JPH03280893A - ペプチドの新規製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、ペプチドの新規製造方法に関するものである
。

［従来の技術および問題点］ 現在、生理活性ペプチドを得るには、一般に、天然より
抽出分離するか、有機化学合成的な手法によるか、また
は、遺伝子組換えを利用した製造方法を利用している。

しかし、分子量が２０００〜１００００の生理活性ペプ
チドを、動物の臓器よりの抽出や、有機化学合成により
大量に生産することは、コスト面より採算が採れず、ま
た、遺伝子組換えによる生産も、そのまま、原核細胞内
で発現させた場合、分解してしまい、入手困難なことか
ら、β−ガラクトシダーゼ等との融合蛋白を予め生産し
、これを分解、精製して得るといった効率の悪い製法で
入手せざるを得なかった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者は、経済効率の高い遺伝子組換えによる生産方
法について、鋭意検討を行った結果、分子内にＬ−メチ
オニンならびにコラゲナーゼ認識部位を有しない分子量
２０００〜１００００のぺ・、プチドの製造に当たって
は、原核細胞内で発現可能なポリペプチドのＣ末部に、
Ｌ−メチオニンと上記分子量２０００〜１ｏｏｏｏのペ
プチドを配する通常の融合蛋白生産方法ではなく、更に
そのＣ末端にコラゲナーゼ認識部位に相当するアミノ酸
配列を配し、このＬ−メチオニンからコラゲナーゼ認識
部位に至る配列を１〜５０回程度繰り返し連結した融合
蛋白を原核細胞内で発現せしめ、該融合蛋白を精製し、
ブロムシアンならびにコラゲナーゼにより分解、消化し
て得られるペプチド混合物より、さらに上記分子量２０
００〜１００００のペプチドを精製することで、大量生
産が可能になることを見いだし、本発明を完成した。

即ち、本発明は、分子内にＬ−メチオニンならびにコラ
ゲナーゼ認識部位を有しない分子量２０００〜１０００
０のペプチドの新規製造方法であって、原核細胞内で発
現可能なポリペプチドのＣ末部に、Ｌ−メチオニンと上
記分子量２０００−１００００のペプチドとコラゲナー
ゼ認識部位に相当するアミノ酸配列を１〜５０程度繰り
返し連結した融合蛋白を原核細胞内で発現せしめ、該融
合蛋白を精製し、ブロムシアンならびにコラゲナーゼに
より分解、消化して得られるペプチド混合物より、さら
に上記分子量２０００〜１００００のペプチドを精製す
る方法である。

上述した本発明の方法、および以下の説明においては、
Ｈｉｓは、Ｌ−ヒスチジン、Ｓｅｒは、Ｌ−セリン、Ａ
　ｓ　ｐはＬ−アスパラギン酸、ＡｈａはＬ−アラニン
、Ｖａｌは、Ｌ−バリン、Ｐｈｅは、Ｌ−フェニルアラ
ニン、Ｔｈｒは、Ｌ−スレオニン、Ａｓｎは、Ｌ−アス
パラギン、Ｔｙｒは、Ｌ−チロシン、Ａｒｇは、Ｌ−ア
ルギニン、Ｌｅｕは、Ｌ−ロイシン、Ｌｙｓは、Ｌ−リ
ジン、Ｇｌｎは、Ｌ−グルタミン、１１ｅは、Ｌ−イン
ロイシン、Ｐｒｏは、プロリンをそれぞれ意味する。

以下に、本発明のペプチドの新規製造方法について、説
明する。

ｌ）構造遺伝子 ｉ）遺伝子の設計 本発明の方法は、ペプチドの新規製造方法であり、天然
には存在しない融合蛋白を予め生産し、それを分解する
ことで所望のペプチドを得るため、その構造遺伝子なら
びにコラゲナーゼ認識部位を有する遺伝子を合成しなけ
ればならないが、所望のペプチドを構成するアミノ酸を
コードするＤＮＡ配列のうち、大腸菌での利用度の高い
配列を選び、また、Ａ−Ｔ塩基対に富む領域が連続しな
いこと、また、この構造遺伝子を合成するための部品と
なる合成フラグメントが分子内自己相補性塩基配列を有
しないこと、繰り返し配列を有しないこと、３０塩基程
度の大きさになることに留意して設計する。

従って、本発明で使用する所望の新規ペプチドの構造遺
伝子およびそれにつながるコラゲナーゼ認識部位を有す
る遺伝子の好ましい具体例は、後記の実施例に示した塩
基配列のものである（図中、この構造遺伝子は、Ｈｉｓ
に対応するＣＡＣからＡｓｎに対応するＡＡＣの部分ま
でであり、コラゲナーゼコラゲナーゼ認識部位は、それ
に統くＧＧＴＣＣＧまでである）。

この構造遺伝子ならびにコラゲナーゼ認識部位を有する
遺伝子を発現させる方法は、例えば、ヒトＴＮＦの構造
遺伝子のＣ末にこの遺伝子を挿入して、融合蛋白として
発現させることができる。

すなわち、まず、構造遺伝子の５′末端側には、臭化シ
アン分解のためのＭｅｔ（Ｌ−メチオニン）のコドンを
設ける。

ｉｉ）合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、十−再調
のそれぞれについて、これをいくつかの７ラグメントに
分けてこれらを化学的に合成し、各々の７ラグメントを
結合する方法によればよい。

各鎖は、１８〜３０塩基からなり、各々が１０〜１２塩
基ずつ重なるように、８個徨度の７ラグメントに分ける
のが好ましい。

各７ラグメントの合成法としては、固相法、液相法によ
る合成方法があるが、ホスホルアミダイト法による固相
合成法によるのがもっとも好ましい。

１ｉｉ）精製 ７ラグメントを合成する際、鎖長が長くなると不純物が
多くなり、一般的に精製が困難になるが、精製するには
、ホスホルアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成
の中間体である５′水酸基の保護基の付いたオリゴヌク
レオチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰ
ＬＣ）で分取し、保護基を除いた後、更に陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーを用いて分取した後、脱塩す
ることで達成出来る。

ｉｖ）リン酸化および結合 ５′末端フラグメントを除く各７ラグメントは、Ｔ４−
キナーゼでリン酸化し、それぞれの反応液において、酵
素を不活性化した後、５′末端フラグメントを加えて、
混合し、脱塩した。脱塩した７ラクシヨンを濃縮し、９
０〜１００　’Ｏ加熱したうえでゆっくり冷却して、ア
ニールさせ、さらにＴ　Ｉ−Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用い
て反応させることにより結合し、構造遺伝子ならびにコ
ラゲナーゼ認識部位を有する遺伝子断片として得ること
ができる。

Ｖ）ヒトＴＮＦ発現系を有するベクターの調製本発明に
おいては、例えば、ヒト染色体ＤＮＡ由来のＴＮＦの構
造遺伝子とその発現のためのプロモーター等の発現シス
テムを有し、大腸菌内で増殖可能なさまざまなプラスミ
ドを用いることが可能であり、それらのプラスミドを調
製するにあたっては、公知の常法に従って行うことがで
きる。

即ち、ヒトＴＮＦの構造遺伝子の適当な場所（特に、Ｃ
末端が望ましレリに、目的とするペプタイドの構造遺伝
子ならびにコラゲナーゼ認識部位を有する遺伝子を組み
込むことで、ヒトＴＮＦとの融合蛋白を発現するプラス
ミドが作られる。

３）プラスミド組換え分子 例えは、前記のヒトＴＮＦの構造遺伝子を、プロモータ
ーを含む発現システムの下流に目的とするペプチドの構
造遺伝子およびコラゲナーゼ認餉部位を有する遺伝子を
１〜５０程度連結するよう別途に調製したプラスミドに
一般の遺伝子組換えの操作によって組込むことにより、
融合蛋白全私用のプラスミド組換え分子を構築する。

４）形質転換 ｉ）宿主菌 こうして得られた融合蛋白の遺伝子を組込んだプラスミ
ド組換え分子、例えばｐＴＧＶ８を用して、形質転換さ
せる宿主細胞としては、大腸菌得ＲＲＩＡＭ１５（ＡＴ
ＣＣ３５１０２）、ＪＭＩｏｌ、ＪＭ１０５等の大腸菌
Ｋ１２株の誘導体であって、ラクトースオペロンのレプ
レッサー活性の高いｌａｃ　　ｉｑの宿主が望ましい。

ｉｉ）形質転換 常法により形質転換する。

５）ペプチドの産生 ｊ）形質転換体の培養 形質転換体の培養に当たっては、Ｌ−培地、Ｍ９培地、
Ｍ９−カザミノ酸培地、高リン酸培地、高リン酸−カザ
ミノ酸培地等を用いることができ、これにイソプロピル
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に培養する
ことにより、融合蛋白を量産することができる。

ｉｉ）融合蛋白の精製 大腸菌で発現した融合蛋白は、大腸菌を超音波破砕後、
遠心分離することによって、水不溶性画分として得るこ
とができ、この操作により大腸菌中の多くの水可溶性蛋
白との分離が可能である。

ｉｉ）融合蛋白の分解 融合蛋白を分解し、目的のペプチドを切り出すためには
、上記のように精製した融合蛋白のＭｅｔ結合をブロム
シアンを用いて分解し、さらに、コラゲナーゼ消化する
ことで得られる。

１１】）本発明のペプチドの精製 融合蛋白を上記のように分解して得られたペプチド混合
物より本発明の化合物を精製するには、逆相ＨＰＬＣお
よび陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（陽イオ
ン交換ＨＰＬＣ）に付すことによりなされるが、更に、
抗ＶＩＰ抗体を用いたイムノアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーに付すことにより、効率的な精製を達成
することができる。

ｉｖ）本発明のペプチドの確認 このようにして、得られた本発明のペプチドはアミノ酸
組成分析、エドマン分解によるアミノ酸配列分析および
抗ＶＩＰ抗体よるイムノアッセイにより、確認すること
ができる。

以下、実施例を示し、具体的に本発明を説明する。

［実施例］ 所望のペプチドの構造遺伝子とＢｒＣＮ反応部位とコラ
ゲナーゼ認識部位を含み終止コドンを持たない遺伝子の
製造 ｉ）フラグメントの合成 所望のペプチドとして選んだＶＩＰ誘導体Ｈ−Ｈｉ　５
−３ｅ　ｒ−Ａｓ　ｐ−Ａ　］　ａ−Ｖａ　ｌ−Ｐｈｅ
−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＡｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌ　ａ−
Ｖａ　１−Ｌｙ　５−Ｌｙ　５−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−
Ａ　ｓ　ｎ−５ｅ　ｒ−１］　ｅ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ａ　ｓ
　ｎ−ＯＨの構造遺伝子とＢｒＣＮ反応部位並びにコラ
ゲナーゼ認識部位を含み終止コドンを持たない遺伝子（
後記第１図参照、以下遺伝子ｌとする。）の構成は、以
下に示す８フラグメントからなるがこのフラグメントの
合成は、ＤＮＡ合成ａ！（アプライドバイオシステム社
製、３８０Ａ）を用いて、ホスホルアミダイト法により
固相合成した。

１　　）　　５’−ＡＡＴＴＣＡ丁ＧＣＡＣＴＣＴＧＡ
ＣＧ２　）　５’　−ＣＡＧＴＧＡＡＴＡＣＡＧＣＧＴ
ＣＡＧＡＧＴＧＣＡＴＧ３　）５’−ＣＴＧＴＡＴＴＣ
ＡＣＴＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣ４）５’−Ｔ
ＧＴＴＴＡＣＧＣＡ（１，ＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧＴＴＣ
，Ｔ５）５′−ＴＧＣＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧ
ＴＴＡＡＧ６　）５’−ＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＡ
ＡＣＴＧＣＣＡＧＣ７）５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡ
ＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＣＧＧＡ８　）５
’−ＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧ
Ａ（１，Ｔ以上の７ラグメントの精製に当たっては、そ
れぞれ、ＤＮＡ合成機による固相合成終了後、得られた
塩基及び５′水酸基の保護基の付いたオリゴヌクレオチ
ドを含むアンモニア溶液を５５°Ｃ１５時間加熱して、
塩基の保護基を外し、反応後アンモニアを減圧留去した
後、逆相ＨＰＬＣに付して、５′水酸基の保護基のみ付
いたオリゴヌクレオチドを分取しｌ：。得られた７ラク
シヨンを８０％。

酢酸で室温１５〜３０分処理して、５′水酸基の保護基
を除去し、減圧留去後、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ
−２ｉｗ）に付し、オリゴヌクレオチド画分を得た。こ
れをゲル濾過カラム（セファデックスＧ２５）で脱塩し
て、それぞれのフラグメントを得た。

１１）リン酸化 上記２）〜７）のフラグメント各８００　ｐｍｏｆ２を
それぞれ６０ＷＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１０ｉＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ（２２，１５鱈　２−メルカプト
エタノール、０．０８ｉＭＡＴＰからなる混合液（緩衝
液ｌ）に加え、更に、Ｔ、−キナーゼ　２５単位（ＢＲ
Ｌ社製）を加えて、３７°０１：１５時間反応させた。

反応後、６５°０１１５分加熱して、酵素を不活化した
後、各反応液の１／２量及びｌ）、８）のオリゴヌクレ
オチドフラグメント各８００　ｐｍｏｆ２を混合し、ゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ５０）でまとめて、脱
塩した。

１１１）フラグメントの結合 脱塩後のフラクションを遠心濃縮機で濃縮後、更に、５
０１Ｍ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、１０　ｉ
Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ２２からなる緩衝液２５Δを加え、９
０°０１３分加熱後、ゆっくり冷却して、アニルさせた
。冷却後、反応液を２０１Ｍの濃度となるようジチオス
レイトールを加え、更に、１此の濃度となるようにＡＴ
Ｐを加えて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ８７５単位（タカラ社
製）を用いて、１６°Ｃ１２２時間反応させた。反応後
、６５℃１５分加熱し、酵素を失活させた。

ｉｖ）精製 反応液を厚さ２ｍｍの８％ポリアクリルアミド電気泳動
（ＰＡＧＥ）に付し、目的の長さ（１００ｂｐ）のバン
ドを切り出した。切り出したゲルから電気的にＮＡ−４
５ペーパー（Ｓ＆Ｓ社製）にＤＮＡを吸着させた後、ペ
ーパーを１ＭＮａＣＩ２．２０朋　トリス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）　、０．１ｉＭＥＤＴＡからなる高塩濃度
緩衝液中６５℃、５０分加熱することにより溶出した。

この溶液を７エノール及びフェノール−クロロホルム、
クロロホルムで不純物を除いた後、２．５倍量のエタノ
ールを加え、エタノール沈澱を行った。

■）リン酸化 このようにして得！＝遺伝子は、それぞれ、５″末端が
リン酸化されていないため、これを６０３！Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０Ｊ！間ＭｇＣＱ２．１５
州　２−メルカプトエタノール、０．０８１ＭＡＴＰか
らなる混合液に加え、更に、Ｔ４キナーゼ　６２．５単
位（ＢＲＬ社製）を加えて、３７°Ｃ，２，５時間反応
させた。反応後、６５°Ｃ１１５分加熱して、酵素を不
活化した後、ゲルー過カラム（セファデックスＧ５０）
で脱塩し、さらに、プラスミドｐＴＺ１８Ｒ３０＃を１
（ｌｊＩＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、ｌ　
Ｏｉ＋Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱ２．１　ｘＭ　ジチオスレイト
ール、１００ｉＭ１００ｉからなる混合液に加え、これ
に、制限酵素ＥｃｏＲＴ　４５０単位および制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌＩＩ　　４００単位を加えて、３７°ｃ、　２
時間３０分反応させた後、反応液を０．７％低融点アガ
ロースゲル電気泳動で分離し、約２．９ｋｂのバンドを
切り出し、６５°Ｃ５分の加熱によりゲルを溶かし、フ
ェノールを加え、遠心分離し、上層を更に、フェノール
クロロホルム、クロロホルムを用いて撹拌、遠心分離後
、その上層に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５
倍量のエタノールを加え、エタノール沈澱を行い、ＤＮ
Ａ断片（ｐＴ２１８Ｒ（Ｅ−Ｈ））を得た。

ｐＴＺ１８Ｒ（Ｅ−Ｈ）３００ｘｇを遺伝子１１１ｎｇ
とともに、ライゲーション緩衝液中で、Ｔ。

ＤＮＡリガーゼ　３５０ｕｎｉｔを用いて、１６’０゜
１９時間３０分反応させ、プラスミド（ｐＴＺ１８Ｒ−
遺伝子１）を含む反応液を得た。この反応液を用いて、
常法に従い、ＣａＣｕ５法により、大腸菌株ＲＲＩＡＭ
１５を形質転換し、５０ＡＩＩ／ｍＭのアンピシリンを
含有するし一プレート上で、白いコロニーとして形質転
換体を得た。

更に、得られた形質転換体より常法により、単鎖ＤＮＡ
を抽出し、ジデオキシ法にて塩基配列を確認し、下記遺
伝子フラグメント（ＶＩＰＧＰ）ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡ
ＣＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＣＴ（、ＡＣＡＡ
ＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＣＴＧＣＧＡＣＡＴ
ＡＡＧＴＧＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣＧＴＣＴＧＣ
ＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡ
ＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡ
ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＡＣＴＴＧＴＣＴ
ＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＡＧＧＡＣＴ
ＴＧＡＣＴＡＴＣＣＴＡＧ（ＶＩＰＧＦ） を含むプラスミド（ｐＴＺ　ｌ　８Ｒ−Ｖ　Ｉ　ＰＧＰ
）が目的とする遺伝子１を含むプラスミドであることを
確認し、組換え体ＲＲＩΔＭ１５（ｐＴＺ１８Ｒ−ＶＩ
ＰＧＰ）を得た。

ｖｉ）ベクターの調整 プラスミドｐＫＫ２２３−３　（７アルマシア社製）３
膚をｌＯ鰭　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）１０１Ｍ
ＭｇＣＩ２２、ｌ　ｘＨジチオスレイトール、１００ｘ
１０Ｏｘρからなる混合液に加え、これに、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　　４２単位および制限酵素Ｈ４ｎｄｍ　　６
０単位を加えて、３７℃、２時間４０分反応させた後、
反応液を０．７％低融点アガロースゲル電気泳動で分離
し、約４．５ｋｂのバンドを切り出し、６５℃５分の加
熱によりゲルを溶かし、フェノールを加え、遠心分離し
、上層を更に、フェノール−クロロホルム、クロロホル
ムを用いて撹拌、遠心分離後、その上層に１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５倍量のエタノールを加え、
エタノール沈澱を行い、ＤＮＡ断片（ｐＫＫ２２３−３
　（Ｅ−Ｈ））を得た。

ｐＫＫ２２３−３（Ｅ−Ｈ）　　１１００ｎをあらがじ
め、ＤＮＡ合成機により作成しておいたＤＮＡ７ラグメ
ント（読み枠のずれた終止コドン３個有する）、 ９　）　５’　−ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＴ
ＴＡＡＧＴＧＡＣＴＡＧｌ　０　）　５’−ＡＧＣＴＣ
ＴＡＧＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧ６．
７ｎｇとともに、ライゲーション緩衝液中で、Ｔ、−Ｄ
　Ｎ　Ａリガーゼ　３５０ｕｎｉｔを用いて、１６°ｃ
１１７時間反応させた。この反応液を用いて、常法に従
い、ＣａＣＯ２法により、大腸菌株ＲＲＩΔＭ１５を形
質転換し、５０Ａａ／ｍＱのアンピシリンを含有するし
一プレート上で、形質転換体を得た。

更に、得られた形質転換体よりアルカリンリシス法によ
り、プラスミド（ｐＳＴＰｌ）を抽出し、１０鰭・トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｘＭＭｇ（１２，１
１Ｍ　ジチオスレイトール、１００ｘＭ１０Ｏｘからな
る混合液に加えたのち、制限酵素ＥｃｏＲ１，制限酵素
Ｈｉ　ｎｄｎｌおよびＢ　ｇＱｌで処理しｌこところ、
それぞれ１カ所で切ることを確認し、組換え体ＲＲＩΔ
Ｍｌ　５　（ｐｓＴＰ　１）と確認した。

このプラスミド（ｐｓＴＰｌ）　　約２Ａｌｉを、１１
０１ｔトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、ＬＯＩＮＭｇ
Ｃｌ、、Ｉ　Ｊ！Ｍ　ジチオスレイトール、１Ｏｃｌ＋
ＭＮａＣＱからなる混合液に加え、これに、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　　５６単位および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ　
　５０単位を加えて、３７°Ｏ％２時間反応させた後、
反応液を０．７％低融点アガロースゲル電気泳動で分離
し、６５℃５分の加熱によりゲルを溶かし、フェノール
を加え、遠心分離し、上層を更に、フェノール−クロロ
ホルム、クロロホルムを加えて撹拌、遠心分離後、その
上層に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５当量の
エタノールを加え、エタノール沈澱法を行い、ＤＮＡ断
片（ｐＳＴＰＩ　　（Ｅ−Ｈ））を得た。

また、プラスミド（ｐＴＺ　Ｉ　８Ｒ−ＶＩ　ＰＧＰ）
約２４を、ｌＯ鰭　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７゜５）、
ｌＯ＊ＭＭｇｃＬ、１峠ジチオスレイトール、１００ｚ
Ｍ１００ｚからなる混合液に加え、これに、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　　５６単位および制限酵素ＨｉｎｄＩＩｌ　
　５０単位を加えて、３７℃、２時間反応させた後、反
応液を３％低融点アガロースゲル電気泳動で分離し、６
５°０５分の加熱によりゲルを溶かし、フェノールを加
え、遠心分離し、上Ｎを更に、フェノール−クロロホル
ム、クロロホルムを加えて撹拌、遠心分離後、その上層
に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５４量のエタ
ノールを加え、エタノール沈澱法を行い、ＤＮＡ断片（
ＶＩＰＧＰ）を得た。

ｐ　ＳＴＰ　１　　（Ｅ−Ｈ）　　約５０ｎｇとＶＩＰ
ＣＰ約１０ｎｇを５０量Ｍ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）ｌＯ鱈ＭｇＣＱ２．１０１Ｍ　ジチオイスレイ
トール、２５Ｊｌ［ＭＮａＣＩ２、ｌｚＭＡＴＰからな
る液に加え、更に、Ｔ　、−Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ　１７
５単位を加えて、１６°Ｃ！、１８時間反応させた。常
法にしたがい、この反応液を用いて、ＣａＣＱ２法によ
り、大腸菌株ＲＲＩΔＭ１５を形質転換し、形質転換体
を得た。

更に、得られた形質転換体よりアルカリンリシス法によ
り、プラスミドを抽出し、１０ｚ１４　　トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）、ｌＯｚＭＭｇｃｆｆｚ、１鱈ジチ
オスレイトール、ｌｏＯｚＭＮａｃｆｆからなる混合液
に加えたのち、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素Ｈ４ｎｄ
ｌｌＩできると１００ｂｐの遺伝子１が得られることお
よびＢｇＱＩで処理したところ、切れないこと、まｔ：
、Ｐｖｕｌ［で処理したところ、２カ所で切ることを確
認し、組換え体ＲＲ１ΔＭＩ５　（ｐＶＩＰＧＰｌ）（
ＶＩＰＧＰ遺伝子が１つ入っている）を得た。

ｖｉｉ）タンデムベクターの作成 プラスミド（ｐＶＩＰＧＰｌ）　　約２砺を、ｌＯｊＩ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０鰭ＭｇＣＱ、
、ＩＩＩＭ　ジチオスレイトール、１００ｚＭ１００ｚ
からなる混合液に加え、これに、制限酵素ＢａｍＨＩ　
　５６単位および制限酵素ＨｉｎｄＩ［１５０単位を加
えて、３７°０．２時間反応させＩ；後、反応液を２％
低融点アガロースゲル電気泳動で分離し、約０．５ｋｂ
のバンドをとった。６５°Ｃ５分の加熱によりゲルを溶
かし、フェノールを加え、遠心分離し、上層を更に、フ
ェノール−クロロホルム、クロロホルムを用いて撹拌、
遠心分離後、その上層に１７１Ｏ量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、２．５倍量のエタノールを加え、エタノール沈澱を
行い、ＤＮＡ断片（ｐＶ　Ｉ　ＰＧＰ　１　（Ｂ−Ｈ）
）を得た。

また、プラスミド（ｐＶＩＰＧＰｌ）　　約２４を、ｌ
０１Ｍ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｆｆ
Ｍ１０ｆｆ、、、１１Ｍ　ジチオスレイトール、１００
ｘＭＮ１０Ｏｘからなる混合液に加え、これに、制限酵
素ＥｃｏＲＩ　　５６単位および制限酵素ＢａｍＨＩ３
０単位を加えて、３７℃、２時間反応させた後、反応液
を０．７％低融点アガロースゲル電気泳動で分離し、約
４．４ｋｂのバンドをとった。６５℃５分の加熱により
ゲルを溶かし、フェノールを加え、遠心分離し、上層を
更に、フェノール−クロロホルム、クロロホルムを用い
て撹拌、遠心分離後、その上層に１／１０量の３Ｍ酢酸
ナトリウム、２．５倍量のエタノールを加え、エタノー
ル沈澱を行い、ＤＮＡ断片（ｐＶ　Ｉ　ＰＧＰ　ｌ　（
Ｂ−Ｅ））を得た。

ｐｖ　Ｉ　ＰＧＰ　１　　（Ｂ−Ｈ）　　約５ｎｇとｐ
ＶＩＰＧＰＩ（Ｂ−Ｅ）　　約１０ｎｇをあらかじめ、
ＤＮＡ合成機により作成しておいたＤＮＡ７ラグメント
（［−Ｈリンカ−）、 １１　）　５’−ＡＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣｌ　２　）　
５’−ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＣ７，４ｎｇとともに、ラ
イゲーション緩衝液中で、Ｔ、−Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ　
１７５ｕｎｉｔを用イテ、１６℃、１６時間３０分反応
させた。この反応液を用いて、常法に従い、ＣａＣＱ、
法により、大腸菌株ＲＲ１ΔＭ１５を形質転換し、５０
Ｉｌｉ／ｍ４のアンピシリンを含有するＬ−プレート上
で、形質転換体を得ｔこ。

更に、得られた形質転換体よりアルヵリンリシス法によ
り、プラスミドを抽出し、１０．ｗＭ　　トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）、１０　ｘＨＭ　ｇ　ＣＱ２、ｌｄ
　ジチオスレイトール、１００ｘＭＮ１０Ｏｘからなる
混合液に加えたのち、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩ［＋で切ると２２１　ｂｐの遺伝子断片が得ら
れることおよびｐｖｕ　Ｉ［で１１１　ｂｐ（７）遺伝
子断片が得られることを確認し、組換え体ＲＲＩΔＭ１
５　（ｐＶＩＰＧＰ２）（ＶＩＰＧＰ遺伝子が２つ入っ
ている）を得た。

このタンデムベクターの製造方法を繰り返して、所望の
ペプチドの構造遺伝子が８個タンデムにつながったプラ
スミド（ｐＶ　Ｉ　ＰＧＦ２）’に：Ｗ％、形質転換し
て組換え体ＲＲＩΔＭＩ５（ｐＶＩＰＧＰ　　８）　　
　を　得　ブこ　。

ｖｉｉｉ）発現ベクターの製造 ここで、上記タンデム遺伝子を発現させるために必要な
ヒトＴＮＦ遺伝子を得るため、ヒトリンパ細胞ＤＮＡラ
イブラリー（ＥＭＢＬ３ファージ）を大腸菌ＮＭ５３ｇ
を用いてＬＢプレート２５枚に各３×１０４ＰＦＵまき
、３７°Ｃで１夜培養後、ニトロセルロースフィルタ− ヘファージを転写した。この転写したフィルター上（７
）７アージを１．５Ｍ　ＮａＣ（１，０．５Ｍ　ＮａＯ
Ｈ溶液で変性し、変性したフィルターを１．５ＭＮａＣ
（２、０．５Ｍ　トリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）で中和
した。中和後、８０°Ｃにて２時間真空乾燥することに
よりファージＤＮＡをフィルター上に固定した。（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　ｐ３３１（１９８２）） 更に、既に報告されているヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列
（Ｄｉａｎｅ　Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２
，７２４（１９８４））の一部である １　　３　　）　　　　３’−ＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴ
ＣＧＡＣＴＣＣＣＣＣ：丁ＣＧＡＧＧＴＣＡ１４）　３
″−ＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡ１５）
　３′−ＣＣＣＧＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＣＣＣＴＡＧ
ＴＡＡのオリゴデオキシヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
を用いてホスホアミダイト法により合成し、ヒトゲノム
ＴＮＦ遺伝子のプローブとした。

これらのオリゴデオキシヌクレオチドは、１００ｐｍｏ
Ｑを最終濃度として、１００ｘＭ　　トリス塩酸（ｐＨ
　　８．０）、１．　ＯＪＩＭ　ＭｇＣＯ２、５州ジチ
オスレイトール、５０μＣｉ　　（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ
。

５ｕｎｉｔＴ４ポリヌクレオチドキナーゼからなる溶液
３０ｙ１中で３７°Ｃ、４５分反応させ、更Ｉこ酵素を
失活させる為、６５°Ｃ１　１０分処理してリン酸化　
し　プこ　。

ラベルしたプローブをＤＮＡを固定したフィルターに別
々に会合させｊ；。会合反応は、７．５μＣｉラベルプ
ローブを含み、０．９Ｍ　ＮａＣＬ　Ｏ．０９Ｍクエン
ｆｉＮａ，５倍１のデンハルツ、０．１％ＳＤＳ，２０
０膚／ー変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液２００通中で
４８°Ｃ！，１６時間行い、反応後フィルターを０．９
ＭＮａＣ１２、０．０９Ｍクエン酸Ｎａ，０．１％ＳＤ
Ｓを含む溶液で４０°Ｃ、１５分づつ３日、更に０．０
３Ｍ　ＮａＣＱ，０．００３ＭクエンＦａＮａ％　Ｏ．
Ｊ％ＳＤＳを含む溶液で５０°ｃ，３日洗浄しｔ二。

洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをとり、プ
ローブに対して反応するプラークを１組２枚のレプリカ
フィルターのラジオオートグラムを重ね合わせることに
より探した。この方法により、７．５ｘｌＯ’個のプラ
ークよりプローブに反応する１種のＥＭＢＬ　３７アー
ジを得た。

ファージよりファージＤＮＡをグリセロールグリセロー
ルステップグラジェント法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ８３（１９８
２））により、抽出精製した。ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　（東洋紡）で切断し、０．５％アガロースゲル電
気泳動で分離した後、ＤＮＡ断片をサザンプロット法を
用いて、ＤＮＡ断片をアガロースゲル中よりニトロセル
ロースフィルターＢＡ８５　（Ｓ＆Ｓ社）上に転写した
。このフィルターにファージの分離で用いたグローブを
会合させて反応した２．９ｋｂのＤＮＡ断片にはヒトＴ
ＮＦのシグナルペプチドから終止コドンまでが完全に含
まれていた。

上記のごとく回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ（
東洋紡）及びＨｉｎｄｎ［（東洋紡）で切断して６２６
ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。更にこの遺伝子を制限酵
素ＨｐａＩｌ　（東洋紡）で切断し、下記のエクソン４
の一部を含む５１１塩基からなるＤＮＡ断片（ＴＮＦ　
ｌ）を分離した。

１１０　　　　１２０　　　　１３０　　　　１４０Ｃ
ＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧ
ＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＣＧＧＧ
ＡＧＧＡＣＣＧＧＴＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＴＣ
ＴＣ＋５０　　　　　１６０　　　　　１７０　　　　
　１８０ＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴ
ＣＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＡＴＴＧＧ
ＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＧＴＡＧＴＣＴＣＣＣＣ、Ｇ
ＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡ１９０　　　　　２００　　　　
　２１０　　　　　２２０ＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣ
ＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴ
ＣＣＧＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣ
ＣＧＧＴＴＣＣＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧ２３０　　　　　
２４０　　　　　２５０　　　　　２６０ＡＣＣＣＡＴ
ＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣ
ＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＡＣＡＣＧＡＧＧＡＧＴ
ＧＧＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＴＡＧＣＧＧＣ２
７０２８０２９０３００ ＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴ
ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴ
ＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＧＧ
ＴＡＧＴＴ３１０　　　　　３２０　　　　　３３０　
　　　　３４０ＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡ
ＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＴＣ
Ｃ：ＣＧＧＡＣＧにＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＴ
ＣＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＧＧ３５０　　　　　３６０　
　　　　３７０　　　　　３８０ＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴ
ＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴ
ＣＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣＡＴＡＣＴＣＧＧＧＴＡ
ＧＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣ、Ｇ３９０　
　　　　４００　　　　　４１０　　　　　４２０ＡＧ
ＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧ
ＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣ
ＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＴＣＧＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＴ
ＡＧＣ４３０４４０４５０４６０ ＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧ
ＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＧＡＴＡ
ＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＧＴＣＣ
ＡＧＡＴＧ４７０　　　　　４８０　　　　　４９０　
　　　　５００ＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧ
ＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＡ
ＣＣＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＧＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣ、Ｔ
ＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧ５１０　　　　　５２０　
　　　　５３０　　　　　５４０ＴＴＣＣＣＡＡＡＣＧ
ＣＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴ
ＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧ
ＧＧＧＴＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＧ５５０　　
　　　５６０　　　　　５７０　　　　　５８０ＣＴＣ
ＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧ
ＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡにＧＡＡにＴＣＴＧＴＧ
ＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＡＧＴＴＴＴＴＣ
ＴＣ５９０６００６１０ ＡＡＴＴＧＧＧＧＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＣＣ
ＡＴＴＡＡＣＣＣＣＣＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＧＧ
ＧＴＴＣＧＡ（ＴＮＦＩ） 更に、エクソン３とエクソン４の残りに相当するＤＮＡ
を合成装置を用いて有機合成した下記の１６〜２３）の
８本のオリゴデオキシヌクレオチ１　６　）５’−ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴｌ　　７　）５’−
ＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｌ　８）５″−ＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧ
ＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧｌ　　９　’）５’−ＡＡＣ
ＡＴＧＧにＣＴＡＣＡ（１；ＧＣＴＴＧＴＣＡＣＴＣＧ
Ｇ２０　）５’−ＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣ
ＣＣＴＣＡＡＧＣ２１）５″−ＴＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧ
ＧＴＴＴＧＣＴＡＧ２２　）５’　−ＴＧＡＧＧＧＧＣ
ＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣ２３）５’
−ＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡにＣＴＧＣ
ＣＣＣ各８００　ｐｍｏ（＋を滅菌水１５−に溶解し、
Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼ、４００ｘＭ　ＡＴＰ、
　　１０倍量のカイ不−ンヨン緩衝液を加え５０ｄとし
、３７°Ｃ２時間反応させた。その後、６５°Ｃ１０分
処理し、脱塩回収後、更に濃縮し、アニーリング緩衝液
５０−に溶解後、９０°Ｃ３分反応し、ゆっくり冷却し
た。これに、Ｔ４ファージリガーゼ２０００ｕｎｉｔ　
（東洋紡）と等量のライゲーション緩衝液を加え、１６
°Ｃ】夜反応した。反応終了後、５５Ｉアクリルアミド
ゲル電気泳動に付し、エチジウムブロマイド染色後、下
記の１０２ｂｐのＤＮＡ断片（ＴＮＦ２）をゲルごと切
り出し、溶出緩衝液で分離精製した。

１０　　　　２０　　　　３０　　　　４０ＡＡＴＴＣ
ＡＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣ
ＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＡ
ＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＴ
５０　　　　６０　　　　７０　　　　８０ＧＣＣＴＧ
ＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡ
ＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡ
ＡＣＡ丁ＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣ
９０１００ ＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＧＴＣＧ
ＡＧＧＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣ（ＴＮＦ２） 次に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断したｐ
　ＫＫ’２２３−３　（ファルマシア）とＴＮＦｌとＴ
ＮＦ２をＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、下記の６０
３ｂｐからなるヒトＴＮＦの構造遺伝子（ｈＴＮＦ）を
有するプラスミド（ｐＫＫ２２３３−ｈＴＮＦ）を得を
二。

１０　　　　２０　　　　３０　　　　４０ＡＡＴＴＣ
ＡＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣ
ＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡｍＨｌ　　５０単位を加えて、３
７℃、２時間反応させた後、反応液を０．７％低融点ア
ガロースゲル電気泳動で分離し、６５℃５分の加熱によ
りゲルを溶かし、フェノールを加え、遠心分離し、上層
ヲ更ｉ＝　、　フェノール−クロロホルム、クロロホル
ムを加えて撹拌、遠心分離後、その上層に１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５当量のエタノールを加え、
エタノール沈澱法を行い、ＤＮＡ断片（ｐＶＩＰＧＰ８
　（Ｂ−Ｅ）”）を得た。

ｐＫＫ２２３−３−ｈＴＮＦ　（Ｂ−Ａ）　　約６０ｎ
ｇとｐＶＩＰＧＰ８　（Ｂ−Ｅ）　　約６０ｎｇをあら
かじめ、ＤＮＡ合成機により作成しておいたＤＮＡ７ラ
グメント（ＴＮＦ−ＶＩＰリンカ−）、２４　）　５’
−ＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＧＧ
２５　）　５’　−ＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡ
ＴＣＣＣＡＡＡＧＴ４０ｎｇとともに、ライゲーション
緩衝液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　３５０ｕｎｉｔを用
いて、１６℃、２４時間反応させた。この反応液を用い
て、常法に従い、ＣａＣ（２２法により、大腸菌株ＲＲ
ＩΔＭ１５を形質転換し、５０／Ｉ！ｉ／ｍＩ２のアン
ピシリンを含有するし一プレート上で、形質転換体を得
た。

更に、得られた形質転換体よりアルカリンリシス法によ
り、プラスミドを抽出し、１０ｚＭ）リス塩Ｍ緩衝液（
ｐＨ７，５）、１０峠ＭｇＣＱ２．１　ｘＭ　ジチオス
レイトール、ｌｏｏｘＭＮａｃｎからなる混合液に加え
たのち、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ
とＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切るとｈＴＮＦ１ＶＩＰＧＰ８、
ｔａｃ−プロモーターの７ラグメントが検出されること
により確認し、組換え体ＲＲＩΔＭｌ　５　（ｐＴＶＧ
８）を得た。

組換え体ＲＲＩΔＭ１５（ｐＴＶＧ８）を、Ｌ−培地中
で、３７°Ｃで、１夜培養し、この培養液５０ＡをＬ−
培地中で、３７℃で、Ｏ、Ｄ　、５５０＝　０　。

５〜０．７になったところで、最終濃度として２鱈のＩ
　ＰＴＧを加え、更に５時間培養し、培養液５００歳よ
り、遠心分離により、菌体を回収し、回収した菌体に、
５ＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液を加え、９０℃、３分過熱し
、１２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

このゲルをニトロセルロース紙にエレクトロブロッティ
ングし、ウサギ抗ＶＩＰ抗血清ＣＣＲＢ社製）およびア
ルカリ性ホスファターゼのＭ合した抗ウサギＩｇＧを用
いウェスタン・ブロッティングしたところ、目的の分子
量のバンドのみが発色し、本発明の方法により、所望の
ペプチドのポリマーがｈＴＮＦとの融合蛋白として発現
していることが確認された。

ｖｉｉ）精製 組換え体ＲＲＩΔＭ１５　（ｐＴＶＧ８）を、２．４（
ｌＬ−培地（５０ｔＩｇ／ｍＩ２アンピシリン）中、３
７°Ｃで培養し、Ｏ、Ｄ　、、、。・０．６となったと
ころで最終濃度としてＩ　ＩＭのＴ　ＰＴＧを加え、更
に６時間培養し、２Ｑ分の培養液より、遠心分離により
、菌体を回収し、回収した菌体を５０峠　トリス塩酸（
ｐＨ８，０）、ｌＯ友ＭＭｇ（、Ｑｉ、ｌ　ＩＮフェニ
ルメヂルスルホニルフルオライｌ’　（ＰＭＳＦ）、５
ＪＩＭ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液５０ｍ
ｆｆに懸濁し、超音波処理により破砕し、これを２７０
００ｇで３０分遠心分離した。

この沈澱（培養液１．５Ｑ分）を７０％ギ酸溶液４２．
６ｍρに溶解後、ＢｒＣＮ　　Ｉｇを加えて、室温で４
８時間反応した。

反応液を減圧濃縮後、水で希釈して凍結乾燥し、得られ
た粉末に０．２Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ７，５）を加え、
水可溶分を数回抽出して、抽出液を濃縮後、逆相ＨＰＬ
Ｃ（カラムＹＭＣ−ｐａｃｋ。

ＡＭ３１２）に付し、所望のペプチドにＣ末にコラゲナ
ーゼ認識部位を有するペプチドとしてＨ−Ｈｉ　５−５
ｅ　ｒ−Ａｓ　ｐ−Ａ　］　ａ−Ｖａ　ｌ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＡｒｇ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＬｅｕＡｌａ−Ｖａ　１−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−５ｅ　ｒ−
］　１　ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｙＰ　ｒ　ｏ−Ｇ
　］　ｕ−Ａ　］　ａ−Ｖａ　］−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　
ｎＰｈｅ−Ｈｓｅ（ペプチドｌ） と Ｈ−Ｈｉ　　５−５ｅ　　ｒ−Ａｓ　　ｐ−Ａ　　］　
　ａ−Ｖａ　　］］Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＡｓｎＴ
ｙｒ−ＴｈｒＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ
−ＬｅｕＡｌａ−Ｖａ　　ｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
−ＬｅｕＡｓｎ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｙＰ　　ｒ　　ｏ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−Ａ　　ｌ　　ａ
−Ｖａ　　１−Ｌｅ　　ｕ−Ｇ　　Ｉ　　ｎ−Ｐｈｅ−
Ｈｓｅｌａｃｔｏｎｅ　（ペプチド２）の平衡混合物並
びに Ｈ−Ｈｉ　ｓ−５ｅ　ｒ−Ａ　ｓ　ｐ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｖ
　ａ　ＩＰｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｖａ　１−Ｌｙ　５−Ｌｙ　５−Ｔｙ
　ｒ−Ｌｅ　ｕＡｓｎ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（ペプチド３）の
ペプチドを含む両分をそれぞれ分取した。

これらの画分を濃縮後、更に陽イオン交換ＨＰＬＣ（Ａ
ｓａｈｉｐａｋ　　ＥＳ−５０２Ｃ）により、精製し、
更に脱塩を兼ねて逆相ＨＰＬＣで、再度精製してペプチ
ド１と２の平衡混合物６．４ｍｇ並びにペプチド３１゜
８ｍｇを得た。

これらのペプチド各１０μｇをコラゲナーゼ（ングマ社
タイプ■）１００μｇ　（１９ｕｎｉｔ）　／ｍＱを含
む１０１Ｍ１−リス塩酸（ｐＨ７，５）　、５０ｚＭ　
ＣａＣａ２からなる緩衝液に溶解し、４°Ｃで反応する
ことで所望のＶＩＰ誘導体 Ｈ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＶａｌＰｈｅ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＡｒｇ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＬｅｕＡ　ｌ　ａ−Ｖａ
　１−Ｌｙ　５−Ｌｙ　５−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ　ｕ＝Ａ　
ｓ　ｎ−５ｅ　ｒ−１］　ｅ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ａ　ｓ　ｎ
−ＯＨをそれぞれ定量的に得た。

ｖｉｉｉ）確認 以上のようにして生産されたペプチドの構造は、アミノ
酸配列をペプチドシークエンサ−（アプライドバイオシ
ステム社製）により、エドマン分解して得られたフェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相ＨＰＬＣ
で分析することにより所望のアミノ酸配列を有すること
を確認した。

［発明の効果］ 本発明の方法は、従来大量生産が期待しにくかった分子
内にＬ−メチオニン並びにコラゲナーゼ認識部位を有さ
ない分子ｉ２０００〜４０００のペプチドの大量生産を
可能にする優れたペプチド生産方法である。

【図面の簡単な説明】

図１１合成Ｖ　Ｉ　ＰＧＰ遺伝子を組み込んだプラスミ
ドｐＶＩＰＧＰｌの構成 構成の詳細は、実施例に述べである。 化学合成したＶＩＰＧＰ遺伝子は、その遺伝子配列中に
終止コドンを有さないが、最終的に構築サレタプラスミ
ドｐｖ　Ｉ　ＰＧＰ　ＩのＶ　Ｉ　ＰＧＰ遺伝子は、プ
ラスミドｐｓＴＰｌ中の３種の終止コドンの内の１つに
より結果として終止コドンを有すること１こなる。 このプラスミドｐｖ　ｌ　ＰＧＰ　ｌは、プラスミドｐ
ＫＫ２２３　３に白米するｔａｃプロモーターｒｒｎＢ
）ランスクリプションターミネーターアンビシリン耐性
遺伝子を有している。 図２．ＶＩＰＧＰ遺伝子をタンデムに連結したプラスミ
ドｐＶＩＰＧＰ２、ｐＶＩＰＧＰ８の構成 構成の詳細は実施例に述べである。 ｐｖ　Ｉ　ＰＧＰ　Ｉから得られた２種のフラグメント
を合成りＮＡリンカ−を用いて連結することｔこより、
Ｖ　Ｉ　ＰＧＰ遺伝子か２個タンデムに連結したプラス
ミドｐＶＩＰＧＰ２が得られた。合成りＮＡリンカ−Ｌ
ＨＥ−１，２は、ＥｃｏＲＩお呼びＨｉｎｄＩ［［認識
部位と同しノリシロを有するが、認識部位とは、異なる
ため結合後は切断されない。 上記の操作をｐＶＩＰＧＰｌのかわりにｐＶＩＰＧＰ２
をもちいることで、ｐＶＩＰＧＰ４が構成され、この繰
り返しにより、ｐｖｒｐｃｐｇ等の様々な数のＶ　Ｉ　
ＰＧＰ遺伝子が連結した遺伝子（ＶＩＰＧＰｎ）を有す
るベクターが構成できる。 図３．ＴＮＦ−ＶＩＰＧＰ８を発現するプラスミドｐＴ
ＶＧ８の構成 構成の詳細は実施例に述べである。 最終のプラスミドｐ　Ｇ　Ｔ　Ｖ　８は、ｔａｃプロモ
ーターの下流にＴＮＦの全長遺伝子とＶ　Ｉ　ＰＧＰ遺
伝子が８個連結した遺伝子との間に接続部位がＥｃｏＲ
Ｉ認識部位である遺伝子を有する。 この接続部位には、終止コドンが無いのでプラスミドｐ
ＴＶＧ３は、ＴＮＦにＶＩＰＧＰが８個連結した融合蛋
白を発現する。 Ｆｉｇ、１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子内にＬ−メチオニンならびにコラゲナーゼ認
   識部位を有しない分子量２０００〜１００００のペプチ
   ドの新規製造方法であって、原核細胞内で発現可能なポ
   リペプチドのＣ末部に、Ｌ−メチオニンと上記分子量２
   ０００〜１００００のペプチドとコラゲナーゼ認識部位
   に相当するアミノ酸配列を１〜５０程度繰り返し連結し
   た融合蛋白を原核細胞内で発現せしめ、該融合蛋白を精
   製し、ブロムシアンならびにコラゲナーゼにより分解、
   消化して得られるペプチド混合物より、さらに上記分子
   量２０００〜１００００のペプチドを精製する方法。
2. （２）分子内にＬ−メチオニンならびにコラゲナーゼ認
   識部位を有しない分子量２０００〜１００００のペプチ
   ドが下記のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 を有する上記（１）の方法。
3. （３）原核細胞内で発現可能なペプチドがＴＮＦである
   上記（１）の方法。
4. （４）下記式のアミノ酸配列を有する新規ペプチド 【遺伝子配列があります。】 （式中、Ｈｓｅは、ホモセリンを表す。）
5. （５）下記式のアミノ酸配列を有する新規ペプチド 【遺伝子配列があります。】 （式中、Ｈｓｅｌａｃｔｏｎｅは、ホモセリンラクトン
   を表す。）
6. （６）下記式のアミノ酸配列を有する新規ペプチド 【遺伝子配列があります。】
7. （７）（４）、（５）及び（６）のペプチドをコラゲナ
   ーゼで分解することによる 【遺伝子配列があります。】 の製造方法。