JPS627916B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な制癌性物質、更に詳細にはフソ
バクテリウム属に属する菌を培養し、その培養液
から得られる制癌性物質TF−100に関する。更に
また、本発明はこの制癌性物質TF−100を製造す
る方法並びにこれを含有する制癌剤に関する。 近年、各種の癌患者の治療法において、宿主の
免疫機能を亢進させ、免疫機能の助けを借りなが
ら制癌効果を発現させる治療法が盛んとなつて来
た。斯る療法に使用される薬剤としては、各種細
菌の菌体、菌体培養物から得られる成分、あるい
は担子菌の子実体又はその培養菌体から得られる
多糖体が知られている。しかし、これらの薬剤は
効果、幅作用及びその製造法等の点で未だ満足し
得るものではない。 一方また、フソバクテリウム属に属する菌、例
えばフソバクテリウム・K031−3B、フソバクテ
リウム・フシフオミス・Ｗ−12、フソバクテリウ
ム・ギランス1012及びフソバクテリウム・ヌクレ
アタム1010を培養して得た菌体及び上清液に関す
る報告がみられる。〔口科誌、21、534〜539頁
（1972）、口科誌、23、322〜333頁（1974）〕。しか
しながら、フソバクテリウム属に属する上記菌を
培養してこの培養液から得られる成分並びにその
薬理作用については未だ研究されていない。 そこで、本発明者は、本発明者によつてヒト口
腔内より分離したフソバクテリウム属に属する菌
を培養し、その培養液から菌体を除去した上清液
について、その薬理作用を調べていたところ、こ
の上清液から採取される特定の成分が強い制癌作
用を有すること、しかもこれは、コロニー形成抑
制法においては癌細胞の集落形成阻止作用は極め
て小さく、殺細胞による制癌作用ではなく、宿主
介在性あるいは宿主の免疫力を亢進させ、免疫力
の助けを借りながら間接的に制癌作用を発現させ
る作用を有するものであること、更にこの成分は
毒性が極めて低いことを見出し、本発明を完成し
た。 本発明で使用される菌は、国立金沢大学医学部
附属病院歯科口腔外科において、ヒト口腔より分
離されたもので、次のような菌学的性状を有す
る。 (1) 形 態 細胞の形：紡錘形（第１図） 細胞の多形性の有無：なし 運動性の有無：なし 胞子の有無：なし グラム染色：グラム陰性 抗酸性：陰性 (2) 培地における生育状態 TF−ａ寒天平板及び斜面培地 外形：円形 大きさ：約１mm 隆起：半球状 構造：露滴状 表面：平滑 辺縁：平滑 色：乳黄白色 透明度：不透明 TF−ａ液体培地 発育の程度：旺盛 濁り：凝塊 沈殿：なし 表面の発育：なし、約５mmまでは発育なし ガス：なし (3) 生理学的性質 硫化水素の生成：＋ 硝酸塩の還元：− 酪酸の生成：＋ インドールの生成：＋ ウレアーゼ：− カタラーゼ：− デンプンの加水分解：− 酸素に対する態度：嫌気性 アンモニアの生成：＋ 炭酸ガスの生成：＋ 生育の範囲：PH５〜7.5 温度30〜45℃ 糖からのガスの生成 Ｌ−アラビノース（−）、Ｄ−キシロース
（−）、Ｄ−グルコース（−）、Ｄ−マンノース
（−）、Ｄ−フラクトース（−）、Ｄ−ガラクト
ース（−）、麦芽糖（−）、シヨ糖（−）、トレ
ハロース（−）、ソルビツト（−）、マンニトー
ル（−）、イノシツト（−）、グリセリン
（−）、デンプン（−） 以上の諸性状をバージーズ・マニユアル、オ
ブ・デイタミネテイブ・バクテリオロジー第８版
に照して検討すると、本菌株はフソバクテリウ
ム・ヌクレアタム（Fusobacterium
nucleatum）に酷似するので、これに属する菌で
あると同定し、本菌株をフソバクテリウム、ヌク
レア＝タムTF−031（Fusobacterium nucleatum
TF−031）と命名して、工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号微工研菌寄第5077号
（FERM−ＰNo.5077）として寄託した。 本発明の制癌性物質TF−100は例えば次の如く
して製造される。 (a) 培養 フソバクテヌウム・ヌクレアタムの培養は、
通常の嫌気性菌の培養法によつて行われる。す
なわち、各種ペプトン、牛の脳、必臓抽出物等
の窒素源；グルコース、ラクトース等の炭素
源；イースト・エクストラクト等のビタミン
源；Ｌ−シスチン、亜硫酸ソーダ、チオグリコ
レート等の還元剤；塩化ナトリウム等の無機塩
を含む培地を水酸化ナトリウムPH７に調整した
ものを用いて、嫌気的条件下30〜40℃の温度で
１〜５日間静置培養を行う。特に次の成分を含
む培地（以下TF培地と称する）を使用するの
が好ましい。なお、寒天を使用しないときは、
撹拌培養を行なうのが好ましい。

【表】

【表】 (b) 培養液から上清液の採取（菌体の除去）上で
得た培養液から菌体を除去して上清液を得る。
菌体の除去は常法、例えば遠心分離、ハイフロ
スーパーゲル等の過助剤を用いる過法を採
用できるが、特に遠心分離法は操作、菌の除去
度合、上清液の収得量の点で好ましい。又菌体
の除去はこの段階で行なうのが好ましいが、次
の(c)の操作において除去してもよい。 (c) 制癌性物質TF−100の採取 上で得られた上清液又は(a)で得られた培養液
に親水性有機溶媒を加えて、生ずる沈殿物を採
取する。この際の上清液又は培養液はPH３〜７
に調整するのが好ましい。親水性有機溶媒とし
ては、例えばエタノール、メタノール等のアル
コール類、アセトン等のケトン類が挙げられる
が、アルコール類等にエタノールが最もよい結
果を与える。この親水性有機溶媒はその濃度が
30〜70％、好ましくは60％前後になるように添
加するのが好適である。親水性有機溶媒を加え
た後、低温、好ましくは約５℃の温度で数時間
〜数日間放置し、沈殿物の生成を完結させる。 このようにして生じた沈殿物をデカンテーシ
ヨン、遠心分離、過等の通常の操作で分離す
る。 次いで、上で得た沈殿物に10〜15倍量の水を加
え、生ずる水不溶物を遠心分離、過等の通常の
方法で除去する。培養液を使用した時は、この処
理により菌体が除かれる。斯くして得られる溶液
を凍結乾燥等によつて乾燥すれば本発明の制癌性
物質TF−100が得られる。 以上のようにして得られた新規な制癌性物質
TF−100は次の如き物性を有する。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
ヒ結節型癌の増殖を阻止し、免疫賦活作用を有
する。 (ハ) 水に溶解し、その水溶液はほぼ中性を示し、
メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
3600〜3200、2960〜2930、1670〜1640、1550、
1440〜1380、1240、1140〜1000及び820cm^-1の
近傍に吸収帯を有する（第２図）。 (ヘ) その水溶液の紫外部吸収スペクトルは吸収末
端に強い吸収があり、また256〜260nｍの近傍
に吸収ピークを示し、0.02％水溶液でのO.D₂₆₀
は0.530〜0.570の吸収を示す（第３図）。 (ト) セフアデツクスＧ−50（フアルマシア社の登
録商標）を用いてゲル過（カラム：50mmφ×
600mm、溶出液：蒸留水）で分画すると260nｍ
の紫外線吸光度測定においてはボイド・ボリウ
ム通過付近から400、430から530、700から
800、および840から870ml付近にかけて吸収帯
を有し、アンスロン硫酸法における620nｍの
吸光度測定においてはボイド・ボリウム通過付
近から390および410から430ml付近にかけて吸
収帯を有する（第４図）。 (チ) TSK−GEL G300 SW（東洋曹達株式会社の
商品名、カラム：7.9mmφ×600mm×２）による
高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
モル燐酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は、
220nｍおよび260nｍの紫外線吸光度測定にお
いてはそれぞれ溶媒先端部分、38〜60分、65分
付近にかけてピークを有する（第５図）。 (リ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
リイー・フオリン反応およびニンヒドリン反応
は陽性。 (ヌ) 元素分析値 Ｃ；30.6％〜35.7％、Ｈ；4.2％〜5.2％、
Ｎ；4.2％〜5.2％ (ル) フエノール硫酸法による糖の含有率は40.0
％〜46.0％（グルコース換算）およびロウリイ
ー・フオリン法による蛋白質の含有率は20.0％
〜23.0％（牛血清アルブミン換算）である。 本発明の制癌性物質TF−100の薬理作用は次の
とおりである。 (1) 癌細胞の集落形成阻止作用 キム・ジエー・エツチらの方法〔Cancer
Res.、25、698（1965）〕に従つて、Hela Ｓ−
３ 細胞を、ウシ血清10％添加イーグルス
MEM培地で３〜５日間培養後、培養液を除去
しエチレンジアミンテトラ酢酸0.01％及びトリ
プシン0.1％を含むPBS（−）溶液（１中に
塩化ナトリウム8.0ｇ、塩化カリウム0.2ｇ、リ
ン酸第一水素ナトリウム1.15ｇ及びリン酸第二
水素カリウム0.2ｇを含有する水溶液）を加
え、培養びんのガラス表面より細胞をはがし、
ウシ血清20％添加イーグルスMEM培地にて希
釈し、希釈液１ml当り200個の細胞を含むよう
に調製する。この細胞懸濁液１mlをCO₂インキ
ユベーターで37℃、24時間培養した後、実施例
１(1)で得た上清液を1/16〜1/128倍希釈になる
ように加える。また、前記の37℃、24時間培養
したのち本発明の制癌性物質TF−100を加え、
７日間Hela細胞を培養する。培養後培地を除
去し、ハンクス氏溶液にて培養皿を洗い、70％
エタノールにて細胞を固定し、次いで100％エ
タノールで細胞を洗い、エタノールを除去した
後ギムザ染色液で細胞を染色し、コロニー数を
数えて細胞の生存率を求めた。 その結果は表１及び表２のとおりである。尚
表中の細胞の生存率は次式によつて算出し、５
枚のシヤーレの平均値で示した。 細胞の生存率＝処理群のコロニー数／無処理群のコロ
ニー数×100

【表】

【表】 この実験から明らかな如く、制癌性物質TF
−100は上清液と比較すると、直接的な細胞傷
害作用である癌細胞の集落形成阻止作用はきわ
めて弱い。 (2) 免疫賦活作用 一群４匹のICR系マウスを用い、制癌性物質
TF−100を生理食塩水0.2mlに溶解し、10mg及
び50mg／Kgを腹腔内投与した。投与24時間後に
Perikan Drawing Ink 17 Black（ギユンタ
ー・ワグナー社製）１mlとゼラチン３％含有生
理食塩水２mlを混合して調整したカーボン浮遊
液0.2mlをマウス尾静脈より注入し、注入後
１、５、10および15分後に眼窩よりヘパリン被
覆ヘマトクリツト毛細管を用いて血液0.02mlを
採取し、直ちに0.1％炭酸ナトリウム水溶液1.6
mlに希釈溶血させ、これを波長675nｍで比色
し貧食係数（Phagocytotic index）：Ｋ値を
Halpernらの数式により求めた。また対照群に
は生理食塩水0.2mlを投与した。 Ｋ＝ｌｏｇ Ｃｏ−ｌｏｇ Ｃ／ｔ−ｔｏ （Co＝to時の血中炭末量、Ｃ＝ｔ時の血中炭末
量）その結果は表３のとおりである。

【表】 この実験から明らかなごとく、対照群に比較
し、本発明のTF−100投与群は網内系マクロフ
アージが活性化され、正常マウスの細胞性免疫
が増大した。 (3) 制癌作用 a.エールリツヒ腹水型腫瘍に対する抗腫瘍作
用 ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ
腹水型癌細胞をマウス１匹当り１×10⁵個腹腔
内接種した。ついでTF−100を生理食塩水に溶
解させ、癌細胞接種後１日目より、１日１回、
７日間各量を連続投与した。また対照群には生
理食塩水0.1ml／１回を同様に投与した。 その結果は表４のとおりである。 Ｔ／Ｃ＝投与群の生存日数／対照群の生存日数×100
（％）

【表】 この実験から明らかなごとく、対照群に比較
し、本発明のTF−100投与群には延命効果が認
められる。 b.エールリツヒ結節型腫瘍に対する抗腫作用
ICR系マウス（雌、６週令）にエールリツヒ癌
細胞をマウス１匹当り４×10⁶個腋下部皮下に
移植した。ついでTF−100をマウス１匹当り静
脈内投与群には35mg／Kgを、皮下投与群および
腹腔内投与群には70mg／Kgをそれぞれ癌細胞移
植後１日目より、１日１回、７日間連続投与し
た。また対照群には生理食塩水0.2ml／１回を
同様に投与した。癌細胞移植後11日目に腫瘍重
量を測定した。腫瘍重量は腫瘍部位の長径(a)と
短径(b)をノギスにて測定し次式によつて求め
た。 腫瘍重量＝ａ×ｂ^２／２（mg） その結果は表５のとおりである。

【表】 表５で明らかなように対照群に比しTF−100
投与群には腫瘍発育抑制効果が認められる。 本発明のTF−100の毒性は次に示すごとく極
めて低い。 マウスにおける急性毒性（LD₅₀） 腹 腔 500mg／Kg 以上の薬理実験の結果から明らかなように、本
発明の制癌性物質TF−100は制癌剤として有用な
ものであり、各種の癌疾患に使用され効果が期待
されるものであるが、とりわけ固型癌に対して著
しい効果が期待できる。 本発明のTF−100は常法により経口、注射、坐
薬等の剤形にして使用することができる。経口剤
としては種々の賦形剤を含んでもよく、カプセル
剤、錠剤、散剤、顆粒剤とすることができる。ま
た、注射剤としては皮下、筋肉内、静脈内注射剤
のいずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時
溶解させる粉末等の剤形が用いられる。また注射
剤には局所麻酔剤を含んでいてもよい。 本発明のTF−100の投与量は患者の症状に応じ
て適宜選択されるが、一般に成人において0.01〜
50mg／Kgを１日１〜数回に分け投与するのが好ま
しく、投与方法としては経口又は皮下、筋肉内、
静脈内もしくは患部への注射によつてなされるの
が好ましい。 次に本発明の実施例を挙げて説明する。 実施例 １ (1) ２容のスクリユーキヤツプ付培養瓶15本
に、それぞれ１本につきトリプトケース・ペプ
トン34ｇ、フアイトン・ペプトン６ｇ、プロテ
アーゼ・ペプトン20ｇ、ブレイン・ハートイン
ヒユージヨン70ｇ、イースト・エクストラクト
６ｇ、食塩15ｇ、グルコース12ｇ、ラクトース
10ｇ、Ｌ−シスチン0.5ｇ、亜硫酸ソーダ0.2
ｇ、チオグリコレート・ナトリウム1.0ｇ、寒
天1.4ｇを加えPH７に調整した培地２を入
れ、120℃で15分間加圧滅菌したのち、ただち
に水冷冷却し、予め同組成の培地で前培養して
おいたフソバクテリウム・ヌクレアタムTF−
031（微工研受託番号 微工研菌寄第5077号）
の前培養液を培養瓶１本につき100mlの割合で
滅菌条件下に接種し、37℃のふ卵器中で48時間
静置培養を行う。培養終了後、５℃で4000r.p.
m、20分間この培養液を遠心分離し菌体を除去
して上清液約27を得た。 (2) (1)で得た上清液に５℃で撹拌下にエタノール
40を加え、無定形の沈殿物が完全に沈殿する
まで低温室で放置する。ついで５℃で、6000r.
p.m、15分間遠心分離し沈殿物を採取し、エタ
ノールで洗浄し、減圧乾燥して約60ｇの粗粉末
を得た。 (3) (2)で得た粗粉末20ｇを水120mlに溶解させ、
この際生じる水不溶物を7500r.p.m、10分間遠
心分離で除去して得た上清液と水不溶物を水60
mlで２回洗浄した洗浄液とを合し、減圧乾燥し
て白灰色〜淡褐色のTF−100の粉末14ｇを得
た。 製剤例 実施例１で得られた粉末５mgをバイアル瓶に充
填した。これは使用時滅菌水又はリドカイン0.5
％含有溶液等で溶解した注射液として用いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いるフソバクテリウム・ヌ
クレアタムTF−031の形態を示す顕微鏡写真、第
２図は本発明の制癌性物質TF−100の赤外線吸収
スペクトル、第３図は同物質の紫外線吸収スペク
トル、第４図は同物質をセフアデツクスＧ−50を
用いてゲル過したときの溶出パターン、第５図
は同物質の高速液体クロマトグラムを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
   −100生産菌を培養し、その培養液から得られる
   次の性状を有する制癌性物質TF−100。 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
   ヒ結節型癌の増殖を阻止し、免疫賦活作用を有
   する。 (ハ) 水に溶解し、その水溶液はほぼ中性を示し、
   メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
   ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
   テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
   め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
   3600〜3200、2960〜2930、1670〜1640、1550、
   1440〜1380、1240、1140〜1000及び820cm^-1の
   近傍に吸収帯を有する。 (ヘ) その水溶液の紫外部吸収スペクトルは吸収末
   端に強い吸収があり、また256〜260nｍの近傍
   に吸収ピークを示し、0.02％水溶液でのO.D₂₆₀
   は0.530〜0.570の吸収を示す。 (ト) セフアデツクスＧ−50（フアルマシア社の登
   録商標）を用いてゲル過（カラム：50mmφ×
   600mm、溶出液：蒸留水）で分画すると260nｍ
   の紫外線吸光度測定においてはボイド・ボリウ
   ム通過付近から400、430から530、700から800
   および840から870ml付近にかけて吸収帯を有し
   アンスロン硫酸法における620nｍの吸光度測
   定においてはボイド・ボリウム通過付近から
   390および410から430ml付近にかけて吸収帯を
   有する。 (チ) TSK−GEL G300 SW（東洋曹達株式会社の
   商品名、カラム：7.9mmφ×600mm×２）による
   高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
   モル燐酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は、
   220nｍおよび260nｍの紫外線吸光度測定にお
   いて、それぞれ溶媒先端部分、38〜60分、65分
   付近にかけてピークを有する。 (リ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
   ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
   リイー・フオリン反応およびニンヒドリン反応
   は陽性。 (ヌ) 元素分析値 Ｃ；30.6％〜35.7％、Ｈ；4.2％〜5.2％ Ｎ；4.2％〜5.2％ (ル) フエノール硫酸法による糖の含有率は40.0
   ％〜46.0％（グルコース換算）およびロウリイ
   ー・フオリン法による蛋白質の含有率は20.0％
   〜23.0％（牛血清アルブミン換算）である。 ２ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
   −100生産菌を培養して得た培養液又は上清液に
   親水性有機溶媒を加えて生ずる沈殿物を採取し、
   これに水を加えて水不溶物を除去して得られたも
   のである特許請求の範囲第１項記載の制癌性物質
   TF−100。 ３ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
   −100生産菌がフソバクテリウム・ヌクレアタム
   である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の制
   癌性物質TF−100。 ４ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
   −100生産菌を培養して得た培養液又は上清液に
   親水性有機溶媒を加えて生ずる沈澱物を採取し、
   これに水を加えて水不溶物を除去することを特徴
   とする制癌性物質TF−100の製造法。 ５ 親水性有機溶媒がアルコールである特許請求
   の範囲第４項記載の制癌性物質TF−100の製造
   法。 ６ 親水性有機溶媒をその濃度が30〜70％になる
   ように培養液又は上清液に加えることを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項又は第５項記載の制癌性
   物質TF−100の製造法。 ７ フソバクテリウム属に属する制癌性物質TF
   −100生産菌を培養し、その培養液から得られる
   次の性状、 (イ) 白灰色ないし淡褐色の粉末。 (ロ) マウスのエールリツヒ腹水型癌、エールリツ
   ヒ結節型癌の増殖を阻止し、免疫賦活作用を有
   する。 (ハ) 水に溶解し、その水溶液はほぼ中性を示し、
   メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼ
   ン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
   テルに不溶。 (ニ) 明確な融点を示さず、約110℃より分解を始
   め、200℃以上で著しく分解する。 (ホ) KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
   3600〜3200、2960〜2930、1670〜1640、1550、
   1440〜1380、1240、1140〜1000及び820cm^-1の
   近傍に吸収帯を有する。 (ヘ) その水溶液の紫外部吸収スペクトルは吸収末
   端に強い吸収があり、また256〜260nｍの近傍
   に吸収ピークを示し、0.02％水溶液でのO.D₂₆₀
   は0.530〜0.570の吸収を示す。 (ト) セフアデツクスＧ−50（フアルマシア社の登
   録商標）を用いてゲル過（カラム：50mmφ×
   600mm、溶出液：蒸留水）で分画すると260nｍ
   の紫外線吸光度測定においてはボイド・ボリウ
   ム通過付近から400、430から530、700から
   800、および840から870ml付近にかけて吸収帯
   を有し、アンスロン硫酸法における620nｍの
   吸光度測定においてはボイド・ボリウム通過付
   近から390および410から430ml付近にかけて吸
   収帯を有する。 (チ) TSK−GEL G300 SW（東洋曹達株式会社の
   商品名、カラム：7.9mmφ×600mm×２）による
   高速液体クロマトグラム（溶出液：PH７の0.1
   モル燐酸緩衝液、流速0.8ml／分、室温）は、
   220nｍおよび260nｍの紫外線吸光度測定にお
   いてそれぞれ溶媒先端部分、38〜60分、65分付
   近にかけてピークを有する。 (リ) モーリツシユ反応、フエノール硫酸反応、ア
   ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウ
   リイー・フオリン反応およびニンヒドリン反応
   は陽性。 (ヌ) 元素分析値 Ｃ；30.6％〜35.7％、Ｈ；4.2％〜5.2％、
   Ｎ；4.2％〜5.2％ (ル) フエノール硫酸法による糖の含有率は40.0
   ％〜46.0％（グルコース換算）およびロウリイ
   ー・フオリン法による蛋白質の含有率は20.0％
   〜23.0％（牛血清アルブミン換算）である。 を有する制癌性物質TF−100を含有することを特
   徴とする制癌剤。