JPH08294399A - サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH08294399A JPH08294399A JP7105192A JP10519295A JPH08294399A JP H08294399 A JPH08294399 A JP H08294399A JP 7105192 A JP7105192 A JP 7105192A JP 10519295 A JP10519295 A JP 10519295A JP H08294399 A JPH08294399 A JP H08294399A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 サルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を検出す
ることを目的とする。 【構成】 サルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子と選択的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１
〜９）を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマー
として遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こすサルモネ
ラ属菌のみを選択的に検出することを特徴としている。
ることを目的とする。 【構成】 サルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子と選択的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１
〜９）を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマー
として遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こすサルモネ
ラ属菌のみを選択的に検出することを特徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのサルモネラ
属菌の検出に関するものである。
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのサルモネラ
属菌の検出に関するものである。
【０００２】
【従来技術】食中毒にかかる検査では、検査材料は患者
の嘔吐物、糞便、患者が食した食品または患者の周辺環
境からの拭き取り材料の場合である。これらの材料から
サルモネラ属菌が検出・同定されるまでには、まず、増
菌培養、確認培養を行い、さらに抗原（血清型）を決定
しなければならない。
の嘔吐物、糞便、患者が食した食品または患者の周辺環
境からの拭き取り材料の場合である。これらの材料から
サルモネラ属菌が検出・同定されるまでには、まず、増
菌培養、確認培養を行い、さらに抗原（血清型）を決定
しなければならない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、サルモ
ネラ属菌は多数の血清型に分けられるが、完全な血清型
別には１００種類にもおよぶ抗血清と十分な経験とを必
要とするため、一般検査室におけるサルモネラ検査の実
施は困難である。しかも、各培養段階に要する時間は、
１８〜２４時間であり、抗原型決定までを含めた総所要
時間は約３日となり、迅速性に欠ける。また、確認培養
では、ＴＳＩ寒天、ＳＩＭ培地、ＶＰ−ＭＲ培地および
リシン脱炭酸試験用培地に接種し、３７℃で１晩培養す
る必要がある。さらに抗原型決定には市販のＯ血清およ
びＨ血清セットを用いるので、費用もかかり、操作も煩
雑である。
ネラ属菌は多数の血清型に分けられるが、完全な血清型
別には１００種類にもおよぶ抗血清と十分な経験とを必
要とするため、一般検査室におけるサルモネラ検査の実
施は困難である。しかも、各培養段階に要する時間は、
１８〜２４時間であり、抗原型決定までを含めた総所要
時間は約３日となり、迅速性に欠ける。また、確認培養
では、ＴＳＩ寒天、ＳＩＭ培地、ＶＰ−ＭＲ培地および
リシン脱炭酸試験用培地に接種し、３７℃で１晩培養す
る必要がある。さらに抗原型決定には市販のＯ血清およ
びＨ血清セットを用いるので、費用もかかり、操作も煩
雑である。
【０００４】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
【０００５】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、サルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を検出
するもので、簡便、迅速、かつ高感度な検査法を食中毒
検査、または下痢症検査に提供することにある。
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、サルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を検出
するもので、簡便、迅速、かつ高感度な検査法を食中毒
検査、または下痢症検査に提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、サルモネラ属
菌の食中毒原因遺伝子と選択的にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドを
プライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こ
すサルモネラ属菌のみを選択的に検出することを特徴と
している。
菌の食中毒原因遺伝子と選択的にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドを
プライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こ
すサルモネラ属菌のみを選択的に検出することを特徴と
している。
【０００７】プライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ドは、ネズミチフス菌のエンテロトキシン遺伝子（stn
遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を標的とする場
合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学
合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオ
チドが以下の配列群、 （５´）−ＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧ−（３´） ・・・（配列番号１） （５´）−ＧＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＡ−（３´） ・・・（配列番号２） （５´）−ＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧ−（３´） ・・・（配列番号３） （５´）−ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣ−（３´） ・・・（配列番号４） （５´）−ＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＴ−（３´） ・・・（配列番号５） （５´）−ＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴ−（３´） ・・・（配列番号６） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
ドは、ネズミチフス菌のエンテロトキシン遺伝子（stn
遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を標的とする場
合は、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学
合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオ
チドが以下の配列群、 （５´）−ＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧ−（３´） ・・・（配列番号１） （５´）−ＧＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＡ−（３´） ・・・（配列番号２） （５´）−ＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧ−（３´） ・・・（配列番号３） （５´）−ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣ−（３´） ・・・（配列番号４） （５´）−ＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＴ−（３´） ・・・（配列番号５） （５´）−ＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴ−（３´） ・・・（配列番号６） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００８】また、ネズミチフス菌のinv A 遺伝子をコ
ードするヌクレオチド配列を標的とするときは、そのヌ
クレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオ
リゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の
配列群、 （５´）−ＧＧＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧ−（３´） ・・・（配列番号７） （５´）−ＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣ−（３´） ・・・（配列番号８） （５´）−ＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＣＣＧ−（３´） ・・・（配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
ードするヌクレオチド配列を標的とするときは、そのヌ
クレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオ
リゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の
配列群、 （５´）−ＧＧＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧ−（３´） ・・・（配列番号７） （５´）−ＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣ−（３´） ・・・（配列番号８） （５´）−ＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＣＣＧ−（３´） ・・・（配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００９】ここで、遺伝子増幅は、Saiki らが開発し
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合はサルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子）を検出する
場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそ
れぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリ
ゴヌクレオチドを用意する。それを熱変性により１本鎖
状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重
合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核
酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマー
に挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大して
くる。
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合はサルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子）を検出する
場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそ
れぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリ
ゴヌクレオチドを用意する。それを熱変性により１本鎖
状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重
合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核
酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマー
に挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大して
くる。
【００１０】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
【００１１】本発明でプライマーとして用いられる上記
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ているサルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子のヌクレオチ
ド配列における増幅領域は、５０塩基から２, ０００塩
基、望ましくは１００塩基から １,０００塩基となれ
ばよい。
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ているサルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子のヌクレオチ
ド配列における増幅領域は、５０塩基から２, ０００塩
基、望ましくは１００塩基から １,０００塩基となれ
ばよい。
【００１２】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
るサルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を増幅させる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
るサルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を増幅させる。
【００１３】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
【００１４】その結果から、検体中にプライマーが認識
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままサルモネラ属菌
の食中毒原因遺伝子の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
やクロマトグラフィーも有効である。
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままサルモネラ属菌
の食中毒原因遺伝子の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
やクロマトグラフィーも有効である。
【００１５】また、上記の配列番号１〜９の配列の１つ
を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして機能さ
せ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオチド配
列を選択的に検出してもよい。この場合、オリゴヌクレ
オチドは標識物で修飾するのが好ましい。
を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして機能さ
せ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオチド配
列を選択的に検出してもよい。この場合、オリゴヌクレ
オチドは標識物で修飾するのが好ましい。
【００１６】
【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によりサ
ルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を検出するもので、簡
便、迅速かつ高感度な検出ができる。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によりサ
ルモネラ属菌の食中毒原因遺伝子を検出するもので、簡
便、迅速かつ高感度な検出ができる。
【００１７】
［実施例１：サルモネラ属菌（ネズミチフス菌）のstn
遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 サルモネラ属菌は表１−１〜１−７の縦の見出しに示し
た総計１７４株を用いた。これらの菌株は、食中毒事例
株で、食中毒患者の下痢便、嘔吐物、原因食品等から分
離されたものである。各菌株をブレインハートインフュ
ージョン培地（ＢＢＬ社製）に接種し、３７℃の好気的
条件下で終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０
ｍＭトリスー塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）
で希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、こ
れらを遠心し、その上清を検体とした。
遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 サルモネラ属菌は表１−１〜１−７の縦の見出しに示し
た総計１７４株を用いた。これらの菌株は、食中毒事例
株で、食中毒患者の下痢便、嘔吐物、原因食品等から分
離されたものである。各菌株をブレインハートインフュ
ージョン培地（ＢＢＬ社製）に接種し、３７℃の好気的
条件下で終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０
ｍＭトリスー塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）
で希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、こ
れらを遠心し、その上清を検体とした。
【００１８】プライマーの合成 ネズミチフス菌（S.typhimurium ）のstn 遺伝子の塩基
配列（Chopra, A,K.,et al., Microbial Pathogenesis
16, 85-98(1994) ）から、請求項第２項に示した配列
（配列番号１〜６）を選び、それと同じ配列を持つオリ
ゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成はサイクロン
プラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行っ
た。
配列（Chopra, A,K.,et al., Microbial Pathogenesis
16, 85-98(1994) ）から、請求項第２項に示した配列
（配列番号１〜６）を選び、それと同じ配列を持つオリ
ゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成はサイクロン
プラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行っ
た。
【００１９】ＰＣＲ 前記検体液３μl を用い、それに滅菌蒸留水１６．０５
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー（Ａ）１．５μｌ、プライマー（Ｂ）
１．５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５
μｌを加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この
反応液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を
５０μｌ加え、反応液上に重層した。
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー（Ａ）１．５μｌ、プライマー（Ｂ）
１．５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５
μｌを加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この
反応液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を
５０μｌ加え、反応液上に重層した。
【００２０】各使用した溶液の内容、およびプライマー
（Ａ）と（Ｂ）の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー（Ａ）および（Ｂ）：前述した化学合成精製
品の各水溶液 （濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に
示した組合せで使用した（１〜６は配列番号を示す）。
（Ａ）と（Ｂ）の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー（Ａ）および（Ｂ）：前述した化学合成精製
品の各水溶液 （濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に
示した組合せで使用した（１〜６は配列番号を示す）。
【００２１】 プライマー（Ａ） プライマー（Ｂ） １ ４ ２ ５ ３ ６ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
【００２２】反応条件は、次のとおりである。 熱変性: ９４℃、１分 アニーリング: ５５℃、１分 重合反応: ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
【００２３】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２４】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第２版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
し、臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第２版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
【００２５】結果 前述したように、S.typhimurium のstn 遺伝子は、すで
に塩基配列が決定されており、この遺伝子の相補鎖はヒ
ドロゲナーゼの調節遺伝子（hyd G の一部およびhyd H
）であるので、stn 遺伝子の塩基配列はサルモネラ属
のそれぞれの菌種に普遍的に存在すると考えられる。し
たがって、本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプラ
イマーとして使用すると、増幅されるヌクレオチド断片
の大きさは容易に推定できる。
に塩基配列が決定されており、この遺伝子の相補鎖はヒ
ドロゲナーゼの調節遺伝子（hyd G の一部およびhyd H
）であるので、stn 遺伝子の塩基配列はサルモネラ属
のそれぞれの菌種に普遍的に存在すると考えられる。し
たがって、本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプラ
イマーとして使用すると、増幅されるヌクレオチド断片
の大きさは容易に推定できる。
【００２６】それによるとプライマー１と４の組合せを
用いた場合には、２６０塩基の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。同様にプライマー２と５、お
よびプライマー３と６を用いた場合には、それぞれ２２
４塩基および２６４塩基の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。
用いた場合には、２６０塩基の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。同様にプライマー２と５、お
よびプライマー３と６を用いた場合には、それぞれ２２
４塩基および２６４塩基の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。
【００２７】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーの組み合わせはst
n 遺伝子の標的としている領域を正しく増幅していると
判断し、表１−１〜７中に”＋”と記入した。一方、ヌ
クレオチドの増幅がみられなかったものには”−”を記
入した。表１−１〜７から明らかなように試験された全
てのサルモネラ属菌のstn 遺伝子が正しく検出されてい
ることがわかる。
の長さが一致した場合、各プライマーの組み合わせはst
n 遺伝子の標的としている領域を正しく増幅していると
判断し、表１−１〜７中に”＋”と記入した。一方、ヌ
クレオチドの増幅がみられなかったものには”−”を記
入した。表１−１〜７から明らかなように試験された全
てのサルモネラ属菌のstn 遺伝子が正しく検出されてい
ることがわかる。
【００２８】（実験例２）実験例１で得られた結果がst
n 遺伝子をもつサルモネラ属菌に対して、選択的なもの
かどうかを確かめるため、臨床検査において検査対象と
なるサルモネラ属菌以外の食中毒菌または下痢症菌等の
遺伝子（表２−１〜２−１２の２９９株）について本発
明のプライマーが反応するかどうか調べた。とりわけ、
従来法ではサルモネラ属菌との鑑別が困難なCitrobacte
r 属菌との鑑別が可能かを検討した。
n 遺伝子をもつサルモネラ属菌に対して、選択的なもの
かどうかを確かめるため、臨床検査において検査対象と
なるサルモネラ属菌以外の食中毒菌または下痢症菌等の
遺伝子（表２−１〜２−１２の２９９株）について本発
明のプライマーが反応するかどうか調べた。とりわけ、
従来法ではサルモネラ属菌との鑑別が困難なCitrobacte
r 属菌との鑑別が可能かを検討した。
【００２９】方法は実験例１に示したものと同じである
が、表２中のClostridium perfring ens 、Campylobacte
r jejuni、Campylobacter coli、 Bacteroides fragili
s 、Bacteroides vulgatus、Lactobacillus acudophilu
s およびBifidobacterium ad olescentisについては、３
７℃、嫌気的条件下で培養を行い、Neisseria gonorr ho
eae 、およびNeisseria meningitidisについては３−１
０％ＣＯ2 存在下で培養した。また、ヒト胎盤由来ＤＮ
Ａ（Human placenta DNA）は１μｇ／ｍｌの濃度のもの
を調整し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
が、表２中のClostridium perfring ens 、Campylobacte
r jejuni、Campylobacter coli、 Bacteroides fragili
s 、Bacteroides vulgatus、Lactobacillus acudophilu
s およびBifidobacterium ad olescentisについては、３
７℃、嫌気的条件下で培養を行い、Neisseria gonorr ho
eae 、およびNeisseria meningitidisについては３−１
０％ＣＯ2 存在下で培養した。また、ヒト胎盤由来ＤＮ
Ａ（Human placenta DNA）は１μｇ／ｍｌの濃度のもの
を調整し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
【００３０】結果を表２に示す。本発明のオリゴヌクレ
オチド１〜６をプライマーとして用いた場合、サルモネ
ラ属菌のＤＮＡを除いて、各種細菌のＤＮＡおよびヒト
胎盤由来ＤＮＡを増幅することはなかった。とくにサル
モネラ属菌とは系統的にも近縁で、しかも従来法では鑑
別困難なCitrobacter 属菌のＤＮＡとは極一部の菌株を
除いて反応しなかった（Citrobacter 属被検菌株６１中
９３％以上の一致率を示した）。したがって、本発明の
オリゴヌクレオチド、すなわちプライマーはサルモネラ
属菌にのみ特異的に反応するものであり、信頼性の高い
ものと断言できる。
オチド１〜６をプライマーとして用いた場合、サルモネ
ラ属菌のＤＮＡを除いて、各種細菌のＤＮＡおよびヒト
胎盤由来ＤＮＡを増幅することはなかった。とくにサル
モネラ属菌とは系統的にも近縁で、しかも従来法では鑑
別困難なCitrobacter 属菌のＤＮＡとは極一部の菌株を
除いて反応しなかった（Citrobacter 属被検菌株６１中
９３％以上の一致率を示した）。したがって、本発明の
オリゴヌクレオチド、すなわちプライマーはサルモネラ
属菌にのみ特異的に反応するものであり、信頼性の高い
ものと断言できる。
【００３１】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アガロースゲルの代わりに
ポリアクリルアミドゲルを使用することで、ヌクレオチ
ドの長さの測定精度を向上させることができ、stn 遺伝
子の特異的検出における信頼度は、さらに高まるものと
考えられる。
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アガロースゲルの代わりに
ポリアクリルアミドゲルを使用することで、ヌクレオチ
ドの長さの測定精度を向上させることができ、stn 遺伝
子の特異的検出における信頼度は、さらに高まるものと
考えられる。
【００３２】［実施例２：サルモネラ属菌のinv A 遺伝
子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００３３】プライマーの合成 サルモネラ属菌のinv A 遺伝子の塩基配列（Galan, J.
E.,et al.,J.Bacteriol.174,4338-4349(1992)）から、
請求項第３項に示した配列（配列番号７〜９）までを選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成および合成したオリゴヌクレオチドの
精製は実施例１と同様の方法で行った。
E.,et al.,J.Bacteriol.174,4338-4349(1992)）から、
請求項第３項に示した配列（配列番号７〜９）までを選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成および合成したオリゴヌクレオチドの
精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００３４】ＰＣＲプライマーとして下記の組合わせの
ものを使用した以外は、実施例１と同様の手法で行った
（７〜９は配列番号を示す）。
ものを使用した以外は、実施例１と同様の手法で行った
（７〜９は配列番号を示す）。
【００３５】 プライマー（Ａ） プライマー（Ｂ） ７ ８ ７ ９ 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００３６】結果 前述したように、サルモネラ属菌のinv A 遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、したがって、本発明の
オリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして使用す
ると、増幅されるヌクレオチド断片の大きさは容易に推
定できる。
でに塩基配列が決定されており、したがって、本発明の
オリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして使用す
ると、増幅されるヌクレオチド断片の大きさは容易に推
定できる。
【００３７】それによるとプライマー７と８の組合せを
用いた場合には、３７８塩基の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。同様にプライマー７と９を用
いた場合には、３４３塩基の長さのヌクレオチドが増幅
されてくるはずである。
用いた場合には、３７８塩基の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。同様にプライマー７と９を用
いた場合には、３４３塩基の長さのヌクレオチドが増幅
されてくるはずである。
【００３８】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーの組み合わせはin
v A 遺伝子の標的としている領域を正しく増幅している
と判断し、表１−１〜７中に”＋”と記入した。一方、
ヌクレオチドの増幅がみられなかったものには”−”を
記入した。表１−１〜７から明らかなように試験された
全てのサルモネラ属菌のinv A 遺伝子が正しく検出され
ていることがわかる。 （実験例２）実験例１で得られた結果がinv A 遺伝子を
もつサルモネラ属菌に対して、選択的なものかどうかを
確かめるため、実施例１と同様の手法で臨床検査におい
て対象となるサルモネラ属球菌以外の食中毒菌または下
痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマーが反応す
るかどうか調べた。
の長さが一致した場合、各プライマーの組み合わせはin
v A 遺伝子の標的としている領域を正しく増幅している
と判断し、表１−１〜７中に”＋”と記入した。一方、
ヌクレオチドの増幅がみられなかったものには”−”を
記入した。表１−１〜７から明らかなように試験された
全てのサルモネラ属菌のinv A 遺伝子が正しく検出され
ていることがわかる。 （実験例２）実験例１で得られた結果がinv A 遺伝子を
もつサルモネラ属菌に対して、選択的なものかどうかを
確かめるため、実施例１と同様の手法で臨床検査におい
て対象となるサルモネラ属球菌以外の食中毒菌または下
痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマーが反応す
るかどうか調べた。
【００３９】表２に示すように、使用したプライマーは
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡのについて
も、極一部のＤＮＡを除いて増幅することはなかった。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプ
ライマーはinv A 遺伝子をもつサルモネラ属菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡのについて
も、極一部のＤＮＡを除いて増幅することはなかった。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプ
ライマーはinv A 遺伝子をもつサルモネラ属菌にのみ、
選択的に反応するものと断言できる。
【００４０】
【表１−１】
【００４１】
【表１−２】
【００４２】
【表１−３】
【００４３】
【表１−４】
【００４４】
【表１−５】
【００４５】
【表１−６】
【００４６】
【表１−７】
【００４７】
【表２−１】
【００４８】
【表２−２】
【００４９】
【表２−３】
【００５０】
【表２−４】
【００５１】
【表２−５】
【００５２】
【表２−６】
【００５３】
【表２−７】
【００５４】
【表２−８】
【００５５】
【表２−９】
【００５６】
【表２−１０】
【００５７】
【表２−１１】
【００５８】
【表２−１２】
【００５９】
【発明の効果】本発明ではＰＣＲ法を用いたことで、サ
ルモネラ属菌の検出において、遺伝子増幅作用による高
い検出感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで
反応が規定されることによる高い選択性を得ることがで
きる。
ルモネラ属菌の検出において、遺伝子増幅作用による高
い検出感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで
反応が規定されることによる高い選択性を得ることがで
きる。
【００６０】また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
【００６１】また、検出にアガロースゲル電気泳動と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
【００６２】食中毒菌としてのサルモネラ属菌を検出す
る場合には、サルモネラ属に属する全ての菌種が対象と
なるので、個々の種あるいは個々の血清型のサルモネラ
菌を逐一検出する方法に比べて、本発明のようにサルモ
ネラ属菌全てを検出できるような試薬もしくは検出法
は、より迅速・簡便な方法であり、非常に効果的な検出
法となる可能性が大である。
る場合には、サルモネラ属に属する全ての菌種が対象と
なるので、個々の種あるいは個々の血清型のサルモネラ
菌を逐一検出する方法に比べて、本発明のようにサルモ
ネラ属菌全てを検出できるような試薬もしくは検出法
は、より迅速・簡便な方法であり、非常に効果的な検出
法となる可能性が大である。
【００６３】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧ
【００６４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＡ
【００６５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧ
【００６６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣ
【００６７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＴ
【００６８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴ
【００６９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧ
【００７０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣ
【００７１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；９ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella typhimurium 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＣＣＧ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/569 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:42）
Claims (4)
- 【請求項１】 検体中におけるサルモネラ属菌（Salmon
ella spp. ）の食中毒原因遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが配列番号１〜９の配列群、また
は対応する相補的配列からなることを特徴とするオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項２】 サルモネラ属菌（Salmonella spp. ）の
食中毒原因遺伝子がネズミチフス菌（Salmonella typh
imurium ）のエンテロトキシン遺伝子（sth遺伝子）で
あって、その合成ヌクレオチドが配列番号１〜６の配列
群、または対応する相補的配列からなる請求項１記載の
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 サルモネラ属菌（Salmonella spp. ）の
食中毒原因遺伝子がネズミチフス菌（Salmonella typh
imurium ）のinv A 遺伝子であって、その合成ヌクレオ
チドが配列番号７〜９の配列群、または対応する相補的
配列からなる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項１〜３項に記載された各オリゴヌ
クレオチドの配列のうち増幅されるべきヌクレオチド配
列の両端を規定する２以上のオリゴヌクレオチドを鎖長
反応のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配
列を選択的に増幅させることを特徴とする方法であっ
て、 （a ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前
記プライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチ
ドの重合反応により鎖長反応を行わせ、 （b ）得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型とし
て機能し、 （c ）前記プライマーによる同時の鎖長反応、プライマ
ー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして更なるプライマ
ーによるハイブリダイゼーションを繰り返すことによ
り、特定のヌクレオチド配列が増幅され、増幅されたヌ
クレオチド断片を検出し、 （d ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでの検出を行うことを
特徴とするサルモネラ属菌の検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7105192A JP2792462B2 (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP96106634A EP0739987A3 (en) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | Oligonucleotides for detecting Salmonella species and detection process using the same |
| US08/637,902 US5683883A (en) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | Oligonucleotides for detecting Salmonella species and detection process using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7105192A JP2792462B2 (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08294399A true JPH08294399A (ja) | 1996-11-12 |
| JP2792462B2 JP2792462B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=14400815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7105192A Expired - Lifetime JP2792462B2 (ja) | 1995-04-28 | 1995-04-28 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5683883A (ja) |
| EP (1) | EP0739987A3 (ja) |
| JP (1) | JP2792462B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| RU2121507C1 (ru) * | 1997-02-18 | 1998-11-10 | Мавзютов Айрат Радикович | Способ определения гена термостабильного энтеротоксина у представителей семейства enterobacteriaceae |
| DE19734940A1 (de) * | 1997-08-12 | 1999-02-18 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäuremolekül-Satz für Salmonella-Nachweis, Nucleinsäuren, Kit und Verwendung |
| US6165721A (en) * | 1999-04-12 | 2000-12-26 | Becton Dickinson And Company | Amplification and detection of Salmonella spp |
| US6893847B2 (en) * | 2001-01-17 | 2005-05-17 | Tosoh Corporation | Oligonucleotide for detecting Salmonella and method of detecting Salmonella |
| MXPA03012075A (es) * | 2001-06-22 | 2005-07-01 | Marshfield Clinic | Metodos y oligonucleotidos para la deteccion de salmonela sp., e. coli o157:h7 y listeria monocitogenes. |
| AU2003226642A1 (en) * | 2003-03-31 | 2004-10-25 | Council Of Scientific And Industrial Research | Stn gene oligonucleotide primers for detecting salmonella species and detection prosses using the same |
| ATE483031T1 (de) * | 2003-03-31 | 2010-10-15 | Council Scient Ind Res | Oligonukleotidprimer für das stn gen zur detektion von salmonella arten und entsprechende nachweismethoden |
| US20060246463A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-02 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| ES2327703B1 (es) | 2008-04-30 | 2010-07-07 | Universidad Del Pais Vasco | Metodos y reactivos para la deteccion de salmonella sp. |
| CN105316397A (zh) * | 2014-07-28 | 2016-02-10 | 康康 | 牛乳中沙门氏菌的直接荧光定量pcr的检测引物、探针及检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0409159B1 (en) * | 1989-07-18 | 1998-11-25 | Shimadzu Corporation | Method for testing causative microorganism of food poisoning and reagents therefor |
| AU2509592A (en) * | 1991-08-22 | 1993-03-16 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| GB9312508D0 (en) * | 1993-06-17 | 1993-08-04 | Bioteknologisk Inst | Compounds |
-
1995
- 1995-04-28 JP JP7105192A patent/JP2792462B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-26 EP EP96106634A patent/EP0739987A3/en not_active Withdrawn
- 1996-04-26 US US08/637,902 patent/US5683883A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5683883A (en) | 1997-11-04 |
| JP2792462B2 (ja) | 1998-09-03 |
| EP0739987A2 (en) | 1996-10-30 |
| EP0739987A3 (en) | 1998-07-29 |
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