JPH03262500A - 赤痢菌及び／又は腸内侵入性大腸菌の検査方法及びその検査に好適なプライマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なプライマーを使用した赤痢菌及び／又は
腸内侵入性大腸菌検査方性に関する。

また本発明は上記検査方法に好適に使用される新規なプ
ライマーにも関する。

赤痢菌や腸内侵入性大腸菌に起因する下痢症は広く全世
界で発生しており、特に発展途上国ではいま尚重要な伝
染病である。本症状は非常に烈しいため迅速な診断と治
療が必要である。また、前記細菌による食品汚染も問題
になっており、伝染を予防する目的や伝染源を特定する
目的で前記細菌に対する食品検査が必要とされている。

この場合にもまた、迅速で感度の良い方法が望まれてい
る。

［従来の技術］ 前記の細菌を検出する従来方法としては、モルモットを
用いるセレニーテスト（Ｓｅｒｅｎｙ、　Ｂ、　、　Ａ
ｃｔａ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｈｕｎｇ、　
２．２９３−２９６１９５５年）や培養細胞を用いる検
査法がある。また、本庄の病原性に関与する１４０メガ
ダルトンプラスミド由来の抗原に対する特異抗体を用い
たＥＩＡ法（伊藤健一部、中村防子、渡辺治雄他　日本
細菌学雑誌　４１巻　４１４頁１９８６年）も開発され
ている。また、最近開発されたＤＮＡプローブ注として
は特開昭６１−４４０００とＵ、Ｓ、ｐａｔｅｎｔ　Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　８８８１９４がある。

前者は細胞侵入に係わる多くの遺伝子を含む約２７キロ
ベース（ｋｂ）以下のＢａｍ１（Ｉ断片をプローブとし
てハイブリダイゼーションを行い検査する方法である。

後者はそのＢａｍＨＩ断片中に含まれている１ｐａＢ遺
伝子断片、１ｐａＣ遺伝子断片、１ｐａＤ遺伝子断片を
プローブとしている。

［発明が解決しようとする課題］ 前記の従来方法ではセレニーテストや培養細胞を用いる
方法は時間と経費を要し、ＥＩＡ法は抗血清の調製方法
が複雑で時間を要し、検査自体にも約２０時間を要した
。また以上の従来法は動物を用いるため、その飼育も大
変であった。またプローブを用いる方法においてはプロ
ーブの作製が困難である上、菌培養やハイブリダイゼー
ションなどの操作に長時間を要し、さらには感度が低い
ため放射性同位体（Ｒ１）を使用しなければならず放射
能汚染防止や放射能管理等の問題がある。

本発明の課題は赤痢菌及び／又は腸内侵入性大腸菌の検
査方法であって、従来法よりも感度の良い、さらにはよ
り簡便であり、迅速な検査方法を提供することにある。

さらに本発明のもう１つの課題は、上記検査方法におい
て好適に用いられる相補的なプライマーを提供すること
にある。

［課題を解決するための手段及び作用］上記課題を解決
するために、請求項１の発明は、赤痢菌及び／又は腸内
侵入性大腸菌の検査方法を提供するものであって、その
検査方法は赤痢菌及び腸内侵入性大腸菌に特異的に存在
している遺伝子に対して相補的なプライマーであって、
センスストランド用プライマー及びアンチセンスストラ
ンド用プライマーから成る組合せを、検査すべき細胞の
ＤＮＡ系に用いて、該遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片
を酵素的方法により増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片
を検出することを特徴とする請求項ｌにおいて、特異的
に存在している遺伝子とは、赤痢菌及び腸内侵入性大腸
菌に共通して存在する遺伝子（以下、特異的遺伝子とい
う）を意味し、たとえば１ｐａＢ、　１ｐａＣ，１ｐａ
Ｄ、　ｉｎｖＥ、　１ｎｖＧ。

１ｎｖＪ又は１ｎｖＫなどである。特にｉｎｖＥの塩基
配列はＷａｔａｎａｂｅらにより究明されている（Ｗａ
ｔａｎａｂｅ、　Ｈ，。

Ａｒａｋａｗａ、Ｅ、、　Ｉｔｏ、に、、　Ｋａｔｏ、
Ｊ、、　Ｎａｋａｍｕｒａ、Ａ、、　Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７２
巻６１９−６２９頁１９９０年）。この遺伝子（ｉｎｖ
Ｅ）は細胞侵入に係わる表面抗原（ｊｐａＢ、　１ｐａ
Ｃ又はｊｐａＤ）を正に制御しており、本遺伝子が存在
していない細菌は細胞に侵入して発症せしめることがで
きない。

前記相補的なプライマーとは前記特異的遺伝子の一部分
に相補的な一重鎖ＤＮＡであり、好ましくは２〜１００
ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜４０ヌクレオチ
ドのオリゴヌクレオチドである。

前記特異的遺伝子がｉｎｖＥである場合には、前記相補
的なプライマーは、請求項１０の発明である次の５種の
オリゴヌクレオチドプライマー５°−ＡＴＡＴＣＴＣＴ
ＡＴＴＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧＴ−３’、５°−ＡＡＡＡ
ＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＡＧ−３°、５°−
ＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧ−３°
、３’　−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−
５°又は３’　−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣ
ＧＧＴＡＧ−５゜（式中においてＡ、　Ｃ，Ｇ及びＴは
それぞれアデニンシトシン、グアニン及びチミン塩基を
有するデオキシリボヌクレオチドを意味する。以下同様
である。） 又はこれらと同等の相補性を有するプライマーを意味す
る。ここで同等の相補性を有するプライマーとは、相補
性を妨げない限度で上記の塩基配列と比較しである塩基
を欠いていたり、多少余分な塩基を有していたり、多少
塩基配列が異なるプライマーを指し、このプライマーも
前記の相補的なプライマーに含まれる。前記プライマー
は必ずしも精製する必要はないが、後記の如くプローブ
として用いる場合には精製を行う方が検査の精度上より
好ましい。

前記相補的なプライマーの組合せとは、前記特異的遺伝
子のｍＲＮＡと相同である鎖を伸長させるためのセンス
ストランド用プライマー及び前記特異的遺伝子のｍ　Ｒ
Ｎ　Ａと相補的である鎖を伸長させるためのアンチセン
スストランド用プライマーの各々を少なくとも１つずつ
含んでなる組合せである。この組合せにおいて、センス
ストランド用プライマーとアンチセンスストランド用プ
ライマーとが相補性を有する場合にはプライマーのダイ
マーができ、目的とする特異的ＤＮＡ断片の増幅効率が
悪くなるので、センスストランド用プライマーとアンチ
センスストランド用プライマーとが相補性を有していな
いことが好ましい。

本発明方法において前記プライマー及びその組合せの選
定は非常に重要であり、もし特異性の低いオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用したならば目的とする部
分以外のＤＮＡ断片も増幅してしまうことがあるし、ル
ープ構造やＧＣリッチ（ｒｉｃｈ）な部分が存在すれば
全く増幅されないこともある。また前記のようにプライ
マーの組合せが悪いとプライマーのダイマーができ、目
的とする特異的ＤＮＡ断片の増幅効率が悪くなる。

前記特異的遺伝子がｉｎｖＥである場合には、前記セン
スストランド用プライマーとしては次の塩基配列である
３種のオリゴヌクレオチドプライマー５′−ＡＴＡＴＣ
ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴｃＧｃＧＴ−３′５’−ＡＡ
ＡＡＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＡＧ−３°又は
５’　−ＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣ
Ｇ−３’又はこれらと同等の相補性を有するプライマー
から少なくともｌっを任意に選び、かつ、アンチセンス
ストランド用プライマーとしては次の塩基配列を有する
２種のオリゴヌクレオチドプライマー３°−ＧＧＧＡＡ
ＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５’　又は３’　−Ｇ
ＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡＧ−５’又
はこれらと同等の相補性を有するプライマーから少なく
とも１つを任意に選んで、前記相補的なプライマーの組
合せとなし得る。すなわち、たとえば具体的には以下に
示す（Ｉ）〜（ＶＩ）の６種類の組合せがある。

（Ｉ　’）　５’−ＡＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＡ
ＴＣＧＣＧＴ−３’と７９５　　　　　　　　　８１６ ３’　−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５
’１０１０　　　　　　　１０２８ （■）５°−ＡＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴＣＧ
ＣＧＴ−３’と７９５　　　　　　　　　８１６ ３’　−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡ
Ｇ−５’１１５５　　　　　　　　　１１７６ （Ｉ［［）　５’−ＡＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣ
ＴＣＴＴＡＧ−３’と８７１　　　　　　　　　８９２ ３’　−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５
’１０１０　　　　　　　　１０２８ （■）５°−ＡＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴ
ＴＡＧ−３’と８７１　　　　　　　　　８９２ ３’　−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡ
Ｇ−５゜１１５５１１７６ （■）５°−ＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣ
ＣＣＧ−３’と９２９　　　　　　　　　　　　　　９
５０３’　−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ
−５’１０１０　　　　　　　　　　　　１０２８又は
、 （Ｗ）　５’−ＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣ
ＣＣＣＧ−３’と９２９　　　　　　　　　９５０ ３’　−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡ
Ｇ−５゜１１５５　　　　　　　　　１１７６ 上記塩基配列に下記した番号は、プライマーが相補性を
有している部分のｉｎｖＥ遺伝子の塩基配列番号と対応
している。なおｉｎｖＥ遺伝子は約１６００塩基からな
り、その塩基配列番号はｐＥＡ１５１の欠損末端を＋１
としている（前記文献、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７２巻６１９−６２９頁　１９９
０年）。

そして上記（Ｉ）〜（ＶＩ）中のプライマーの１つ以上
がその各々と同等の相補性を有するプライマーで置換さ
れていても良い。また、上記（Ｉ）〜（ＶＩ）の組合せ
を用いるとプライマーの種類が少なくてすみ、経済上好
ましいが、請求項ＩＯの発明である他の５種のプライマ
ー又はそれらと同等の相補性を有するプライマーから１
つ以上を選んで（Ｉ）〜（ＶＩ）の組合せに加えて、前
記相補的プライマーの組合せとしてもよい。この場合に
は後述するように前記増幅されたＤＮＡ断片の種類が複
数になる。

前記検査すべき細胞とは、たとえば、赤痢菌及び／又は
腸内侵入性大腸菌が存在すると思われる下痢便や食品な
どの細胞及びそれらに付着している細菌の細胞であり、
その細胞のＤＮＡ系とは、上記の細胞のＤＮＡを含む系
を意味する。このＤＮＡは加熱処理やプロテイナーゼＫ
を用いる方法など通常の方法で検査すべき細胞から調製
しつる。

このＤＮＡは必ずしも精製されている必要はない。

たとえば検査すべき細胞が細菌培養液である場合、培地
成分も存在したままの細菌培養液を熱処理等でＤＮＡを
調製したものを精製せずにそのまま後述のポリメラーゼ
連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法という）等の酵素的方法に
用いうる。ただし血液が検査すべき細胞に存在する場合
にはポルフィリンが後述のＰＣＲ法等を阻害するので、
通常の方法にてポルフィリンを除去したものをその細胞
のＤＮＡ系とする。

本発明中の酵素的方法とは酵素を用いて特定のＤＮＡを
増幅する方法を意味し、たとえば５ａｉｋｉ。

Ｒ，Ｋ、らによって報告されたＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　２３９巻４８７〜４９１頁、１９８８年、特開昭６
ｌ−２７４６９７）、その変法及びその改良法（以下Ｐ
ＣＲ法等という）を意味する。これらのＰＣＲ法等によ
ると少量の試料から特定のＤＮＡ断片を増幅することが
できる。ＰＣＲ法等において用いるＤＮＡポリメラーゼ
として、ＤＮＡの解裂温度において耐熱性であるポリメ
ラーゼ、たとえばＴａｑ、Ｔｔｈポリメラーゼなどを用
いると該酵素の補充がほとんど必要とされないのでＰＣ
Ｒ法等をより簡便、迅速な方法となし得る。ＰＣＲ法等
においては、少なくとも２種類のプライマー、すなわち
前記センスストランド用プライマー及びアンチセンスス
トランド用プライマーが必要とされ、それらのプライマ
−は増幅されるべきＤＮＡの一部分に相補的な短い一重
鎖ＤＮＡである。この２種のプライマーの組合せを過剰
に加え、増幅されるべきＤＮＡを有する鋳型ＤＮＡと４
種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリ
メラーゼを有する系において、この互いに向き合う２つ
のプライマーに挾まれた部分のみのＤＮＡが増幅される
。すなわち、上記２つのプライマーが１重鎖の鋳型ＤＮ
Ａにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼが働き、互いに向
き合う２つのプライマーに挟まれたＤＮＡの量が２倍に
なる。ここで始めに戻って二重鎖になった部分を加熱に
よって解き同じ操作を行うと、今度は前回と同じ反応の
ほかに前回プライマーから合成されたＤＮＡにも、もう
一方のプライマーがアニールし、鋳型となるので両方の
プライマーに挟まれた部分は４倍に増やされる。この一
連の操作を繰り返せばプライマーに挟まれた部分のみを
指数関数的に増やすことができるのである。すなわち理
論上、プライマーに挟まれた部分のＤＮＡは上記一連の
操作をＮサイクル行うと２Ｎ倍に増幅されることになる
。そしてＤＮＡポリメラーゼは１分間に数百から数千塩
基の合成を行えるので１サイクルを５〜７分で行うこと
ができ、たとえば２５サイクルの増幅か３時間程度で終
了し、各サイクルの効率が９０％であるとすれば（１＋
０．９）”倍すなわち約１００万（１０’）倍に増幅で
きる。すなわち、短時間に特定のＤＮＡを増幅しつる優
れた方法である。

請求項３の発明に係る検査方法においてはＰＣＲ法等に
て増幅されるべきＤＮＡ断片は赤痢菌及び腸内侵入性大
腸菌に特異的に存在している遺伝子の一部分を含むＤＮ
Ａ断片である。このＤＮ、Ａ断片の大きさはＰＣＲ法で
増幅できる大きさである必要があるため４０００塩基対
（ｂｐ）程度以下であることが望ましい。また、小さす
ぎるとプライマーのダイマーと区別しにくくなるため、
５０ｂｐ以上であることが望ましい。さらに、短時間で
効率良く増幅されるためには５０〜１ｏ００ｂｐ程度が
より好ましい大きさである。また、この増幅されるＤＮ
Ａ断片は本発明方法にて用いるプライマーの組合せによ
って、定まってくるものである。すなわち、用いたプラ
イマーに挾まれる部分のＤＮＡ断片が増幅されるからで
ある。たとえば赤痢菌及び侵入性大腸菌に特異的に存在
している遺伝子がｉｎｖＥであり、この遺伝子に相補的
なプライマーの組合せとして前記（Ｉ） （Ｉ　）　５’−ＡＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴ
ＣＧＣＧＴ−３’と７９５　　　　　　　　　８１６ ３’　−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５
゜１０１０　　　　　　　１０２８ を選んだ場合には、７９５の位置番号から始まるセンス
ストランド用プライマーと１０２８の位置番号で終わる
アンチセンスストランド用プライマーとをＰＣＲ法等に
て用いるので、増幅されるＤＮＡ断片は塩基配列番号の
７９５から１０２８までの部分となる。

従って、請求項６の発明において、用いられるプライマ
ーの組合せとして（Ｉ）〜（ＶＩ）のいずれかの組合せ
に請求項１０の発明である他の種類のプライマーのいず
れか１以上を加えた組合せを用いた場合には、増幅され
る特定のＤＮＡ断片か複数となる。

以上の様に本発明方法によると、分析すべき細胞に赤痢
菌及び／又は腸内侵入性大腸菌が存在している場合には
、該細菌に特異的な遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片か
簡便に短時間に増幅される。

そしてこの増幅されたＤＮＡ断片を検出する方法として
は種々の従来方法を用いうるが、検査対象たる特定のＤ
ＮＡ断片が増幅されているので、Ｒ■を用いる必要は特
になく、たとえば電気泳動法でＤＮＡの大きさにより検
出する方法や、非Ｒ１で標識（ラベル）された特異的プ
ローブを用いて検出する方法等により増幅されたＤＮＡ
断片の検出、すなわち赤痢菌及び／又は腸内侵入性大腸
菌の検出が可能である。特異的プローブを用いて検出す
る方法において該プローブとして、ＰＣＲ法等に用いつ
るプライマーであって、増幅されるＤＮＡ断片に含まれ
るプライマーを通常の方法により修飾したものを１つ以
上用いることができる。

たとえば、ｉｎｖＥ遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片を
増幅する際、請求項１０の発明である５種のプライマー
の内 ５°−ＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧ
−３°と９２９　　　　　　　　　９５０ ３’　−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡ
Ｇ〜５′１１．５５　　　　　　　　１１７６ を前記プライマーの組合せとした場合には、増幅される
ＤＮＡ断片は塩基配列番号９２９〜１１７６までの部分
である。従ってプローブとして用い得るプライマーは請
求項１０の発明である５種のプライマーの内上記塩基配
列番号９２９〜１１７６に含まれる５“−ＣＣＴＴＧＡ
ＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧ−３’９２９　　　
　　　　　　９５０ ３°−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５°
又は１０１０　　　　　　　１０２８ ３°−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡＧ
−５’１１５５　　　　　　　　１１７６ 又は上記３種のプライマーと同等の相補性を有するプラ
イマーを修飾したものの少なくとも１つ以上をプローブ
として用いることができる。

本発明方法においては検出されるべきＤＮＡ断片が増幅
されているので、プローブの修飾も、ＲＩを用いてラベ
ルする必要は特になく、たとえばジゴキシゲニン−１１
−ｄＵＴＰでラベルすることによっても検出されるべき
ＤＮＡ断片を感度良く検出することができる。従ってＲ
Ｉ法に付随する放射能汚染の問題を生ぜず、また特別な
設備、熟練者等を必要としない利点がある。そして本発
明に係るプライマーは約３時間でＤＮＡ合威台底自動的
に合成でき精製も約３時間で容易に行うことができる。

従って入手容易なプローブとなしうる。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが本発
明はこれに限定されるべきものではない。

（実施例１）ｉｎｖＥの一部分を含むＤＮＡ断片のＰＣ
Ｒ法による増幅 （１−Ａ）　ｉｎｖＥを含む大腸菌ＤＮＡの調製最初に
赤痢菌由来のｉｎｖＥ遺伝子を含むＤＮＡを調製するた
めに、赤痢菌由来のｉｎｖＥ遺伝子及びアンピシリン耐
性遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＨＷ１２７３（ｐ
ｓｓ１２０　：　：Ｔｎｌ　）（Ｗａｔａｎａｂｅ、　
Ｈ，、Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ａ、　。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４８
巻　２６０〜２６２頁１９８５年）を（１コピー／細胞
）有するに−１２Ｄ旧株大腸菌）ＩＷ１２７３　（国立
予防衛生研究所細菌部（東京）より入手）を使用した。

上記大腸菌をアンピシリン（５０μｇ　／ｄ）入りのＹ
Ｔ培地（蒸留水１リットル当り、ＮａＣｌ５ｇ、バクト
ドリプトン８ｇ、酵母抽出物５ｇを含む）２００−に−
白金耳植菌し、３７℃で一夜振とう培養した。培養液を
３０分間、３０００ｒｐｒｎで遠心分離することにより
集菌し、そこに生理食塩水５−を加えて洗菌した後、再
び１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離して培地成分を
除去し、菌体を得た。これに、０．１　Ｍ　ＮａＣ１，
１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ　トリス−ＨＣＩ（
ｐＨ８，０）の溶液３．６−を加えて菌体を懸濁後、リ
ゾチーム（４０■／−）を４００μｌ加えて攪拌し、３
７℃で１０分間加温した。この溶液に５％ＳＤＳ、　０
．１　Ｍ　ＮａＣ１，ｌ　ＯｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．
１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８゜０）の溶液を１−加えて
転倒混和後、６０℃で２０分間加温し細胞膜を破壊した
。これに５０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）で飽和
しナーフェノール及びクロロホルムの等量混合物を１時
間静置後、上層を除去した下層部分であるフェノール／
クロロホルムを５−加えて混和後、３０分間、３０００
ｒｐｍで遠心分離し、その上層にＤＮＡ溶液を得た。こ
のフェノール／クロロホルム抽出をさらにもう２回繰り
返し蛋白を除去した。そこからこの上層にエーテルを加
え混和した後に１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し
、上層を除去して下層を得た。このエーテル抽出をさら
に２回繰り返しフェノール／クロロホルムを除いた後、
エタノールを７１Ｌｌ加えて一７０℃に１５分間静置し
た。その後、２０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離する
ことにより得られたＤＮＡの沈澱を７０％冷エタノール
で洗浄し、減圧下に乾燥した。これにリボヌクレアーゼ
緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１５　Ｍ　ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）　）　２
ｖｔｌを加え溶解後、熱処理済みのりボヌクレアーゼ（
１０ｍｇ／　ｉ）を８０μで加えて３７℃で２時間反応
させＲＮＡを除いた。この溶液をフェノールで２回、エ
ーテルで２回抽出した後、冷エタノールを４１ｎｌ加え
一２０℃で一夜静置した。

それを２０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離して得られ
たＤＮＡの沈澱を７０％冷エタノールで洗浄し、減圧下
で乾燥した後、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１　ｍＭ
トリス−ＨＣＩ（ＰＨ７，４）の溶液２−に溶解した。

それをＤＮＡ試料溶液として凍結保存した。

（１−Ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーの選定と合成 ｉｎｖＥ遺伝子の塩基配列（Ｗａｔａｎａｂｅ、　Ｈ，
、Ａｒａｋａｗａ。

Ｅ、　、　Ｉｔｏ、　Ｋ、　、　Ｋａｔｏ、　Ｊ、　、
　Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ａ、　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７２巻６１９−６２
９頁１９９０年）より特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーを以下の方法で選定した。

ＩｎｖＥ蛋白質のＮ末端よりは、ＰａｒＢ（Ａｂｅｌｅ
ｓ、　Ａ、　Ｌ、　。

Ｆｒｉｅｄｍａｎ、　Ｓ、　Ａ、　、　Ａｕ５ｔ　ｉｎ
、　Ｓ、　Ｊ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１
８５巻２６１−２７２頁　１９８５年）およびＳｏｐＢ
（Ｍｏｒｉ、　Ｈ，、Ｋｏｎｄｏ。

Ａ、　、　Ｏｓｈｉｍａ、　Ａ、　、　Ｏｇｕｒａ、　
Ｔ、　、　Ｈｉｒａｇａ、　Ｓ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏ１１９２巻１−１５頁　１９８６年）と類似し
ていたがＣ末端よりの部分は既知蛋白との類似性はなか
った（前記文献、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ　１７２巻６１９−６２９頁１９９０年）
。従ってＩｎｖＥ蛋白のＣ末端より部分をコードしてい
るｉｎｖＥ遺伝子の３°より部分から特異的増幅を阻害
する虞れのある繰り返し配列、類似配列、ＧＣ含量の多
い領域、パリンドローム構造、ループ構造をコンピュー
ターで検索して除き、以下の５種類のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして選定した。

すなわちセンスストランド用プライマーとしては以下の
３種を選定し、 ５’　−ＡＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧ
Ｔ−３７９５８１６ ５’　−ＡＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＡ
Ｇ−３゜８７１　　　　　　　　　８９２ ５’　−ＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣ
Ｇ−３゜９２９　　　　　　　　　９５０ アンチセンスストランド用プライマーとしては以下の２
種のプライマーを選定した。

３°−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５’
１０１０　　　　　　　１０２８ ３°−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡＧ
　−５’１１５５　　　　　　　　　１１７６ なおヌクレオチド配列に下記した番号は塩基配列番号で
あり、前記と同様である。これらのオリゴヌクレオチド
をＤＮＡ合威台底スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
　ＬＫＢ社製Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　Ｐｌｕｓ
）で合成し、陰イオン交換体（スウェーデン国、Ｐｈａ
ｒｍａｃ　ｉａ社製ＭｏｎｏＱ）を用いて液体クロマト
グラフ（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＦＰ
ＬＣ）で精製した。

上記合成は自動的に行われ約３時間で合成しつる。

それに続く精製も約３時間ですみ、かつ容易である。

大腸菌には約４．２　Ｘ　１０　＠塩基対のＤＮＡが存
在しているが塩基配列が解明されているのは一部だけで
ある。従って上記方法によって理論的に選定されたプラ
イマーが、いまだ解明されていない大腸菌の塩基配列と
もアニーリングするものであれば、ｉｎｖＥ遺伝子を含
むＤＮＡ断片以外の部分も増幅してしまうことになり、
このようなプライマーは特異的とは言えない。

そこで選定した５種のオリゴヌクレオチドプライマーに
よってｉｎｖＥ遺伝子の特異的部分のみが増幅されるこ
とを確認するために以下の（１−Ｃ）及び（１−Ｄ）の
実験を行った。

（１−Ｃ）　ｉｎｖＥを含む大腸菌ＤＮＡ断片の増幅（
１−Ａ）で調製したＤＮＡを前記ＰＣＲ法を用いて増幅
した。ＰＣＲ法において必要とされる特異的プライマー
としては（１−Ｂ）にて合成したプライマーを用いた。

プライマーの組合せ、すなわちセンスストランド用プラ
イマー及びアンチセンスストランド用プライマーの組合
せとしては、前記５種類のプライマーから可能とされる
組合せである（１）〜（Ｖｌ）の６組をすべて用い、そ
れぞれの組についてＰＣＲ法を行った。第１表にその組
成を示した反応液をミネラルオイルで覆いＤＮＡサーマ
ル・サイクラ−（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）　（
米国、ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲＣＥＴＵＳ社製）にセ
ットした。熱変性９２°Ｃ１分間、アニーリング６１°
Ｃ１分間、伸張反応を７０°Ｃ２分間行った後、熱変性
９２℃　１０秒間、アニーリング６１°０１分間、伸張
反応７０°Ｃ２分間を３９サイクル行った。その後７０
℃で７分間保温した。

第 １ 表 第１表中、１０倍濃度の反応用緩衝液は５００ｄＫＣＩ
、　　１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１９Ａセラチンを含
む１００ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐ）１８．３）から成る
ものてあり、ｄＮＴＰｓは４種のデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びＴ
ＴＰ）を各１．２５　ｍＭずつ含むものであり、ＤＮＡ
溶液は（１−Ａ）において調製したＤＮＡ保存試料溶液
を１００倍希釈した溶液であり、プライマーはセンスス
トランド用プライマー及びアンチセンスストランド用プ
ライマーを各々１，２５μＭ含むものである。

（１−Ｄ）増幅ＤＮＡ断片の検出 増幅反応後、反応溶液の一部をサイズマーカーと共に５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い臭化エチジウ
ムで染色した。その結果、第１図に示される様にいずれ
のプライマーの組合せでも予想された大きさのＤＮＡ断
片を確認した。すなわち第１図において、レーンｌは対
照のために市販のプラスミドｐＢＲ３２２を旧ｎｆｌで
消化した断片を電気泳動した結果であり、レーン２〜７
は各々、プライマーの組合せとして前記（１）〜（Ｖｌ
）を各々ＰＣＲ法に用いた場合の電気泳動の結果である
。

ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ断片は２つのプライマーに
はさまれた部分である。たとえばレーン２の場合にはセ
ンスストランド用として５°−７９５〜８１６−３’、
アンチセンスストランド用として３゛１０１０〜１０２
８−５’の塩基配列番号を有するプライマーを用いてい
るので、増幅されるＤＮＡ部分は塩基配列番号の７９５
から１０２８であり、従って増幅されるＤＮＡ断片の大
きさは１０２８−７９５　＋１・２３４ｂｐである。他
のレーン３〜レーン７の場合も同様にアンチセンススト
ランド用プライマーの５′塩塩基列番号からセンススト
ランド用プライマーの５゛塩塩基列番号をひきそれに１
を加えた数が予想されるＤＮＡ断片の大きさである。

実際に第１図に示されるようにレーン２〜７において各
々２３４　ｂｐ、　　３８２　ｂｐ、　　１５８　ｂｐ
、　　３０６ｂｐ、　　１０　ｏｂｐおよび２４８ｂｐ
の断片が予想どおり増幅され検出された。

また、各増幅ＤＮＡ断片を制限酵素旧ｎｆＪで消化し５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、確認したと
ころ、すべて予想された大きさのＤＮＡ断片に切断され
ていた。

以上の実験結果より前記プライマー５種からの組合せ（
Ｉ）〜（ＶＩ）のいずれを用いてもｉｎｖＥ遺伝子の一
部分を特異的に増幅できることか確認できた。

（実施例２）検出感度の検定 本発明に係る検査方法により目的とされる細菌の検出を
行った場合における検出感度を以下の如くに検定した。

（２−Ａ）ｉｎｖＥを含む大腸菌ＤＮＡの調製最初に検
査対象となるＤＮＡ試料溶液を調製するため、第１実施
例と同じに−１２ＤＨＩ株大腸菌ＨＷ１２７３を使用し
た。上記大腸菌をアンピシリン（５０μｇ　／ｄ）入り
のＹＴ培地ＩＯ−に−白金耳植菌し３７℃で一夜振とう
培養した。この培養液の一部を希釈し、５００ｎｍの吸
光度を測定し、ＯＤｉ。

ｏｌ、０＝４Ｘ１０’細胞／ｍＡ’として培養液の菌体
濃度を計算すると５．４Ｘ１０’細胞／ｍｊであった。

この培養液を以下の如くに（ｉ）熱処理のみ、または（
ｉｊ）プロテイナーゼに処理後、熱処理して、ＤＮＡ試
料溶液を調製した。

（ｉ）熱処理法 培養液１−を９７℃で工０分間処理し、ＤＮＡ試料溶液
とした。

（ｉｉ）プロテイナーゼＫ及び熱処理法培養液０．１−
を遠心分離し、上清を除去したのちペレットを非イオン
界面活性剤の入った緩衝液（５０ｍＭ　ＫＣＩ、　　２
．５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　　Ｏ，Ｉｍｇ／−ゼラチン
、０．４５％ノニデットＰ４０，０．４５％ツイーン２
０を含むＩＯｍＭ）リス−〇ＣＩ（［）８８．３　）　
）８．９−で懸濁した。この懸濁液１−に３μｌのブロ
テイナーゼＫ（２０■／−）を加えて、５０〜６０℃で
１時間加温後、９５℃で１０分間熱処理し、ＤＮＡ試料
溶液とした。

（２−Ｂ）検出感度 上記（ｉ）および（ｉｉ）で得たＤＮＡ試料溶液の希釈
液を用いてＰＣＲ法により増幅反応を行い、検出感度を
求めた。プライマーの組合せとしては５’−ＣＣＴＴＧ
ＡＴＡＣＡ、ＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧ−３’と３’　
−ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡＧ−５
’からなる組合せ（ＶＩ）を使用した。

ＤＮＡ試料溶液の希釈液としては、反応液５０μｌ中に
（ｉ）の方法で得たＤＮＡについては１５００゜１５０
００又は１５００００細胞由来の量を、（ｉｉ）の方法
で得たＤＮＡについては１５．１．５０．１５００又は
１５０００細胞由来の量を含む希釈液（以下ＤＮＡ希釈
液という）を作製して、それぞれ以下の如＜　ＰＣＲ法
によりＤＮＡを増幅した。

ＰＣＲ法に用いる反応液の組成は第１表においてＤＮＡ
溶液としては前記ＤＮＡ希釈液を適量用い、Ｔａｑ　　
ＤＮＡポリメラーゼとしては２．５Ｕ／−のものを用い
、蒸留水は反応液か全体として５０μｌとなるまで加え
る以外は第１表に示す反応液組成と同じである。

この反応液をミネラルオイルで覆いＤＮＡサーマル・サ
イクラ−にセットした。熱変性９２°Ｃ１分間、アニー
リング６１’ＣＩ分間、伸長反応を７０’Ｃ２分間行っ
た後、熱変性　９２°Ｃ１０秒間、アニーリング６１°
Ｃ１分間、伸長反応７００Ｃ２分間を３９サイクル行っ
た。その後７０℃で７分間保温した。この簡便かつ迅速
なＰＣＲ法によって理論上、試料溶液中のＤＮＡ量は約
２４０倍に増幅されたことになる。

この様にＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡを含む溶液
２０μｌをサイズマーカーと共に５％ポリアクリルアミ
ド電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色して、ｉｎｖ
Ｅ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を検出した。その結果
を第２図に示した。

すなわち第２図において、レーン１はＤＮＡを含まない
反応液についての結果であり、ブランクに相当する。レ
ーン２〜４は（ｉ）熱処理法によりＤＮＡ試料溶液を調
製した場合において、各々１５００００、１５０００．
および１５００細胞由来ＤＮＡが反応溶液５０μｌ中に
含まれる場合についての結果である。レーン２及び３に
おいては２４８ｂｐの断片が検出され、すなわち、大腸
菌が検出された。しかしレーン４すなわち１５００細胞
由来ＤＮＡについては検出不可能であった。

レーン５は断片の大きさの対照として前記ｐＢＲ３２２
を旧ｎｆｌで消化した断片を電気泳動した結果である。

レーン６〜９は（ｉｉ）プロテイナーゼＫ及び熱処理法
によってＤＮＡ試料溶液を調製した場合の結果であり、
レーン６〜９は各々１５０００、１５００．１５０およ
び１５細胞由来ＤＮＡか反応溶液５０μｌ中に含まれる
場合についての結果を示す。

レーン６〜８においては２４８ｂｐの断片か検出され、
すなわち大腸菌か検出された。しかしレーン９すなわち
１５細胞由来ＤＮＡについては検出不可能であった。

以上の結果より、５０μｌの増幅反応系に（ｉ）の熱処
理のみの方法では少なくとも１５０００以上の、（ｈ）
のプロテイナーセに及び熱処理の方法では少なくとも１
５０以上の細胞に由来するＤＮＡが存在すればｉｎｖＥ
遺伝子を含む大腸菌か検出可能であった。これは従来の
ＲＩを使用したプローブ法に比べ約７〜１００倍感度か
高い。すなわち本発明に係る検査方法は従来法と比較し
て、検出感度が良好であることが確認された。

（実施例３）侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）の検出臨床分離
菌（ＥＩＥＣ２７株およびその他の病原大腸菌８株）を
試料とし、本発明の方法と従来法であるセレニーテスト
、細胞侵入性テスト、菌体表面抗原に対する抗血清を用
いたＥＩＡ法（伊藤健一部、中村防子、渡辺治雄他、日
本細菌学雑誌４１巻４１４頁１９８６年）との検査結果
を比較し、その特異性を確認した。

（３−Ａ）試料からのＤＮＡの調製 前記臨床分離菌株３５株を普通寒天培地にツスイ）上で
３０℃にて一夜培養した。各−白金耳を１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡを含む１０＋ｎＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，０）の
溶液ｌ−に懸濁し、９７℃で１０分間熱処理したものを
ＤＮＡ試料溶液とした。

（３−Ｂ）ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅ＰＣＲ法に必要
とされる特異的なプライマーの組合せとしては５’−Ｃ
ＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧ−３°と
３゛〜ＧＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＡＧ
−５°とから成る組合せ（ＶＩ）を使用した。

ＰＣＲ法に用いる反応液の組成は第１表において、ＤＮ
Ａ溶液としては上記（３−Ａ）で調製したＤＮＡ試料溶
液を用い、Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼは５μｌ、蒸
留水は２２μｌ用いた以外は第１表に示す反応液組成と
同じである。

この反応液をミネラルオイルで覆いＤＮＡサーマル・サ
イクラ−にセットした。熱変性　９２°Ｃ１分間、アニ
ーリング６１’ＣＩ分間、伸張反応を７０°Ｃ２分間を
行った後、熱変性　９２℃１０秒間、アニーリング６１
℃　１分間、伸長反応７０°Ｃ２分間を３９サイクル行
った。その後７０℃で７分間保温した。

（３−Ｃ）電気泳動による検出 ＰＣＲ法を行って得られた反応溶液の２０μｌをサイズ
マーカーと共に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、臭化エチジウムで染色し検出した。その結果、従
来法で陽性であった２７菌株を試料とした場合のみｉｎ
ｖＥ遺伝子を含む特異的ＤＮＡ断片が検出され、従来法
で陰性であった８菌株の場合には検出されなかった。す
なわち従来法との結果が完全に一致した。従って本発明
に係る検査方法が特異性を有することが確認された。

（３−Ｄ）プローブによる検出 上記（３−Ｃ）において５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、臭化エチジウムで染色したゲルをサザン
トランスファーし、本発明中のオリゴヌクレオチド３′
−ＧＧＧＡＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧ−５°をジ
ゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでラベルしたものをプロ
ーブとし、西ドイツ国、ベーリンガーーマンハイム社製
検出用キット（ＤＮＡラベリング＆デイテクションキッ
ト　製品番号１０９３６５７）を用いて非Ｒ１的に検出
したところ、陽性菌のみにおいて特異的ＤＮＡ断片の位
置が検出された。

従って従来のプローブ法の如＜ＲＩでプローブをラベル
する必要はなく、目的とする菌を検出しうる。また容易
に調製可能である本発明に係るプライマーをプローブと
して用いることができる。

［発明の効果］ 請求項１ないし９の発明に係る検査方法によると従来法
よりも感度良く赤痢菌及び／又は腸内侵入性大腸菌を検
出し得る。従って少ない試料でも検査可能である。また
放射能汚染などの危険のない非ＲＩ法でも検査可能であ
る。

請求項２の発明に係る検査方法によると増幅されるべき
ＤＮＡ断片が効率よく増幅されるのでより迅速に検査し
つる。

請求項４の発明に係る検査方法によるとＰＣＲ法が自動
化できるので、より迅速かつ簡便に検査しうる。

請求項８又は９の発明に係る検査方法によると特異的プ
ローブか入手容易である。

請求項１０の発明に係るプライマーは入手容易であり、
本発明に係る検査にて好適に用いることができ、かつ、
プローブとして用いることもできる。また、そのような
検査以外の目的で、特定のＤＮＡ断片を増幅するために
も用いることかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は第１実施例中の（１−Ｄ）において各プライマ
ーの組合せ（Ｉ）〜（ＶＩ）を用いて増幅反応を行った
場合の臭化エチジウムで染色されたポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のゲルを示す。 第２図は第２実施例中の（２−Ｂ）において１５〜１．
５００００細胞由来のＤＮＡ量を用いて増幅反応を行っ
た場合の臭化エチジウムで染色されたポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動のゲルを示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）赤痢菌及び腸内侵入性大腸菌に特異的に存在して
   いる遺伝子に対して相補的なプライマーであって、セン
   スストランド用プライマー及びアンチセンスストランド
   用プライマーから成る組合せを、検査すべき細胞のＤＮ
   Ａ系に用いて、該遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片を酵
   素的方法により増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片を検
   出することを特徴とする赤痢菌及び／又は腸内侵入性大
   腸菌の検査方法。
2. （２）前記ＤＮＡ断片の大きさが５０〜１０００塩基対
   である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）前記酵素的方法がポリメラーゼ連鎖反応法である
   特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
4. （４）前記ポリメラーゼ連鎖反応法において使用される
   ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ鎖の解裂温度において耐
   熱性である特許請求の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）前記特異的に存在している遺伝子がｉｎｖＥ遺伝
   子である特許請求の範囲第１項〜４項のいずれか１項に
   記載の方法。
6. （６）前記センスストランド用プライマーとして次の３
   種の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 又はこれらと同等の相補性を有するプライマーの内から
   少なくとも１つを選び、前記アンチセンスストランド用
   プライマーとして次の２種の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 又はこれらと同等の相補性を有するプライマーから少な
   くとも１つを選んだ特許請求の範囲第５項に記載の方法
   。
7. （７）前記増幅されたＤＮＡ断片の検出方法が電気泳動
   法及び特異的プローブを用いる方法のいずれかである特
   許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。
8. （８）前記特異的プローブとして前記相補的プライマー
   であって前記増幅されるＤＮＡ断片に含まれるプライマ
   ーの少なくとも１つを用いる特許請求の範囲第７項に記
   載の方法。
9. （９）前記特異的遺伝子がｉｎｖＥ遺伝子であり、前記
   特異的プローブとして、次の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 であって該増幅されるＤＮＡ断片に含まれるプライマー
   又はこれらと同等の相補性を有するプライマーの内から
   少なくとも１つを任意に選んで用いる特許請求の範囲第
   ８項に記載の方法。
10. （１０）次の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 又は 【遺伝子配列があります】 又はこれらと同等の相補性を有するプライマー