JPH03291232A - 抗腫瘍、免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はラクトバチルスｓｐ、ＫＰＢ−１６７を培養し
て得られる多糖を有効成分とする抗腫瘍活性並びに免疫
賦活活性の優れた毒性のない安全な抗腫瘍、免疫賦活剤
に関する。

〔従来の技術〕

ソ連コーカサス地方の伝統的な発酵乳ケフィールは、ケ
フィール粒と呼ばれるスタータを用いて製造される。こ
のケフィール粒は黄白色の弾力のあるカリフラワー状の
画境であり、各種乳酸菌と酵母萼が共生している。ケフ
ィール粒は、ある種の莢膜性多糖生産性の乳酸菌が作る
多１１１（ケフィラン）が支持体となって、乳酸菌や酵
母等が接合されて形成されている。このケフィール粒か
ら抽出された多糖には抗腫瘍活性が有ることは開示され
ている（特開昭５２−１２８２０７号、特公昭５６−４
０９号。

特公昭５６−４１０号公報）。しかしながらケフィール
粒は種々の微生物相で構成されているため、その培養及
び管理が難かしく、また目的とする多糖を生産する莢膜
性多糖生産菌が純粋に分離されていない。従って、どの
ような微生物学的分類に属する菌があるのか不明であり
、上記抗腫瘍活性多糖の物質としての確認はもとより、
安定した同多糖の生産は困難である。

本発明者らは先に、ケフィール粒から莢膜多糖生産菌ラ
クトバチルスｓｐ、ＫＰＢ−１６７を分離し、この微生
物が生産する多糖類の生産方法を見出し特願昭６３−１
７５６３７号として出願した。

〔発明が解決しようとする課題〕

常に安定した生産性を有し、高品質でしかも抗腫瘍活性
等の活性を有するケフィール粒から抽出された多糖様の
物質の提供は広く要望されている。

本発明はこの要望に適合した抗腫瘍、免疫賦活剤を提供
するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記課題を解決する目的で、本発明者らが
先に発明したケフィール粒から分離したラクトバチルス
ｓｐ、ＫＰＢ−１６７（微工研菌寄第９８８６号）を培
養し、その培養液から分離、採取した多糖の抗腫瘍活性
並びに免疫賦活性について研究を行なったところ、この
培養物が極めて高い抗腫瘍、免疫賦活性を有することを
見出し、更にその主成分である多糖を確認し本発明を完
成した。

本発明はラクトバチルスｓｐ、ＫＰＢ−１６７（微工研
菌寄第９８８６％）を培養し、その培養液から分離、採
取された多糖を有効成分とする抗腫瘍、免疫賦活剤並び
に同成分の主要成分が次の理化学的性質を有する多糖で
あることを見出した。

■　元素分析値Ｃ：３９％、Ｈ：７％、Ｎ：検出限界以
下 ■分子ｌ 約１００〜５００万の高分子物質 ■　呈色反応 １２　クロモトロープ−硫酸反応　　　十ｉｌ、アニリ
ンー塩酸反応 山、ナフトレゾルシノール反応 ｌｖ、カルバゾール−硫酸反応 Ｖ、エルソンーモルガン反応 ■　溶剤に対する溶解度 水に可溶、メタノール、エタノール、ア七トン、エーテ
ルに不溶。

■　塩基性、酸性、中性の別 本物質の水溶液は中性である。

■　構成糖の種類及び組成比 グルコース：ガラクトース＝１：１ ■外　観 無味無臭の白色粉末 ■　紫外線吸収スペクトル 特性吸収を示さない。

■　赤外吸収スペクトル 第１図の通りの特性吸収を示す。

本発明の有効成分を生産するラクトバチルスｓｐ、　Ｋ
ＰＢ−１６７は、ケフィール粒から分離されるラクトバ
チルス属に属する長桿菌の一種で、その菌学的性質は次
の通りである。

Ａ、菌の形態 （＋）　　細胞の大きさ：　１〜１，５ｘ１５〜６０（
μｍ）（２）形　　　状：桿　状 （３）運　動　性：な　し く４）胞子の有Ｗｅ：な　し （５）ダラム染色：陽　性 蒸留水 ００ｍＪ２ Ｂ、培地に於ける生育状態 ミルクホエー寒天培地に菌を塗抹し、３０℃で１週間嫌
気培養（ガスバック法又はグローブボックス法）した時
のコロニーの形態 培地組成 ミルクホエー ラ　　り　　ト　　−　　ス カザミノ酸 Ｌ−システィン塩酸塩 酢酸ナトリウム ツイーン８０＊＊ ミネラルＢ… 寒　　　　　　　　天 ｐＩ（ ００ｍｆｉ １ｇ ０．５ｇ ｏ、　ｏｓ　ｇ Ｏ，５ｇ ０．１ｇ ｍｆｉ １ｇ ５．５ ＊ネ 本本本 １０％脱脂乳を乳酸でｐＨ４，６とし、３０分煮沸後、
沈澱を濾別した濾液。

ポリオキシエチレンソルビタンモ ノオレートの商品名 組成：　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０４ｇ ＭｏＳＯ４・４Ｈ２００，Ｉｓ　ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，１８ｇ ＮａＣｌ　　　　　　　０．１ｇ コロニーの性状 形状二円　形　　色調：白色 大きさ：２〜４ｍ　　　透明度：半透明隆起：凸円状　
　硬度：粘稠 周　縁：円　　滑　　　構　造：均質、露滴状表面二円
　滑 Ｃ９生理学的性質 ■　生育温度＝３０℃（至適）、２０〜３５℃（生育範
囲） ■　生育ｐ）１：５，５〜６（至適）、５〜７．５（生
育範囲） ■　酸素に対する態度：通気嫌気性、好気下でも生育す
るが、Ｃ０２存在下の方が生育良好。

■　色素の生Ｉ＆：なし ■　カタラーゼ：陰性 ■　糖からの生成乳酸の旋光性：　Ｄ（Ｌ）型■　糖類
からの酸及びガスの生成： Ｄ（−）−アラビノース Ｄ（＋）−キシロース α−Ｌ−ラムノース Ｄ−リボース グルコース Ｄ−マンノース Ｄ（−）−フラクトース Ｄ−ガラクトース シュクロース マルトース セロビオース ラ　　り　　ト　　−　　ス トレハロース メルビオース ラフィノース メレチトース Ｄ−マンニトール Ｄ−ソルビトール エ　　ス　　り　　リ　　ン サ　　リ　　シ　　ン アミクダリン 酸の生成 ＋ ガスの生成 この菌を用いて本発明の有効成分を生産するには、例え
ばミルクホエー培地又は修正ＭＲＳ培地（第１表で示す
）で培養した後、培養液の上澄画分及び菌体表面画分か
ら通常の分離、採取方法によって行うことができる。

ミルクホエー培地及び修正ＭＲ５培地組成の例を第１表
に示すが、これに限られるものではない。また、培養条
件としては、温度２５〜３５℃、ｐｌ（４，５〜６，０
が好ましく、菌を接種して気相部をＣ０２ガスで置換後
１Ｍ＆気的条件下で培養するのが有利である。通常４〜
６日間培養すると、培養液中に本発明の有効成分である
多糖が蓄積する。

（以下余白） 第１表（培地組成） 注）本：上記のミルクホエーは１０％脱脂粉乳を塩酸で
ｐＨ４，６とし、３０分煮沸後濾過して得た濾液をＮａ
ＯＨでｐＨを６．８とし、さらに３０分煮沸濾過して得
た濾液である。

以上のようにして得られたラクトバチルスｓｐ、　ＫＰ
Ｂ−１６７を培養液中より本発明の有効成分を分離、精
製するには、培養液を１０．００Ｏｒｐｍ。

ＩＯ分間遠心分離して培養液上澄画分と菌体面分に分け
る。

上澄液画分に同量の有機溶媒（メタノール、エタノール
、アセトン等）好適には冷エタノールを添加して氷水中
で１５分間静置後、遠心分離して沈澱した多糖を集める
。これを適量の蒸留水に溶解し、再度エタノールを加え
て多糖を再沈澱させ集める。この操作を数回繰返すこと
により多糖の精製を行なう。

菌体画分中の多糖は、培養液を遠心分離して得られる菌
体を９５℃の熱水中で３０分熱抽出した後、再度遠心分
離して多糖の溶解している上澄液を得る。次いで、同量
の冷エタノール等の有機溶媒を加えて、前述の上澄液か
らの多糖の精製と同様の方法により数回の再沈澱によっ
て精製する。

以上の如くして得られた、ラクトバチルスｓｐ、　ＫＰ
Ｂ−１６７の培養液中の多糖は分離精製され純粋な多糖
である。

この多糖は次の理化学的性質を有する。

■　元素分析値 Ｃ：３９％、Ｈ：７％、Ｎ：検出限界以下■　分子量 Ａｓａｈｉｐａｋ　　Ｇ５−７１０　（旭化成■製〕カ
ラムを用いて、展開溶媒として蒸留水を用い、流速１．
０ｍｆｉ／ｍｎでのゲル濾過分析法によって、約１００
〜５００万であった。

■　呈色反応 １、クロモトロープ−硫酸反応　　十 ｉｉ　、　　アニリン−塩酸反応 山、ナフトレゾルシノール反応 ｌｖ、カルバゾール−硫酸反応 Ｖ、エルソンーモルガン反応 ■　溶媒に対する溶解度 水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
ルに不溶。

■　塩基性、酸性、中性の別 本物質の水溶液は中性である。

■　構成糖の種類及び組成比 多糖を２Ｎ−トリプルオロ酢酸を用いて１００℃で３時
間加水分解した後、分解溶液を減圧濃縮器で蒸発乾固し
て蒸留水に溶かし、液体クロマトグラフィーによる分析
を行った。使用カラムは５ＵＧＡＲＳＰ−＋０１０　Ｃ
昭和電工■製〕で、展開溶媒は蒸留水、流速０．７ｍＱ
／ｍｉｎ、温度８０℃で分析した。その結果、グルコー
スとガラクトースからのみ構成され、その組成比は、グ
ルコース：ガラクトース＝１．１であった。

■外　観 無味無臭の白色粉末。

■　紫外部吸収スペクトル 特性吸収を示さない。

■　赤外部吸収スペクトル 第１図の通りの特性吸収を示す。

上記のラクトバチルスｓｐ、　ＫＰＢ−１６７を培養し
、分離精製した多糖の生理活性特に抗腫瘍活性並びに免
疫賦活性は次の通りである。

（１）　　抗腫瘍活性 生後５週令、体重約３０ｇのＩＣＲ系マウス（オス）を
用い、−群８匹で試験した。予めＩＣＲ系マウス（オス
）で１０日日日に移植、継代しているザルコーマ１８０
　（Ｓａｒｃｏｍａ　［１０）細胞を、滅菌生理食塩水
で１　ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／１ｒｉｌｌとなるように希
釈後、マウスの右足大腿部皮下に０．１−移植し、翌日
より生理食塩水に溶解した本発明の有効成分の多糖０．
２５−を７日間腹腔内に連続投与した。対照には生理食
塩水のみを投与した。

ザルコーマ１８０を移植後、毎日腫瘍の長径と短径をノ
ギスで計測し、腫瘍移植後３００日目腫瘍抑制率を求め
た。

腫瘍阻止率は下式により計算した。

ｏ−Ｓ 腫瘍抑制率（％）＝　　　　　Ｘ１００式中、Ｓは本発
明の有効成分の多糖 を投与した群の腫瘍の大きさ （長径×短径）、ＳＯは対照群 の腫瘍の大きさ（長径×短径） 結果は第２表の通りである。

第　　２　　表 以上のように本発明の有効成分である多糖は顕著に腫瘍
を抑制するものである。

（２）免疫賦活効果 生後６週令、体重約３０ｇのＩＣＲ系マウス（オス）を
用い、−群６匹を廟いて、本発明の有効成分である多糖
を投与してマウス膵臓中の羊赤血球に対する抗体産生細
胞数の増減を調べた。抗原としての羊赤血球４ｘ１０９
　Ｃｅ１ｌｓ／ｍｆｉをマウス腹腔内に０．２５ｍｆｉ
投与し、投与口をＤａｙ　Ｏとした。ＤａｙＯを基準と
し、基準日より前のＤａｙ−３，−２，−１の３日間、
多糖溶液０．２５＋ｎｆｉをマウス腹腔内に投与する。

「前投与群」、基準日より後のＤａｙ＋１．＋２．＋３
に投与する「後投与群」及び基準日より前のＤａｙ−３
，７１と後の＋１．＋３に投与する「前後投与群」の３
群に分けた。対照としてはＤａｙ−３，−１゜＋１．＋
３に生理食塩水を０．２５ｍＡ投与して「対照群」とし
た。なお、多糖溶液の濃度は全て４０■／　ｋｇ　／　
ｄ　ａ　ｙとした。

羊赤血球を投与後、６日目に全マウスを解剖してｊｐ！
！ｔａを抽出し、膵臓中の抗羊赤血球抗体産生細胞数を
カニンガム法で測定した。その結果を第３表に示す。

（以下余白） 第３表 以上のように本発明の有効成分である多糖は対照群に比
べて顕著にｎ＊細胞当りの抗羊赤血球抗体産生細胞数が
増大している。

この結果より、本発明の有効成分は免疫賦活効果が優れ
ていることが明らかである。

（３）　　急性毒性 生後５〜６週令、体重約３０ｇのＩＣＲ系マウス（オス
）を用いて、各試験群４匹に対し、本発明の多糖を１回
腹腔内投与及び経口投与してその急性毒性試験を行った
。

投与後、３週間にわたって各試験群マウスの一般的症状
、死亡例について観察した。

その結果、腹腔的投与では試験群の最大濃度１００■／
ｋｇ−マウスにおいて、何ら異常なく、また径口投与に
おいても試験群の最大濃度１５００■／ｋｇ−マウスに
おいて何ら異常も見られなかった。従って、本発明の有
効成分である多糖は極めて安全性の高い物質であること
が郭ｆる。

本発明の抗腫瘍剤、免疫賦活剤は、その症状、年令等に
より異なるが抗腫瘍剤の場合は１　ｍｇ　〜１００ｍｇ
／ｋｇ／ｄａＬ免疫賦活剤の場合は１　ｍｇ　−１００
ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを経口剤例えば錠剤、カプセル剤、
液剤等非経口剤例えば注射剤等に一般の製剤用助剤を用
い通常の製剤方法によって製剤とする。

次に本発明の実施例を挙げる。

〔実施例〕

例１　有効成分の製造 トリプトン１０ｇＩＱ、肉エキス１０　ｇ　／　Ｑ、酵
母エキス５　ｇＩＱ、ラクトース２０　ｇ　／　Ｑ、Ｋ
２ＨＰ０．２　ｇ　／　Ｑ、クエン酸ニアンモニウム２
ｇＩＱ、ツイーン８０１ｇＩＱ、酢酸ナトリウム５　ｇ
／　Ｑ　、　ｖｇｓｏ４・７Ｉ（２００，５１１ｇ／Ｑ
　、　ＭｎＳＯ４・４Ｈ２００，２８ｇ／　Ｑの修正Ｍ
Ｒ５培地２００ｍｆｉをねじ口頚に入れ、ラクトバチル
スｓｐ、　ＫＰＢ−１６７菌株をこれに接種して気相部
をＣＯ２ガスで置換し、後３０℃で４日間嫌気的条件下
で静置培養を行い、前培養液とした。

本培養はトリプトン２０　ｇ　／　Ｑ、肉エキス２０ｇ
／Ｑ、酵母エキス１０ｇ／Ｑ、ラクトース１００ｇＩＱ
、　Ｋ２ＨＰ０．２　ｇＩＱ、クエン酸ニアンモニウム
２ｇＩＱ、ツイー ン８０１ｇ／Ｑ、酢酸ナトリウム５　ｇＩＱ、ＭｇＳＯ
４−７Ｈ２００，５８ｇ／Ｑ　、　ＭｎＳＯ４・４Ｈ２
００、２８ｇ　／　Ｑ及び塩化カルシウム０．５５５　
ｇ　／Ｑのケフィラン生産用ＭＲＳ培地１．５Ｑを入れ
たカルチャーフラスコに、３０ｔｒｒ（ｌの前培養液を
加え、気相部をＣＯ２ガスで置換後、３０℃、ｐｕｓ、
０制御下で培養を行った。培養中、乳酸の生成によりｐ
Ｈが低下するため、５Ｎ−苛性ソーダを滴下しｐＨを制
御し、攪拌はマグネチツクスターラーを用いて行った。

６日間培養した後、培養液上澄中から 多糖を回収した６即ち、培養液ＩＱを １０．００Ｏｒｐｍ、　１５分間遠心分離して、培養液
上澄画分と菌体画分に分けた。培養液上澄画分からの多
糖の回収は、上澄液に同量（ＩＱ）の冷エタノール（９
９，５％）を添加して氷水中で１５分間静置後、 １０、００Ｏｒｐｍ、１５分間遠心分離して、沈澱部に
多糖を得た。得られた多糖を５００ｒｎｆｌの蒸留水に
溶解した後、更に５００ｍＱの冷エタノール（９９，５
％）を添加して氷水中で静置し、多糖を沈澱させた。こ
のエタノール沈澱操作を３回繰り返して行い多糖の精製
を行い、後凍結乾燥して多糖の白色粉末１．９７ｇを得
た。

例２　錠　　剤 （１）　　例１で得られた多糖　　　　　２０ｇ乳糖　
　　　　　　１００ｇ 結晶セルロース　　　　　　　３０ｇ 馬鈴薯澱粉　　　　　　　　　３０ｇ ステアリン酸マグネシウム　　２ｇ （１）〜（４）の成分を混合し、予め別けておいた（４
）の一部を糊として添加し顆粒とし、乾燥する。これに
（５）を加え混合して、１　ｇ２００■の錠剤とする。

例３　カプセル剤 （１）　　例１で得られた多糖　　　　　２０ｇ（２）
乳糖　　　　　　　１００ｇ （３）　　結晶セルロース　　　　　　　５０ｇ（４）
　　タルク　　　　　　　　　　　　１０ｇ以上の（１
）〜（４）を混合し、２００■ずつカプセルに充填する
。

〔発明の効果〕

本発明は優れた抗腫瘍活性並びに免疫賦活効果を有する
抗腫瘍、免疫賦活剤である。そして、毒性が極めて低く
安全にヒトに投与す４゜ ることができる有用な薬剤である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の有効成分である多糖の赤外吸収スペク
トルである。 密　噸　緩　Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ラクトバチルスｓｐ．ＫＰＢ−１６７（微工研菌寄
   第９８８６号）を培養し、その培養液から分離、採取さ
   れた多糖を有効成分とする抗腫瘍、免疫賦活剤。 ２、多糖が次の理化学的性質を有する抗腫瘍、免疫賦活
   剤。 （１）元素分析値Ｃ：３９％、Ｈ：７％、Ｎ：検出限界
   以下 （２）分子量約１００〜５００万の高分子物質 （３）呈色反応 ｉ、クロモトロープ−硫酸反応　＋ ｉｉ、アニリン−塩酸反応　− ｉｉｉ、ナフトレゾルシノール反応　− ｉｖ、カルバゾール−硫酸反応　− ｖ、エルソン−モルガン反応　− （４）溶剤に対する溶解度水に可溶、メタノール、エタ
   ノール、アセトン、エーテルに不溶。 （５）塩基性、酸性、中性の別本物質の水溶液は中性で
   ある。 （６）構成糖の種類及び組成比グルコース：ガラクトー
   ス＝１：１ （７）外観無味無臭の白色粉末 （８）紫外部吸収スペクトル特性吸収を示さない。 （９）赤外部吸収スペクトル第１図の通りの特性吸収を
   示す。