JPH07108227B2 - 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター - Google Patents
光合成関連遺伝子及びそのプロモーターInfo
- Publication number
- JPH07108227B2 JPH07108227B2 JP2075774A JP7577490A JPH07108227B2 JP H07108227 B2 JPH07108227 B2 JP H07108227B2 JP 2075774 A JP2075774 A JP 2075774A JP 7577490 A JP7577490 A JP 7577490A JP H07108227 B2 JPH07108227 B2 JP H07108227B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- lhcp
- present
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 35
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 title description 3
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 title description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 101710195281 Chlorophyll a-b binding protein Proteins 0.000 description 27
- 101710143415 Chlorophyll a-b binding protein 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 27
- 101710181042 Chlorophyll a-b binding protein 1A, chloroplastic Proteins 0.000 description 27
- 101710091905 Chlorophyll a-b binding protein 2, chloroplastic Proteins 0.000 description 27
- 101710095244 Chlorophyll a-b binding protein 3, chloroplastic Proteins 0.000 description 27
- 101710127489 Chlorophyll a-b binding protein of LHCII type 1 Proteins 0.000 description 27
- 101710184917 Chlorophyll a-b binding protein of LHCII type I, chloroplastic Proteins 0.000 description 27
- 101710102593 Chlorophyll a-b binding protein, chloroplastic Proteins 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 22
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- ARQXEQLMMNGFDU-UHFFFAOYSA-N 4MUG Natural products C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O ARQXEQLMMNGFDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 4-methylumbelliferone beta-D-glucuronide Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108010034715 Light-Harvesting Protein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002377 thylakoid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、植物の光合成に関する集光性クロロフィルa/
b結合タンパク質の遺伝子及びそのプロモーターに関す
るものであり、遺伝子組替えを利用した植物の新品種の
開発や代謝産物を生産させる培養細胞の改変に利用され
る。
b結合タンパク質の遺伝子及びそのプロモーターに関す
るものであり、遺伝子組替えを利用した植物の新品種の
開発や代謝産物を生産させる培養細胞の改変に利用され
る。
［従来の技術］ 近年、植物でも遺伝子組み換え技術の利用が可能にな
り、特に双子葉植物での研究が活発に行なわれている。
中でも土壌細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエン
スのT1プラスミドを利用したベクター系がいくつか作製
され、植物の形質転換実験に用いられてきた（Hoekema
ら（1985）Plant Molecular Biology 5:85−89。Velten
ら（1984）The EMBO Journal 3:2723−2730他）。しか
しながら、アグロバクテリウム属は双子葉植物と単子葉
植物の極く限られた一部にしか感染しないため、イネを
始めとする主要穀物では殆ど形質転換実験は不可能であ
った。この問題を解決した技術がエレクトロポレーショ
ン法である（Frommら（1986）Nature 319:791−793
他）。この方法は単離したプロトプラストに電気的刺激
を与えることにより、細胞表面に極く小さな穴を開け、
そこから遺伝子を取り込ませて形質転換を行う技術であ
る。この方法が開発されたことにより、イネを始めとす
る主要穀物においても形質転換実験が可能となり、現在
盛んに行なわれている。
り、特に双子葉植物での研究が活発に行なわれている。
中でも土壌細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエン
スのT1プラスミドを利用したベクター系がいくつか作製
され、植物の形質転換実験に用いられてきた（Hoekema
ら（1985）Plant Molecular Biology 5:85−89。Velten
ら（1984）The EMBO Journal 3:2723−2730他）。しか
しながら、アグロバクテリウム属は双子葉植物と単子葉
植物の極く限られた一部にしか感染しないため、イネを
始めとする主要穀物では殆ど形質転換実験は不可能であ
った。この問題を解決した技術がエレクトロポレーショ
ン法である（Frommら（1986）Nature 319:791−793
他）。この方法は単離したプロトプラストに電気的刺激
を与えることにより、細胞表面に極く小さな穴を開け、
そこから遺伝子を取り込ませて形質転換を行う技術であ
る。この方法が開発されたことにより、イネを始めとす
る主要穀物においても形質転換実験が可能となり、現在
盛んに行なわれている。
従来用いられてきたベクター系におけるプロモーターは
アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのTiプラスミ
ドの遺伝子由来のプロモーターであるか、あるいはカリ
フルワーモザイクウイルス（CaMV）の遺伝子由来のプロ
モーターが殆どである。これらのプローモーターは、遺
伝子を植物内で効率よく発現させるためのプロモーター
として使用されてきた。しかしながら、これらのプロモ
ーターは遺伝子導入後の植物を生育時期や植物部位に関
係なく常に遺伝子を発現させるものであり、制御するこ
とが不可能なプロモーターであった。
アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのTiプラスミ
ドの遺伝子由来のプロモーターであるか、あるいはカリ
フルワーモザイクウイルス（CaMV）の遺伝子由来のプロ
モーターが殆どである。これらのプローモーターは、遺
伝子を植物内で効率よく発現させるためのプロモーター
として使用されてきた。しかしながら、これらのプロモ
ーターは遺伝子導入後の植物を生育時期や植物部位に関
係なく常に遺伝子を発現させるものであり、制御するこ
とが不可能なプロモーターであった。
［発明が解決しようとする課題］ 現在、植物細胞に効率よく遺伝子を挿入する技術は完成
されており、遺伝子を発現させるための強力なプローモ
ーターが使用されている。しかしながら、実際の植物育
種にあたっては常に遺伝子を発現させているプロモータ
ーでは不都合な面もある。そこで、生育時期特異的にあ
るいは器官特異的に発現させることのできるプロモータ
ーや人為的に制御が可能なプロモーターが望まれる。
されており、遺伝子を発現させるための強力なプローモ
ーターが使用されている。しかしながら、実際の植物育
種にあたっては常に遺伝子を発現させているプロモータ
ーでは不都合な面もある。そこで、生育時期特異的にあ
るいは器官特異的に発現させることのできるプロモータ
ーや人為的に制御が可能なプロモーターが望まれる。
［課題を解決するための手段］ 植物の葉緑体のチラコイド膜に存在している集光性クロ
ロフェイルa/b結合タンパク質（以下、LHCP IIと略すこ
とがある）は光合成系IIの集光性クロロフィルを結合し
た複合タンパク質であり、光合成において重要な役割を
果している。その遺伝子は核DNAにコードされており、
光によって誘導がかかり葉緑体中で発現することが知ら
れている。
ロフェイルa/b結合タンパク質（以下、LHCP IIと略すこ
とがある）は光合成系IIの集光性クロロフィルを結合し
た複合タンパク質であり、光合成において重要な役割を
果している。その遺伝子は核DNAにコードされており、
光によって誘導がかかり葉緑体中で発現することが知ら
れている。
本発明者らは、このLHCP II遺伝子のプロモーターを利
用することにより、光によって遺伝子発現の誘導を岡な
えるのではないか、すなわち、人為的に遺伝子発現を誘
導できるのではないかと考えLHCP IIの遺伝子をクロー
ニングし、プロモーター部分の解析を行なった。そして
このプロモーター部分を切り出し大腸菌由来のβ−グル
クロニダーゼ遺伝子に接続し、このキメラ遺伝子を植物
相貌に導入した。遺伝子導入を行なった細胞を培養した
カルス（細胞塊）やそれより再分化した植物体では光を
照射することによってβ−グルクロニダーゼ遺伝子が発
現することが確認できた。従ってLHCP II遺伝子のプロ
モーターは光によって誘導がかけられることを確認し、
本発明を完成するに至った。
用することにより、光によって遺伝子発現の誘導を岡な
えるのではないか、すなわち、人為的に遺伝子発現を誘
導できるのではないかと考えLHCP IIの遺伝子をクロー
ニングし、プロモーター部分の解析を行なった。そして
このプロモーター部分を切り出し大腸菌由来のβ−グル
クロニダーゼ遺伝子に接続し、このキメラ遺伝子を植物
相貌に導入した。遺伝子導入を行なった細胞を培養した
カルス（細胞塊）やそれより再分化した植物体では光を
照射することによってβ−グルクロニダーゼ遺伝子が発
現することが確認できた。従ってLHCP II遺伝子のプロ
モーターは光によって誘導がかけられることを確認し、
本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の塩基配列を有するDNA断片
又はプロモーター活性を有するその一部から成るDNA断
片を提供する。
又はプロモーター活性を有するその一部から成るDNA断
片を提供する。
さらにまた、本発明は、上記本発明のDNA断片を含む植
物細胞用ベクターを提供する。
物細胞用ベクターを提供する。
［発明の効果］ 本発明により、光照射によって発現を制御できるプロモ
ーターを含む新規なDNA断片及びこれを含む新規な植物
細胞用ベクターが提供された。本発明により開発された
ベクターを用いることにより導入遺伝子を光を照射する
ことにより発現させることが可能となった。また、葉で
最も発現量が認められることから、遺伝子を発現させる
部位に特異性を持たせられる可能性も示唆された。従っ
て、本発明は、植物の遺伝子工学に大いに貢献するもの
と考えられる。
ーターを含む新規なDNA断片及びこれを含む新規な植物
細胞用ベクターが提供された。本発明により開発された
ベクターを用いることにより導入遺伝子を光を照射する
ことにより発現させることが可能となった。また、葉で
最も発現量が認められることから、遺伝子を発現させる
部位に特異性を持たせられる可能性も示唆された。従っ
て、本発明は、植物の遺伝子工学に大いに貢献するもの
と考えられる。
［発明の具体的説明］ 上述のように、本発明のDNA断片は、LHCP II遺伝子のプ
ロモーターを含む。該プロモーターの由来は特に限定さ
れないが、下記実施例においてはプロモーター部分を含
む、イネのLHCP II遺伝子が単離されている。下記実施
例において単離されたLHCP II遺伝子の全構造及びプロ
モーター領域のDNA塩基配列が図１に示されている。枠
で囲んだ部分がLHCP II遺伝子の構造部分を示す。＋１
はLHCP II遺伝子の転写開始点を、また＋60のATGは成熟
LHCP IIのタンパク質の第１番目のアミノ酸をコードす
る塩基配列を表わす。遺伝子の転写に必要な要素である
CATボックスとTATAボックスはそれぞれ−91と−29に認
められる。また、−64には最近Grobらによって報告され
た光感受性ボックスが存在する（Grobら（1988）Nuclei
c Acids Resaerch 23:9953−9973）。下記実施例におい
ては、図１に示される塩基配列の第−785番目から＋59
番目の塩基配列を有するDNA断片をベクターに組み込ん
で該DNA断片の下流に存在する外来遺伝子の発現に成功
しているので、プロモーター配列は少なくともこのDNA
断片中に完全に含まれていることは明らかである。
ロモーターを含む。該プロモーターの由来は特に限定さ
れないが、下記実施例においてはプロモーター部分を含
む、イネのLHCP II遺伝子が単離されている。下記実施
例において単離されたLHCP II遺伝子の全構造及びプロ
モーター領域のDNA塩基配列が図１に示されている。枠
で囲んだ部分がLHCP II遺伝子の構造部分を示す。＋１
はLHCP II遺伝子の転写開始点を、また＋60のATGは成熟
LHCP IIのタンパク質の第１番目のアミノ酸をコードす
る塩基配列を表わす。遺伝子の転写に必要な要素である
CATボックスとTATAボックスはそれぞれ−91と−29に認
められる。また、−64には最近Grobらによって報告され
た光感受性ボックスが存在する（Grobら（1988）Nuclei
c Acids Resaerch 23:9953−9973）。下記実施例におい
ては、図１に示される塩基配列の第−785番目から＋59
番目の塩基配列を有するDNA断片をベクターに組み込ん
で該DNA断片の下流に存在する外来遺伝子の発現に成功
しているので、プロモーター配列は少なくともこのDNA
断片中に完全に含まれていることは明らかである。
一般に、特定の機能を有するDNA配列において、少数の
ヌクレオチドが置換し、欠失し又は付加された場合であ
っても実質的に同一の機能を発揮し得る場合があること
は当業者に広く認識されているところである。従って、
図１に示されるDNA断片中に含まれるプロモーターのDNA
配列のうち、少数のヌクレオチドが置換し、欠失し又は
付加された配列を有するDNA断片であっても、その配列
がプロモーターとして機能するのであれば、その配列は
本願特許請求の範囲にいう「プロモーター」に含まれる
ものとし、このような配列を含むDNA断片は本発明の範
囲に含まれるものと解釈するものとする。
ヌクレオチドが置換し、欠失し又は付加された場合であ
っても実質的に同一の機能を発揮し得る場合があること
は当業者に広く認識されているところである。従って、
図１に示されるDNA断片中に含まれるプロモーターのDNA
配列のうち、少数のヌクレオチドが置換し、欠失し又は
付加された配列を有するDNA断片であっても、その配列
がプロモーターとして機能するのであれば、その配列は
本願特許請求の範囲にいう「プロモーター」に含まれる
ものとし、このような配列を含むDNA断片は本発明の範
囲に含まれるものと解釈するものとする。
本発明はさらに、上記本発明のDNA断片を含む植物細胞
用ベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞
内で自律的に複製するための複製開始点と、好ましくは
例えば薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有するプ
ラスミドに上記本発明のDNA断片を組み込むことによっ
て得ることができる。このようなプラスミドとしては、
植物細胞用のベクターとして公知のもの、例えばpBI101
（クローンテック社製）を用いることができ、このよう
な公知のベクターのクローニング部位に本発明のDNA断
片を常法により組み込むことによって本発明のベクター
を得ることができる。下記実施例においては、図１に示
す配列の−785番目の＋59番目の塩基配列を有する断片
を上記pBI101のXbaＩ−BamHI消化物中に組み込むことに
よって本発明のベクターを構築した。本発明のベクター
においては、上記本発明のDNA断片の下流に所望のタン
パク質をコードする構造遺伝子が組み込まれる。下記実
施例においては、構造遺伝子としてβ−グルクロニダー
ゼ遺伝子が挿入されたベクターpLH/GUSが得られてい
る。
用ベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞
内で自律的に複製するための複製開始点と、好ましくは
例えば薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有するプ
ラスミドに上記本発明のDNA断片を組み込むことによっ
て得ることができる。このようなプラスミドとしては、
植物細胞用のベクターとして公知のもの、例えばpBI101
（クローンテック社製）を用いることができ、このよう
な公知のベクターのクローニング部位に本発明のDNA断
片を常法により組み込むことによって本発明のベクター
を得ることができる。下記実施例においては、図１に示
す配列の−785番目の＋59番目の塩基配列を有する断片
を上記pBI101のXbaＩ−BamHI消化物中に組み込むことに
よって本発明のベクターを構築した。本発明のベクター
においては、上記本発明のDNA断片の下流に所望のタン
パク質をコードする構造遺伝子が組み込まれる。下記実
施例においては、構造遺伝子としてβ−グルクロニダー
ゼ遺伝子が挿入されたベクターpLH/GUSが得られてい
る。
次に、上記本発明のDNA断片及びベクターの調製方法を
イネを例にとって説明する。なお、本発明のDNA断片の
調製方法は下記のものに限定されるものではない。
イネを例にとって説明する。なお、本発明のDNA断片の
調製方法は下記のものに限定されるものではない。
先ず、イネのcDNAライブラリーを作製する。イネの場
合、例えば発芽後約２週間経過した芽生えより全RNAを
抽出することが好ましい。全RNAよりmRNAのみを単離
し、市販のキット等を用いた常法によりcDNAを合成す
る。合成したcDNAを例えば大腸菌用のクローニングベク
ターに接続しcDNAライブラリーを完成させる。
合、例えば発芽後約２週間経過した芽生えより全RNAを
抽出することが好ましい。全RNAよりmRNAのみを単離
し、市販のキット等を用いた常法によりcDNAを合成す
る。合成したcDNAを例えば大腸菌用のクローニングベク
ターに接続しcDNAライブラリーを完成させる。
LHCP II遺伝子に特異的な配列をプローブとして合成
し、コロニーハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングしLHCP II遺伝子のcDNAを得ることができる。
し、コロニーハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングしLHCP II遺伝子のcDNAを得ることができる。
次に暗所発芽させたイネよりCTAB法（Plant Molecular
Biology（1985）5:69）によってDNAを抽出し、大腸菌の
クローニング用のベクターに接続し、イネのゲノミック
ライブラリーを作製することができる。
Biology（1985）5:69）によってDNAを抽出し、大腸菌の
クローニング用のベクターに接続し、イネのゲノミック
ライブラリーを作製することができる。
LHCP II遺伝子のcDNAをプローブとしてゲノミックライ
ブラリーをスクリーニングし、イネのLHCP II遺伝子を
単離することができる。
ブラリーをスクリーニングし、イネのLHCP II遺伝子を
単離することができる。
プロモーターとしての活性についての検討は次のように
実験を行なえばよい。例えば、プロモーター活性を持つ
と考えられる部分をβ−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝
子の５′側上流に接続する。β−グルクロニダーゼは本
来植物には存在せず、４−メチルウンベリフェロン（４
−MU）にグルクロン酸が結合した４−MUGを基質として
反応し、その反応生成物４−MUが強い蛍光を発すること
により定量できる（Richardら（1986）The EMBO Journa
l 6:3901−3907）。LHCP II遺伝子のプロモーターとGUS
遺伝子を植物細胞用ベクターに組み込んだ組換えプラス
ミドを植物のプロトプラストにエレクトロポレーション
法により導入する。導入した植物細胞は培養後、ベクタ
ーの選択マーカーに従って選抜する。例えば、本発明の
プロモーター含有DNA断片を、GUS遺伝子を有するpBI101
に組み込んだ場合には、pBI101のカナマイシン耐性に基
づいて選抜することができる。すなわち、pBI101にはNP
T II遺伝子も含まれており、この酵素が合成されるとカ
ナマイシンに対して耐性となる。従って、カナマイシン
存在下で生き残る細胞はLHCP IIプロモーターとGUS遺伝
子のキメラ遺伝子を持つ可能性が高くなる。
実験を行なえばよい。例えば、プロモーター活性を持つ
と考えられる部分をβ−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝
子の５′側上流に接続する。β−グルクロニダーゼは本
来植物には存在せず、４−メチルウンベリフェロン（４
−MU）にグルクロン酸が結合した４−MUGを基質として
反応し、その反応生成物４−MUが強い蛍光を発すること
により定量できる（Richardら（1986）The EMBO Journa
l 6:3901−3907）。LHCP II遺伝子のプロモーターとGUS
遺伝子を植物細胞用ベクターに組み込んだ組換えプラス
ミドを植物のプロトプラストにエレクトロポレーション
法により導入する。導入した植物細胞は培養後、ベクタ
ーの選択マーカーに従って選抜する。例えば、本発明の
プロモーター含有DNA断片を、GUS遺伝子を有するpBI101
に組み込んだ場合には、pBI101のカナマイシン耐性に基
づいて選抜することができる。すなわち、pBI101にはNP
T II遺伝子も含まれており、この酵素が合成されるとカ
ナマイシンに対して耐性となる。従って、カナマイシン
存在下で生き残る細胞はLHCP IIプロモーターとGUS遺伝
子のキメラ遺伝子を持つ可能性が高くなる。
このようにして外来遺伝子を有すると考えられるカルス
（細胞塊）より常法に基づき植物体を再分化させる。再
分化した植物体を光条件下で遺伝子を発現させ、その植
物体を葉、茎、花弁及び根の各器官ごとにGUS活性を測
定することにより、いずれの植物体においても葉で最も
大きな発現量が確認される。従って、LHCP IIプロモー
ターは光存在下において遺伝子を発現させることが可能
であり、その発現する場所も葉等の光合成開器官の存在
する部位に発現しやすいことが確認される。
（細胞塊）より常法に基づき植物体を再分化させる。再
分化した植物体を光条件下で遺伝子を発現させ、その植
物体を葉、茎、花弁及び根の各器官ごとにGUS活性を測
定することにより、いずれの植物体においても葉で最も
大きな発現量が確認される。従って、LHCP IIプロモー
ターは光存在下において遺伝子を発現させることが可能
であり、その発現する場所も葉等の光合成開器官の存在
する部位に発現しやすいことが確認される。
従って、本発明によるLHCP II遺伝子のプロモーターを
利用することにより、光によって遺伝子が発現誘導でき
る。また、葉等の光合成器官を有する部位に発現しやす
いことから器官特異的に遺伝子を発現させることができ
る可能性も示唆された。
利用することにより、光によって遺伝子が発現誘導でき
る。また、葉等の光合成器官を有する部位に発現しやす
いことから器官特異的に遺伝子を発現させることができ
る可能性も示唆された。
なお、下記実施例において得られたLHCP IIプロモータ
ーはイネを始めとする単子葉のみでなく、タバコ等の双
子葉植物においても発現可能なプロモーターであった。
ーはイネを始めとする単子葉のみでなく、タバコ等の双
子葉植物においても発現可能なプロモーターであった。
［実施例］ 本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の実
施例はこれらに限られれものではない。なお、下記実施
例において特に断わらない限り、各操作は、Maniatisら
Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Lab.に記載さ
れた方法に基づいて行なった。
施例はこれらに限られれものではない。なお、下記実施
例において特に断わらない限り、各操作は、Maniatisら
Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Lab.に記載さ
れた方法に基づいて行なった。
先ず、芽生えより以下の方法によりcDNAライブラリーを
作製した。すなわち、芽生え後２週間経過した芽生え30
gよりグアニジンチオシアネート法により全RNAを抽出し
た。抽出した全RNAよりオリゴdTセルロースカラムによ
りmRNAを単離した。mRNAは全RNAのほぼ1.5％の収量であ
った。mRNAよりcDNAの合成は市販の合成キット（アマシ
ャム社製）を使用した。合成したcDNAは市販の大腸菌用
クローニングベクターであるpUC8のEcoRI部位に接続
し、大腸菌を形質転換することによりcDNAライブラリー
を得た。
作製した。すなわち、芽生え後２週間経過した芽生え30
gよりグアニジンチオシアネート法により全RNAを抽出し
た。抽出した全RNAよりオリゴdTセルロースカラムによ
りmRNAを単離した。mRNAは全RNAのほぼ1.5％の収量であ
った。mRNAよりcDNAの合成は市販の合成キット（アマシ
ャム社製）を使用した。合成したcDNAは市販の大腸菌用
クローニングベクターであるpUC8のEcoRI部位に接続
し、大腸菌を形質転換することによりcDNAライブラリー
を得た。
次に、既知のLHCP II遺伝子の構造部分より17塩基の合
成プローブ（塩基配列:GCCCATCTGCAGTGGAT）を作製し、
コロニーハイブリダイゼーション法によってポジティブ
クローンを得た。これを解析したところ既知のLHCP II
遺伝子の構造と類似しており、イネのLHCP II遺伝子と
断定した。
成プローブ（塩基配列:GCCCATCTGCAGTGGAT）を作製し、
コロニーハイブリダイゼーション法によってポジティブ
クローンを得た。これを解析したところ既知のLHCP II
遺伝子の構造と類似しており、イネのLHCP II遺伝子と
断定した。
次に、ゲノミックライブラリーを作製した。すなわち、
暗所で発芽させて１週間経過したイネの芽生え30gよりC
TAB法（Plant Molecular Biology（1985）5:69）によっ
てDNAを抽出した。DNA10μｇを制限酵素Sau3AI（宝酒造
社製）によって部分分解した。これをベクターEMBL3
（ストラータジーン社製）のBamHI部位に接続し、大腸
菌に感染させてゲノミックライブラリーを作製した。
暗所で発芽させて１週間経過したイネの芽生え30gよりC
TAB法（Plant Molecular Biology（1985）5:69）によっ
てDNAを抽出した。DNA10μｇを制限酵素Sau3AI（宝酒造
社製）によって部分分解した。これをベクターEMBL3
（ストラータジーン社製）のBamHI部位に接続し、大腸
菌に感染させてゲノミックライブラリーを作製した。
cDNAの一部（５′側非翻訳領域から成熟タンパク質のＮ
末端まで含む約260塩基）をプローブとして用いて、ゲ
ノミックライブラリーのスクリーニングを行ない、４つ
のポリティブクローンを得た。これらの塩基配列をディ
デオキシ法に従って決定したところ、いずれも同じ配列
を有するLHCP II遺伝子であると確認できた。図１に示
したものがそのLHCP II遺伝子及びそのプロモーター領
域の塩基配列である。
末端まで含む約260塩基）をプローブとして用いて、ゲ
ノミックライブラリーのスクリーニングを行ない、４つ
のポリティブクローンを得た。これらの塩基配列をディ
デオキシ法に従って決定したところ、いずれも同じ配列
を有するLHCP II遺伝子であると確認できた。図１に示
したものがそのLHCP II遺伝子及びそのプロモーター領
域の塩基配列である。
次に、LHCP II遺伝子のプロモーターの活性を検討する
ためにLHCP II遺伝子のプロモーター部位を切り出し、G
US遺伝子に接続した。すなわち、図１に示す配列の−78
5番目から＋59番目までの部分をPCR法（Saikiら、（198
8）,Science 239;482−491）によって増幅し、−785側
には制限酵素XbaＩのリンカーを、＋59側には制限酵素B
amHIのリンカーを接続した。次に、pBI101のXbaＩ部位
とBamHI部位をそれぞれ制限酵素で切断し、この部分にL
HCP II遺伝子の上記プロモーター含有断片（LHCP−pr
o）を接続した（プラスミドpLH/GUS）。得られたプラス
ミドpLH/GUSの部分遺伝子地図を図２に示す。このプラ
スミドpLH/GUSを用いて次の形質転換実験を行ない形質
転換植物のGUS活性を検定した。
ためにLHCP II遺伝子のプロモーター部位を切り出し、G
US遺伝子に接続した。すなわち、図１に示す配列の−78
5番目から＋59番目までの部分をPCR法（Saikiら、（198
8）,Science 239;482−491）によって増幅し、−785側
には制限酵素XbaＩのリンカーを、＋59側には制限酵素B
amHIのリンカーを接続した。次に、pBI101のXbaＩ部位
とBamHI部位をそれぞれ制限酵素で切断し、この部分にL
HCP II遺伝子の上記プロモーター含有断片（LHCP−pr
o）を接続した（プラスミドpLH/GUS）。得られたプラス
ミドpLH/GUSの部分遺伝子地図を図２に示す。このプラ
スミドpLH/GUSを用いて次の形質転換実験を行ない形質
転換植物のGUS活性を検定した。
タバコの葉より常法に基づきプロトプラストを調製し
た。プロトプラストを精製した後に２×105個/mlの濃度
に緩衝液に懸濁した。この溶液に図２に示す構造を持つ
pLH/GUSプラスミドDNAを20μg/mlの濃度で加えた。この
懸濁液をエレクトロポレーション用の容器に移し電気刺
激を与えた後、プロトプラストを回収しMS培地で培養し
た。培養開始後１週間してカナマイシンを50μg/mlの濃
度で培地に添加し、さらに細胞を増殖させた。カルスが
径５〜10mmになった時点で植物ホルモンフリーの培地に
移植し再分化させた。このようにして再分化した植物体
の葉、茎、花弁、根についてRichardらの方法に従ってG
US遺伝子の発現量を測定した。具体的にはGUS遺伝子の
産物である酵素が4MUGを分解した産物の4MUの蛍光を測
定することになる。
た。プロトプラストを精製した後に２×105個/mlの濃度
に緩衝液に懸濁した。この溶液に図２に示す構造を持つ
pLH/GUSプラスミドDNAを20μg/mlの濃度で加えた。この
懸濁液をエレクトロポレーション用の容器に移し電気刺
激を与えた後、プロトプラストを回収しMS培地で培養し
た。培養開始後１週間してカナマイシンを50μg/mlの濃
度で培地に添加し、さらに細胞を増殖させた。カルスが
径５〜10mmになった時点で植物ホルモンフリーの培地に
移植し再分化させた。このようにして再分化した植物体
の葉、茎、花弁、根についてRichardらの方法に従ってG
US遺伝子の発現量を測定した。具体的にはGUS遺伝子の
産物である酵素が4MUGを分解した産物の4MUの蛍光を測
定することになる。
結果を表１に示す。表１にも明らかなように、各固体に
よる差があるものの、いずれにおいても葉においてGUS
遺伝子の発現が最も多かった。
よる差があるものの、いずれにおいても葉においてGUS
遺伝子の発現が最も多かった。
図１は、イネのLHCP II遺伝子の全構造と５′側（プロ
モーター部分）のDNA配列を示す。 図２は、図１に示したLHCP II遺伝子のプロモーター部
分を切り出し、植物ベクターであるpBI101に含まれるβ
−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子の上流に接続するこ
とにより構築したプラスミドpLH/GUSの遺伝子地図を示
す。
モーター部分）のDNA配列を示す。 図２は、図１に示したLHCP II遺伝子のプロモーター部
分を切り出し、植物ベクターであるpBI101に含まれるβ
−グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子の上流に接続するこ
とにより構築したプラスミドpLH/GUSの遺伝子地図を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鮫島 宗明 茨城県つくば市松代５―242―１―545―２ (56)参考文献 Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔ ｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏ ｇｉｓｔｓ，（Ｊｕｌｙ，1987），Ｐ．19 −23
Claims (3)
- 【請求項１】下記の塩基配列を有するDNA断片又はプロ
モーター活性を有するその一部から成るDNA断片。 - 【請求項２】イネ由来のものである請求項１記載のDNA
断片。 - 【請求項３】請求項１又は２のいずれか１項に記載のDN
A断片を含む植物細胞用ベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2075774A JPH07108227B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2075774A JPH07108227B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03277291A JPH03277291A (ja) | 1991-12-09 |
| JPH07108227B2 true JPH07108227B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=13585892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2075774A Expired - Fee Related JPH07108227B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108227B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1113075A4 (en) | 1998-09-10 | 2002-01-02 | Nissan Chemical Ind Ltd | DNS FRAGMENT WITH PROMOTOR FUNCTION. |
| AU9001998A (en) * | 1998-09-10 | 2000-04-03 | Nissan Chemical Industries Ltd. | Dna fragment having promoter function |
-
1990
- 1990-03-27 JP JP2075774A patent/JPH07108227B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，（Ｊｕｌｙ，１９８７），Ｐ．１９−２３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03277291A (ja) | 1991-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Benfey et al. | The CaMV 35S enhancer contains at least two domains which can confer different developmental and tissue‐specific expression patterns | |
| KR100228918B1 (ko) | 헬리안티닌의 상부 조절요소를 기초로 한 키메릭 식물 유전자 | |
| US5097025A (en) | Plant promoters | |
| US5110732A (en) | Selective gene expression in plants | |
| US5633363A (en) | Root preferential promoter | |
| CA2140014C (en) | A brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression | |
| CN1377417B (zh) | 来自棉花的纤维特异性肌动蛋白启动子的分离和鉴定 | |
| CA2228046C (en) | Root cortex specific gene promoter | |
| US5712112A (en) | Gene expression system comprising the promoter region of the alpha-amylase genes | |
| US6239329B1 (en) | Shoot meristem specific promoter sequences | |
| JP2009261408A (ja) | エンハンサーによって増大した植物における遺伝子の発現 | |
| JPH10504968A (ja) | 植物に導入された遺伝子の発現のためのアセトヒドロキシ酸シンターゼプロモーター | |
| US5460952A (en) | Gene expression system comprising the promoter region of the α-amylase genes | |
| AU665778B2 (en) | Callus-specific promoters | |
| JP2001502551A (ja) | トランスジェニック植物における遺伝子の葉部特異的発現 | |
| Kosugi et al. | Upstream sequences of rice proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene mediate expression of PCNA-GUS chimeric gene in meristems of transgenic tobacco plants | |
| JP2003509048A (ja) | 遺伝子発現調節用植物調節配列 | |
| US6998478B1 (en) | Isolation and characterization of a fiber-specific β-tubulin promoter from cotton | |
| EP2554674A1 (en) | Trichome specific promoters | |
| US20040244072A1 (en) | Leaf specific gene promoter of coffee | |
| US5824872A (en) | A constitutive promoter from tobacco | |
| JP4134281B2 (ja) | 雌しべの各組織に特異的な活性を有するプロモーターおよびその利用 | |
| JPWO2000071704A1 (ja) | 雌しべの各組織に特異的な活性を有するプロモーターおよびその利用 | |
| WO2003104465A1 (en) | Soybean promoter expressed preferentially in pods | |
| JPH07108227B2 (ja) | 光合成関連遺伝子及びそのプロモーター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |