JPH03280877A - 糖化型キトサン分解酵素の製造方法 - Google Patents
糖化型キトサン分解酵素の製造方法Info
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- JPH03280877A JPH03280877A JP8153090A JP8153090A JPH03280877A JP H03280877 A JPH03280877 A JP H03280877A JP 8153090 A JP8153090 A JP 8153090A JP 8153090 A JP8153090 A JP 8153090A JP H03280877 A JPH03280877 A JP H03280877A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
この発明は、キトサンに作用して直接その構成単糖であ
るＤ−グルコサミンにまで分解する糖化型キトサン分解
酵素の新規な製造方法に関するものである。
るＤ−グルコサミンにまで分解する糖化型キトサン分解
酵素の新規な製造方法に関するものである。
Ｄ−グルコサミンは、食品添加物、化学品成分、医薬品
等や、それらの原料として利用できるものであり、従来
からキトサンあるいはキチンを塩酸等の鉱酸て加熱分解
することによって生産されている。 一方、鉱酸処理によらずにキトサン分解酵素をキトサン
に作用させてＤ−グルコサミンを製造する方法は、かな
り温和な条件下でキトサンを分解できるため変性の少な
い天然のＤ−グルコサミンの製造が可能になる。 これまでにキトサン分解酵素を生産する微生物について
は、細菌類ではバチルス・セレウス（特開昭８０−１８
０５８５ ） 、バチルスＮｏ、７−Ｍ （特公平１
−５６７５５ ） 、アルカリゲネスＭＩＩＫ−１（特
開昭６２−２０１．５７１ ） 、バチルス・サーキュ
ランス（特開昭６３−９４９７１） 、バチルス・バミ
ルス（特開昭６３−６３３８２）等；放線菌類ではスト
レプトマイセス（Ｊ、 Ｓ、 Ｐｒ１ｃｅ ａｎｄ Ｒ
，５ｔｏｒｃｋ、 （１９７５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１２４．
１５７４−１５８５） 、ノカルデイア・オリエンタリ
ス（日本農芸化学会、平成元年度大会、講演要旨集ｐ、
８０９ ）等：糸状菌類ではペニシリウム・アイランデ
イカム（Ｄ、Ｍ、Ｆｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄ、Ｅ、Ｅｖ
ｅｌｅｉｇｈ。 （１９８１）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。 Ｖｏｌ、１２１３．１５１−１８５）等の報告がある。 これらの報告に記載されているキトサン分解酵素は、多
くはキトサンに作用してオリゴ糖を遊離する液化型（あ
るいはＥｎｄｏ−型）であり、キトサンの構成単糖であ
るＤ−グルコサミンにまで完全に分解することはできな
い。 上記の報告の中で、キトサンに作用して直接あるいは間
接的に構成単糖であるＤ−グルコサミンを遊離する糖化
型（あるいはＥｘｏ−型）キトサン分解酵素の生産菌に
ついての報告は、放線菌の一種であるノカルデイア・オ
リエンタリスが唯一の報告であり、それ以外には糸状菌
類においても細菌類においても未だ報告されていない。
等や、それらの原料として利用できるものであり、従来
からキトサンあるいはキチンを塩酸等の鉱酸て加熱分解
することによって生産されている。 一方、鉱酸処理によらずにキトサン分解酵素をキトサン
に作用させてＤ−グルコサミンを製造する方法は、かな
り温和な条件下でキトサンを分解できるため変性の少な
い天然のＤ−グルコサミンの製造が可能になる。 これまでにキトサン分解酵素を生産する微生物について
は、細菌類ではバチルス・セレウス（特開昭８０−１８
０５８５ ） 、バチルスＮｏ、７−Ｍ （特公平１
−５６７５５ ） 、アルカリゲネスＭＩＩＫ−１（特
開昭６２−２０１．５７１ ） 、バチルス・サーキュ
ランス（特開昭６３−９４９７１） 、バチルス・バミ
ルス（特開昭６３−６３３８２）等；放線菌類ではスト
レプトマイセス（Ｊ、 Ｓ、 Ｐｒ１ｃｅ ａｎｄ Ｒ
，５ｔｏｒｃｋ、 （１９７５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１２４．
１５７４−１５８５） 、ノカルデイア・オリエンタリ
ス（日本農芸化学会、平成元年度大会、講演要旨集ｐ、
８０９ ）等：糸状菌類ではペニシリウム・アイランデ
イカム（Ｄ、Ｍ、Ｆｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄ、Ｅ、Ｅｖ
ｅｌｅｉｇｈ。 （１９８１）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。 Ｖｏｌ、１２１３．１５１−１８５）等の報告がある。 これらの報告に記載されているキトサン分解酵素は、多
くはキトサンに作用してオリゴ糖を遊離する液化型（あ
るいはＥｎｄｏ−型）であり、キトサンの構成単糖であ
るＤ−グルコサミンにまで完全に分解することはできな
い。 上記の報告の中で、キトサンに作用して直接あるいは間
接的に構成単糖であるＤ−グルコサミンを遊離する糖化
型（あるいはＥｘｏ−型）キトサン分解酵素の生産菌に
ついての報告は、放線菌の一種であるノカルデイア・オ
リエンタリスが唯一の報告であり、それ以外には糸状菌
類においても細菌類においても未だ報告されていない。
本発明者等は、現在行われている酸分解法よりも温和な
条件下でＤ−グルコサミンを製造することができる酵素
分解法に着目した。 そこでこの発明は、上記のごとき酵素分解法に不可欠な
糖化型キトサン分解酵素を効率よく生産することができ
る方法を提供することを目的としてなされたものである
。
条件下でＤ−グルコサミンを製造することができる酵素
分解法に着目した。 そこでこの発明は、上記のごとき酵素分解法に不可欠な
糖化型キトサン分解酵素を効率よく生産することができ
る方法を提供することを目的としてなされたものである
。
本発明者等は、種々の土壌からキトサン分解酵素を生産
する微生物の検索を行った結果、ペニシリウム属に属す
る糸状菌が菌体外に糖化型キトサン分解酵素を生産する
ことを見出し、この発明を完成させたものである。 すなわちこの発明による糖化型キトサン分解酵素の製造
方法は、ペニシリウム属に属する糖化型キトサン分解酵
素生産菌を培養し、この培養物から糖化型キトサン分解
酵素を採取することを特徴とするものである。 以下に（１）使用する微生物、（２）微生物の培養およ
び糖化型キトサン分解酵素の採取、（３）糖化型キトサ
ン分解酵素の性質について順次詳述する。 （１）使用する微生物 この発明に使用するペニシリウム属に属する糖化型キト
サン分解酵素生産菌としては、例えば本発明者等が土壌
中より分離したペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１１２（微工
研菌寄第１１３７４号、 ＦＥＲＮＰ−１１，３７４）
、ペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１１５（微工研菌寄１１
．３７５号、 ＦＥＲＮ Ｐ−１１３７５） 、ペニシ
リウムＡＰ９−Ｐ−１２８（、微工研菌寄第１１３７６
号、 ＦＥＲＭ Ｐ−１１３７６）が挙げられる。これ
らの菌株は、以下に示す菌学的性質からもわかるように
いずれも糸状菌であるペニシリウム属に属するが、ペニ
シリウム属に属する糸状菌が糖化型キトサン分解酵素を
生産するという従来の報告はないため、ペニシリウム属
に属する新菌株であると考えられ、いずれも工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。 ペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１２の菌学的性質：・培養
所見および性質 麦芽エキス寒天培地上での生育は良く、コロニーは発育
初期には白色であるが、分生子の形成、成熟に従って灰
緑色を呈する。 好気性菌である。 ２５℃程度の温度域で生育が良く、３７℃では生育は認
められない。３０℃以上および２０℃以下での生育は緩
慢である。 生育可能なｐＨはｐＨ２〜ｐｌ！ ８であるが、最適ｐ
ＨはｐＨ５〜ＩＩＨ８である。 ・形態的性質 常法に従って麦芽エキス寒天培地上で生育したものを顕
微鏡下で形態観察した。 分生子柄は無色で、その先端は箒状の構造であるベニシ
ラスを形成する。この先端に分生子の数珠状の連鎖を生
ずる。 以上の観察の結果、本菌株はペニシリウム属に属する糸
状菌であると判定された。 各種培地における性質は以下の通りである。 麦芽エキス寒天培地 生育状態：２５℃、７日間で４〜５ ａｍコロニー色調
：灰緑色、周縁部は白色。 裏面は無色〜薄い黄褐色。 オートミール寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で４〜５０Ｉコロニ一色調：
灰緑色、周縁部は白色。 ＰＤＡ培地 生育状態：２５℃、７日間で４〜５ ｃｍコロニー色調
：薄い灰緑色、周縁部は白色。 裏面は淡黄色〜無色。 ツアペック寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で２．５〜３．５ｃｏ＋コロ
ニー色調：薄い灰緑色、周縁部は白色。 ペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１５の菌学的性質：・培養
所見および性質 麦芽エキス寒天培地上での生育は良く、コロニーは発育
初期には白色であるが、分生子の形成、成熟に従って灰
緑色を呈する。 好気性菌である。 ２５℃程度の温度域で生育が良く、３７℃では生育は認
められない。３０℃以上および２０℃以下での生育は緩
慢である。 生育可能なｐＨはｐＨ２〜ｐＨ８であるが、最適ｐＨは
ｐＨ５〜ｐＨ６である。 ・形態的性質 常法に従って麦芽エキス寒天培地上で生育したものを顕
微鏡下で形態観察した。 分生子柄は無色で、その先端は箒状の構造であるベニシ
ラスを形成する。この先端に分生子の数珠状の連鎖を生
ずる。 以上の観察の結果、本菌株はペニシリウム属に属する糸
状菌であると判定された。 各種培地における性質は以下の通りである。 麦芽エキス寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で３．５〜４ ｃｎ＋コロニ
ー色調：灰緑色、周縁部は白色。 裏面は無色〜薄い黄褐色。 オートミール寒天培地 生育状態・２５℃、７日間で４〜５ ｃｍコロニー色調
：灰緑色、周縁部は白色。 ＰＤＡ培地 生育状態＝２５℃、７日間で２．５〜３．５ ｃｍコロ
ニー色調：灰緑色、周縁部は白色。 ツアペック寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で２〜３ ｃ＋ｎコロニー色
調：白色〜淡黄色。 ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１２８の菌学的性質：・培養
所見および性質 麦芽エキス寒天培地上での生育は良く、コロニーは発育
初期には白色であるが、分生子の形成、成熟に従って灰
緑色を呈する。 好気性菌である。 ２５℃程度の温度域で生育が良い。３７℃では僅かなが
ら生育は認められるが、それ以上の温度では生育できな
い。３０℃以上および２０℃以下での生育は緩慢である
。 生育可能なｐＨはｐＨ３〜ｐＨ８であるが、最適ｐＨは
ｐＨ５〜ｐＨ６である。 ・形態的性質 常法に従って麦芽エキス寒天培地上で生育したものを顕
微鏡下で形態観察した。 分生子柄は無色で、その先端は箒状の構造であるベニシ
ラスを形成する。この先端に分生子の数珠状の連鎖を生
ずる。 以上の観察の結果、本菌株はペニシリウム属に属する糸
状菌であると判定された。 各種培地における性質は以下の通りである。 麦芽エキス寒天培地 生育状態；２５℃、７日間で４．５〜５．５ ｃｏ＋コ
ロニー色調；灰緑色、周縁部は白色。 裏面は無色〜薄い黄褐色。 オートミール寒天培地 生育状態：２５℃、７日間で４．５〜５．５０ｒｒｌコ
ロニ一色調：灰緑色、周縁部は白色。 ＰＤＡ培地 生育状態＝２５℃、７日間で４．５〜５．５ ｃｍコロ
ニー色調：灰緑色、周縁部は白色。 ツアペック寒天培地 生育状態：２５℃、７日間で２．５〜３．５ ｃ＋ｎコ
ロニー色調：白色。 裏面は淡黄色〜薄い黄褐色 上述したところかられかるように、３菌株はいずれもペ
ニシリウム属に属するものであるが、各種培地における
生育状態、生育可能な温度やｐＨ域において若干の相違
が認められるため、それぞれ異なる菌株であると判定し
た。 （２）＠生物の培養および酵素の採取 上記した糸状菌を培養して糖化型キトサン分解酵素を生
産させるための培地としては、例えば以下の組成の培地
（以下“基本培地“という）を用いることができる。 キトサン ５．Ｏｇ ペプトン ２・Ｏｇ 酵母エキス ０．５ｇ Ｋ１１２ＰＯ４１，０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，３ｇ 脱イオン水 口 ｐ Ｈ６，５ 培地にキトサンを添加しなくても若干ではあるが酵素を
生産する。しかしキトサンを培地に添加した方が酵素の
生産性は高い。 培地に添加するキトサンとしては、脱アセチル化度がど
の様なキトサンであってもよく、さらにはフレーク状の
ものでも、粉砕したものでも、希酸（例えば塩酸、硫酸
等の無機酸、クエン酸、酢酸等の有機酸）に溶解した溶
液状のものでもよい。またこれらのキトサンの分子量は
いかなるものでもよく、さらにはキトサンを含有してい
るもの（例えば接合菌類等の細胞壁）をそのまま培地に
添加してもよい。 その他の培地成分は、通常の糸状菌の培養に用いられる
ものであれば使用できる。 培地のｐＨは、使用する菌株が生育てきる範囲であれば
いかなるｐｌ！でもよいが、好ましくはｐＨ５，０〜７
．０に調整して培養を行う。 培養温度は通常は２５℃前後であり、培養日数は１〜７
日間であり、通気攪拌培養等により培養する。 糖化型キトザン分解酵素は培地中に生成、蓄積される。 培養終了後、遠心分離や濾過等で培養液から菌体を除去
することにより粗酵素液か得られる。この粗酵素液を必
要に応じて限外濾過濃縮、硫安塩析および抽出等の処理
を行うことにより、濃縮粗酵素液とすることができ、さ
らにこれを凍結乾燥等により乾燥すれば、粗酵素粉末と
することができる。 （３）糖化型キトサン分解酵素の性質 ■キトサンに対する作用 この発明により生産される糖化型キトサン分解酵素は、
キトサンに作用してこれを分解し、その構成単糖である
Ｄ−グルコサミンを遊離する。 ■至適ｐｎ ｐＨ３，８からｐＨ１Ｏ，Ｏまでの範囲で、基質である
キトサンに対する活性を調べた。 使用した緩衝液とｐｉの関係は次の通りである。 ｐＨ３，６〜６．０ 酢酸緩衝液 ｐｌ＋５．８〜７．８ リン酸緩衝液ｐＨ８，０〜Ｉ
Ｏ３０炭酸ソーダ・硼酸緩衝液なお、基質のキトサンと
して１００％脱アセチル化キトサンである「キトサン１
００ＬＪ（和光純薬■製商品名）を使用した場合、中性
からアルカリ域の緩衝液中では不溶であり析出してしま
う。そのため広範囲のｐＨ域での至適ｐＨを調べる場合
には、広範囲なｐＨ域で可溶なグリコールキトサンを基
質として使用した。 種々のＩ）Ｈの緩衝液中で酵素を基質に反応させたとき
の酵素活性を測定した（反応温度３７℃）。結果を第１
図〜第３図のグラフに示す。これらのグラフから読み取
れる至適ｐｌ（は以下の通りである。 キトサン グリコール １００Ｌ キトサン ＡＦ９−Ｐ−１１２の生産する ５付近 ４〜６酵
素（第１図） 八Ｆ９−Ｐ−１１５の生産する ４．５付近 ５〜
６酵素（第２図） ＡＦ９−Ｐ−１２８の生産する ４〜５．５ ４〜６
酵素（第３図） 上表かられかるように、いずれの糖化型キトサン分解酵
素も酸性域に至適ｐＨを有する。 ■至適温度および温度安定性 至適温度二種々の温度で酵素を基質に反応させたときの
酵素活性を測定した（反応液ｐＨは５．０、基質はキト
サン１００Ｌ ）。 温度安定性：酵素をｐＨ５，０の酢酸緩衝液で希釈、混
合したものを種々の温度で３０分間熱処理した後冷却し
、これらの酵素液を用いて３７℃で基質に反応させたと
きの残存活性を測定した（反応液ｐ１１は５，０、基質
はキトサン１００Ｌ ）。 これらの結果を第４図〜第６図のグラフに示す。これら
のグラフから読み取れる至適温度および温度安定性は以
下の通りである。 八Ｆ９−Ｐ−１１２ する酵素 八Ｆ９−Ｐ−１，１５ する酵素 八Ｆ９−Ｐ−１２８ の生産 ６０℃ （第４図） の生産 ６０℃ （第５図） の生産 ６０℃ ６０℃、３０分間 ６０℃、３０分間 ５０℃、３０分間 上表かられかるように、ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１１
２およびＡＦ９−Ｐ−１１５の生産する糖化型キトサン
分解酵素の反応至適温度は６０℃位であり、６０℃、３
０分間の熱処理でも失活せずに安定であった。また、ペ
ニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１２８の生産する糖化型キトサ
ン分解酵素の反応至適温度は６０℃位であるが、５０℃
、３０分間の熱処理まで安定であった。 ■糖化型キトサン分解酵素の活性測定法０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ａｌｌ ５．０）にキトサン１００Ｌを濃度が０
．５％となるように溶解してキトサン溶液を調製する。 このキトサン溶液２００μｇに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，０） ７００μｇと酵素液１００μｇを加えて
良く混合し、３７℃で３０分間反応させる。 反応終了後、生成した遊離還元糖をＲｏｎｄ Ｉ ｅＭ
ｏｒｇａｎ法（Ｒｏｎｄｌｅ、 Ｃ，Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ
Ｍｏｒｇａｎ、 Ｗ、ＴＪ、（１９５５）、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、 Ｖｏｌ、６１．
５８８−５８９）によって定量する。なお、対照にはグ
ルコサミン塩酸塩を用いる。 この反応条件で１分間に１μモルのグルコサミンを遊離
する酵素量を１ユニツトとする。
する微生物の検索を行った結果、ペニシリウム属に属す
る糸状菌が菌体外に糖化型キトサン分解酵素を生産する
ことを見出し、この発明を完成させたものである。 すなわちこの発明による糖化型キトサン分解酵素の製造
方法は、ペニシリウム属に属する糖化型キトサン分解酵
素生産菌を培養し、この培養物から糖化型キトサン分解
酵素を採取することを特徴とするものである。 以下に（１）使用する微生物、（２）微生物の培養およ
び糖化型キトサン分解酵素の採取、（３）糖化型キトサ
ン分解酵素の性質について順次詳述する。 （１）使用する微生物 この発明に使用するペニシリウム属に属する糖化型キト
サン分解酵素生産菌としては、例えば本発明者等が土壌
中より分離したペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１１２（微工
研菌寄第１１３７４号、 ＦＥＲＮＰ−１１，３７４）
、ペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１１５（微工研菌寄１１
．３７５号、 ＦＥＲＮ Ｐ−１１３７５） 、ペニシ
リウムＡＰ９−Ｐ−１２８（、微工研菌寄第１１３７６
号、 ＦＥＲＭ Ｐ−１１３７６）が挙げられる。これ
らの菌株は、以下に示す菌学的性質からもわかるように
いずれも糸状菌であるペニシリウム属に属するが、ペニ
シリウム属に属する糸状菌が糖化型キトサン分解酵素を
生産するという従来の報告はないため、ペニシリウム属
に属する新菌株であると考えられ、いずれも工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。 ペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１２の菌学的性質：・培養
所見および性質 麦芽エキス寒天培地上での生育は良く、コロニーは発育
初期には白色であるが、分生子の形成、成熟に従って灰
緑色を呈する。 好気性菌である。 ２５℃程度の温度域で生育が良く、３７℃では生育は認
められない。３０℃以上および２０℃以下での生育は緩
慢である。 生育可能なｐＨはｐＨ２〜ｐｌ！ ８であるが、最適ｐ
ＨはｐＨ５〜ＩＩＨ８である。 ・形態的性質 常法に従って麦芽エキス寒天培地上で生育したものを顕
微鏡下で形態観察した。 分生子柄は無色で、その先端は箒状の構造であるベニシ
ラスを形成する。この先端に分生子の数珠状の連鎖を生
ずる。 以上の観察の結果、本菌株はペニシリウム属に属する糸
状菌であると判定された。 各種培地における性質は以下の通りである。 麦芽エキス寒天培地 生育状態：２５℃、７日間で４〜５ ａｍコロニー色調
：灰緑色、周縁部は白色。 裏面は無色〜薄い黄褐色。 オートミール寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で４〜５０Ｉコロニ一色調：
灰緑色、周縁部は白色。 ＰＤＡ培地 生育状態：２５℃、７日間で４〜５ ｃｍコロニー色調
：薄い灰緑色、周縁部は白色。 裏面は淡黄色〜無色。 ツアペック寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で２．５〜３．５ｃｏ＋コロ
ニー色調：薄い灰緑色、周縁部は白色。 ペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１５の菌学的性質：・培養
所見および性質 麦芽エキス寒天培地上での生育は良く、コロニーは発育
初期には白色であるが、分生子の形成、成熟に従って灰
緑色を呈する。 好気性菌である。 ２５℃程度の温度域で生育が良く、３７℃では生育は認
められない。３０℃以上および２０℃以下での生育は緩
慢である。 生育可能なｐＨはｐＨ２〜ｐＨ８であるが、最適ｐＨは
ｐＨ５〜ｐＨ６である。 ・形態的性質 常法に従って麦芽エキス寒天培地上で生育したものを顕
微鏡下で形態観察した。 分生子柄は無色で、その先端は箒状の構造であるベニシ
ラスを形成する。この先端に分生子の数珠状の連鎖を生
ずる。 以上の観察の結果、本菌株はペニシリウム属に属する糸
状菌であると判定された。 各種培地における性質は以下の通りである。 麦芽エキス寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で３．５〜４ ｃｎ＋コロニ
ー色調：灰緑色、周縁部は白色。 裏面は無色〜薄い黄褐色。 オートミール寒天培地 生育状態・２５℃、７日間で４〜５ ｃｍコロニー色調
：灰緑色、周縁部は白色。 ＰＤＡ培地 生育状態＝２５℃、７日間で２．５〜３．５ ｃｍコロ
ニー色調：灰緑色、周縁部は白色。 ツアペック寒天培地 生育状態＝２５℃、７日間で２〜３ ｃ＋ｎコロニー色
調：白色〜淡黄色。 ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１２８の菌学的性質：・培養
所見および性質 麦芽エキス寒天培地上での生育は良く、コロニーは発育
初期には白色であるが、分生子の形成、成熟に従って灰
緑色を呈する。 好気性菌である。 ２５℃程度の温度域で生育が良い。３７℃では僅かなが
ら生育は認められるが、それ以上の温度では生育できな
い。３０℃以上および２０℃以下での生育は緩慢である
。 生育可能なｐＨはｐＨ３〜ｐＨ８であるが、最適ｐＨは
ｐＨ５〜ｐＨ６である。 ・形態的性質 常法に従って麦芽エキス寒天培地上で生育したものを顕
微鏡下で形態観察した。 分生子柄は無色で、その先端は箒状の構造であるベニシ
ラスを形成する。この先端に分生子の数珠状の連鎖を生
ずる。 以上の観察の結果、本菌株はペニシリウム属に属する糸
状菌であると判定された。 各種培地における性質は以下の通りである。 麦芽エキス寒天培地 生育状態；２５℃、７日間で４．５〜５．５ ｃｏ＋コ
ロニー色調；灰緑色、周縁部は白色。 裏面は無色〜薄い黄褐色。 オートミール寒天培地 生育状態：２５℃、７日間で４．５〜５．５０ｒｒｌコ
ロニ一色調：灰緑色、周縁部は白色。 ＰＤＡ培地 生育状態＝２５℃、７日間で４．５〜５．５ ｃｍコロ
ニー色調：灰緑色、周縁部は白色。 ツアペック寒天培地 生育状態：２５℃、７日間で２．５〜３．５ ｃ＋ｎコ
ロニー色調：白色。 裏面は淡黄色〜薄い黄褐色 上述したところかられかるように、３菌株はいずれもペ
ニシリウム属に属するものであるが、各種培地における
生育状態、生育可能な温度やｐＨ域において若干の相違
が認められるため、それぞれ異なる菌株であると判定し
た。 （２）＠生物の培養および酵素の採取 上記した糸状菌を培養して糖化型キトサン分解酵素を生
産させるための培地としては、例えば以下の組成の培地
（以下“基本培地“という）を用いることができる。 キトサン ５．Ｏｇ ペプトン ２・Ｏｇ 酵母エキス ０．５ｇ Ｋ１１２ＰＯ４１，０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，３ｇ 脱イオン水 口 ｐ Ｈ６，５ 培地にキトサンを添加しなくても若干ではあるが酵素を
生産する。しかしキトサンを培地に添加した方が酵素の
生産性は高い。 培地に添加するキトサンとしては、脱アセチル化度がど
の様なキトサンであってもよく、さらにはフレーク状の
ものでも、粉砕したものでも、希酸（例えば塩酸、硫酸
等の無機酸、クエン酸、酢酸等の有機酸）に溶解した溶
液状のものでもよい。またこれらのキトサンの分子量は
いかなるものでもよく、さらにはキトサンを含有してい
るもの（例えば接合菌類等の細胞壁）をそのまま培地に
添加してもよい。 その他の培地成分は、通常の糸状菌の培養に用いられる
ものであれば使用できる。 培地のｐＨは、使用する菌株が生育てきる範囲であれば
いかなるｐｌ！でもよいが、好ましくはｐＨ５，０〜７
．０に調整して培養を行う。 培養温度は通常は２５℃前後であり、培養日数は１〜７
日間であり、通気攪拌培養等により培養する。 糖化型キトザン分解酵素は培地中に生成、蓄積される。 培養終了後、遠心分離や濾過等で培養液から菌体を除去
することにより粗酵素液か得られる。この粗酵素液を必
要に応じて限外濾過濃縮、硫安塩析および抽出等の処理
を行うことにより、濃縮粗酵素液とすることができ、さ
らにこれを凍結乾燥等により乾燥すれば、粗酵素粉末と
することができる。 （３）糖化型キトサン分解酵素の性質 ■キトサンに対する作用 この発明により生産される糖化型キトサン分解酵素は、
キトサンに作用してこれを分解し、その構成単糖である
Ｄ−グルコサミンを遊離する。 ■至適ｐｎ ｐＨ３，８からｐＨ１Ｏ，Ｏまでの範囲で、基質である
キトサンに対する活性を調べた。 使用した緩衝液とｐｉの関係は次の通りである。 ｐＨ３，６〜６．０ 酢酸緩衝液 ｐｌ＋５．８〜７．８ リン酸緩衝液ｐＨ８，０〜Ｉ
Ｏ３０炭酸ソーダ・硼酸緩衝液なお、基質のキトサンと
して１００％脱アセチル化キトサンである「キトサン１
００ＬＪ（和光純薬■製商品名）を使用した場合、中性
からアルカリ域の緩衝液中では不溶であり析出してしま
う。そのため広範囲のｐＨ域での至適ｐＨを調べる場合
には、広範囲なｐＨ域で可溶なグリコールキトサンを基
質として使用した。 種々のＩ）Ｈの緩衝液中で酵素を基質に反応させたとき
の酵素活性を測定した（反応温度３７℃）。結果を第１
図〜第３図のグラフに示す。これらのグラフから読み取
れる至適ｐｌ（は以下の通りである。 キトサン グリコール １００Ｌ キトサン ＡＦ９−Ｐ−１１２の生産する ５付近 ４〜６酵
素（第１図） 八Ｆ９−Ｐ−１１５の生産する ４．５付近 ５〜
６酵素（第２図） ＡＦ９−Ｐ−１２８の生産する ４〜５．５ ４〜６
酵素（第３図） 上表かられかるように、いずれの糖化型キトサン分解酵
素も酸性域に至適ｐＨを有する。 ■至適温度および温度安定性 至適温度二種々の温度で酵素を基質に反応させたときの
酵素活性を測定した（反応液ｐＨは５．０、基質はキト
サン１００Ｌ ）。 温度安定性：酵素をｐＨ５，０の酢酸緩衝液で希釈、混
合したものを種々の温度で３０分間熱処理した後冷却し
、これらの酵素液を用いて３７℃で基質に反応させたと
きの残存活性を測定した（反応液ｐ１１は５，０、基質
はキトサン１００Ｌ ）。 これらの結果を第４図〜第６図のグラフに示す。これら
のグラフから読み取れる至適温度および温度安定性は以
下の通りである。 八Ｆ９−Ｐ−１１２ する酵素 八Ｆ９−Ｐ−１，１５ する酵素 八Ｆ９−Ｐ−１２８ の生産 ６０℃ （第４図） の生産 ６０℃ （第５図） の生産 ６０℃ ６０℃、３０分間 ６０℃、３０分間 ５０℃、３０分間 上表かられかるように、ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１１
２およびＡＦ９−Ｐ−１１５の生産する糖化型キトサン
分解酵素の反応至適温度は６０℃位であり、６０℃、３
０分間の熱処理でも失活せずに安定であった。また、ペ
ニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１２８の生産する糖化型キトサ
ン分解酵素の反応至適温度は６０℃位であるが、５０℃
、３０分間の熱処理まで安定であった。 ■糖化型キトサン分解酵素の活性測定法０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ａｌｌ ５．０）にキトサン１００Ｌを濃度が０
．５％となるように溶解してキトサン溶液を調製する。 このキトサン溶液２００μｇに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，０） ７００μｇと酵素液１００μｇを加えて
良く混合し、３７℃で３０分間反応させる。 反応終了後、生成した遊離還元糖をＲｏｎｄ Ｉ ｅＭ
ｏｒｇａｎ法（Ｒｏｎｄｌｅ、 Ｃ，Ｊ、Ｍ、 ａｎｄ
Ｍｏｒｇａｎ、 Ｗ、ＴＪ、（１９５５）、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、 Ｖｏｌ、６１．
５８８−５８９）によって定量する。なお、対照にはグ
ルコサミン塩酸塩を用いる。 この反応条件で１分間に１μモルのグルコサミンを遊離
する酵素量を１ユニツトとする。
以下に実施例を挙げてこの発明を説明する。
キトサンを含有する前述した組成の基本培地１００ ｍ
ｌを坂ロフラスコに分注し、１２０℃で２０分間の高圧
蒸気滅菌を行った。 ツアペック寒天培地上で生育させたペニシリウム八Ｆ９
−Ｐ−１１２の菌糸マット片（約５關×５順）をこのフ
ラスコ中の培地に接種し、２５℃で６日間の往復振盪培
養を行った。 培養後、培養液を濾紙（Ｎｏ、２）を用いて除菌濾過し
、酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素
活性は培養濾液１ｍｌ当たり１３９ミリユニツトであっ
た。 キトサンを含有する前述した組成の基本培地３１１を５
ｇ容小型発酵装置に分注し、１２０℃で２０分間の高圧
蒸気滅菌を行った。 同じ基本培地１００ ｍｌを含む三角フラスコにペニシ
リウムＡＦ９−Ｐ−１１２の菌糸マット片（約５ ｍｍ
×５關）を接種して２５℃で２日間の回転振盪培養を行
って予め種培養物を調製し、これを前記小型発酵装置に
接種して培養した。発酵装置における培養条件は次の通
りとした。 温 度 ２５℃ 培地ｐＨａｌｌ７を超えないように 塩酸で制御 通気量 ３１１／分 回転数 ３００ ｒｐｍ 培養日数 ４日間 培養後、培養液を濾紙（Ｎｏ、２）を用いて除菌濾過し
、酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素
活性は培養濾液１ａ＋Ｉ当たり１２３ミリユニツトであ
った。 ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
八Ｆ９−Ｐ−１１５を用いた以外は実施例１と同様にし
て酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素
活性は培養濾液１１当たり２４８ミリユニツトであった
。 ペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
ＡＰ９−Ｐ−１１５を用いたこと、および発酵装置によ
る培養日数を８日間としたこと以外は実施例２と同様に
して酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵
素活性は培養濾液１１当たり２８９ ミリユニットであ
った。 ペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
ＡＦ９−Ｐ−１２８を用いたこと、フラスコによる往復
振盪培養日数を４日間としたこと以外は実施例１と同様
にして酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解
酵素活性は培養濾液１１当たり２５３ミリユニツトであ
った。 実施例６：ペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１２８による小型
発酵装置での酵素生産 ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
ＡＰ９−Ｐ−１２８を用いたこと、発酵装置における培
養日数を７日間としたこと以外は実施例２と同様にして
酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素活
性は培養濾液ｌｌ１１１当たり５５９ミリユニツトであ
った。 実施例７：得られた酵素の基質に対する作用上記の実施
例１〜６て得られた各糖化型キトサン分解酵素１０μｇ
を、キトサン溶液（キトサン１００Ｌを５１１ｇ／ｍｌ
となるようにｐＨ５，０の酢酸緩衝液に溶解したもの）
４０μｇにそれぞれ添加、混合し、３７℃で１時間およ
び２４時間静置条件下で反応させた。次にこの反応液を
１００℃で５分間加熱処理して反応を停止させた後、薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により反応液中の酵素
分解産物を分析した。 ＴＬＣプレートはｒＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ Ｊ
（メルク社製商品名）を使用し、標準品にはキトサン
オリゴ糖混合物（２０Ｂ／ｍｌ ） ２．５μｇを用い
た。 展開溶媒にはｎ−ブタノール−酢酸−水−２：１：２を
用い、常法に従って展開し、硫酸発色によりスポットの
検出を行った。得られたＴＬＣ分析パターンを第７図に
示す。 このパターンかられかるように、ペニシリウム八Ｆ９−
Ｐ−１１２、八Ｆ９−Ｐ−１１５および八Ｆ９−Ｐ−１
２８の生産する糖化型キトサン分解酵素は、１時間およ
び２４時間の反応のいずれの場合にも、キトサンに作用
してＤ−グルコサミンの単糖のみを生成しており、キト
サンオリゴ糖は検出されなかった。
ｌを坂ロフラスコに分注し、１２０℃で２０分間の高圧
蒸気滅菌を行った。 ツアペック寒天培地上で生育させたペニシリウム八Ｆ９
−Ｐ−１１２の菌糸マット片（約５關×５順）をこのフ
ラスコ中の培地に接種し、２５℃で６日間の往復振盪培
養を行った。 培養後、培養液を濾紙（Ｎｏ、２）を用いて除菌濾過し
、酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素
活性は培養濾液１ｍｌ当たり１３９ミリユニツトであっ
た。 キトサンを含有する前述した組成の基本培地３１１を５
ｇ容小型発酵装置に分注し、１２０℃で２０分間の高圧
蒸気滅菌を行った。 同じ基本培地１００ ｍｌを含む三角フラスコにペニシ
リウムＡＦ９−Ｐ−１１２の菌糸マット片（約５ ｍｍ
×５關）を接種して２５℃で２日間の回転振盪培養を行
って予め種培養物を調製し、これを前記小型発酵装置に
接種して培養した。発酵装置における培養条件は次の通
りとした。 温 度 ２５℃ 培地ｐＨａｌｌ７を超えないように 塩酸で制御 通気量 ３１１／分 回転数 ３００ ｒｐｍ 培養日数 ４日間 培養後、培養液を濾紙（Ｎｏ、２）を用いて除菌濾過し
、酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素
活性は培養濾液１ａ＋Ｉ当たり１２３ミリユニツトであ
った。 ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
八Ｆ９−Ｐ−１１５を用いた以外は実施例１と同様にし
て酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素
活性は培養濾液１１当たり２４８ミリユニツトであった
。 ペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
ＡＰ９−Ｐ−１１５を用いたこと、および発酵装置によ
る培養日数を８日間としたこと以外は実施例２と同様に
して酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵
素活性は培養濾液１１当たり２８９ ミリユニットであ
った。 ペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
ＡＦ９−Ｐ−１２８を用いたこと、フラスコによる往復
振盪培養日数を４日間としたこと以外は実施例１と同様
にして酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解
酵素活性は培養濾液１１当たり２５３ミリユニツトであ
った。 実施例６：ペニシリウム八Ｆ９−Ｐ−１２８による小型
発酵装置での酵素生産 ペニシリウムＡＰ９−Ｐ−１１２に代えてペニシリウム
ＡＰ９−Ｐ−１２８を用いたこと、発酵装置における培
養日数を７日間としたこと以外は実施例２と同様にして
酵素液を得た。この酵素液の糖化型キトサン分解酵素活
性は培養濾液ｌｌ１１１当たり５５９ミリユニツトであ
った。 実施例７：得られた酵素の基質に対する作用上記の実施
例１〜６て得られた各糖化型キトサン分解酵素１０μｇ
を、キトサン溶液（キトサン１００Ｌを５１１ｇ／ｍｌ
となるようにｐＨ５，０の酢酸緩衝液に溶解したもの）
４０μｇにそれぞれ添加、混合し、３７℃で１時間およ
び２４時間静置条件下で反応させた。次にこの反応液を
１００℃で５分間加熱処理して反応を停止させた後、薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により反応液中の酵素
分解産物を分析した。 ＴＬＣプレートはｒＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ Ｊ
（メルク社製商品名）を使用し、標準品にはキトサン
オリゴ糖混合物（２０Ｂ／ｍｌ ） ２．５μｇを用い
た。 展開溶媒にはｎ−ブタノール−酢酸−水−２：１：２を
用い、常法に従って展開し、硫酸発色によりスポットの
検出を行った。得られたＴＬＣ分析パターンを第７図に
示す。 このパターンかられかるように、ペニシリウム八Ｆ９−
Ｐ−１１２、八Ｆ９−Ｐ−１１５および八Ｆ９−Ｐ−１
２８の生産する糖化型キトサン分解酵素は、１時間およ
び２４時間の反応のいずれの場合にも、キトサンに作用
してＤ−グルコサミンの単糖のみを生成しており、キト
サンオリゴ糖は検出されなかった。
上述したところかられかるようにこの発明によれば、ペ
ニシリウム属に属する新規な糸状菌を培養することによ
って糖化型キトサン分解酵素を製造することができる。 この発明で得られた糖化型キトサン分解酵素は、キトサ
ンに作用させることによりキトサンを分解してその構成
単糖であるＤ−グルコサミンを生成することができる。 かような酵素反応による分解は、従来の鉱酸による加熱
分解に比べて温和な条件でキトサンに作用してＤ−グル
コサミンまで分解するため、変性の少ない天然のＤ−グ
ルコサミンの製造が可能となる。
ニシリウム属に属する新規な糸状菌を培養することによ
って糖化型キトサン分解酵素を製造することができる。 この発明で得られた糖化型キトサン分解酵素は、キトサ
ンに作用させることによりキトサンを分解してその構成
単糖であるＤ−グルコサミンを生成することができる。 かような酵素反応による分解は、従来の鉱酸による加熱
分解に比べて温和な条件でキトサンに作用してＤ−グル
コサミンまで分解するため、変性の少ない天然のＤ−グ
ルコサミンの製造が可能となる。
第１図、第２図および第３図は、それぞれペニシリウム
八Ｆ９−Ｐ−１１２、Ａｒ１−Ｐ−１１５およびＡｒ１
−Ｐ−１２８の生産した糖化型キトサン分解酵素の酵素
活性とｐ＋＋との関係を示すグラフ；第４図、第５図お
よび第６図は、それぞれペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１
２、八Ｆ９−Ｐ−１１５およびＡｒ１−Ｐ−１２８の生
産した糖化型キトサン分解酵素の酵素活性と温度との関
係を示すグラフ；および第７図は、ペニシリウムＡＦ９
−Ｐ−１１２、Ａｒ１−Ｐ−１１５およびＡｒ９−Ｐ−
１２８の生産した各糖化型キトサン分解酵素をキトサン
に作用させたときの分解産物の分析結果を示すＴＬＣ分
析パターンである。 ５ 第 「 図 Ｈ 第２図 ■ 第 図 Ｈ 第４図 温 度 （’Ｃ）
八Ｆ９−Ｐ−１１２、Ａｒ１−Ｐ−１１５およびＡｒ１
−Ｐ−１２８の生産した糖化型キトサン分解酵素の酵素
活性とｐ＋＋との関係を示すグラフ；第４図、第５図お
よび第６図は、それぞれペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１
２、八Ｆ９−Ｐ−１１５およびＡｒ１−Ｐ−１２８の生
産した糖化型キトサン分解酵素の酵素活性と温度との関
係を示すグラフ；および第７図は、ペニシリウムＡＦ９
−Ｐ−１１２、Ａｒ１−Ｐ−１１５およびＡｒ９−Ｐ−
１２８の生産した各糖化型キトサン分解酵素をキトサン
に作用させたときの分解産物の分析結果を示すＴＬＣ分
析パターンである。 ５ 第 「 図 Ｈ 第２図 ■ 第 図 Ｈ 第４図 温 度 （’Ｃ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ペニシリウム属に属する糖化型キトサン分解酵素生
産菌を培養し、この培養物から糖化型キトサン分解酵素
を採取することを特徴とする糖化型キトサン分解酵素の
製造方法。 ２、前記糖化型キトサン分解酵素生産菌がペニシリウム
ＡＦ９−Ｐ−１１２（微工研菌寄第１１３７４号）、ペ
ニシリウムＡＦ９−Ｐ−１１５（微工研菌寄第１１３７
５号）またはペニシリウムＡＦ９−Ｐ−１２８（微工研
菌寄第１１３７６号）であることを特徴とする請求項１
記載の糖化型キトサン分解酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8153090A JPH03280877A (ja) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | 糖化型キトサン分解酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8153090A JPH03280877A (ja) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | 糖化型キトサン分解酵素の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03280877A true JPH03280877A (ja) | 1991-12-11 |
Family
ID=13748874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8153090A Pending JPH03280877A (ja) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | 糖化型キトサン分解酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03280877A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0885954A1 (en) * | 1997-06-16 | 1998-12-23 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Chitinolytic enzymes production by Penicillium janthinellum |
| CN1300311C (zh) * | 2005-06-14 | 2007-02-14 | 浙江大学 | 壳聚糖内切酶的制备方法 |
-
1990
- 1990-03-29 JP JP8153090A patent/JPH03280877A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0885954A1 (en) * | 1997-06-16 | 1998-12-23 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Chitinolytic enzymes production by Penicillium janthinellum |
| CN1300311C (zh) * | 2005-06-14 | 2007-02-14 | 浙江大学 | 壳聚糖内切酶的制备方法 |
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