JPH04231872A - 免疫反応性リガンドを測定するための試験キットおよび測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、緩衝化組成物および
それを含む試験キットに関する。また、この発明は、各
種の免疫反応性リガンドを検出するための各種の免疫学
的な方法におけるこの組成物の用途にも関する。これら
の方法は、多様な医療状況の検査または各種疾患の診断
および処置を可能にする。

【０００２】

【従来の技術】医療、研究および診断法の実施に際し、
生物学的流体中に存在すると信じられているかまたは知
られている生物学的物質の迅速かつ正確な測定法に対す
る欲求は依然として存在する。例えば、薬物、麻薬、ホ
ルモン、ステロイド、ポリペプチド、タンパク質、多糖
、プラスタグランジンならびに血液、唾液、精液、膣分
泌液、尿、組織培養物および他の生物学的流体中の感染
性生物体の存在は、法外でない価格の適当な診断および
処置のための迅速かつ効率のよい方法によって測定され
ねばならない。

【０００３】このような測定法を提供する目的で、抗体
または抗原物質、薬物またはハプテンのような免疫反応
に関与する生物学的物質または化学物質の存在を単離し
、そして検出する各種の方法が案出されてきた。本明細
書では、これらの物質を「免疫反応体」と称し、そして
それらと特異的にバインディング（または反応）して免
疫複合体を形成する生物学的物質または化学物質を「受
容体」と称する。しばしば、このような複合体における
１種もしくはその他の反応体、または最初の２種の反応
体のいずれかと反応性の第三物質をも検出可能なマーカ
ーで標識し、前記複合体を検出する手段を提供する。こ
の目的では、一般に、放射性同位体、酵素、化学発光成
分、蛍光成分および色素が使用されてきた。

【０００４】近年、免疫アッセイは、動物またはヒトの
感染体の存在またはその量を検出するための手段として
重要性を増してきた。一般的に、感染体は、それらから
抽出された抗原性成分より形成される免疫複合体の存在
もしくはその量を測定するか、あるいは被検体中の感染
体に対する抗体の存在もしくはその量を測定することに
よって検出されている。

【０００５】最近では、酵素標識が他の標識、特に放射
性同位体および蛍光マーカーを陵駕する利点を提供する
ことからその使用に注目があつまってきた。酵素標識は
、感染体を検出するための競争酵素免疫アッセイ（ＥＩ
Ａ）　、直接および間接エンザイムリンクト　　イムノ
ソルベント　　アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　およびイムノ
メトリックもしくは「サンドイッチ」アッセイとして当
該技術分野で知られている免疫アッセイにおいて優先的
に使用されるようになってきた。

【０００６】免疫アッセイで検出できるこのような感染
体の一つは、クラミジアレス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅ
ｓ）　目、クラミジアセエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａ
ｅ　）属の２つの微生物種の１つであるクラミジア・ト
ラコマチス（　Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍ
ａｔｉｓ　）（以下、「Ｃ．トラコマチス」とも称する
）が挙げられる。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性
リンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を初め
とする多くのヒトの眼および性器の疾病の原因となるこ
の種に属する１５以上の菌株が存在する。Ｃ．トラコマ
チスに由来する感染症は、普遍的な世代間で蔓延し、そ
のため非淋菌性尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人
存在すると信じられる。

【０００７】淋病は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
　）属、時にＮ．ゴノローエ（Ｎ．　　ｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ　）に属する細菌に起因する性器接触で一般に
伝播される疾病である。この疾病は年に数千の人間を疾
病にかからせ、たとえ抗生物質がその蔓延の抑制に役立
っているとはいえ、いまだ世界の多くの地域の人々の間
で伝染性の疾病として存続している。この細菌の検出お
よび処置の重要性は、十分に認識されている。Ｎ．メニ
ンギチジス（Ｎ．　　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）　お
よびＮ．ラクタミカ（Ｎ．　　ｌａｃｔａｍｉｃａ　）
もまた、無視できない医療上および診断上の対象の菌種
である。

【０００８】これらの疾病の広く蔓延する性質のため、
クラミジア菌体および淋菌菌体の検出に関する迅速、簡
便かつ信頼性のある試験を入手することに相当な興味が
存在する。クラミジア菌体由来の抗原を検出しそして抽
出するための有用な方法を見い出すべく相当な数の研究
が行われてきた。固体支持体を使用して実施されるＣ．
トラコマチスおよびＮ．ゴノローエ用アッセイは、米国
特許第　４，４９７，８９９号および同　４，４９７，
９００号明細書に記載されている。記載されたアッセイ
は、それらの菌体から抗原を抽出する工程およびそれを
裸の固体支持体上に塗布する工程により行われている。 次に、この塗布された抗原は、１種は適当に標識されて
いる１種または２種のいずれかの抗体により検出されて
いる。このアッセイの主な特徴は、どのような材料にも
処理されていないか、または塗布もされていない付着用
の固体支持体を使用することにある。抗原の付着は、支
持体上に抗原の吸着を起こさせるのに十分長い時間その
塗布支持体をインキュベーションすることにより達成さ
れていることが明らかである。この吸着時間は、加温（
３７℃）　下で少なくとも３０分である。米国特許第　
４，４９７，８９９号明細書に記載されるアッセイ全体
は、少なくとも３時間かけて行われる。 Ｎ．ゴノローエに対する類似するアッセイが米国特許第
　４，４９７，９００号明細書に記載されている。

【０００９】改良は、特開平２−１５６１５７号公報に
記載されそして特許請求されている。イオン的に帯電し
た支持体はクラミジア抗原または淋菌抗原を引きつけ、
これらの抗原を迅速かつ感度よく検出することを可能に
することが見い出された。しかしながら、ある種の生物
学的被検体、具体的には膨大な量の全血、粘液または成
分を含むものについてはさらなる改良が必要であった。 従って、特開平２−２１０２６３号公報に記載の改良が
行われた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述の出願では相当な
改良が公表されているとはいえ、依然としてアッセイを
さらに早める（すなわち、２０分未満にする）必要性が
存在する。ユーザーがクラミジア感染症や淋菌感染症の
迅速な診断や処置についてより都合がよくそして適する
アッセイを見い出すには、従来のアッセイのプロトコー
ルから可能な限り多くの工程を省略することが望まれる
であろう。さらに、アッセイで使用されるペルオキシダ
ーゼ標識抗体結合物は、ある程度の安定性（すなわち、
保存寿命）を有するが、さらなる安定性とより長期の保
存寿命についての欲求が存在する。

【００１１】非常に迅速で正確なアッセイは、発明の名
称「クラミジア抗原または淋菌抗原の測定における酵素
標識抗体フラグメントの使用」として同時に出願係属中
のわが国における特許出願（１９９０年５月１１日出願
の米国特許出願第　５２２，４４４号に対応）明細書に
さらに詳細に記載されている。このアッセイでは、抗原
を検出するのにより少ない工程が用いられているので迅
速性が増したアッセイが達成されている。さらに、酵素
標識抗体Ｆ（ａｂ′）２フラグメントは、酵素で標識さ
れた抗体全体よりも安定であることが見い出された。

【００１２】しかしながら、そのアッセイの開発に際し
て、抗体フラグメントに結合される酵素標識（特に、ペ
ルオキシダーゼ）の早すぎる反応が、アッセイにおける
真の陽性シグナルを不明瞭にする好ましくないバックグ
ランドを与えることがわかった。このことは、アッセイ
のプロトコールが適正に行われたか否かを示すのに使用
される負対照にとって特に問題となる。その結果、好ま
しくない色素の生成が存在した。

【００１３】抗体フラグメントや抗原フラグメントのよ
うな酵素標識免疫反応体の安定組成物は、好ましくない
バックグランドシグナルを伴わない迅速アッセイを提供
するのに必要である。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記課題は、４′−ヒド
ロキシアセタニリドを含まないが、ヘムタンパク質と混
合した酵素標識免疫反応体を含む緩衝化組成物の使用に
よって解決された。

【００１５】この組成物は、免疫反応性リガンドの測定
に有用な試験キットの一部として供給することができ、
このキットは、酵素標識免疫反応体がリガンドに対する
受容体である上記緩衝化組成物を含んでなる。

【００１６】さらに、この発明は、下記工程を含んでな
る免疫反応性リガンドの測定方法を提供する。Ａ．４′
−ヒドロキシアセタニリドを含まないが、免疫反応性リ
ガンドに対する酵素標識受容体を含んでなり、かつその
酵素標識受容体がヘム含有タンパク質と混合されたもの
である緩衝化組成物を、目的の免疫反応性リガンドと接
触させる工程、ならびにＢ．前記リガンドの存在の指標
として未複合体化酵素標識受容体かまたは得られた酵素
標識免疫複合体のいずれかの存在を検出する工程。

【００１７】また、酵素標識免疫反応体が免疫反応性リ
ガンドに対する受容体である前記緩衝化組成物と前記リ
ガンドを接触させた後、目的の免疫反応性リガンドに対
する未複合体化酵素標識受容体かまたは前記リガンドに
よって形成した酵素標識受容体の酵素標識複合体のいず
れかの存在またはその量を検出することを含んでなる免
疫反応性リガンドの測定方法も提供する。

【００１８】さらに、免疫反応性リガンドの測定のため
のアッセイにおけるバックグランドの実質的な消去方法
であって、酵素標識免疫反応体が免疫反応性リガンドに
対する受容体である前記緩衝化組成物を免疫反応性リガ
ンドと接触させた後、目的の免疫反応性リガンドに対す
る未複合体化酵素標識受容体かまたは前記リガンドによ
って形成した酵素標識受容体の酵素標識複合体のいずれ
かの存在またはその量を検出することを含んでなる方法
も提供する。この発明はまた、被検体中のリガンドの存
在またはその量を検出するための酵素結合物を形成する
ために酵素と結合した抗体または抗原を用いる酵素免疫
アッセイであって、緩衝化組成物に加え、４′−ヒドロ
キシアセタニリドを含まないが、リガンドまたはそれら
の受容体と特異的な反応性を有する酵素と免疫反応体の
結合物およびヘム含有タンパク質を含んでなる免疫アッ
セイも提供する。

【００１９】

【具体的な態様】この発明は、各種の免疫アッセイで使
用できる酵素標識免疫反応体（上記に定義した）を含有
する非常に有用な組成物を提供する。免疫反応性リガン
ドに対する天然または人工的な特異的バインディング受
容体の存在する組成物を使用して被検体中の前記各種の
リガンドを検出することができる。この組成物の酵素標
識免疫反応体はリガンドと直接特異的に反応するか、あ
るいはそのリガンドと特異的に反応する他の生物学的化
合物または化学物質と反応することができる。リガンド
の測定は、定性もしくは定量またはそれらの両者を行う
ことができる。

【００２０】就中、この発明の組成物は、動物、ヒトま
たは植物の生物学的流体、好ましくはヒトの流体のアッ
セイに使用することができる。限定されるものでないが
、このような流体としては、全血もしくはその成分、リ
ンパ液、胆汁、尿、髄液、精液、涙液、膣分泌液、唾液
、汗、糞便、組織検体および綿棒検体が挙げられる。

【００２１】限定されるものでないが、この発明を用い
て検出できる代表的なリガンドとしては、アミン類、ア
ミノ酸類、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類
、糖タンパク質類、薬物、ハプテン類、酵素類、ステロ
イド類、ホルモン類（例えば、ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン）、ビタミン類、多糖類、糖脂質類、アルカロイド
類、菌体もしくはその成分〔例えば、連鎖球菌類（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、クラ
ミジア菌類（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ）　、淋菌類（Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ　ｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ）　、真菌類（ｆｕｎｇｉ）、糸状菌類（ｍｏｌ
ｄｓ）、プロトゾア（ｐｒｏｔｏｚｏａ）　ならびにヘ
ルペスおよびレトロウイルスのようなウイルス類〕、血
液成分、組織および器官の抗原が挙げられる。この発明
は、クラミジア菌体または淋菌菌体から抽出された抗原
の検出に特に有用である。従って、本明細書の記載の残
余部は殆どがこれらの菌体に向けられるが、これらの好
ましい態様に本発明が限定されるものでないことを理解
しなければならない。

【００２２】本発明は、いずれかの適当な医療または診
断上の技術を使用して患者から得られた生物学的被検体
中のＣ．トラコマチス（もしくは他のクラミジア種）の
存在またはＮ．ゴノローエ（もしくは他の淋菌種）の存
在を測定する方法として有用である。このような被検体
としては、例えば、患者の頸管、尿道、咽喉または肛門
および滑液または病巣由来の流体もしくは滑液のような
体液から得られる綿棒被検体が挙げられる。こうして得
られる生物学的被検体は、測定されるべきクラミジア抗
原または淋菌抗原（あるいは、それらの混合物）を含む
細菌を含有することが予測される。

【００２３】このアッセイは、自然のままのクラミジア
菌体または淋菌菌体上の抗原部位の検出を行うことがで
きるが、アッセイ感度を高めるにはそれらの菌体から抗
原を抽出することが一般に望ましい。菌体を溶解し、含
まれる抗原を遊離させるための標準的な技法、例えば溶
媒希釈もしくは高ｐＨ溶菌液、酵素処理、加熱および音
波処理もしくは遠心のような物理的攪拌を使用すること
ができる。アニオン洗浄剤またはドデジル硫酸ナトリウ
ムおよびデスオキシコール酸ナトリウムのような塩の使
用も既知である。最も好ましい態様では、本発明を使用
してクラミジアのリポ多糖（糖脂質グループ）抗原を検
出することができる。もう一つの態様では、検出される
抗原が全構成外層膜タンパク質の６０％を占めるクラミ
ジア菌体の主要外層膜タンパク質であってもよい。いく
つかの例では、これらのクラミジア抗原の混合物を、本
発明の実施によって免疫反応体を用いて検出することが
できる。さらにもう一つの態様では、本発明を使用して
１種以上の淋菌抗原（ＩＡもしくはＩＢタンパク質）、
あるいは１種以上の淋菌株に由来する抗原混合物を検出
することができる。好ましい抽出組成物は、後述の例１
〜５に示される。その組成物はアルコールアミンまたは
その塩を含み、高いｐＨを有するものである。さらに、
抽出工程でプロテアーゼを使用して全血および粘液を分
解することが好ましい場合もある。菌体から抗原がひと
たび抽出されてしまえば、必須ではないが、次の処理を
する前に被検体を予備濾過して細胞残屑、粒状物および
他の不要物を除去することが望ましい。

【００２４】抽出された抗原は、平均細孔サイズ１〜１
０μｍ、好ましくは５μｍを有するポリマー微孔質膜と
接触される。この膜は、アッセイ中にその保全性を維持
できるいずれか適当な材料、限定されるものでないが焼
結ガラス、多孔質セルロース材料、多孔質ポリマーフィ
ルムおよびフィルター材料、繊維織物および当該技術分
野で既知の他の材料から作製することができる。好まし
くは、この膜は、ポリマー主鎖に反復アミド基を有する
長鎖合成ポリマーであるポリアミドから調製される。こ
れらは、一般にジアミンとジカルボン酸のコポリマーま
たはアミノ酸のラクタムのホモポリマーである。限定さ
れるものでないが、代表的な材料としては、ポリヘキサ
メチレンドデカンジアミド（ナイロン６１２）、ポリヘ
キサメチレンアジパミド（ナイロン６６）、ポリ−ε−
カプロラクタム（ナイロン６）、ポリヘキサメチレンセ
バカミド（ナイロン６１０）およびポリ−７−アミノヘ
プタンアミド（ナイロン７）ならびにそれらの混合物が
挙げられる。 これらの膜は、場合によってイオン電荷を担持する膜を
使用できるが、非イオン性が好ましい。しかしながら、
これらの膜はクラミジア抗原または淋菌抗原と反応性の
どのような生物学的化合物も実質的に含まないことが必
須である。

【００２５】この発明の実施に際し、場合によって前記
膜は少なくとも２０ｍｇ／ｍ２　の量の１種以上の界面
活性剤を塗布するか、またはそれで処理することができ
る。限定されるものでないが、有用な界面活性剤として
は、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオ
ン界面活性剤が挙げられ、非イオン界面活性剤が好まし
い。

【００２６】本明細書で記載する微孔質膜は、アッセイ
を行うために他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカ
ーまたはカップ）と組み合わせて使用することができる
。別法として、好ましくは、アッセイを実施できそして
すべての流体を収容できる使い捨て試験デバイス中に微
孔質膜を固定する。試験デバイスの有用な形状は当該技
術分野で既知である。抗原と微孔質膜との接触と殆ど同
時に抗原は微孔質膜にバインディングする。抗原は、他
のタンパク質、細胞成分、全血もしくは粘液または被検
体中に存在する可能性のある他の残滓あるいはアッセイ
で使用する試薬類に比べ膜に優先的にバインディングさ
れる。

【００２７】接触の５分以内、好ましくは１〜５以内に
バインディングしていない（未バインディング）抗原を
バインディングした抗原から分離し、次いでバインディ
ングした抗原を、抗原と複合体化して支持体に直接結合
した免疫複合体を形成する免疫反応体を含むこの発明の
緩衝化組成物と接触される。この接触前または接触と同
時に流体およびバインディングしていない物質を除去し
てもよい。必要によって分離洗浄液（後述する）を使用
してもよい。アッセイを使い捨て試験デバイスを使用し
て行う場合には、被検体中の流体および未バインディン
グ物質（例えば、全血および粘液成分）は、抗原が膜に
バインディングされる時間中に膜を通過して適当なコン
パートメントに集められる。

【００２８】この発明の緩衝化組成物は、適当な酵素標
識免疫反応体（抗体、抗−抗体、リポ多糖、タンパク質
もしくは抗体と反応性の他の物質、ハプテンおよび上記
の他のもの）を含む。一般に、この免疫反応体は、上記
定義のごとく検出するリガンドに対する受容体または他
の受容体分子に対する受容体が考慮されている。好まし
くは、免疫反応体は酵素標識抗体またはそれらのフラグ
メント（モノクローナルもしくはポリクローナル）であ
る。最も好ましい態様では、標識免疫反応体は抗体フラ
グメント、例えばＦ（ａｂ′）２フラグメントである。

【００２９】抗体フラグメントの調製およびそれらの酵
素、例えばペルオキシダーゼによる標識化の好ましい方
法は、例との関連で後述する。この発明で使用する好ま
しい抗体フラグメントは、１種以上のクラミジア株また
は淋菌株（目的の菌体が何んであるかによって）と特異
的な免疫反応性を有する。

【００３０】この発明の組成物は目的の微生物の菌株１
種以上の抗原１種以上にそれぞれ向けられる複数の酵素
標識免疫反応体〔例えば、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント
〕を含むことができる。これは、検出する菌体が各種の
株として被検体中に見い出される場合に、特に有用であ
る。

【００３１】免疫反応体は、基質がアッセイに際して検
出可能なシグナルを生じうるいずれか適当な酵素で標識
される。限定されるものでないが、有用な酵素標識とし
ては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、
酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、カタラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
およびβ−アミラーゼが挙げられる。Ｆ（ａｂ′）２フ
ラグメントを標識する好ましい方法では、そのフラグメ
ントをスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレートと反応させてＦ
（ａｂ′）２フラグメント試薬を生成する。酵素、例え
ばペルオキシダーゼでは、Ｓ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物と反応させて反応性メルカプト部分を含有す
る酵素試薬を生成する。次に、この部分に前記Ｆ（ａｂ
′）２試薬を反応させてこの発明のアッセイで使用する
のに好ましい酵素標識免疫試薬を生成する。この手順の
さらなる詳細は後述の例との関連で示す。

【００３２】酵素標識免疫反応体は、一般的にｐＨ６〜
８に緩衝化したこの発明の組成物中に含められる。この
発明ではまた、１種以上のヘム含有タンパク質も含めら
れる。これらの物質は、それに結合した１個以上の鉄原
子を含むタンパク質であり、限定されるものでないが、
シトクロム、ミオグロビン、ヘモグロビン、ヘマチン、
ヘム、ヘミンまたはこれらのいずれかの混合物が挙げら
れる。本明細書で使用する「シトクロム」とは、鉄ポリ
フリンに結合した数種のタンパク質のいずれかをいい、
各種の生物源から得ることができる。限定されるもので
ないが、この語にはシトクロムｂ、シトクロムｃ、シト
クロムｆ、シトクロムｐおよび他の現在既知のものもし
くは将来発見されるもののすべての種類を含む。この語
は、単一の鉄含有タンパク質またはこのようなタンパク
質の混合物を称するのに使用できる。ミオグロビンおよ
びシトクロムｃがこの発明の実施に際して好ましく、シ
トクロムｃが最も好ましいものである。

【００３３】組成物中のヘム含有タンパク質は、一般的
に、酵素標識免疫反応体に対する重量化として、　５０
０：１〜１０：１で存在する。この発明の組成物は、既
知のあるものに使用されているようなフェノール系電子
移動剤、４′−ヒドロキシアセタニリドを含まない。

【００３４】場合によって、しかし好ましくは、この組
成物の成分としてアッセイにおける非特異的な相互作用
を低減する１種以上の非免疫タンパク質を含んでもよい
。「非免疫タンパク質」とは、感知できる程度までは目
的の抗原と免疫反応によるバインディングをしないタン
パク質を意味する。有用な非免疫タンパク質は周知であ
り、それらとしては、例えば、カゼイン、α−カゼイン
、ウシ胎児血清およびブタガンマグロブリンが挙げられ
る。

【００３５】この発明の好ましいアッセイでは、バイン
ディングした抗原が標識免疫反応体を含む緩衝化組成物
と接触すると、ほとんど瞬時にバインディングした免疫
複合体が膜上に形成される。この複合体化を促進するに
は、膜と試薬類を１０分以内１５〜３０℃の温度でイン
キュベーションすることができる。好ましくは、１〜３
分間１８〜２５℃（すなわち、室温）でインキュベーシ
ョンが行われる。これらの温和なインキュベーション条
件は、米国特許第　４，４９７，８９９号明細書に裸の
支持体に対してクラミジア抗原の吸着を必要とするよう
に記載されている３０分間３７℃の条件と非常に対照的
である。

【００３６】このインキュベーション後、複合体形成の
開始１０分以内（好ましくは、１〜３分以内）にバイン
ディングした複合体は、一般にｐＨ７〜１２の洗液で１
回以上洗浄される。このような洗液はアッセイのいずか
の時点で１回以上使用することができる。好ましくは、
この溶液はバインディングした複合体から未バインディ
ング物質を分離するのに役立つ界面活性剤１種以上を含
む。特に有用な界面活性剤はカチオン界面活性剤である
。

【００３７】洗浄後、バインディングした標識複合体は
、適当に検出される。一般に、微孔質膜上のバインディ
ングした標識複合体を検出するには、適当な色素生成組
成物をその複合体と接触する。この組成物は、酵素が存
在する場合にその酵素が直接もしくは間接的に検出可能
な色素を生成するような酵素の基質を含む。色素は、酵
素作用によって活性化される単一化合物であるか、ある
いは２種以上の化合物の酵素作用から生成されるかまた
は２種以上の化合物に由来する中間体から生成すること
もできる。適当な基質は当業者にとって容易に明らかな
ものであろう。

【００３８】特に好ましい態様では、酵素標識がペルオ
キシダーゼであり、アッセイのある時点で過酸化水素と
適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を生成す
る。例えば、有用な色素生成組成物には、トリアリール
イミダゾールロイコ染料（米国特許第　４，０８９，７
４７号明細書に記載されるような）またはペルオキシダ
ーゼおよび過酸化水素の存在下で反応して色素を生成す
る他の化合物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒作用
により色素を提供するように反応する化合物）を含む。

【００３９】色素生成組成物の添加は、バインディング
した複合体の洗浄後比較的迅速に、すなわち、一般に２
分以内、好ましくはその直後に行われる。場合によって
、試薬類が許容する場合にはインキュベーションして色
素の検出を早めてもよい。次に、得られた色素は標準的
な装置および操作によって検出して視覚的もしくは分光
光度計の読み取りが行われる。

【００４０】この発明の好ましい態様の代表例は、次の
工程を含んでなる生物学的被検体中のクラミジア抗原ま
たは淋菌抗原の測定方法である。 Ａ．生物学的被検体中に存在することが予想されるクラ
ミジア菌体または淋菌菌体から抽出された抗原を微孔質
膜と接触してそれに抗原をバインディングする工程、Ｂ
．このバインディングした抗原を、その抗原に向けられ
た酵素標識抗体またはそのフラグメントであって、ヘム
含有タンパク質と混合された酵素標識抗体またはそのフ
ラグメントを含むが、４′−ヒドロキシアセタニリドを
含まない緩衝化組成物と接触させて、膜上にバインディ
ングした前記抗原と酵素標識抗体またはそのフラグメン
トとの間で酵素標識免疫複合体を形成する工程、Ｃ．こ
のバインディングした複合体を前記酵素の存在下で色素
を生成する組成物と接触する工程、ならびにＤ．被検体
中のクラミジア菌体または淋菌菌体の存在またはその量
の指標として膜上の色素の存在を検出する工程。

【００４１】別法として、しかし好ましくはないが、こ
の発明の免疫アッセイは、目的の抗原に向けられた抗体
（またはそのフラグメント）が標識されていないことを
除き、前記好ましい方法と同様に実施される。従って、
膜（または他の適当な支持体）にバインディングした未
標識複合体が形成される。バインディングしていない物
質からバインディング複合体を（例えば、洗浄によって
）分離した後、バインディング複合体は、ヘム含有タン
パク質およびバインディング複合体の抗原かまたは抗体
のいずれかに向けられた酵素標識免疫反応体を含むこの
発明の緩衝化組成物と接触される。一般的に、標識免疫
反応体は複合体化された抗体に向けられた抗体である。 すなわち、それは酵素標識抗−抗体である。

【００４２】従って、この態様の例は、下記の工程を含
んでなる生物学的被検体中のクラミジア抗原または淋菌
抗原の測定方法である。 Ａ．生物学的被検体中に存在することが予想されるクラ
ミジア菌体または淋菌菌体から抽出された抗原を微孔質
膜と接触してそれに抗原をバインディングする工程、Ｂ
．このバインディングした抗原を、それに向けられた未
標識抗体またはそのフラグメントと接触して、膜にバイ
ンディングした前記抗原と未標識抗体との間で未標識免
疫複合体を形成する工程、 Ｃ．このバインディングした複合体を、未標識抗体に向
けられた酵素標識抗−抗体またはそのフラグメントであ
って、ヘム含有タンパク質を混合した酵素標識抗−抗体
またはそのフラグメントを含むが、４′−ヒドロキシア
セタニリドを含まない緩衝化組成物と接触して、膜にバ
インディングした抗原、未標識抗体および酵素標識抗−
抗体間の酵素標識免疫複合体を形成する工程、Ｄ．この
バインディングした複合体を前記酵素の存在下で色素を
生成する組成物と接触する工程、ならびにＥ．被検体中
の前記菌体の存在またはその量の指標として膜上の色素
の存在を検出する工程。

【００４３】この発明のさらにもう一つの態様としては
、競争バインディングアッセイ、エンザイム・リンクト
・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびイ
ムノメトリックアッセイ（サンドイッチ）におけるこの
発明の緩衝化組成物の使用が挙げられ、これらにおいて
は、酵素標識免疫反応体を目的のリガンドまたはその受
容体のいずれかにバインディングするのに使用すること
ができる。次に、酵素標識免疫反応体を、適当な基質お
よび色素生成組成物を用いるアッセイによって複合体化
したリガンドまたは複合体化していないリガンドを検出
するための手段を提供することができるので、試験試料
中のリガンド（もしくはリガンド混合物）の存在（もし
くは不存在）またはその量の指標を与える。

【００４４】この発明の診断試験キットは、本明細書に
開示する免疫組成物ならびにアッセイを実施するための
１種以上の他の成分の組成物、溶液またはデバイスを含
んでなる。例えば、一般的には、この発明の緩衝化組成
物および適当な色素生成組成物を別々のコンテナーに含
む。このキットの任意構成要素としては、洗液、抽出組
成物、抽出デバイス、綿棒もしくは他の被検体を採取す
る手段および使い捨て試験デバイス（それに固定された
微孔質膜を含む）が挙げられる。

【００４５】

【実施例】以下の例は、この発明をさらに具体的に説明
する目的で提供するものであり、その範囲を限定するも
のでない。すべてのパーセンテージは、別途指摘しない
限り重量基準である。

【００４６】材　　料 Ｆ（ａｂ′）２抗−クラミジアフラグメントを調製する
のに用いる抗体は、リン酸緩衝溶液としてクラミジアリ
ポ多糖抗原に向けられた１０Ｇ９モノクローナル抗体（
６．９６ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）であった。ペプシン
は、シグマ化学社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ．）　から入手した（カタログＮｏ．６　８８７、９
００　ユニット／タンパク質のｍｇ）。

【００４７】抗体フラグメントの調製 抗−クラミジア抗体（６．９６ｍｇ／ｍＬ）　のリン酸
緩衝溶液（１４ｍＬ）を、分子量３０，０００カットオ
フ膜とクエン酸緩衝液（５６ｍＬ、０．１モル濃度、ｐ
Ｈ４．１）を用いてアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　濃縮器
によって透析した。最終容量は、クエン酸緩衝液１ｍＬ
当り１０．８ｍｇを含有する溶液９ｍＬであった。この
溶液をペプシン（クエン酸緩衝液１ｍＬ当り２．５ｍｇ
含有液１．１６９ｍＬ）と混合し、得られた混合物を３
７℃で２時間回転させた。トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（１モル濃度、ｐＨ１０．８）　で
ｐＨ７に高め、この溶液を分子量３０，０００カットオ
フ膜とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（２０ミリモル濃度、ｐＨ８）を用いるアミコン濃縮器
で透析した。得られた溶液（約３０ｍＬ）　は使用する
まで４℃で保存した。

【００４８】この生成物を、最初にトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（２５〜３０ｍＬ、２０ミ
リモル濃度、ｐＨ８）、次いでこの緩衝液（２５ｍＬ）
と塩化ナトリウム（０．７５モル濃度）を用いるＤＥＡ
Ｅ−セファロースカラムで精製した。抗体フラグメント
を含む画分（ＯＤ２８０）　を集め、２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸（２５ミリモル濃度、ｐＨ６．
５）に対して透析してＦ（ａｂ′）２フラグメントおよ
びＦ（ａｂ′）フラグメントを合計２１．８ｍｇ得た。

【００４９】これらのフラグメントを、ＡＢｘカラムお
よび２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（３０ｍ
Ｌ、２５ミリモル濃度、ｐＨ５．６）、次いで硫酸アン
モニウム（０．５モル濃度）および酢酸ナトリウム（０
．０２モル濃度）　からなる溶液（３０ｍＬ）　での溶
離を用いるクロマトグラフィーによって分離した。Ｆ（
ａｂ′）２フラグメントを含む画分を集め、それらを合
わせ、次いでアミコン濃縮器でリン酸緩衝溶液に対して
透析して純粋なＦ（ａｂ′）２フラグメント（１３．８
５ｍｇ）　を得た。

【００５０】標識フラグメントの調製 工程Ａ：西洋ワサビペルオキシダーゼ（乾燥重量１００
ｍｇ）を４℃で炭酸ナトリウム緩衝液（１３．４ｍＬ、
０．１モル濃度、ｐＨ９．５）に溶解し、４℃以下で１
時間乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１７．４ｍｇ
／ｍＬの　３００μＬ）中Ｓ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物と反応させた。この混合物を、予じめ脱イオ
ン蒸留水で１０分間湿めらしたＳｐｅｃｔｒｏ　Ｐｏｒ
（商標）　透析バッグにピペットで移した。次に、この
バッグを反応混合物容量の５０倍のリン酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．４）中に置き、約４時間４℃でゆっくり攪拌した
。この溶液をアミコン濃縮器で濃縮して目的の中間体（
１８．６ｍｇ／ｍＬ）を得た。

【００５１】リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中で調製さ
れたばかりの中間体（２．６１ｍＬ、１８．６ｍｇ／ｍ
Ｌを含有する溶液）を、室温で２時間リン酸緩衝液（０
．２５モル濃度、ｐＨ７．５）中のヒドロキシルアミン
（０．６５２ｍＬ、０．２５モル濃度）　とエチレンジ
アミン四酢酸（０．００１モル濃度）を含有する溶液と
反応させることによって保護基を脱離した。得られた酵
素試薬を、ＰＤ−１０カラムおよび溶離液としてリン酸
緩衝溶液（ｐＨ７．４）を用いるクロマトグラフィーに
よって調製した。

【００５２】工程Ｂ：前記の調製したＦ（ａｂ′）２フ
ラグメント（リン酸緩衝溶液１ｍＬ当り２．５ｍｇの溶
液　１３．８５ｍｇ）を、スクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍＬ当り１６．
７ｍｇの　１３０．２μＬ）と混合し、次いで４℃で２
時間振盪した。得られた生成物を、ＰＤ−１０カラムお
よびリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を溶離液として用い
るクロマトグラフィーによって精製した。

【００５３】工程Ｃ：前記工程Ａで調製した酵素試薬（
リン酸緩衝溶液１ｍＬ当り１８．６ｍｇの溶液２．６ｍ
Ｌ）と、工程Ｂで調製した生成物（リン酸緩衝溶液１ｍ
Ｌ当り１．３２ｍｇの溶液１０．５ｍＬ）　とを混合し
、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントの濃度を約１ｍｇ／ｍＬ
に調整し、次いでこの混合物を２５℃で約１５時間回転
させた。得られた酵素−標識フラグメントの結合体を、
分子量１０，０００カットオフ膜を備えるアミコン濃縮
器を用い２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝
液（４０μＬ、２５ミリモル濃度、ｐＨ５．６）に対し
て透析した。次に、得られた生成物（５ｍＬ）をＡＢｘ
カラムを用い、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸、次いで硫酸アンモニウム（０．５モル濃度）および
酢酸ナトリウム（２０ミリモル濃度）（ｐＨ６．７）の
グラジエント溶液（３０ｍＬ）　で溶離して精製した。 約０．６の吸光度比（４０３／２８０）を示す画分を集
めて目的のペルオキシダーゼ標識フラグメント４．８５
ｍｇを得た。この標識フラグメントを、マーシオレート
（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）　防腐剤（０．０１％）　
を含むリン酸緩衝溶液中４℃で保存した（０．２％溶液
、ｐＨ７．４）。標識フラグメントの分子量範囲は約　
１３５〜約　２５０キロダルトンであった。

【００５４】例１〜５：緩衝化組成物の比較これらの例
は、この発明の数種の緩衝化組成物およびそれらのクラ
ミジア抗原用直接バインディング免疫アッセイにおける
使用を具体的に説明する。この発明の組成物は、免疫ア
ッセイにおいてこの発明の範囲外の組成物（対照Ａ〜Ｆ
）と比較する。

【００５５】材　　料 クラミジア抗原溶液は、ウシ血清アルブミン（０．１ｍ
ｇ／ｍＬ）を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）中にク
ラミジアのセロバー（Ｓｅｒｏｖａｒ）Ｇエレメンタリ
ー小体を含めた。ブランク対照溶液は、抗原を含まない
リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）中にウシ血清アルブミン
（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含めた。

【００５６】Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デ
バイスは、各試験ウェルに未塗布　ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ
（商標）微孔質膜（５μｍ）を含めて使用した。抽出管
を使用して被検体からクラミジア抗原を抽出したが、そ
の管の内部の離れ離れになった場所に（１）チメロサー
ル（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）防腐剤　（０．０１％）　
を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
剤（１．６５モル濃度溶液２０μＬ、ｐＨ１１）ならび
に（２）アジ化ナトリウム（１．５４ミリモル濃度）　
、エチレンジアミン四酢酸（５．４ミリモル濃度）、５
，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（２１
．４ミリモル濃度）、ジチオスレイトール（０．１８８
モル濃度）　およびポリ（アクリルアミド）（６．３５
％）を有する２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（１０ミリモル濃度溶液５０μＬ、ｐＨ６）の乾燥塗布
物を有する。

【００５７】組成物１は、１０ミリモル濃度２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ６）、塩化
ナトリウム（５０ミリモル濃度）、塩化カルシウム（５
ミリモル濃度）、１，２−プロパンジオール（１０％ｗ
／ｖ）およびチメロサール（０．０１％）　中にＡｍｉ
ｄｅｃｋ（商標）プロテアーゼ（４ｍｇ／ｍＬ、　１７
０ユニット／ｍｇ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ，　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，　Ｎ．Ｙ．か
ら入手可能）　を含めた。

【００５８】抽出組成物は、エタノールアミン塩酸（０
．４７モル濃度）、塩化ナトリウム（０．２７モル濃度
）　、チメロサール（３０ミリモル濃度）　、エチレン
ジアミン四酢酸（５０ミリモル濃度）　、Ｅｍｃｏｌ（
商標）ＣＣ−３６カチオン界面活性剤（０．４５％）お
よび水酸化ナトリウム（０．６６規定、ｐＨ１３．５に
なるまで）　を含めた。組成物２は、過酸化水素（水中
１２％）、ジエチレントリアミン五酢酸（１０マイクロ
モル濃度）　およびチメロサール（０．０１％）　を含
めた。

【００５９】洗液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−
ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸緩衝液（０．０５
モル濃度、ｐＨ１０）、Ｅｍｃｏｌ（商標）ＣＣ−９カ
チオン界面活性剤（０．７５％）　およびチメロサール
（０．０１％）　を含めた。色素生成組成物は、２−（
４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−４，５−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料（
０．００８％）　、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）
、リン酸ナトリウム（１０ミリモル濃度、ｐＨ６．８）
、ジエチレントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度
）　、４′−ヒドロキシアセトアニリド（２ミリモル濃
度）および過酸化水素（１０ミリモル濃度）　を含めた
。

【００６０】この発明の５種の緩衝化組成物は、リン酸
緩衝溶液（ｐＨ７．２）中ヘム含有タンパク質（０．１
１〜１．２５ｍｇ／ｍＬ、後述する）、カゼイン（０．
０５％）　、Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性
剤（０．０１％）　およびチメロサール（０．０１％）
　を上述のように調製した標識フラグメント（４μｇ／
ｍＬ溶液、最終濃度）と混合して調製した。これらの組
成物は、フェノール系の電子移動剤である４′−ヒドロ
キシアセタニリドを含まない。

【００６１】対照Ａ〜Ｅは、この発明の緩衝化組成物が
さらに４′−ヒドロキシアセタニリド（１０ミリモル濃
度）　を含む以外はそれらと同様であった。対照Ｆは、
ヘム含有タンパク質または４′−ヒドロキシアセタニリ
ドを含まない他は同様に調製した。

【００６２】例１〜５および対照Ａ〜Ｅは、以下の量の
ヘム含有タンパク質を含む： 例１および対照Ａ：ミオグロビン　　　０．１２５ｍｇ
／ｍＬ。 例２および対照Ｂ：ミオグロビン　　０．２５ｍｇ／ｍ
Ｌ。 例３および対照Ｃ：ミオグロビン　　１．２５ｍｇ／ｍ
Ｌ。 例４および対照Ｄ：シトクロムｃ　　０．１１ｍｇ／ｍ
Ｌ。 例５および対照Ｅ：シトクロムｃ　　０．２３ｍｇ／ｍ
Ｌ。

【００６３】アッセイ操作 各例および対照について、それぞれ以下のアッセイ操作
を施した。抽出管に組成物１（８滴）、次いで前記エレ
メンタリー小体を加えた後、５〜１０秒間混合した。次
に、この管と内容物を室温（１８〜２５℃）で１分間イ
ンキュベーションした。抽出組成物（８滴）を加えて管
の内容物と混合し、次いで室温で１分間インキュベーシ
ョンした。組成物２（８滴）を加え、５〜１０秒混合し
、室温で２分間管の内容物をインキュベーションした。

【００６４】得られた抽出リポ多糖抗原を含む溶液をピ
ペットを使用してその管から採取し、予備濾過した後、
Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイスの各ウ
ェルに移した（ウェル当り抗原５００ｐｇ　を含有する
溶液　１６０μＬ）。ウェル中の微孔質膜を通して流体
を排液した。次に、各ウェルを洗液（各　２５０μＬ）
で２度洗浄し、排液した。

【００６５】ブランク対照溶液は、抽出組成物で同様に
処理し、予備濾過し、そして特定の試験デバイスの各ウ
ェルに移した。次に、試験ウェル（抗原が加えられ、次
いでブランク溶液が加えられたデバイスのウェル）に各
標識フラグメント組成物（例または対照にそれぞれ１滴
）を加え、次いで２分間室温でインキュベーションして
各ウェルの膜上の免疫複合体を形成した。

【００６６】色素生成組成物（２滴）を加え、室温で３
分間インキュベーション後、膜上に生成した色素を、０
が色素濃度が存在しないことを示しそして１０が最高の
色素濃度を示す０〜１０の値をもつ段階カラーチャート
に対して評価した。試験デバイス（抽出されたクラミジ
ア抗原を有するものと有しないもの）中で観察された値
を、各試験に対する３度の個別アッセイの各試験に対す
る平均値として図１に示す。バックグランドシグナルは
抗原を加えなかった（ブランク対照溶液）試験ウェルで
観察した。

【００６７】これらの結果は、この発明の組成物（ヘム
含有タンパク質を含むが、４′−ヒドロキシアセタニリ
ドを含まない）がバックグランドの割合について許容で
きるシグナルを与えることを示す（不十分な洗浄または
膜の変性によって異常値を示したものと思われる例３は
除く）。しかしながら、抗原を加えなかった試験ウェル
の濃度の評価によって示されるように、４′−ヒドロキ
シアセタニリドが組成物中に存在する場合（対照Ａ〜Ｅ
）は、一般にバックグランドが非常に高い。組成物がヘ
ム含有タンパク質を含み、４′−ヒドロキシアセタニリ
ドを含まない場合には、同様な試験ウェルは色素を示さ
なかった。

【００６８】例６：ＣＫ−ＭＢ抗体フラグメントを含有
する緩衝化組成物 この発明のもう一種の緩衝化組成物は、西洋ワサビペル
オキシダーゼを結合したクレアチンキナーゼ−ＭＢ　Ｆ
（ａｂ　′）２抗体フラグメント（５μｇ／ｍＬ）、カ
ゼイン（０．０５％）　、Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商標）Ｃ
両性界面活性剤（０．０１％）　、シトクロムｃ（０．
５ｍｇ／ｍＬ）およびチメロサール（０．０１％）　を
リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で共に混合して調製し
た。標識フラグメントは、上記例１で使用した標識フラ
グメントについて記載したのと同じ操作で調製した。し
かしながら、最後のクロマトグラフィーは、標準滴なＡ
Ｂｘカラムに代え標準的なＥＤＡＥカラムを使用して行
った。使用した溶離緩衝液は、（１）トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（２０ミリモル濃度、ｐＨ８）
および（２）塩化ナトリウム（０．７４モル濃度）　を
含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（２０ミ
リモル濃度、ｐＨ８）であった。

【００６９】例７：抗体の全体を含む緩衝化組成物およ
びアッセイでの使用 この例は、酵素標識抗−抗体（標識抗体でない）を緩衝
化組成物が含む以外は、例１〜６と同様な直接バインデ
ィングアッセイでのこの発明の緩衝化組成物の使用を具
体的に説明する。

【００７０】材　　料 抗原溶液（１μＬ当り約２９００ｎｇのＳｅｒｏｖａｒ
　Ｇ　抗原含有液５μＬ）は、リン酸緩衝溶液中ウシ血
清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）で希釈
して最終濃度約　５００ｐｇにし、このものはＳｕｒｅ
ｃｅｌｌ（商標）試験デバイスの各試験ウェルにその量
で通常加えられた。

【００７１】クラミジアリポ多糖抗原に対するマウスモ
ノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技法およ
び標準的なマウスセルラインを使用して調製し、アジ化
ナトリウム（０．０１％）含有リン酸緩衝溶液（ｐＨ７
．２）の溶液として保存した。抗体試薬組成物は、ブロ
ッキングタンパク質としてカゼイン（０．５％）および
Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．０１
％）　を含有するリン酸緩衝溶液に抗体溶液試料を加え
（希釈１：８００）て調製し、次いで０．２２μｍのフ
ィルターを通して作業溶液とした。

【００７２】ポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体
は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した。この結合物
を、カゼイン（０．５％）、Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商標）
Ｃ両性界面活性剤（０．０１％）　およびシトクロムｃ
（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含有するリン酸緩衝溶液で約１
：７５０まで希釈してこの発明の緩衝化組成物を調製し
た。次にそれを予備濾過した。対照組成物は、シトクロ
ムｃを添加しない以外は同様に調製した。

【００７３】負対照試薬組成物は、クレアチンキナーゼ
−ＭＢ抗体（５μｇ／ｍＬ）、カゼイン（０．５％）、
Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．０１
％）　およびチメロサール防腐剤（０．０１％）　を用
いリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で調製した。Ｓｕｒ
ｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイスは、各試験ウ
ェルに未塗布　ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）微孔質膜（
５μｍ）を含めて使用した。この例で使用した他の組成
物は、上記例１〜５で使用したものと同じであった。

【００７４】アッセイ操作 ８つのＳｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイス
をこの例では使用した。各アッセイ（例および対照）は
２度ずつ行った。２組の試験デバイスは抽出抗原溶液に
使用し、そして２組は抗原を含まないもの（負対照試薬
組成物）について実施した。各組の試験は、この発明の
緩衝化組成物および対照組成物（シトクロムｃを含まな
い）を用いて実施した。

【００７５】組成物１（８滴）、次いでエレメンタリー
小体を抽出管に加えて５秒混合した後、１分間室温でイ
ンキュベーションした。抽出組成物（８滴）を前記管に
加え、その内容物を５秒間混合し、次いで室温で１分間
インキュベーションした。次に、組成物２（８滴）をそ
の管に加えて５秒間その内容物を混合し、次いで室温で
２分間インキュベーションした。

【００７６】ブランク試料（抗原を含まない）も同様に
処理した。抗原を含む試料と抗原を含まない試料をピペ
ットを使用して抽出管から採取し、個別のＳｕｒｅｃｅ
ｌｌ（商標）試験デバイスの試験ウェルに加えた（存在
する場合、抗原約５００ｐｇ　を含む各　１６０μＬ）
　。膜を通して流体を排液した後、各試験ウェルを洗液
（約　３００μＬ）で洗浄し、排液した。未標識モノク
ローナル抗体組成物（２滴）を各試験デバイスの試験ウ
ェルに加えた。対照試薬組成物（２滴）を各デバイスの
別の試験ウェルに加えた。これらの試験デバイスを室温
で２分間インキュベーションした後、各試験ウェルを洗
液（約　３００μＬ）を使用して洗浄した。

【００７７】シトクロムｃを含有するこの発明の緩衝化
組成物（２滴）を、１組の試験デバイスのすべての試験
ウェルに加えた。対照緩衝化組成物（２滴）を、もう１
組の試験デバイスに同様に加えた。すべての試験デバイ
スを５分間室温でインキュベーションした後、これらの
試験ウェルを洗液で２度（毎時、約　３００μＬ）洗浄
した。次に、色素生成組成物（２滴）を加え、試験デバ
イスをさらに５分間室温でインキュベーションした。色
素濃度を、例１〜５に記載するように評価した。

【００７８】これらの評価の結果は、シトクロムｃ含有
緩衝化組成物を使用して実施するこの発明のアッセイが
バックグランドを伴うことなく約４の視覚的色素濃度を
与えることを示した。対照緩衝化組成物を使用して実施
したアッセイは、４〜５の色素濃度を与えたが、バック
グランドが許容範囲外の０．５であった。

【００７９】例８：ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣ
Ｇ）　のアッセイ この例は、サンドイッチアッセイによりこの発明の緩衝
化組成物を用いるｈＣＧの検出に関する本発明の実施を
具体的に説明する。

【００８０】材　　料 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイスは、そ
れぞれＥｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ　１３５非イオン界
面活性剤を塗布（０．０５ｇ／ｍ２　）したＬｏＰｒｏ
ｄｙｎｅ（商標）　微孔質膜（５μｍ）を含めて使用し
た。アフィニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧアルファポリク
ローナル抗体を誘導体化したスチレンビーズにバインデ
ィングした。グリシン緩衝液（０．１モル濃度、ｐＨ８
．５）中前記ビーズ（０．９％）、ポリアクリルアミド
（５％）、Ｕｖｉｔｅｘ（商標）色素（０．０１％）　
およびチメロサール防腐剤（０．０１％）　を含む組成
物（２μＬ）を、試験ウェルの一つの限定区域にのせた
（試料ウェルと称する）。

【００８１】ヤギガンマグロブリンを同じタイプのビー
ズにバインディングして別の試験ウェルの膜上にのせた
（負対照ウェルと称する）。第３の試験ウェル（正対照
ウェルと称する）は、ビーズにバインディングした抗−
ｈＣＧ抗体とその抗体に予めバインディングしたｈＣＧ
抗原を含めた。

【００８２】試験溶液は、リン酸緩衝溶液（塩化ナトリ
ウム　１５０ミリモル濃度、リン酸ナトリウム５０ミリ
モル濃度、ｐＨ６．２）、ウシ血清アルブミン（０．７
％）およびマーシオレート（０．０１％）の溶液にｈＣ
Ｇ（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍＬ）　を含めた。抗−ｈＣＧモ
ノクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ（
Ｍｉｌｅｓ）　の結合物を調製した。この結合物を、２
−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（４．８
８％）　、シトクロムｃ（０．０５％）　、ウシ血清ア
ルブミン（１％）およびチメロサール（０．０１％）　
と混合してこの発明の緩衝化組成物を調製した。

【００８３】洗液は、リン酸ナトリウム（０．１モル濃
度、ｐＨ７．２）、デシル硫酸ナトリウム（１００ミリ
モル濃度、２．７％）、塩化ナトリウム（０．３モル濃
度）およびチメロサール（０．０１％）から調製した。 色素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキ
シフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）
イミダゾールロイコ染料（０．００５％）　、ポリ（ビ
ニルピロリドン）（１　％）　、リン酸ナトリウム緩衝
剤（５ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチレントリア
ミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）　、４′−ヒドロ
キシアセタニリド（２ミリモル濃度）および過酸化水素
（１０ミリモル濃度）　を含めた。

【００８４】アッセイ操作 試験デバイスの３つの試験ウェルにｈＣＧ（５０ｍＩ．
Ｕ．／ｍＬ）を含む試験液（１５０μＬ）を加え、流体
を膜を通して排液した。標識抗体を含む緩衝化組成物（
１滴、約４０μＬ）を各試験ウェルに加え、膜を通して
排液した。それらの試験ウェルを２度洗浄（毎時、　３
００ｍＬ）　し、次いで膜を通して排液した。次に、色
素生成組成物を各試験ウェルに加え、同様に排液した。 室温で短時間インキュベーションした後、膜上の色素濃
度の評価し、上記例１〜５に記載したようなカラーチャ
ートに対して採点した。 試験ウェルに塗布した組成物区域の周辺をバックグラン
ドとして評価した。このアッセイを３度行った。

【００８５】３度の試験のそれぞれについて特定の試験
ウェルに見られる可視色素濃度としての結果を下記表１
に示す。

【００８６】

【表１】

【００８７】これらのデータは、３つの別個のアッセイ
において、非常の低濃度のｈＣＧ（５０ｍＩ．Ｕ．）が
バックグランド０のまま容易に検出できることを示す。

【００８８】

【発明の効果】この発明のアッセイは、特に、クラミジ
ア抗原および淋菌抗原の検出について迅速かつ正確であ
るだけでなく〔従って、同時にわが国に特許出願係属中
の出願明細書（上述の１９９０年５月１１日付出願の米
国特許出願第　５２２，４４４号明細書に対応する）　
に記載され特許請求されている発明の利点を有する〕、
さらなる利点も有する。酵素標識免疫反応体と混合する
ヘム含有タンパク質の使用がその免疫反応体を安定化す
るので、バックグランド色素の形成はもはや問題点とな
らない。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の数種の緩衝化組成物を使用して得ら
れる色素濃度シグナルを示す。これは、上記例１〜５に
おいて詳細に検討されている。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　４′−ヒドロキシアセタニリドを含ま
   ないが、ヘム含有タンパク質と混合した酵素標識免疫反
   応体を含んでなる緩衝化組成物。
2. 【請求項２】　　４′−ヒドロキシアセタニリドを含ま
   ないが、ヘム含有タンパク質と混合した酵素標識免疫反
   応体を含み、かつその免疫反応体が免疫反応性リガンド
   に対する受容体である緩衝化組成物を含んでなる免疫反
   応性リガンドの測定に有用な試験キット。
3. 【請求項３】　　Ａ．４′−ヒドロキシアセタニリドを
   含まないが、免疫反応性リガンドに対する酵素標識受容
   体を含んでなり、かつその酵素標識受容体がヘム含有タ
   ンパク質と混合されたものである緩衝化組成物を、目的
   の免疫反応性リガンドと接触させる工程、ならびにＢ．
   前記リガンドの存在の指標として未複合体化酵素標識受
   容体かまたは得られた酵素標識免疫複合体のいずれかの
   存在を検出する工程、を含んでなる免疫反応性リガンド
   の測定方法。
4. 【請求項４】　　４′−ヒドロキシアセタニリドを含ま
   ないが、ヘム含有タンパク質と混合した酵素標識受容体
   を含む緩衝化組成物を免疫反応性リガンドと接触させた
   後、目的の免疫反応性リガンドに対する未複合体化酵素
   標識受容体かまたは前記リガンドによって形成した酵素
   標識受容体の酵素標識複合体のいずれかの存在またはそ
   の量を検出することを含んでなる免疫反応性リガンドの
   測定方法。
5. 【請求項５】　　免疫反応性リガンドの測定のためのア
   ッセイにおけるバックグランドの実質的な消去方法であ
   って、４′−ヒドロキシアセタニリドを含まないが、ヘ
   ム含有タンパク質と混合した酵素標識受容体を含む緩衝
   化組成物を免疫反応性リガンドと接触させた後、目的の
   免疫反応性リガンドに対する未複合体化酵素標識受容体
   かまたは前記リガンドによって形成した酵素標識受容体
   の酵素標識複合体のいずれかの存在またはその量を検出
   することを含んでなる方法。
6. 【請求項６】　　被検体中のリガンドの存在または量を
   検出するための酵素結合物を形成するために酵素と結合
   した抗体または抗原を用いる酵素免疫アッセイであって
   、緩衝化組成物に加え、４′−ヒドロキシアセタニリド
   を含まないが、リガンドまたはそれらの受容体と特異的
   な反応性を有する酵素と免疫反応体の結合物およびヘム
   含有タンパク質を含んでなる免疫アッセイ。