JPH032880B2

JPH032880B2 -

Info

Publication number: JPH032880B2
Application number: JP56112950A
Authority: JP
Inventors: Shinro Tachibana; Kengo Araki; Shizuko Ooya; Seiji Yoshida
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1981-07-21
Filing date: 1981-07-21
Publication date: 1991-01-17
Also published as: CS236487B2; JPS5815946A; US4481138A; DK326082A; CA1234565A; DK171680B1; HU186955B; EP0070569A1; DE3264768D1; EP0070569B1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は鎮痛作用を有する新規なヘプタデカペ
プタイドに関する。さらに詳しくは、ブタ十二指
腸より得られるvasoactiv intestinal peptide
（VIPと略記）分劃中に存在し、モルヒネ様活性
を有するヘプタデカペプタイドに関する。本発明者はかねてより、ブタ十二指腸を原料と
してセクレチン、コレシストキニンパンクレオザ
イミン、バソアクチブインテスチナルペプタイド
等の消化管ホルモンの抽出精製およびこれらの利
用について検討をおこなつて来たが、たまたま
VIP分劃中にモルヒネ様活性を有する物質の存在
することを知つた。そこでさらに該物質を抽出精
製し、分析をおこなつたところ、該物質は新規な
一次構造式によつて示されるペプタイドでありか
つモルヒネに比較して数百倍の強さのモルヒネ様
活性を有するものであることを知るに至り、本発
明を完成した。そもそも、内因性モルヒネ様物質としてエンケ
フアリンおよびエンドルフインが脳内に存在して
おり、痛覚をはじめ種々の生体感覚や精神作用を
調節していると考えられている。エンケフアリン
にはメチオニンエンケフアリンとロイシンエンケ
フアリンの２種類のペンタペプタイドがあり、両
者は別々に生理作用を示すものと考えられてい
る。また、エンドルフインにはα，β.γ，δ等の
類似体があることが知られており、31個のアミノ
酸からなるβ−エンドルフインが最も強い鎮痛作
用を示すと言われている。以下に示す文献はエン
ドルフインに関する従来知見を総説したものであ
り参考のために列挙する。 A.Beaumont J.Hughes：Ann.Rev.
Pharmacol.Toxicol.19 245（1979）尾山力：診断と治療68 825（1980）蛋白質、核酸、酵素26 ２号（1981）オピオイドペプチド特集号さて、最近内因性モルヒネ様物質は脳内だけで
はなく、身体の他の部位にも存在することが示唆
されるようになり、事実、副腎髄質からはエンケ
フアリンの前駆体と考えられる二，三のペプタイ
ドが単離されるに至つた。腸管においても同様に
従来から蛍光抗体法、ラジオイムノアツセイ法等
の免疫学的方法およびインピトロの生物検定法に
よりモルヒネ様物質の存在は示唆されていた。しかし、その抽出精製法、物質の構造、薬理活
性等の詳細についてはまつたく知られていない。本発明者が本発明において提示する物質は詳細
の知られていない腸管からの抽出精製物であり、
エンケフアリン、エンドルフイン等の従来公知で
ある前記内因性モルヒネ様物質とは異なつており
しかも従来知見から予想されるよりもはるかに強
いモルヒネ様活性を示すものであることが明らか
となつた。従つて本発明は新規であり、かつ進歩
性あるものと認められる。以下に本発明を詳細に説明する。本発明物質は次に示すごとき一次構造式をもつ
たへペタデカペプタイドである。 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg−
Pro Lys Leu Lys Trp Asp Asn Gln （式中Aspはアスパラギン酸、Asnはアスパラ
ギン、Glnはグルタミンを意味する）この一次構造式は後期実施例において示される
ように本発明物質についてのアミノ酸組成分析、
ダンシル化法によるＮ末端アミノ酸の同定および
本発明物質をトリプシン分解して得られるフラグ
メントについてのアミノ酸組成分析、Ｎ末端アミ
ノ酸の同定、エドマン分解によるアミノ酸配列の
決定、さらには本発明物質をカルボキシペプチダ
ーゼ分解して遊離されるアミノ酸を経時的に定量
する等をおこない、これらにおける結果を総合し
て確定された。次に本発明物質は、ブタ十二指腸より抽出牲製
せられる。抽出精製は、従来一般に公知の方法を
準用しておこなえばよいが、例えば以下のごとき
概要の方法を示すことができる。まず、ブタ十二
指腸よりVIP分劃物を用意する。VIP分劃物をブ
タ十二指腸より得るためには、例えば、鈴木、荒
木、橘：薬学雑誌99巻172頁（1979）に記載の方
法を使用することができる。次にVIP分劃物を
CM−セルローズカラムクロマトグラフイー、セ
フアデツクスG25ゲル過、およびCM−セフア
デツクスカラムクロマトグラフイーの各精製処理
により濃縮する。なお、この間における活性劃分
の追跡は、モルモツト回腸縦走筋を用いる生物検
定法（後記実験例の２方法の項のＡに記載の方
法）を用いておこなう。次に活性劃分を集め、塩
析し、Bio Gel P6を用いて再びゲル過をおこ
なう。当該ゲル過は最初に弱アルカリ性条件で
続いて弱酸性条件でおこなうのが好ましく、これ
によつて比活性を著しく上昇せしめることができ
る。ここで一旦凍結乾燥し、次にヌクレオジル
C18を用いて逆相高速液体クロマトグラフイーを
おこなう。展開剤としては、トリフルオロ酢酸を
含有するアセトニトリル水溶液を使用し、かつア
セトニトリルの濃度について10％から40％に至る
濃度勾配を与えるとよい。凍結乾燥と上記逆相高
速液体クロマトグラフイーを繰返した後、最後に
ヌクレオジルフエニルを用いて逆相高速液体クロ
マトグラフイーをおこなえば、単一な本発明ペプ
タイドが得られる。本発明物質が鎮痛作用を有する有用な物質であ
ることを以下の実験例をもつて示す。実験例 (1) 試料実施例１記載の方法によつて得られた本発明物
質を検体試料とした。なお、対照試料としてモル
ヒネを使用した。 (2) 方法以下に記載するＡおよびＢの２種類の方法をお
こなつた。 (A) モルモツト回腸縦走筋を使用する検定方法
H.W.Kosterlitzらの方法を準用した。すなわち、
成熟したモルモツトの頚静脈を切断し、放血死さ
せ、開復し直ちに回腸を回盲部より15〜20cm離れ
た場所より40〜50cmだけ取り出した。直ちにリン
ゲル液中に入れ、10cmずつ切断し、それぞれの腸
断片よりメスと綿棒を利用して縦走筋を剥離し
た。これをリング状に糸で結び内容量６mlの恒温
ガラスセルに入れ、上下につるした。白金電極を
上下に設置し、0.1Hz、0.5ms、80〜90Voltの電気
刺激を与え、これによつて生ずる収縮をトランス
デユーサーを通じて記録した。セル中に試料を入
れると、用量に応じて収縮の高さが抑制されるの
で、これを利用してモルヒネ様活性を測定した。本方法の参考文献を次に示す。 H.W.Kosterlitz，A.A.Waterfield：Annu，
Rev.Dharmacol.15.29（1975） (B) マウス輸精管を用いる方法 Hughesらの方法を準用した。すなわち、成熟
した雄マウスを断頭、放血死させ、直ちに開腹し
左右輸精管をとり出した。リンゲル液中で管内に
つまつている精液をピンセツトで押し出し、左右
両輸精管の両端を糸で結び輪状にした。これを前
記Ａにおけると同様の電気刺激装置に入れ電気刺
激した。その条件は、0.1Hz，1ma，90Voltであ
る。モルモツト回腸縦走筋の場合と同様、電気刺
激による収縮は試料の用量に応じて阻害されるの
で、これを利用してモルヒネ様活性を測定した。本方法の参考文献を次に示す。 Hughes HW，Kostelitz HW，Lealie F.M；
Br.J.Pharmacol.53 371（1975）なお、モルヒネ様活性の力価は、電気刺激によ
つて生ずる収縮を50％に減少させるのに要する濃
度IC₅₀（ナノモル）をもつて表示されるので、A.
B両方法においてもIC₅₀を求めた。 (3) 結果結果を表１に示す。

【表】表中、数値はIC₅₀（ナノモル）を示し、（）内
は例数を示す。表１より本発明物質は電気的刺激に対するモル
モツト回腸縦走筋の収縮を抑制し、その強さはモ
ルヒネの約150倍である。また、本発明物質は電
気的刺激に対するマウスの輸精管の収縮を抑制
し、その強さはモルヒネの約30倍であることが判
明する。以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに
詳細に説明する。実施例１ 20万頭分のブタ十二指腸から得られたVIP分劃
物１KgをCM−セルロースカラム（直径30cm×長
さ70cm）にかけ、20mMリン酸緩衝液で十分に洗
滌（４／hr）後、20mM、pH10（140）から
100mM、pH12（140）に至る直線濃度勾配をも
つたリン酸ナトリウム溶液を展開剤として溶出せ
しめ、前記実験例の方法の項のＡに記載の生物検
定法によつて追跡しながら、活性劃分を集めた。図１は、当該分劃の分劃プロフイルを示す図で
あり、▲…▲はモルヒネ換算値によつて、また、
●−●はOD₂₈₀nmによつて追跡したものを示す。
次に活性劃分を食塩飽和にて塩析し、２回に分け
てセフアデツクスG25カラム（21.5cm×81cm）を
用いて脱塩し、凍結乾燥した（78g）。次にあらかじめ20mM、pH10リン酸緩衝液で
十分に緩衝化したCM−セフアデツクスカラム
（3.5cm×90cm）にかけ、同緩衝液で洗滌後、
20mM、pH10（３）から100mM、PH12（３）
に至る直線濃度勾配を持つたリン酸ナトリウム溶
液を展開剤として溶出（107ml／hr、15g／fr）せ
しめた。活性を前記生物検定法により追跡しなが
ら、活性劃分を集め、食塩で塩析した（20g）。
塩析物を４回に分けて、Bio Gel P6カラム（３
cm×100cm）にかけた。まず100mM炭酸水素アン
モニウム溶液で溶出し、その活性劃分を凍結乾燥
した後、同じくBio Gel P6カラム（2.4cm×87
cm）を用いて100mM酢酸溶液で流出させた。活
性劃分は100mM炭酸アンモニウム溶液では塩ピ
ークに重なつて流出し、100mM酢酸溶液では塩
ピークの後にそれと分れて流出した。図２はBio
GelP6カラムにかけ100mM炭酸水素アンモニウ
ムで分劃したときの分劃プロフイルを示す図であ
り、…線はモルフイン換算値によつて、また一線
はOD₂₈₀nmにつて追跡したものを示す。図３は
Bio GelP6カラムにかけ100mM酢酸溶液で分劃
したときの分劃プロフイルを示す図であり、…線
はOD₂₂₅nmによつて、また一線はOD₂₈₀nmによ
つて追跡したものを示す。図中斜線部分は活性部
分を示す。分かれた活性劃分を凍結乾燥した後、アセトニ
トリル水混合液（１：９）にトリフルオロ酢酸を
0.065％Ｖ／Ｖ含有せしめた溶液１mlに溶解し、
ヌクレオジルC18カラム（4.6mm×500mm）を使用
する逆相高速液体クロマトグラフイーをおこなつ
た。なお、展開条件はアセトニトリル水混合液に
トリフルオロ酢酸を0.065％Ｖ／Ｖ含有せしめた
溶液であつて、アセトニトリルの濃度について20
％から40％までの濃度勾配をかけたものを２ml／
minの速度で流出させた。図４は、当該クロマトグラフイーの結果を示す
図であり、点線はアセトニトリルの濃度変化を示
す。図中斜線部分は活性部分を示す。図４は示さ
れるごとく、活性劃分はアセトニトリルの濃度が
30％となるフラクシヨンの附近において濃縮され
て流出した。これを凍結乾燥し、同一条件の高速
液体クロマトグラフイー精製を更に１回おこな
い、最後にヌクレオジルフエニルカラム（4.6mm
×250mm）を使用する逆相高速液体クロマトグラ
フイーをおこなつた。なお、展開剤は30％アセト
ニトリル水溶液にトリフルオロ酢酸を0.065％
Ｖ／Ｖ含有せしめた溶液を用い、１ml／minの速
度で流出させた。活性部分は280nmおよび225nm
の吸光値ピークと一致し、かつ左右対称に流出し
た。図５は、当該クロマトグラフイーの結果を示す
図である。得られた物質につき常法によりダンシ
ル誘導体に導き、単一性を確認した。収量15n
moles得られた物質の構造決定を以下(1)〜(4)に記
載する分析によつておこなつた。 (1) アミノ酸組成２ナノモル相当ペプチドを３規定メルカプトエ
タンスルホン酸20μ中で110℃24時間加水分解
し、日立835型アミノ酸分析計により構成アミノ
酸を分析した。その結果、Asp1，Gln1，Asn1，
Pro1，Ileu1，Leu2，Phe1，Tyr1，Lys2，
Arg3，Trp1の計17個アミノ酸からできているこ
とが判つた。 (2) Ｎ末端アミノ酸の同定１ナノモル相当ペプチドを0.5規定重炭酸ソー
ダ50μに溶かし、ダンシルクロライド１mg／ml
アセトン溶液50μを加え室温一夜放置した。ダ
ンシル化ペプチドは、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフイー（TLC）、ｎ−BuOH：AcOH：H₂O＝
４：１：５上層にて展開した。Rf0.3〜0.4のダン
シルペプチドのスポツトをかきとり、MeOH：
AcOH：Pyridine：H₂O＝１：１：１：１混合液
で溶出した。加水分解管で濃縮乾固後、6N塩酸
100μ、105℃16時間加水分解した。塩酸を留去
後、水飽和酢酸エチル100μにて抽出。不溶物
を遠沈除去し、上澄液をHPLC（ウオターズ）
Nucleosil C18カラム（4.6mm×250mm）にて分析
し、ε−DNS−リジン及びＯ，Ｎ−diDNS−チ
ロシンを同定した。従つて、Ｎ端はチロシンであ
ると推定された。 (3) トリプシン分解物の構造確認５ナノモル相当ペプチドを100μ蒸留水に溶
解し、これにトリプシン（（シグマー社）10μg／
ml0.1Mリン酸緩衝液PH7.6，15μを添加し、37
℃1.5時間酵素分解した。そのままHPLC（ウオタ
ーズ）装置を用いNucleosil C18カラム（4.6mm×
250mm）、0.065％TFA水溶液でアセトニトリルを
10％から60％まで直線濃度勾配で増加させる条件
にて分離し、５個のフラグメントを分離した。各
フラグメントのアミノ酸分析、Ｎ末端アミノ酸の
同定、エドマン分解によるアミノ酸配列の決定を
行つた。その結果、各フラグメントのアミノ酸配
列は、 Frag Ile Arg Pro Lys Frag Arg Ile Arg Pro Lys Frag Leu Lys Trp Asp（Asx Glx） Frag Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Frag Tyr Gly Gly Phe Leu Arg と推定された。Frag，，，，の各フ
ラグメントの構造は標品との同定により確認し
た。なお、エドマン分解については下記文献を参
考のために示す。 Methods in Enzymology Ve1.XL．PartE，
335ページEdited by C.H.W.Hirs and S.N.
Timasheff，1977年、Academic Press.
NewYork. (4) Ｃ端部アミノ酸配列の決定１ナノモル相当ペプチドをカルボキシペプチダ
ーゼＡ（シグマー）1μgと共に0.1M酢酸アンモン
緩衝液PH8.0，150μ中33℃でインキユベートし
分解した。２時間及び16時間後各50μを、日立
835型アミノ酸分析計生体液カラムにて遊離した
アミノ酸を測定した。更に残液50μにカルボキ
シペプチダーゼA1μgを追加し、24時間分解した。
24時間後全量をアミノ酸分析計にかけ、遊離アミ
ノ酸を定量した。その結果Ｃ端は、Glnであり、
その前２ヶのアミノ酸は、Asp又はAsnと考えら
れた。即ちＣ端部は、−Asp−Asn Gln又は−
Asn Asp Glnと推定された。しかし、トリプシ
ン分解フラグメントのエドマン分解により、Ｃ
端から３番目はAspと推定されるので、Ｃ端部の
アミノ酸配列としては−Asp Asn−Glnが定され
た。以上(1)〜(4)の分析結果を総合し、得られたペプ
タイドのアミノ酸配列は以下のごとく決定され
た。 Tyr Gly Gly Phe Arg Arg Ile Arg−Pro
Lys Leu Lys Trp Asp Asn Gln 新規ヘプタデカペプタイドの施光度を測定した
ところ〔α〕²⁰ _D−77.4、また、下記薄層クロマト
グラフイーの条件でいずれもモノスポツトであつ
た。薄層板：セルロース溶媒：ｎ−BuOH：AcOH：H₂O＝４：１：５
（上層） Rf＝0.37 ｎ−BoOH：AcOH：H₂O＝ピリジン＝
15：３：12：10 Rf＝0.58 検出：ニンヒドリン試薬

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１記載の図１であり、CM−セル
ロースカラムによる分劃ブロフイルを示す図面で
ある。図２は実施例１記載中の図２であり、Bio
Gel P6カラムを使用して炭酸水素ナトリウム溶
液で分劃したときの分劃プロフイルを示す図面で
ある。図３は実施例１記載中の図３であり、Bio
Gel P6カラムを使用して酢酸溶液で分劃したと
きの分劃プロフイルを示す図面である。図４は実
施例１記載中の図４であり、ヌクレオジルC₁₈カ
ラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフイー
の結果を示す図面である。図５は実施例１記載中
の図５であり、ヌクレオジルフエニルカラムを使
用する逆相高速液体クロマトグラフイーの結果を
示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１一次造式 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg−
Pro Lys Leu Lys Trp Asp Asn Gln によつて示される新規なヘプタデカペプタイド