JPH03277291A - 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター - Google Patents
光合成関連遺伝子及びそのプロモーターInfo
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- JPH03277291A JPH03277291A JP7577490A JP7577490A JPH03277291A JP H03277291 A JPH03277291 A JP H03277291A JP 7577490 A JP7577490 A JP 7577490A JP 7577490 A JP7577490 A JP 7577490A JP H03277291 A JPH03277291 A JP H03277291A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、植物の光合成に関する集光性クロロフィルａ
／ ｂ結合タンパク質の遺伝子及びそのプロモーター
に関するものであり、遺伝子組替えを利用した植物の新
品種の開発や代謝産物を生産させる培養細胞の改変に利
用される。
／ ｂ結合タンパク質の遺伝子及びそのプロモーター
に関するものであり、遺伝子組替えを利用した植物の新
品種の開発や代謝産物を生産させる培養細胞の改変に利
用される。
［従来の技術］
近年、植物でも遺伝子組み換え技術の利用が可能になり
、特に双子葉植物での研究が活発に行なわれている。中
でも土壌細菌アグロバクテリウム・トウメファシエンス
のＴ１プラスミドを利用したベクター系がいくつか作製
され、植物の形質転換実験に用いられてきた（ Ｈｏｅ
ｋｅ＋＋＋ａらｆ１９８５１Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：８５−８９． Ｖｅｌｔ
ｅｎら（１９８４） Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ
３：２７２３−２７３０他）、シかしながら、アグロ
バクテリウム属は双子葉植物と単子葉植物の掻く限られ
た一部にしが感染しないため、イネを始めとする主要穀
物では殆ど形質転換実験は不可能であった。この問題を
解決した技術がエレクトロポレーション法である（ Ｆ
ｒｏｗｎら（１９８６１Ｎａｔｕｒｅ ３１９ニア９１
−７９３他）、コノ方法は単離したプロトプラストに電
気的刺激を与えることにより、細胞表面に極く小さな穴
を開け、そこから遺伝子を取り込ませて形質転換を行う
技術である。この方法が開発されたことにより、イネを
始めとする主要穀物においても形質転換実験がｉ能とな
り、現在盛んに行なわれている。
、特に双子葉植物での研究が活発に行なわれている。中
でも土壌細菌アグロバクテリウム・トウメファシエンス
のＴ１プラスミドを利用したベクター系がいくつか作製
され、植物の形質転換実験に用いられてきた（ Ｈｏｅ
ｋｅ＋＋＋ａらｆ１９８５１Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：８５−８９． Ｖｅｌｔ
ｅｎら（１９８４） Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ
３：２７２３−２７３０他）、シかしながら、アグロ
バクテリウム属は双子葉植物と単子葉植物の掻く限られ
た一部にしが感染しないため、イネを始めとする主要穀
物では殆ど形質転換実験は不可能であった。この問題を
解決した技術がエレクトロポレーション法である（ Ｆ
ｒｏｗｎら（１９８６１Ｎａｔｕｒｅ ３１９ニア９１
−７９３他）、コノ方法は単離したプロトプラストに電
気的刺激を与えることにより、細胞表面に極く小さな穴
を開け、そこから遺伝子を取り込ませて形質転換を行う
技術である。この方法が開発されたことにより、イネを
始めとする主要穀物においても形質転換実験がｉ能とな
り、現在盛んに行なわれている。
従来用いられてきたベクター系におけるブ［モーターは
アグロバクテリウム・トウメツアシコンスのＴｉプラス
ミドの遺伝子由来のプロモーターであるか、あるいはカ
リフラワーモザイクづイルス（Ｃａ Ｍ Ｖ ）の遺伝
子由来のプロモーターが殆どである。これらのプロモー
ターは、遺伝９を植物内で効率よく発現させるためのプ
ロモーターとして使用されてきた。しかしながら、こｊ
らのプロモーターは遺伝子導入後の植物の生育輛期や植
物部位に関係なく常に遺伝子を発現させるものであり、
制御することが不可能なプロモーターであった。
アグロバクテリウム・トウメツアシコンスのＴｉプラス
ミドの遺伝子由来のプロモーターであるか、あるいはカ
リフラワーモザイクづイルス（Ｃａ Ｍ Ｖ ）の遺伝
子由来のプロモーターが殆どである。これらのプロモー
ターは、遺伝９を植物内で効率よく発現させるためのプ
ロモーターとして使用されてきた。しかしながら、こｊ
らのプロモーターは遺伝子導入後の植物の生育輛期や植
物部位に関係なく常に遺伝子を発現させるものであり、
制御することが不可能なプロモーターであった。
［発明が解決しようとする課題］
現在、植物細胞に効率よく遺伝子を挿入する技術は完成
されており、遺伝子を発現させるための強力なプロモー
ターが使用されている。しかしながら、実際の植物育種
にあたっては常に遺伝子を発現させているプロモーター
では不都合な而もある。そこで、生育時期特異的にある
いは器官特異的に発現させることのできるプロモーター
や人為的に制御が可能なプロモーターが望まれる。
されており、遺伝子を発現させるための強力なプロモー
ターが使用されている。しかしながら、実際の植物育種
にあたっては常に遺伝子を発現させているプロモーター
では不都合な而もある。そこで、生育時期特異的にある
いは器官特異的に発現させることのできるプロモーター
や人為的に制御が可能なプロモーターが望まれる。
［課題を解決するための手段１
植物の葉緑体のチラコイド膜に存在している集光性クロ
ロフェイルａ ／ ｂ結合タンパク質（以下、ＬＨＣＰ
ＩＩと略すことがある）は光合成系ＴＩの集光性クロロ
フィルを結合した複合タンパク質であり、光合成におい
て重要な役割を果している。その遺伝子は核ＤＮＡにコ
ードされでおり、光によって誘導がかかり葉緑体中で発
現することが知られている。
ロフェイルａ ／ ｂ結合タンパク質（以下、ＬＨＣＰ
ＩＩと略すことがある）は光合成系ＴＩの集光性クロロ
フィルを結合した複合タンパク質であり、光合成におい
て重要な役割を果している。その遺伝子は核ＤＮＡにコ
ードされでおり、光によって誘導がかかり葉緑体中で発
現することが知られている。
本発明者らは、このＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモー
ターを利用することにより、光によって遺伝子発現の誘
導を行なえるのではないか、すなわち、−人為的に遺伝
子発現を誘導できるのではないかと考えＬ ＨＣＰ Ｉ
Ｉの遺伝子をクローニングし、プロモータ一部分の解析
を行なった。そしてこのプロモータ一部分を切り出し大
腸菌由来のＢ−グルクロニダーゼ遺伝子に接続し、この
キメラ遺伝子を植物細胞に導入した。遺伝子導入を行な
った細胞を培養したカルス（細胞塊）やそれより再分化
した植物体では光を照射することによってβ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子が発現することが確認できた。従って、
Ｌ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモーターは光によって誘
導がかけられることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。
ターを利用することにより、光によって遺伝子発現の誘
導を行なえるのではないか、すなわち、−人為的に遺伝
子発現を誘導できるのではないかと考えＬ ＨＣＰ Ｉ
Ｉの遺伝子をクローニングし、プロモータ一部分の解析
を行なった。そしてこのプロモータ一部分を切り出し大
腸菌由来のＢ−グルクロニダーゼ遺伝子に接続し、この
キメラ遺伝子を植物細胞に導入した。遺伝子導入を行な
った細胞を培養したカルス（細胞塊）やそれより再分化
した植物体では光を照射することによってβ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子が発現することが確認できた。従って、
Ｌ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモーターは光によって誘
導がかけられることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち１本発明は、集光性クロロフィルａ ／ ｂ結
合タンパク質遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片を
提供する。
合タンパク質遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片を
提供する。
さらにまた、本発明は、上記本発明のＤＮＡ断片を含む
植物細胞用ベクターを提供する。
植物細胞用ベクターを提供する。
［発明の効果１
本発明により、光解射によって発現を制御できるプロモ
ーターを含む新規なりＮＡ断片及びこれを含む新規な植
物細胞用ベクターが提供された。本発明により開発され
たベクターを用いることにより導入遺伝子を光を昭射す
ることにより発現させることが可能となった。また１葉
で最も発現量が認められることから、遺伝子を発現させ
る部位に特異性を持たせられる可能性も示唆された。従
って、本発明は、植物の遺伝子工学に大いに貢献するも
のと考えられる。
ーターを含む新規なりＮＡ断片及びこれを含む新規な植
物細胞用ベクターが提供された。本発明により開発され
たベクターを用いることにより導入遺伝子を光を昭射す
ることにより発現させることが可能となった。また１葉
で最も発現量が認められることから、遺伝子を発現させ
る部位に特異性を持たせられる可能性も示唆された。従
って、本発明は、植物の遺伝子工学に大いに貢献するも
のと考えられる。
［発明の詳細な説明］
上述のように、本発明のＤＮＡ断片は、ＬＨＣＰ ＩＩ
遺伝子のプロモーターを含む。該プロモーターの由来は
特に限定されないが、下記実施例においてはプロモータ
一部分を含む、イネのＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子が羊離さ
れている。下記実施例において単離されたＬ ＨＣＰ
ＩＩ遺伝子の全構造及びプロモーター領域のＤＮＡ塩基
配列が図１に示されている。枠で囲んだ部分がＬ ＨＣ
Ｐ ＩＩ ｉｉ伝子の構造部分を示す、＋１はＬ ＨＣ
Ｐ Ｉ＋遺伝子の転写開始、６．を、また＋６０のＡＴ
Ｇは成ＰＬＨＣＰＩＩのタンパク質の第１番目のアミノ
酸をコードする塩基配列を表わす。遺伝子の転写に必要
な要素であるＣＡＴボックスとＴＡＴＡボックスはそれ
ぞれ−９１と−２９に認められる。また、−６４には最
近Ｇｒｏｂらによって報告された光感受性ボックスが存
在する（ Ｇｒｏｂら ｆ１９８８１ Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅ５ａｅｒｃｈ ２３： ９９５３−９
９７３１ 、下記実施例におイテは、図１に示される塩
基配列の第一７８５番目から＋５９番目の塩基配列を有
する。Ｄ Ｎ Ａ断片をベクターに組み込んで該ＤＮＡ
断片の下流に存在する外来遺伝子の発現に成功している
ので、プロモーター配列は少なくともこのＤＮＡ断片中
に完全に含まれていることは明らがである。
遺伝子のプロモーターを含む。該プロモーターの由来は
特に限定されないが、下記実施例においてはプロモータ
一部分を含む、イネのＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子が羊離さ
れている。下記実施例において単離されたＬ ＨＣＰ
ＩＩ遺伝子の全構造及びプロモーター領域のＤＮＡ塩基
配列が図１に示されている。枠で囲んだ部分がＬ ＨＣ
Ｐ ＩＩ ｉｉ伝子の構造部分を示す、＋１はＬ ＨＣ
Ｐ Ｉ＋遺伝子の転写開始、６．を、また＋６０のＡＴ
Ｇは成ＰＬＨＣＰＩＩのタンパク質の第１番目のアミノ
酸をコードする塩基配列を表わす。遺伝子の転写に必要
な要素であるＣＡＴボックスとＴＡＴＡボックスはそれ
ぞれ−９１と−２９に認められる。また、−６４には最
近Ｇｒｏｂらによって報告された光感受性ボックスが存
在する（ Ｇｒｏｂら ｆ１９８８１ Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅ５ａｅｒｃｈ ２３： ９９５３−９
９７３１ 、下記実施例におイテは、図１に示される塩
基配列の第一７８５番目から＋５９番目の塩基配列を有
する。Ｄ Ｎ Ａ断片をベクターに組み込んで該ＤＮＡ
断片の下流に存在する外来遺伝子の発現に成功している
ので、プロモーター配列は少なくともこのＤＮＡ断片中
に完全に含まれていることは明らがである。
一般に、特定の機能を有するＤＮＡ配列において、少数
のヌクレオチドが置換し、欠失し又は付加された場合で
あっても実質的に同一の機能を発揮し得る場合があるこ
とは当業者に広く認識されているところである。従って
、図１に示されるＤＮＡ断片中に含まれるプロモーター
のＤＮＡ配列のうち、少数のヌクレオチドが置換し、欠
失し又は付加された配列を有するＤＮＡ断片であっても
、その配列がプロモーターとして機能するのであれば、
その配列は本願特許請求の範囲にいう「プロモーター」
に含まれるものとし、このような配列を含むＤＮＡ断片
は本発明の範囲に含まれるものと解釈するものとする。
のヌクレオチドが置換し、欠失し又は付加された場合で
あっても実質的に同一の機能を発揮し得る場合があるこ
とは当業者に広く認識されているところである。従って
、図１に示されるＤＮＡ断片中に含まれるプロモーター
のＤＮＡ配列のうち、少数のヌクレオチドが置換し、欠
失し又は付加された配列を有するＤＮＡ断片であっても
、その配列がプロモーターとして機能するのであれば、
その配列は本願特許請求の範囲にいう「プロモーター」
に含まれるものとし、このような配列を含むＤＮＡ断片
は本発明の範囲に含まれるものと解釈するものとする。
本発明はさらに、上記本発明のＤＮＡ断片を含む植物細
胞用ベクターを提供する１本発明のベクターは、宿主細
胞内で自律的に複製するための複製開始点と、好ましく
は例えば薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有する
プラスミドに上記本発明のＤＮＡ断片を組み込むことに
よって得ることができる。このようなプラスミドとして
は、植物細胞用のベクターとして公知のもの、例えばｐ
ＢＩｌｏｌ （クローンチック社製）を用いることがで
き、このような公知のベクターのクローニング部位に本
発明のＤＮＡ断片を常法により組み込むことによって本
発明のベクターを得ることができる。下記実施例におい
ては、図１に示す配列の一７８５番目から＋５９番目の
塩基配列を有する断片を上記ｐＢＩ１０１のＸｂａＩ−
Ｂａｍ旧消化物中に組み込むごとによって本発明のベク
ターを構築した１本発明のベクターにおいては、上記本
発明のＤＮＡ断片の下流に所望のタンパク質をコードす
る構造遺伝子が組み込まれる。下記実施例においては、
構造遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝子が挿入さ
れたベクターｐＬＨ／ＧＵＳが得られている。
胞用ベクターを提供する１本発明のベクターは、宿主細
胞内で自律的に複製するための複製開始点と、好ましく
は例えば薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有する
プラスミドに上記本発明のＤＮＡ断片を組み込むことに
よって得ることができる。このようなプラスミドとして
は、植物細胞用のベクターとして公知のもの、例えばｐ
ＢＩｌｏｌ （クローンチック社製）を用いることがで
き、このような公知のベクターのクローニング部位に本
発明のＤＮＡ断片を常法により組み込むことによって本
発明のベクターを得ることができる。下記実施例におい
ては、図１に示す配列の一７８５番目から＋５９番目の
塩基配列を有する断片を上記ｐＢＩ１０１のＸｂａＩ−
Ｂａｍ旧消化物中に組み込むごとによって本発明のベク
ターを構築した１本発明のベクターにおいては、上記本
発明のＤＮＡ断片の下流に所望のタンパク質をコードす
る構造遺伝子が組み込まれる。下記実施例においては、
構造遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝子が挿入さ
れたベクターｐＬＨ／ＧＵＳが得られている。
次に、上記本発明のＤＮＡ断片及びベクターの調製方法
をイネを例にとって説明する。なお。
をイネを例にとって説明する。なお。
本発明のＤＮＡ断片の調製方法は下記のものに限定され
るものではない。
るものではない。
先ず、イネのｃＤＮＡライブラリーを作製する。イネの
場合１例えば発芽後約２週間経過した芽生えより全ＲＮ
Ａを抽出することが好ましい。
場合１例えば発芽後約２週間経過した芽生えより全ＲＮ
Ａを抽出することが好ましい。
全ＲＮＡよりｍＲＮＡのみを単離し、市販のキット等を
用いた常法によりｃＤＮＡを合成する０合成したｃＤＮ
Ａを例えば大腸菌用のクローニングベクターに接続しｃ
ＤＮＡライブラリへを完成させる。
用いた常法によりｃＤＮＡを合成する０合成したｃＤＮ
Ａを例えば大腸菌用のクローニングベクターに接続しｃ
ＤＮＡライブラリへを完成させる。
Ｌ ＨＣＰ １１遺伝子に特異的な配列をプローブとし
て合成し、コロニーハイブリダイゼーションによってス
クリーニングしＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のＣＤＮＡを得
ることができる。
て合成し、コロニーハイブリダイゼーションによってス
クリーニングしＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のＣＤＮＡを得
ることができる。
次に暗所発芽させたイネよりＣＴＡＢ法（Ｐｌａｎｔ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８５１５
：６９）によってＤＮＡを抽出し、大腸菌のクローニン
グ用のベクターに接続し、イネのゲノミックライブラリ
ーを作製することができる。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８５１５
：６９）によってＤＮＡを抽出し、大腸菌のクローニン
グ用のベクターに接続し、イネのゲノミックライブラリ
ーを作製することができる。
Ｌ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとしてゲ
ノミックライブラリーをスクリーニングし、イネのＬ
ＨＣＰ ＩＩ遺伝子を単離することができる。
ノミックライブラリーをスクリーニングし、イネのＬ
ＨＣＰ ＩＩ遺伝子を単離することができる。
プロモーターとしての活性についての検討は次のように
実験を行なえばよい６例えば、プロモーター活性を持つ
と考えられる部分をβ−グルクロニダーゼ（ＧＬＩＳ）
遺伝子の５°側上流に接続する。β−グルクロニダーゼ
は本来植物には存在せず、４−メチルウンベリフェロン
（４−ＭＵ）にグルクロン酸が結合した４−ＭＵＧを基
質として反応し、その反応生成物４−ＭＵが強い蛍光を
発することにより定量できる（ Ｒｉｃｈａｒｄらｆ１
９８９ｉ Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ ６： ３
９０１−３９０７）、 Ｌ ＨＣＰ■遺伝子のプロモー
ターとＧＵＳ遺伝子を植物細胞用ベクターに組み込んだ
組換えプラスミドを植物のプロトプラストにエレクトロ
ポレーション法により導入する。導入した植物細胞は培
養後、ベクターの選択マーカーに従って選抜する。
実験を行なえばよい６例えば、プロモーター活性を持つ
と考えられる部分をβ−グルクロニダーゼ（ＧＬＩＳ）
遺伝子の５°側上流に接続する。β−グルクロニダーゼ
は本来植物には存在せず、４−メチルウンベリフェロン
（４−ＭＵ）にグルクロン酸が結合した４−ＭＵＧを基
質として反応し、その反応生成物４−ＭＵが強い蛍光を
発することにより定量できる（ Ｒｉｃｈａｒｄらｆ１
９８９ｉ Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ ６： ３
９０１−３９０７）、 Ｌ ＨＣＰ■遺伝子のプロモー
ターとＧＵＳ遺伝子を植物細胞用ベクターに組み込んだ
組換えプラスミドを植物のプロトプラストにエレクトロ
ポレーション法により導入する。導入した植物細胞は培
養後、ベクターの選択マーカーに従って選抜する。
例えば、本発明のプロモーター含有ＤＮＡ断片をＧＵＳ
遺伝子を有するｐＢｌｌ［１１に組み込んだ場合には、
ｐＢｌｌｏｌのカナマイシン耐性に基づいて選抜するこ
とができる。すなわち、ｐＢＩｌｏｌにはＮＰＴＩＩ遺
伝子も含まれており、この酵素が合成されるとカナマイ
シンに対して耐性となる。従って、カナマイシン存在下
で生き残る細胞はＬＨＣＰＩＩプロモーターとＧＵＳ遺
伝子のキメラ遺伝子を持つ可能性が高くなる。
遺伝子を有するｐＢｌｌ［１１に組み込んだ場合には、
ｐＢｌｌｏｌのカナマイシン耐性に基づいて選抜するこ
とができる。すなわち、ｐＢＩｌｏｌにはＮＰＴＩＩ遺
伝子も含まれており、この酵素が合成されるとカナマイ
シンに対して耐性となる。従って、カナマイシン存在下
で生き残る細胞はＬＨＣＰＩＩプロモーターとＧＵＳ遺
伝子のキメラ遺伝子を持つ可能性が高くなる。
このようにして外来遺伝子を有すると考えられるカルス
（細胞塊）より常法に基づき植物体を再分化させる。再
分化した植物体を光条件下で遺伝子を発現させ、その植
物体を葉、茎、花弁及び根の各器官ごとにＧＵＳ活性を
測定することにより、いずれの植物体においても葉で最
も大きな発現量が確認される。従って、Ｌ ＨＣＰ Ｉ
Ｉプロモーターは光存在下において遺伝子を発現させる
ことが可能であり、その発現する場所も葉等の光合成器
官の存在する部位に発現しやすいことが確認される。
（細胞塊）より常法に基づき植物体を再分化させる。再
分化した植物体を光条件下で遺伝子を発現させ、その植
物体を葉、茎、花弁及び根の各器官ごとにＧＵＳ活性を
測定することにより、いずれの植物体においても葉で最
も大きな発現量が確認される。従って、Ｌ ＨＣＰ Ｉ
Ｉプロモーターは光存在下において遺伝子を発現させる
ことが可能であり、その発現する場所も葉等の光合成器
官の存在する部位に発現しやすいことが確認される。
従って、本発明によるＬＨＣＰＩＩ遺伝子のプロモータ
ーを利用することにより、光によって遺伝子が発現誘導
できる。また、葉等の光合成器官を有する部位に発現し
やすいことから器官特異的に遺伝子を発現させることが
できる可能性も示唆された。
ーを利用することにより、光によって遺伝子が発現誘導
できる。また、葉等の光合成器官を有する部位に発現し
やすいことから器官特異的に遺伝子を発現させることが
できる可能性も示唆された。
なお、下記実施例において得られたＬ）ＩＣＰ■プロモ
ーターはイネを始めとする単子葉のみでなく、タバコ等
の双子葉植物においても発現可能なプロモーターであっ
た。
ーターはイネを始めとする単子葉のみでなく、タバコ等
の双子葉植物においても発現可能なプロモーターであっ
た。
［実施例］
本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の実
施例はこれらに限られるものではない、なお、下記実施
例において特に断わらない限り、各操作は、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ に記載され
た方法に基づいて行なった。
施例はこれらに限られるものではない、なお、下記実施
例において特に断わらない限り、各操作は、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ に記載され
た方法に基づいて行なった。
先ず、芽生えより以下の方法によりｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。すなわち、芽生え後２週間経過した芽生
え３０ｇよりグアニジンチオシアネート法により全ＲＮ
Ａを抽出した。抽出した全ＲＮＡよりオリゴｄＴセルロ
ースカラムによりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは全Ｒ
ＮＡのほぼ１．５％の収量であった。ｍＲＮＡよりｃＤ
ＮＡの合成は市販の合成キット（アマジャム社製）を使
用した１合成したｃＤＮＡは市販の大腸菌用クローニン
グベクターであるｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位に接続し、
大腸菌を形質転換することによりｃ ＤＮＡライブラリ
ーを得た。
ーを作製した。すなわち、芽生え後２週間経過した芽生
え３０ｇよりグアニジンチオシアネート法により全ＲＮ
Ａを抽出した。抽出した全ＲＮＡよりオリゴｄＴセルロ
ースカラムによりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは全Ｒ
ＮＡのほぼ１．５％の収量であった。ｍＲＮＡよりｃＤ
ＮＡの合成は市販の合成キット（アマジャム社製）を使
用した１合成したｃＤＮＡは市販の大腸菌用クローニン
グベクターであるｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位に接続し、
大腸菌を形質転換することによりｃ ＤＮＡライブラリ
ーを得た。
次に、既知のＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子の構造部分より１
７塩基の合成プローブ（塩基配列： ＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＧＣＡＧＴＧＧＡＴ）を作製し、コロニーハイブリタイ
ゼーション法によってポジティブクローンを得た。これ
を解析したところ既知のＬＨＣＰＩＴ遺伝子の構造と類
似しており、イネのＬＨＣＰＩＩ遺伝子と断定した。
７塩基の合成プローブ（塩基配列： ＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＧＣＡＧＴＧＧＡＴ）を作製し、コロニーハイブリタイ
ゼーション法によってポジティブクローンを得た。これ
を解析したところ既知のＬＨＣＰＩＴ遺伝子の構造と類
似しており、イネのＬＨＣＰＩＩ遺伝子と断定した。
次に、ゲノミッタライブラリーを作製した。
すなわち、暗所で発芽させて１週間経過したイネの芽生
え３０ｇよりＣＴＡＢ法（ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８５１５：６］によってＤ
ＮＡを抽出した。ＤＮＡｌ０μｇを制限酵素５ａｕ３Ａ
Ｉ（宝酒造社製）によって部分分解した。これをベクタ
ーＥＭＢＬ３ （ストクー２９〜２社製）のＢａｍＨＩ
部位に接続し、大腸菌に感染させてゲノミックライブラ
リーを作製した。
え３０ｇよりＣＴＡＢ法（ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８５１５：６］によってＤ
ＮＡを抽出した。ＤＮＡｌ０μｇを制限酵素５ａｕ３Ａ
Ｉ（宝酒造社製）によって部分分解した。これをベクタ
ーＥＭＢＬ３ （ストクー２９〜２社製）のＢａｍＨＩ
部位に接続し、大腸菌に感染させてゲノミックライブラ
リーを作製した。
ｃＤＮＡの一部（５°側非翻訳領域から成熟タンパク質
のＮ末端まで含む約２６０塩基）をプローブとして用い
て、ゲノミックライブラリーのスクリーニングを行ない
、４つのポジティブクローンを得たにれらの塩基配列を
デイデオキシ法に従って決定したところ、いずれも同じ
配列を有するＬＨＣＰＩＩ遺伝子であると確認できた１
図１に示したものがそのＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子及びそ
のプロモーター領域の塩基配列である。
のＮ末端まで含む約２６０塩基）をプローブとして用い
て、ゲノミックライブラリーのスクリーニングを行ない
、４つのポジティブクローンを得たにれらの塩基配列を
デイデオキシ法に従って決定したところ、いずれも同じ
配列を有するＬＨＣＰＩＩ遺伝子であると確認できた１
図１に示したものがそのＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子及びそ
のプロモーター領域の塩基配列である。
次に、Ｌ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモーターの活性を
検討するためにＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモータ一
部位を切り出し、ＧＵＳ遺伝子に接続した。
検討するためにＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモータ一
部位を切り出し、ＧＵＳ遺伝子に接続した。
すなわち、図１に示す配列の一７８５番目から＋５９番
目までの部分をＰＣＲ法（５ａｉｋｉら、ｆ１９８８１
．５ｃｉｅｎｃｅ ２３９： ４８２−４９１１ によ
って増幅し、−７８５側には制限酵素ＸｂａＩのリンカ
−を、＋５９側には制限酵素ＢａｍＨＩのリンカ−を接
続した０次に、ｐＢｌｌｏｌのＸｂａＩ部位とＢａｍＨ
Ｉ部位をそれぞれ制限酵素で切断し、この部分にＬ Ｈ
ＣＰ ＩＩ遺伝子の上記プロモーター含有断片（ＬＨＣ
Ｐ−ｐｒｏ）を接続した（プラスミドｐＬＨ／ＧＵＳ）
、得られたプラスミドｐＬ Ｈ／Ｇ Ｕ Ｓの部分遺伝
子地図を図２に示す、このプラスミドｐ Ｌ Ｈ／ Ｇ
Ｕ Ｓを用いて次の形質転換実験を行ない形質転換植
物のＧＵＳ活性を検定した。
目までの部分をＰＣＲ法（５ａｉｋｉら、ｆ１９８８１
．５ｃｉｅｎｃｅ ２３９： ４８２−４９１１ によ
って増幅し、−７８５側には制限酵素ＸｂａＩのリンカ
−を、＋５９側には制限酵素ＢａｍＨＩのリンカ−を接
続した０次に、ｐＢｌｌｏｌのＸｂａＩ部位とＢａｍＨ
Ｉ部位をそれぞれ制限酵素で切断し、この部分にＬ Ｈ
ＣＰ ＩＩ遺伝子の上記プロモーター含有断片（ＬＨＣ
Ｐ−ｐｒｏ）を接続した（プラスミドｐＬＨ／ＧＵＳ）
、得られたプラスミドｐＬ Ｈ／Ｇ Ｕ Ｓの部分遺伝
子地図を図２に示す、このプラスミドｐ Ｌ Ｈ／ Ｇ
Ｕ Ｓを用いて次の形質転換実験を行ない形質転換植
物のＧＵＳ活性を検定した。
タバコの葉より常法に基づきプロトプラストを調製した
。プロトプラストを精製した後に２×１０５個／ｍｌの
濃度に緩衝液に懸濁した。この溶液に図２に示す構造を
持つｐＬＨ／ＧＵＳプラスミドＤＮＡを２０μｇ／ａｌ
の濃度で加えた。この懸濁液をエレクトロポレーション
用の容器に移し電気刺激を与えた後、プロトプラストを
回収しＭＳ培地で培養した。培養開始後１週間してカナ
マイシンを５０ＬＬｇ／■■の濃度で培地に添加し、さ
らに細胞を増殖させた。カルスが径５〜１０■腸になっ
た時点で植物ホルモンフリーの培地に移植し再分化させ
た。このようにして再分化した植物体の葉、茎、花弁、
根についてＲｉｃｈａｒｄらの方法に従ってＧＵＳ遺伝
子の発現量を測定した。具体的にはＧＵＳ遺伝子の産物
である酵素が４ＭＵＧを分解した産物の４ＭＵの蛍光を
測定することになる。
。プロトプラストを精製した後に２×１０５個／ｍｌの
濃度に緩衝液に懸濁した。この溶液に図２に示す構造を
持つｐＬＨ／ＧＵＳプラスミドＤＮＡを２０μｇ／ａｌ
の濃度で加えた。この懸濁液をエレクトロポレーション
用の容器に移し電気刺激を与えた後、プロトプラストを
回収しＭＳ培地で培養した。培養開始後１週間してカナ
マイシンを５０ＬＬｇ／■■の濃度で培地に添加し、さ
らに細胞を増殖させた。カルスが径５〜１０■腸になっ
た時点で植物ホルモンフリーの培地に移植し再分化させ
た。このようにして再分化した植物体の葉、茎、花弁、
根についてＲｉｃｈａｒｄらの方法に従ってＧＵＳ遺伝
子の発現量を測定した。具体的にはＧＵＳ遺伝子の産物
である酵素が４ＭＵＧを分解した産物の４ＭＵの蛍光を
測定することになる。
結果を表１に示す０表１にも明らかなように、各固体に
よる差があるものの、いずれにおいても葉においてＧＵ
Ｓ遺伝子の発現量が最も多かった。
よる差があるものの、いずれにおいても葉においてＧＵ
Ｓ遺伝子の発現量が最も多かった。
図１は、イネのＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子の全構造と５°
側（プロモータ一部分）のＤＮＡ配列を示す。 図２は、図１に示したＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモ
ータ一部分を切り出し、植物ベクターであるｐＢＩｌｏ
ｌに含まれるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の
上流に接続することにより構築したプラスミドｐ Ｌ
Ｈ／ Ｇ ｔＪ Ｓの遺伝子地図を示す。
側（プロモータ一部分）のＤＮＡ配列を示す。 図２は、図１に示したＬ ＨＣＰ ＩＩ遺伝子のプロモ
ータ一部分を切り出し、植物ベクターであるｐＢＩｌｏ
ｌに含まれるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の
上流に接続することにより構築したプラスミドｐ Ｌ
Ｈ／ Ｇ ｔＪ Ｓの遺伝子地図を示す。
Claims (4)
- （１）集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子
のプロモーターを含むＤＮＡ断片。 - （２）イネ由来のものである請求項１記載のＤＮＡ断片
。 - （３）図１に示す塩基配列の第−７８５番目から＋５９
番目の塩基配列を有する請求項２記載のＤＮＡ断片。 - （４）請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＤＮＡ
断片を含む植物細胞用ベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2075774A JPH07108227B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2075774A JPH07108227B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03277291A true JPH03277291A (ja) | 1991-12-09 |
| JPH07108227B2 JPH07108227B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=13585892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2075774A Expired - Fee Related JPH07108227B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108227B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000015812A1 (en) * | 1998-09-10 | 2000-03-23 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Dna fragment having promoter function |
| WO2000015811A1 (en) * | 1998-09-10 | 2000-03-23 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Dna fragment having promoter function |
-
1990
- 1990-03-27 JP JP2075774A patent/JPH07108227B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS=1987 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000015812A1 (en) * | 1998-09-10 | 2000-03-23 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Dna fragment having promoter function |
| WO2000015811A1 (en) * | 1998-09-10 | 2000-03-23 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Dna fragment having promoter function |
| US6812381B2 (en) | 1998-09-10 | 2004-11-02 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | DNA fragment having promoter function |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07108227B2 (ja) | 1995-11-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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| R350 | Written notification of registration of transfer |
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