の被検生化学成分を吸着せしめ、続い
   て上記前処理カラムを誘導体化試薬液で満たし上記前処
   理カラム内における液の流れを停止して誘導体化反応を
   行わせる第２の工程と、上記前処理カラムから分離カラ
   ム内に受け入れた誘導体化された生化学成分を成分分離
   し検出する第３の工程を有し、特定の試料が上記第２の
   工程を行つている間に、その特定の試料より先行する試
   料に対し上記第３の工程を実行すると共に、上記特定の
   試料に後続する試料に対し上記第１の工程を実行するこ
   とを特徴とする生体試料の分析方法。
5. 【請求項５】生体試料中の生化学成分を吸着し得る前処
   理カラムと、生化学成分を成分分離し得る分離カラム
   と、この分離カラムから流出した成分に基づく蛍光を検
   出する検出器を備えた液体クロマトグラフ分析装置にお
   いて、上記前処理カラムとしてフエニル硼酸を導入した
   親水性ゲルを充填したカラムを設け、上記分離カラムと
   して逆相型充填剤を充填したカラムを設け、上記前処理
   カラムに誘導体化試薬液を供給すると共に上記前処理カ
   ラム内が誘導体化試薬液で満たされたときに上記前処理
   カラム内の液の流れを停止せしめる手段を設けたことを
   特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
6. 【請求項６】請求項第５項記載の分析装置において、上
   記前処理カラムを30乃至60℃に保温する手段を設けたこ
   とを特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。
7. 【請求項７】請求項第５項記載の分析装置において、上
   記生体試料を計量管内に導入する手段を設け、上記計量
   管内の生体試料を緩衝液の流れで上記前処理カラムへ搬
   送せしめる手段を設けたことを特徴とする液体クロマト
   グラフ分析装置。
8. 【請求項８】フエニル硼酸を導入した親水性ゲルを充填
   剤として充填した前処理カラムへ生体試料を供給し、ジ
   オールを有する生化学成分を上記充填剤に吸着せしめる
   こと、上記前処理カラムに緩衝液を流してジオールを有
   しない成分を上記前処理カラムから排出すること、上記
   生化学成分の吸着に関与している官能基と結合し得る誘
   導体化試薬を含む液を上記前処理カラム内に満たし、上
   記生化学成分を誘導体化すること、および上記前処理カ
   ラムにて誘導体化された生化学成分を分離カラムに導き
   成分分離すること、を特徴とする生体試料の分析方法。
9. 【請求項９】請求項第８項記載の分析方法において、上
   記生化学成分を誘導体化する反応は上記前処理カラム内
   の液の流れを停止した状態で行うことを特徴とする生体
   試料の分析方法。
10. 【請求項１０】請求項第８項又は第９項記載の分析方法
    において、上記ジオールを有する生化学成分はカテコー
    ルアミンであり、上記誘導体化試薬は1,2−ジフエニル
    エチレンジアミンであることを特徴とする生体試料の分
    析方法。
11. 【請求項１１】請求項第８項又は第９項記載の分析方法
    において、上記生化学成分を誘導体化する反応は上記生
    化学成分と上記誘導体試薬との閉環反応であることを特
    徴とする生体試料の分析方法。