JPH03266982A - ヒト血中単球増殖剤 - Google Patents
ヒト血中単球増殖剤Info
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- JPH03266982A JPH03266982A JP2065639A JP6563990A JPH03266982A JP H03266982 A JPH03266982 A JP H03266982A JP 2065639 A JP2065639 A JP 2065639A JP 6563990 A JP6563990 A JP 6563990A JP H03266982 A JPH03266982 A JP H03266982A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分解〕
本発明は、ヒト単球−マクロファージの増殖剤に関する
。
。
血液、組織に存在する抗感染、抗癌エフエフクー細胞で
ある単球−マクロファージは骨髄に由来し、骨髄中の単
球−マクロファージ系幹細胞がコロニー刺激因子（Ｃ３
Ｆ）、特にマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３
ＩＩ）の作用で、分化、増殖して単球−マクロファージ
になることが知られている（Ｗｏｎｇ、ｅｔ ａｌ ；
５ｃｉｅｎｃｅ ２３５１５０４．（１９８７））。
ある単球−マクロファージは骨髄に由来し、骨髄中の単
球−マクロファージ系幹細胞がコロニー刺激因子（Ｃ３
Ｆ）、特にマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３
ＩＩ）の作用で、分化、増殖して単球−マクロファージ
になることが知られている（Ｗｏｎｇ、ｅｔ ａｌ ；
５ｃｉｅｎｃｅ ２３５１５０４．（１９８７））。
単球−マクロファージは、種々の抗原物質やリンホカイ
ン、免疫細胞等の作用を受けて活性化マクロファージと
なり、癌細胞、細菌、原虫等を殺し、自然治癒力の原動
ノコになっていると考えられている（ｌ（ｉｇｕｃｈｉ
、ｅｔ ａｌ ； Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ８Ｌ
６２６（１９８４））。
ン、免疫細胞等の作用を受けて活性化マクロファージと
なり、癌細胞、細菌、原虫等を殺し、自然治癒力の原動
ノコになっていると考えられている（ｌ（ｉｇｕｃｈｉ
、ｅｔ ａｌ ； Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ８Ｌ
６２６（１９８４））。
さらに、単球−マクロファージを生体外に於いて活性化
させ、再び患者に戻し、悪性腫瘍の治療に用いる事がＬ
ＡＫ療法（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ、ａｌ；Ｎ、［ｉ
ｎｇｌ。
させ、再び患者に戻し、悪性腫瘍の治療に用いる事がＬ
ＡＫ療法（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ、ａｌ；Ｎ、［ｉ
ｎｇｌ。
Ｊ、Ｍｅｄ、、３１３．１４８５ （１９８５））と関
連して考えられているが、その絶対量は、全白血球数中
の約４％と低いため、ヒト単球−マクロファージのｉｎ
ｖｉｔｒ。
連して考えられているが、その絶対量は、全白血球数中
の約４％と低いため、ヒト単球−マクロファージのｉｎ
ｖｉｔｒ。
での大量取得法の確立が望まれていた。
従来、ヒ１へ膵臓癌由来細胞株旧へ・ＰａＣａより得た
１、６ｋｂのｔ’１−Ｃ３Ｆ遺伝子に基づいて作製され
た組換えＭ−Ｃ５Ｆを用いてヒ１へ血中単球の増殖テス
１−がなされた［：Ｇｅｎｄｅ１ｍａｎ他、Ｊ、Ｅｘｐ
、Ｍｅｄ、、 １６７．１４２８（１９８８） ）が、
その結果は、１０日間で単球が５０％増加するのが限界
であり、実用性に乏しい問題があった。
１、６ｋｂのｔ’１−Ｃ３Ｆ遺伝子に基づいて作製され
た組換えＭ−Ｃ５Ｆを用いてヒ１へ血中単球の増殖テス
１−がなされた［：Ｇｅｎｄｅ１ｍａｎ他、Ｊ、Ｅｘｐ
、Ｍｅｄ、、 １６７．１４２８（１９８８） ）が、
その結果は、１０日間で単球が５０％増加するのが限界
であり、実用性に乏しい問題があった。
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、本発明者が先に取
得したヒト尿由来Ｍ−Ｃ３ＦとＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子に基づ
いて作製されたヒト組換え型Ｍ−Ｃ３Ｆがｉｎνｉ ｔ
ｒｏに於いて著明なヒト単球−マクロファージの増殖作
用を示す事を見い出し、本発明を完成した。
得したヒト尿由来Ｍ−Ｃ３ＦとＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子に基づ
いて作製されたヒト組換え型Ｍ−Ｃ３Ｆがｉｎνｉ ｔ
ｒｏに於いて著明なヒト単球−マクロファージの増殖作
用を示す事を見い出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
１、 コロニー刺激因子を有効成分として成るヒト単球
−マクロファージ増殖剤。
−マクロファージ増殖剤。
２、 コロニー刺激因子がヒト尿由来マクロファージコ
ロニー刺激因子および、またはヒト組換え型マクロファ
ージコロニー刺激因子からなることを特徴とする１記載
のヒト単球−マクロファージ増殖剤。
ロニー刺激因子および、またはヒト組換え型マクロファ
ージコロニー刺激因子からなることを特徴とする１記載
のヒト単球−マクロファージ増殖剤。
である。以下、さらに本発明について詳しく説明する。
本発明において、ヒｌ−Ｍ−Ｃ３Ｆは、細胞培養法、尿
や腹水などからの抽出法、および遺伝子組換え法によっ
て得ることができるが、好ましくは、特開昭６４−３４
９９８号公報記載のヒＩ−尿より精製して取得したヒト
尿由来Ｍ−Ｃ３Ｆ及び、特願平１−１９２５９２の明細
書に記載された約４ｋｂのＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子をＣＩＯ細
胞等に例えばリン酸カルシウム法（Ｏｋａｙａｍａ、
ＩＩ。
や腹水などからの抽出法、および遺伝子組換え法によっ
て得ることができるが、好ましくは、特開昭６４−３４
９９８号公報記載のヒＩ−尿より精製して取得したヒト
尿由来Ｍ−Ｃ３Ｆ及び、特願平１−１９２５９２の明細
書に記載された約４ｋｂのＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子をＣＩＯ細
胞等に例えばリン酸カルシウム法（Ｏｋａｙａｍａ、
ＩＩ。
ｅｔ ａｌ、・Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ７
２７２４ （１９８７））やＤＥＡＥ−デキストラン
法（Ａｒａｉ、 Ｎ、 ｅｔ ａｌ、、実験医学５１０
１９ （１９８７））等を用いて導入し、無血清条件下
で産生させ、ヒト尿由来Ｍ−Ｃ３Ｆと同様に精製して取
得したヒト組換え型Ｍ−Ｃ３Ｆである。
２７２４ （１９８７））やＤＥＡＥ−デキストラン
法（Ａｒａｉ、 Ｎ、 ｅｔ ａｌ、、実験医学５１０
１９ （１９８７））等を用いて導入し、無血清条件下
で産生させ、ヒト尿由来Ｍ−Ｃ３Ｆと同様に精製して取
得したヒト組換え型Ｍ−Ｃ３Ｆである。
第１図に本遺伝子の全塩基配列を示す。また、この約４
ｋｂの遺伝子を含むプラスミドｐｕｓ ｌＩＣ５Ｆを保
有するＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ １０９株は工業技術院微生
物工業技術研究所乙こ寄託されている（徽工研条寄第２
５２６号ＣＣｌ１ＥＲＢＰ−２５２６） ）。
ｋｂの遺伝子を含むプラスミドｐｕｓ ｌＩＣ５Ｆを保
有するＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ １０９株は工業技術院微生
物工業技術研究所乙こ寄託されている（徽工研条寄第２
５２６号ＣＣｌ１ＥＲＢＰ−２５２６） ）。
尚、Ｍ−Ｃ５Ｆを分離精製するには、例えば特開平１、
−１３５８００に記載の方法等により行うことができる
。
−１３５８００に記載の方法等により行うことができる
。
具体的には酸処理、熱処理、限外濾過、塩析、イオンク
ロマトグラフィー、分子ふるいクロマＩ・グラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の組合せに例示できる。
ロマトグラフィー、分子ふるいクロマＩ・グラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の組合せに例示できる。
より具体的には、まず培養」二清を限外濾過方式で濃縮
し、それをリン酸等によりｐ旧、０〜５．０に調整、析
出物を除去する。次に陰イオン交換体、例えばＤＥ且−
セルロースと接触させ、Ｍ−Ｃ５Ｆ活性が認められる両
分を取得する。この活性画分を疎水性クロマトグラフィ
ー、例えばフェニルセファロースなどに接触させ、活性
画分を取得する。さらに分子ふるいクロマトグラフィー
、例えばスーパーローズ１２などを充填したカラムに通
液して分画し、脱塩、濃縮する。
し、それをリン酸等によりｐ旧、０〜５．０に調整、析
出物を除去する。次に陰イオン交換体、例えばＤＥ且−
セルロースと接触させ、Ｍ−Ｃ５Ｆ活性が認められる両
分を取得する。この活性画分を疎水性クロマトグラフィ
ー、例えばフェニルセファロースなどに接触させ、活性
画分を取得する。さらに分子ふるいクロマトグラフィー
、例えばスーパーローズ１２などを充填したカラムに通
液して分画し、脱塩、濃縮する。
上記の方法により高収率、高純度のＭ−Ｃ３Ｆを取得で
きる。
きる。
本発明に用いるヒト単球は、パーコール法を用いた遠心
分離操作（Ｉｌｉｇｕｃｈｉ、ｅｔ ａｌ ； Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ。
分離操作（Ｉｌｉｇｕｃｈｉ、ｅｔ ａｌ ； Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、３１，４６９ （１９７Ｂ））すなわ
ち、遠心によりパーコール溶液中に形成された密度勾配
に基づいて各血球がその密度に応して分離する方法によ
り容易に取得することができる。
ち、遠心によりパーコール溶液中に形成された密度勾配
に基づいて各血球がその密度に応して分離する方法によ
り容易に取得することができる。
ヒト単球の増殖条件としては、培地はいずれでも良いが
、好ましくは、ＲＰ）’ＩＩ １６４０培地を用い、ヒ
ト又は牛胎児血清（Ｆｅ２）を５〜２０％の範囲で添加
し、ヒト単球濃度をｌＸｌ０”〜１×１０５個／ｍρに
なるように調整し、これをブラフチックシャーレに入れ
て培養する。培養条件は、−ｉには、３５〜３７°Ｃ，
飽和水蒸気下、３〜７％二酸化炭素存在下に保つ。なお
、ヒト単球培養の際、添加するＨＣ５Ｆ濃度は好ましく
は１０ ｎｇ ／ ｍ（１以上であり、過剰に添加して
も抑制現象は認めない。３〜５日おきにＭ−Ｃ５Ｆが添
加されている新培地に交換し、約２〜４週間経過後、増
殖したヒト単球−マクロファージをラバーポリスマン等
を用いて剥離回収する。形態学的、また、細胞化学的検
討（エステレース染色）により増殖した細胞は１００％
ヒト単球−マクロファージである事が確認された。
、好ましくは、ＲＰ）’ＩＩ １６４０培地を用い、ヒ
ト又は牛胎児血清（Ｆｅ２）を５〜２０％の範囲で添加
し、ヒト単球濃度をｌＸｌ０”〜１×１０５個／ｍρに
なるように調整し、これをブラフチックシャーレに入れ
て培養する。培養条件は、−ｉには、３５〜３７°Ｃ，
飽和水蒸気下、３〜７％二酸化炭素存在下に保つ。なお
、ヒト単球培養の際、添加するＨＣ５Ｆ濃度は好ましく
は１０ ｎｇ ／ ｍ（１以上であり、過剰に添加して
も抑制現象は認めない。３〜５日おきにＭ−Ｃ５Ｆが添
加されている新培地に交換し、約２〜４週間経過後、増
殖したヒト単球−マクロファージをラバーポリスマン等
を用いて剥離回収する。形態学的、また、細胞化学的検
討（エステレース染色）により増殖した細胞は１００％
ヒト単球−マクロファージである事が確認された。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
正常人末梢血液５０ｍ１２からｌｌｉｇｕｃｈｉ らの
方法（前述）を用いてｌＸ１０７個のヒト単球を取得し
た。１０％ＦＣ３１ｍｌｌ含有するＲＩＩＭＩ １６４
０培地を底面積２ｃｆＩｌの円型プラスチックウェルに
入れ、ヒト単球ｌＸＩＯ３個を添加した。次いで、特開
昭６４３４９９８号公報記載のヒト尿より精製して取得
したヒト尿由来Ｍ−Ｃ３Ｆ ２０ｎｇ及び５０ｎｇを添
加し、３７°Ｃ１飽和水蒸気下、５％ＣＯ□存在下にて
１７日間培養した。尚、増殖した単球は、ラバ゛−ポリ
スマンを用いて剥離回収し、血球計算盤にて計数した。
方法（前述）を用いてｌＸ１０７個のヒト単球を取得し
た。１０％ＦＣ３１ｍｌｌ含有するＲＩＩＭＩ １６４
０培地を底面積２ｃｆＩｌの円型プラスチックウェルに
入れ、ヒト単球ｌＸＩＯ３個を添加した。次いで、特開
昭６４３４９９８号公報記載のヒト尿より精製して取得
したヒト尿由来Ｍ−Ｃ３Ｆ ２０ｎｇ及び５０ｎｇを添
加し、３７°Ｃ１飽和水蒸気下、５％ＣＯ□存在下にて
１７日間培養した。尚、増殖した単球は、ラバ゛−ポリ
スマンを用いて剥離回収し、血球計算盤にて計数した。
結果を第１表に示す。
単球数はそれぞれ４．５倍、６．９倍増加した。尚、コ
ントロールとして用いたＰＢＳ （０，９％の塩化ナト
リウムを含む５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，３）添加では
、単球は剥離消失し、計測不能であった。
ントロールとして用いたＰＢＳ （０，９％の塩化ナト
リウムを含む５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，３）添加では
、単球は剥離消失し、計測不能であった。
第 １ 表
実施例２
正常人末梢血液３０ｍｎからＩｌｉｇｕｃｈｉ らの方
法（前述）を用いて５Ｘ１．０６個のヒ１−単球を取得
した。１０％ＰＣ３１ｍｌ含有するＲＰＭＩ １６４０
培地を底面積２ｃｔＡの円型プラスチックウェルに入れ
、ヒト単球５Ｘ１０’個を添加した。次いで、ヒト組換
え型Ｍ−Ｃ５Ｆを５０ｎｇ添加した。このヒト組換え型
Ｍ−Ｃ３Ｆは特願平１−１９２５９２号の明細書に記載
された約４ｋｂのＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子を０１１０細胞に導
入し、そのＣＨＯ細胞ｌＸｌ０’個を１０ｃｍシャーレ
上に１０％ＦＣ５を含むＭＵＭ α培地１０ｍＡと供に
まき込み４日間、３７℃、５％ＣＯ□下で培養し、ＭＥ
Ｍα培地で細胞を２回洗浄後、［ｉＲ叶培地（ＦＣ５不
含）１０ｍｊ！を入れ、さらに４日間培養して取得した
ものである。その後、３７°Ｃ１飽和水蒸気下、５％Ｃ
Ｏ，存在下にて１７日間培養した後、単球数を計数した
。結果を第２表に示す。
法（前述）を用いて５Ｘ１．０６個のヒ１−単球を取得
した。１０％ＰＣ３１ｍｌ含有するＲＰＭＩ １６４０
培地を底面積２ｃｔＡの円型プラスチックウェルに入れ
、ヒト単球５Ｘ１０’個を添加した。次いで、ヒト組換
え型Ｍ−Ｃ５Ｆを５０ｎｇ添加した。このヒト組換え型
Ｍ−Ｃ３Ｆは特願平１−１９２５９２号の明細書に記載
された約４ｋｂのＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子を０１１０細胞に導
入し、そのＣＨＯ細胞ｌＸｌ０’個を１０ｃｍシャーレ
上に１０％ＦＣ５を含むＭＵＭ α培地１０ｍＡと供に
まき込み４日間、３７℃、５％ＣＯ□下で培養し、ＭＥ
Ｍα培地で細胞を２回洗浄後、［ｉＲ叶培地（ＦＣ５不
含）１０ｍｊ！を入れ、さらに４日間培養して取得した
ものである。その後、３７°Ｃ１飽和水蒸気下、５％Ｃ
Ｏ，存在下にて１７日間培養した後、単球数を計数した
。結果を第２表に示す。
単球数は約１３倍増加した。尚、コントロールとして用
いたＰＢＳ添加では、実施例１と同様単球は剥離消失し
、計測不能であった。
いたＰＢＳ添加では、実施例１と同様単球は剥離消失し
、計測不能であった。
第２表
〔発明の効果〕
本発明に基づく特定のＭ−Ｃ３Ｆを用いて、末梢血中の
ヒト単球−マクロファージを生体外で増殖せしめること
は、感染症の治療及び癌の免疫療法に際して、エフェク
ター細胞であるヒト単球−マクロファージを臨床に応用
する道が開かれる。
ヒト単球−マクロファージを生体外で増殖せしめること
は、感染症の治療及び癌の免疫療法に際して、エフェク
ター細胞であるヒト単球−マクロファージを臨床に応用
する道が開かれる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、コロニー刺激因子を有効成分として成るヒト単球−
マクロファージ増殖剤。 ２、コロニー刺激因子がヒト尿由来マクロファージコロ
ニー刺激因子および、またはヒト組換え型マクロファー
ジコロニー刺激因子からなることを特徴とする請求項１
記載のヒト単球−マクロファージ増殖剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2065639A JP2747355B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | ヒト血中単球増殖剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2065639A JP2747355B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | ヒト血中単球増殖剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03266982A true JPH03266982A (ja) | 1991-11-27 |
| JP2747355B2 JP2747355B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=13292796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2065639A Expired - Lifetime JP2747355B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | ヒト血中単球増殖剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2747355B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6434998A (en) * | 1986-10-31 | 1989-02-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Human urine derived csf and production thereof |
| JPH01104176A (ja) * | 1986-09-17 | 1989-04-21 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 遺伝子 |
-
1990
- 1990-03-16 JP JP2065639A patent/JP2747355B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01104176A (ja) * | 1986-09-17 | 1989-04-21 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 遺伝子 |
| JPS6434998A (en) * | 1986-10-31 | 1989-02-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Human urine derived csf and production thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2747355B2 (ja) | 1998-05-06 |
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