JPH03280889A - グリシンの生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグリシノニトリルから微生物を用いることによ
りグリシンを製造する方法に関するものである。グリシ
ンは食品添加物、医農薬合成原料として重要なものであ
る。

〔従来の技術とその問題点］ グリシンの工業的製造法としては、従来青酸、ホルムア
ルデヒドおよびアンモニアを主原料にしたストレッカー
法によりグリシノニトリルを合成し、続いて苛性アルカ
リを用い加水分解する方法が知られている。この方法に
おいては、反応液の著しい着色、副反応によるイミノジ
酢酸等の副生および大量に生成する塩類の処理等が大き
な問題となり、脱色や副反応物の除去のための精製工程
に高度な技術を必要とする。

一方、グリシノニトリルの微生物的加水分解によるグリ
シンの製造法として、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｊ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属やコリネバクテリウム（Ｃ。

ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓ）属の微生物を用いる方法
（特公昭５Ｂ−１５１２０号、特開昭６１４６２１９１
号各公報参照）が知られている。しかしながら、これら
の方法は、グリシンの生成活性が弱く、多量の菌体を用
い、グリシンの蓄積濃度も低いことなどにより、工業的
には実施し難い。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは、このような従来の製造方法に対し、副生
物の生成がなく、エネルギー的にも、また収率的にも工
業的に有利なグリシンの製造方法の開発を目的として、
グリシノニトリルの加水分解によりグリシンを生成する
活性が高く、且つ生成したグリシンを分解、資化する活
性を持たない微生物の探索と培養および反応条件の研究
を鋭意行った。その結果、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃ　ｔ
ｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏ＋ａｏｎａ
ｓ）属、エンテロバクタ−（Ｅｎ　ｔｅｒｏｂａｃ　ｔ
ｅｒ）属、アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ
）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　）属およびストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒｅｐ
　ｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物にグリシノニトリ
ルからグリシンを生産する高い能力があることを見出し
、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、微生物由来の加水分解酵素の作用
によりグリシノニトリルからグリシンを生成させる方法
において、使用する微生物がロドコッカス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属、カセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）属
、エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、
アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属ま
たはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
ｉＫに属し該ニトリルを加水分解する能力を有するもの
であること、を特徴とするグリシンの生物学的製造法で
ある。

本発明において使用される微生物は、上記の各属に属す
るグリシン生産菌であるが、具体的にはロドコッカスｓ
ｐ、　５Ｋ４９（微工研菌寄第１１３０３号）、ロドコ
ッカスｓｐ、　５Ｋ７０（微工研菌寄第１１３０４号）
、ロドコッカスｓｐ、　５Ｋ９２（微工研菌寄第１１３
０５号）、ロドコッカスｓｐ、　ＨＲＩＩ（微工研菌寄
第１１３０６号）、アルスロバクタ−ｓｐ、　Ｓに１０
３（＠工研菌寄第１１３００号）、アルスロバクターｓ
ｐ、　ＨＲＩ（微工研菌寄第１１３０１号）、アルスロ
バクタ−ｓｐ、　ＨＲ４（微工研菌寄第１１３０２号）
、カセオバクタ−ｓｐ、　ＢＣ４（＠工研菌寄第１１２
６０号）、シュードモナスｓｐ、　５ＫＩＯ（微工研菌
寄第１１３０７号）、シュードモナスｓｐ、　５ＫＩＩ
（微工研菌寄第１１３０８号）、シュードモナスｓｐ、
　５Ｋ１３（微工研菌寄第１１３０９号）、シュードモ
ナスｓｐ、　Ｓに３１（微工研菌寄第１１３１０号）、
シュードモナスｓｐ。

５Ｋ８７　（微工研菌寄第１１３１１号）、エンテロバ
クタｓｐ、　５Ｋ１２（微工研菌寄第１１２９９号）、
アシネトバクタ−ｓｐ、　ＢＣ９−２（微工研菌寄第１
１２６２号）、アルカリゲネスｓｐ、　ＢＣｌ２−２（
微工研菌寄第１１２７６号）、コリネバクテリウムニト
リロフィラス（ＡＴＣＣ２１４１９）およびストレプト
マイセスグリセウス（ＩＰｏ　３３５５）あるいはこれ
らの変異株を挙げることができる。

これらの微生物のうち、コリネバクテリウムニトリロフ
ィラス（ＡＴＣＣ２１４１９）およびストレプトマイセ
ス　グリセウス（ＩＦＯ３３５５）以外は、本発明者ら
により自然界から新たに分離されたものであり、それぞ
れ上記寄託番号にて工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されており、これらの微生物の菌学的性質は以下の
とおりである。

５Ｋ４９および５Ｋ７０菌株 Ｋ４９ Ｋ７０ 形 態 多形性桿菌 多形性桿菌 ダラム染色性 ＋ ＋ 芽 胞 運 動 性 オキシダーゼ カタラーゼ 十 十 ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓ　　ｃｙｃｌｅ 集落の周辺の伸長 認めず 認めず 嫌気下での成育 ガラクトース 十 十 キ ノ ン 系 ＭＫ−８（Ｈ２） ＭＫ−８（Ｈｚ） 形　　　　　態 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 鞭毛 オキシダーゼ カタラーゼ Ｆ 光沢あり 半透明 淡黄白色 桿菌 十 極毛 ＋ 十 光沢あり 半透明 白色 桿菌 ＋ 極毛 ＋ ＋ 肉汁寒天斜面培養 における生育状態 Ｋ８７ 発育中程度 表面粗 光沢あり 半透明 濃茶白色 形　　　　　態 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 鞭　　　　　毛 オキシダーゼ カタラーゼ Ｆ 桿 極 ５に１２ｉＩ株 Ｋ１２ 形　　　　　態 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 オキシダーゼ カタラーゼ Ｆ グルコースからのガスの産生 インドール産生 桿菌 メチルレッド −Ｐ クエン酸塩利用 硫化水素産生 尿素分解 フェニルアラニン脱アミノ リジン脱炭酸 アルギニンジヒドロラーゼ オルニチン脱炭酸 ＢＣ９−２およびＢＣｌ２−２菌株 Ｃ９−２ Ｃ１６−２ 形　　　　　態 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 鞭毛 オキシダーゼ カタラーゼ ○Ｆ 桿菌 桿菌 ＋ 周毛 ＋ 十 アルカリ化 ３−ケトラクトース　　　ＮＴ の産生 キノン系　　　　ＮＴ　　　Ｑ−８ ＮＴ：　　試験せず 以上の菌学的性質をバーシーズ・マニュアルオプ　シス
テマティック　バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　
Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　５ｙｓｔｅ＋ｌ１ａｔｉｃ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

１９８６）に従って分類し、５Ｋ４９．５Ｋ７０５Ｋ９
２およびＨＲＩ　１株はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ）　Ｊｉｉ、５Ｋ１０３、ＨＲＩおよびＨＲ４
株はアルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属
、８Ｇ４株はカセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ
）属、５ＫＩＯ，５Ｘ１１．５Ｘ１３．５Ｋ３１および
５Ｋ８７株はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）属、５Ｋ１２株はエンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ）属、ＢＣ９−２株はアシネトバクタ−（Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）およびＢＣｌ２−２株はア
ルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）属に属する
細菌とそれぞれ同定した。

本発明に使用される微生物の培養には、ニトリル化合物
、またはアミド化合物等の酵素誘導物質、通常資化しう
る炭素源、窒素源および微生物の生育に必要な無機栄養
素を含有する培地が用いられる。培養は好気的条件下で
ｐＨ４〜１０、温度２０〜５０°Ｃで、それぞれの微生
物に適した範囲に制御しつつ行えばよい。

加水分解反応は、上記により微生物を培養し、その培養
液、培養液から分離した面体または菌体処理物（菌体破
砕物、抽出酵素）または常法により固定化した菌体ある
いは酵素をを水、緩衝液または生理食塩水に懸濁し、こ
れにグリシノニトリルを共存させればよい。

グリシノニトリルに前記菌体等を作用させる条件として
は、菌体等を乾燥菌体換算０．０１〜１０重量％、グリ
シノニトリル０．１〜２０重量％を含む水性懸濁液を温
度氷点〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃、ｐｌ（５〜
１１、好ましくは６〜１０で、０．５〜５０時間反応さ
せればよい。

かくして、グリシノニトリルは、はぼ１００％のモル収
率でグリシンとアンモニアに転換され、グリシンアンモ
ニウム塩の高濃度水溶液として生成蓄積させることがで
きる。グリシンアンモニウムを含有した反応液からのグ
リシンの単離は濃縮、イオン交換、抽出、晶析などの公
知の方法を利用することにより目的物であるグリシンを
取得できる。

〔発明の作用及び効果〕

本発明は、グリシノニトリルの加水分解活性を有する微
生物を用いることを特徴とし、グリシノニトリルからグ
リシンを生成せしめるものであり、反応活性およびグリ
シンへの選択性が高い上に、グリシンの蓄積濃度が極め
て高く、工業的に十分満足し得るグリシンの製造方法を
提供するものである。

〔実験例〕

以下の例により本発明を具体的に説明するが、本発明は
これらの例のみに限定されるものではない。

実施例１ （１）培養 表−１に示す各微生物を下記のプレート培地に接種し、
培養した。

培地 グリセロール ２−クロロプロピオニトリル 酵母エキス に、ＨＰＯ。

ａｇＳＯａ ＭｇＣ１゜ ａＣ１ｚ ＭｎＳＯｍ　’　４ＨｘＯ ＦｅＣＩｓ　’　ＩＨｚＯ ｎＳＯ４ 寒天 Ｒ 培養 ３０’Ｃ／３日間 （２）　　グリシノニトリルの加水分解各プレートより
菌体を一定量採取し、各々０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
）ｌ　７．７）で洗浄した後、遠心分離して菌体を集め
、１ｄの上記リン酸緩衝液に懸濁した０次に、２００ｍ
Ｍグリシノニトリルを含む０．０５５ｇ／ｊ！ ０．５ｄ＃２ ０．２ｇ＃７ ３　ｇ／ｊ！ ０．３ｇ／ｊ！ ０．２ｇ／ｆ ４０■／！ ４■／１ ０．７　■／２ ０．１■／１ １　Ｂ　ｇ／Ｉ！ ７．２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）　０．５ｄに上記菌体懸
濁液を０．５ｄ添加して３０°Ｃで４８時間反応させた
１反応終了後、それぞれの反応液を遠心分離して菌体を
除去した後、上清液を液体クロマトグラフィーにて分析
し反応液中のグリシンを測定した。結果を表−１に示し
た。

表−１ 車生成グリシン量 ＋ ７０、１−０．５　ｇ／ｌ！ ＋＋ 二０．５〜１．０ｇ／７！ ＋＋＋：１．０〜３．０ｇ／ｌ 実施例２ （１ン　培１−１ ０ドコツカスＳρ。

した。

培地 プロピオニトリル グルコース 酵母エキス Ｍｇ５０ｇ・７Ｈ２０ ＫＨ，ＰＯ。

５Ｈ９２株を下記の条件で培養 １０ｄ／１ １０ｇ／Ａ ５ｇ／１ ０．５ｇ／１ ０、８　ｇ　／　１ に２ＨＰ０．　　　　　　　　　　　　　　　２．５　
ｇ　／　ｆｆ１ｐＨ７，５ 培養 ３０°Ｃ／３日間 （２）グリシノニトリルの加水分解 培養終了後、得られた培養液から遠心分離によって菌体
を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，７）で洗浄
した後、乾燥重量として０．８重量％となるように前記
緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液６０戚にグリシノニ
トリル１．７ｇを添加し、４０°ＣでｐＨを７．９〜８
，１に制御しながら反応を行ったところ、反応開始６時
間でグリシノニトリルはほぼ完全に加水分解し、モル収
率はぼ１００％でグリシンが生成していた。さらに、こ
の時点で１．７ｇのグリシノニトリルを添加して反応を
継続したところ、反応開始後１３時間で９０　ｇ　／　
ＩＶ、のグリシンが生成した。

反応はまだ進行するようであったので、さらに、３４４
ｇのグリシノニトリルを反応開始後１３時間目に添加し
て反応を継続したところ、反応開始後３０時間で１４８
　ｇ　／　ｆのグリシンが生成、蓄積した。

グリシンの収率はほぼ１００％であり、副生物としての
グリシンアミドはほとんど生成しなかった。

実施例３ 実施例２と同様の方法で培養したロドコッカスｓｐ、　
５Ｈ９２株の培養液から遠心分離によって菌体を集め、
０．０５Ｍリン酸緩衝Ｋ１．（ｐＨ７，７）で洗浄した
ものを活性菌体液として反応に供した。すなわち、乾燥
菌体量として０．８重量％の活性菌体および１２．０重
量％のグリシノニトリルを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を調製し、４０°ＣにてｐＨを７．９〜
８、１に制御しつつ４２時間反応させたところ、１６８
ｇ　／　ｌのグリシンを生成、蓄積した。なお、未反応
のグリシノニトリルおよびグリシンアミドの副生はほと
んど認められず、反応はほぼ定量的に進行し完結してい
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 微生物由来の加水分解酵素の作用によりグリシノニトリ
   ルからグリシンを生成させる方法において、使用する微
   生物がロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ア
   ルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、カセ
   オバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモ
   ナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エンテロバクタ
   ー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネトバクター
   （Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（
   Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃ
   ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはストレプトマ
   イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し該ニトリ
   ルを加水分解する能力を有するものであること、を特徴
   とするグリシンの生物学的製造法。