JPH0353889A - ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの
製造法に関する。さらに詳しくは、微生物由来の脱ハロ
ゲン化酵素の４１用により、シアン化アルカリの存在下
に１．３−ジハロ−２−プロパノールから生化学的に４
−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法
に関する。

４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、２種の異
なる官能基をもつ化合物であることから、種々の医薬品
や生理活性物質の合成原料として有用な物質であり、特
にＬ−カルニチンの合或原料として有用であることが知
られている（特開昭５７−１６５３５２号公報参照）。

（従来技術と問題点） 従来、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造
する方法としては、下記のような（１）〜（３）の方法
が知られている。

（］）　１　．　３−ジクロロ−２−プロパノールを水
溶液中シアン化アルカリと共に加温反応させる方法（特
公昭３６−２１７１８号公報参照）。

（２）　３−クロロ−１，２−プロパンジオールに塩化
トシルを作用させて１位のアルコールをトシル化したの
ち、シアン化アルカリと反応させる方法（特開昭５７−
１６５３５２号公報参照）。

（３）エピクロルヒドリンと青酸とを触媒量のシアン化
カリウムの存在下に反応させる方法（Ｆ．ビノン（Ｂｉ
ｎｏｎ）　　ら、ハイルテン・デス・ソシェテス・デス
・シくケス・ヘルジェス（Ｂｕｌｌ．　Ｓｏｃ．　Ｃｈ
ｉｍ．Ｂｅｌｇｅｓ），　Ｖｏｌ　７２，　１６６−１
７７（１９６３）参照〕。

しかし、（１）の方法では収率が約４０％と低いこと、
（２）の方法では二つの工程からなり反応が煩雑である
上に、総合収率も約４５％と低いこと、（３）の方法で
は操作、取扱い上危険な青酸を使用すること、副生物の
生威防止のための反応条件のコントロールが困難である
こと、などの問題点を有し、工業的実施に有利な方法と
は云い難い。さらに（１）〜（３）の方法はいずれも化
学的製造法であり、プロキラルまたはラセξ体原料から
では光学活性体を得ることはできない。

（発明の概要） そこで本発明者らは、４−ハロ−３−ヒド口キシブチロ
ニトリルの有用性、特に光学活性体が種々の医薬晶合威
の中間体として有用なる点に着目し、４−ハロ−３−ヒ
ドロキシプチ口ニトリルの製造法について鋭意検討を重
ねた。その結果、微生物の酵素作用を利用する新規な製
造法を見出した。ずな３ シアン化アルカリの存在下に微生物由来の脱ハロゲン化
酵素の作用により４−ハロ−３−ヒトロキソブヂロニト
リルに転化させ、これを採取することを特徴とずる４−
ハロ−３−ヒトロキシブチロニトリルの製造法、である
。

一般に、ハロゲン基を水酸基に変換する酵素は脱ハロゲ
ン化酵素として知られているが〔酵素ハンドブンク，６
２７頁（朝倉書店）、Ｔ．横田ら．アグリ力ルチュラル
・アンド・ハイオロジカル・ケ旦ストリー（Ａｇｒｉｃ
．旧ｏ１．Ｃｈｅｍ．）Ｖｏｉ．５０．４５３４６０（
１９８６）参照）　、１．３−ジハロ−２−プロパノー
ルを基質として３−ハロ−１，２−プロパンジオールに
変換する反応は従来全く知られておらず、本発明者らに
より初めて見出され、先に特許出願した（特願平１−１
００１７３号明細書参照）。しかしながら、さらに驚く
べきことに本酵素をシアン化アルカリの存在下に１．３
−ジハロ−２−プロパノールに作用させるとハロゲン基
が水酸基でなく、二トリル基で変換されることを新たに
見出し、本発明に至ったの４ である。本発明の方法によれば、常温、中性付近のｐｎ
で極めて効率よく反応が行えるので、化学的方法に比し
有利であり、また、特に光学活性の４ハロー３−ヒドロ
キシブチロニトリルを安価なプロキラル化合物１．３−
ジハロ−２−プロパノールから理論的には１０ｏｚの収
率で製造することが初めて可能となった。

（発明の具体的説明） 本発明でいう脱ハロゲン化酵素とは１，３−ジハロ２−
プロパノールのハロゲン原子一個を最終的にニトリル基
に転換し得る酵素である。具体的には、例えば、本発明
者らにより新たに分離、見出されたコリネハクテリウム
属に属する微生物、Ｎ−６５３ならびにＮ−１０７４株
、およびミクロバクテリウｌ．属に属する微生物、Ｎ−
４７０１株等の産生ずる酵素を挙げることができる。こ
れらの微生物番よ、工業妓術院微生物工業技術研究所（
微工研）に、それぞれ微工研菌寄第１０３９０号（コリ
ネバクテリウＡｓｐ．Ｎ−６５３）　、ｔ散工研菌富第
１０３９］−冒（コリ不ハクテリウムｓｐ．　Ｎｌ０７
４）および微工研菌寄第１０６７４５（鎚クロハクテリ
ウムｓｐ．　Ｎ−４７０１）として寄託されており、そ
の菌学的性質は以下に示す通りである。

鼾土顆一 形　　態　　　　　　　　　多形性桿菌集落の周辺細胞
　　　　　　　伸長せずダラム染色性　　　　　　　　
　　十 抗　　酸　　性 芽　　　胞　　　　　　　　　認めず 運　　動　　性　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　十オキシダーゼ カタラーゼ　　　　　　　　　　　＋ ＯＦ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ嫌気下での生育 全細胞の塩酸加水分解物中の ｍ　ｅ’　ｓ　ｏ−ジアミノピメリン酸の存在細胞壁の
ジアミノ酸　　　　　ジアミノ酪酸グリコリル試験　　
　　　　　−（アセチノレ型）デンプン分解 ゼラチン液化　　　　　　　　　　１一セルロースの分
解 尿素分解 スキムミルク培地中での 耐熱性 ６３゜Ｃ　　３０分間 ７２゜Ｃ　　１５分間 Ｎ−１０７４ 形　　　態　　　　　　　　　多形性桿菌集落の周辺細
胞　　　　　　　伸長せずダラム染色性　　　　　　　
　　　十 抗　　酸　　性 芽　　　　　胞　　　　　　　　　　　　　　　認めず
運　　動　　性　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　十オキシダーゼ カタラーゼ　　　　　　　　　　　＋ 〇Ｆ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ嫌気下での生育 全細胞の塩酸加水分解物中の ｍｅｓｏ−ジア≧ノビメリン酸の存在 細胞壁のジアミノ酸　　　　　ジアξノ酪酸７ グリコリル試験 デンプン分解 ゼラチン液化 セルロースの分解 尿素分解 スキムミルク培地中での 耐熱性 ６３゜Ｃ　　３０分間 ７２゜Ｃ　　１５分間 Ｎ−４７社 形　　　　　態 集落の周辺細胞 ダラム染色性 芽　　　　　胞 運　　動　　性 鞭毛 集落の色 オキシダーゼ カタラーゼ ＯＦ （アセチル型） 多形性桿菌 伸長せず ＋ 認めず ＋ 極〜側毛 黄橙色 」一 十 Ｏ ８ 嫌気下での生育 全細胞の加水分解物中の ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸の存在 細胞壁のジアミノ酸　　　　　リジン グリコリル試験　　　　　＋（グリコリル型）デンプン
分解　　　　　　　　　　十 ゼラチン液化 硝酸塩還元 アルギニン利用　　　　　　　　　十 硫化水素産生 尿素分解 スキムミルク培地中での 耐熱性　６０゜Ｃ　　３０分間 酸の産生 イヌリン　　　　　　　　　　　＋ グリセロ−ル グルコ−ス　　　　　　　　　　＋ シュ−クロース　　　　　　　　１ トレハロ−ス　　　　　　　　　　＋ ラフィノ−ス　　　　　　　　　＋ 以上の菌学的性質をバージェーズ・マニュアル・オブ・
システマティック・バタテリオロジーＶｏｌ．　２（ｌ
９８６）　　（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　Ｖ
ｏｌ．２　　（１９８６）　　）に従って検索すると、
Ｎ−６５３ならびにＮ−１０７４株はコリネバクテリウ
ム属およびＮ−４７０１株はごクロバクテリウム属にそ
れぞれ属する細菌と同定された。

上記微生物を培養するための培地組威としては通常これ
らの微生物が生育しうるものであれば何でも使用できる
。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シ
ュークロース、マルトース等のＦ類、酢酸、クエン酸等
の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール
類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス
、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然窒素源の他
に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用でき、この
他無機塩、微量金属塩、ビタごン等が必要に応して適宜
使用される。この際高い酵素活性を誘導させるために、
１，３−ジクロロ−２−プロパノール、３−クロロ−１
，２−プロパンジオール等を培地に添加ずることも有用
である。

上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ４〜
１０、温度２０〜４０゜Ｃの範囲にて好気的に１０〜９
６時間培養する。

本発明で使用する１．３−ジハロ−２−プロパノールは
１，３−ジクロロ−２−プロパノール、■，３−ジフロ
モ２−プロパノール等である。また、シアン化アルカリ
はシアン化カリウム、シアン化ナ１・リウｌ、等である
。

１．３−ジハロ−２−プロパノールに脱ハロゲン化酵素
を作用させて４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
を得る方法としては、上記のように培養して得た微生物
の培養液あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液
に基質およびシアン化アルカリ（以下基質等という）を
添加する方法、菌体処理物（例えば菌体破砕物、粗酵素
・梢製酵素等の菌体抽出物等）あるいは常法により固定
化した菌体または菌体処理物等の懸濁液に基質等を添加
する方法、微生物の培養時に基質等を培養液に添加して
培養と同時に反応を行う方法等がある。

１１ 反応液中の基質の濃度は特に限定するものではないが、
０．１〜１．０（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、また、シアン
化アルカリの使用量は通常基質の１〜３倍量（モル）で
ある。基質等は反応液に一括して加えるか、あるいは分
割添加することができる。

反応温度は５〜５０゜Ｃ、反応ｐｌ＋は４〜１０の範囲
で行うことが好ましい。

反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反
応条件等によって変わるが、通常１〜１２０時間で總了
するように条件を設定するのが好ましい。

かくして反応液中に４１Ｅ威、蓄積した４−ノ＼ロー３
ヒドロキシブチ口ニトリルは、公知の方法を用いて採取
および精製することができる。例えば、反応液から遠心
分離などの方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルな
どの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することに
より４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのソロツ
プを得ることができる。また、このシロノプを滅圧ドに
蕩留することによりさらに精製することもできる。

１２ 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの例のみに限定されるものではない。

実施例１ グルコース１％、ペプトン０．５％、肉エキス０．３％
、酵母エキス０．　３％からなる培地をｐｌ１７．０に
調整して、５００一三角フラスコにｌ００ｍｌずつ分注
し、１２０゜Ｃで１５分殺菌後、メンプランフィルター
にて除菌した２５　（Ｗ／Ｖ）％の３−クロロー１．２
−プロパンジオール水溶液を０．　８　ｍＱ添加した。

上記培地にそれぞれＮ−６５３およびＮ−１０７４菌株
を接柚し、３０゜Ｃにて４　８Ｌ’ｉ間似とう’；’ｉ
　ｈを行った。これらの培養液をそれぞれ遠心分離して
菌体を集め１００ｍ　Ｍのリン酸緩衝液１００ｍｆｆｉ
で１回洗浄後、０．５（Ｗ／Ｖ）％の１，３−ジクロロ
ー２−プロパノールおよび０．５％シアン化カリウムを
含む溶液．（ＩＭリン酸緩衝液，　ｐｉｆ　７．　８　
ＨＯＯｍｆに菌休を懸濁・し、２０゜Ｃで２２〜２３時
間攪拌して反応を行った。

反応後、反応液から菌休を遠心分離によって除去し、上
清中の生威４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
をガスクロマ１・グラフィーにて定量した結果、基質か
らの収率はそれぞれ２５．８％および７８．５％であっ
た。

実施例２ 実施例１と同様にして得た培地にＮ−４７０１菌株を接
種し、３０゜Ｃにて４８時間振とう培養を行った。この
培養液８０ｄを遠心分離して菌体を集め、１００１のト
リスー１１Ｃ１緩衝液（ｐｔｌ　８．０）８０成で１回
洗浄後、１．０（Ｗ／Ｖ）％の１，３−ジクロロ−２−
プロパノールおよび０．　５％のシアン化ナトリウムを
含む溶液（ＩＭトリスーＨＣＩ緩衝液，　ｐＨ　８．０
）　４０戚に菌体を懸濁し、２０゜Ｃで２０時間攪拌し
て反応を行った。

反応後、反応液から菌体を遠心分離によって除去し、上
清中の生或４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
をガスクロマトグラフィーにて定量した結果、基質から
の収率は８０％であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）１，３−ジハロ−２−プロパノールをシアン化ア
   ルカリの存在下に微生物由来の脱ハロゲン化酵素の作用
   により４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルに転化
   させ、これを採取することを特徴とする４−ハロ−３−
   ヒドロキシブチロニトリルの製造法。
2. （２）微生物がコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ）属またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃ
   ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である請求項１記載の製造
   法。