JPH03291238A - 角膜障害治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はフィブロネクチンの機能性ポリペプチドを有効
成分とする角膜障害治療剤に関する。

〔従来の技術〕

フィブロネクチン（以下、ＦＮと略記する）はヒト及び
動物の血液や組織に広く分布する多機能糖タンパク質で
あり、細胞の接着、伸展、移動、分化、増殖、寅食など
の生理作用に関与し、組織の構築と修復、血液凝固、生
体防御などに重要な役割を果していることが知られてい
る。

最近の分子生物学の進歩によりＦＮの全アミノ酸配列及
び遺伝子構造が解明された〔ジ・エムボ・ジャーナル（
Ｔｈｅ　ＢＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）第４巻、第１７５５
〜１７５９頁（１９８５）］。ＦＮは最大２３２７アミ
ノ酸から戒る分子量約２５万のポリペプチドがＣ末端付
近で２つのＳ−５結合により２量体を浴底している。分
子内アミノ酸配列はＩ型、■型、■型の繰返し構造を有
し、更に細胞、コラーゲン、ヘパリン及びフィブリンな
どに対する結合領域がそれぞれ独立に存在する〔ザ・ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２５８巻、第３９
６７〜３９７３頁（１９８３）］。

ＦＮのこれらの機能は産業上有用であり、角膜障害治療
剤として用いる試みも特開平１−２７９８３６号公報な
どに見られる。このようにＦＮは有用であるが、血液か
ら採取するために高価で採取量にも限界がある。またウ
ィルス感染等の問題もあることから、その利用は大幅に
制限されていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

角膜潰瘍、角膜上皮はく離、角膜炎、眼球乾燥症などの
角膜障害は、眼の組織にとって重要な障害であり、その
治療剤の研究は重要な課題となっている。

本発明の目的は、損傷を受けた角膜を修復し、治療する
新規な薬剤を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は角膜障害治療剤に関する
発明であって下記式［Ｉ］で表される、２７４アミノ酸
残基ポリペプチドを有効成分とすることを特徴とする。

Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒ。

Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｔｈｒ Ａｌａ １ｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ５ｐ Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇａｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｐｒ。

１ａ Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｇａｙ Ｌｅｕ １ｅ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓａｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇａｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ ｉｓ Ａｒｇ Ｓａｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇａｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ｅｔ Ｉｃｅ Ｓａｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇａｙ Ｓａｒ １ａ １（ｉｓ Ｇｌｕ ｅ Ｇｌｕ Ｇａｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓａｒ Ａｒｇ Ａｒｇ ＾Ｓρ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ ｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｃｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓａｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ しｙｓ １ｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＩＳ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ １ｅ Ａｓｎ ｒｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓａｒ Ａｓｎ Ｓａｒ Ｓａｒ Ｇｌｙ Ｓａｒ ｉｓ Ｇａｙ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ａｓｎ Ｓａｒ Ｓａｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓａｒ １ｅ Ａｌａ Ｐｈｅ １ｕ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ ｒｐ Ｔｙｒ Ｓａｒ １（ｉｓ Ｌｅｕ １ｅ Ｐｒ。

Ｓａｒ Ａｌａ ｒｐ １ｙ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ Ｉｃｅ １ｅ Ａｒｇ １ｙ Ｓａｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ　　Ｐｒｏ　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｖ
ａｌ　　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇｌｌｅ　
Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　５ｅｒＰｒｏ　　Ｖａｌ
　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　５ｅｒＬｙｓ　　Ｓａｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｉｃｅ　　Ｓｅｒ　　Ｇａ
ｙ　　Ｌｅｕ　　ＬｙｓＰｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　　Ｖ
ａｌ　　ＴｙｒＡｌａ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ
　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ
　　ＡｌａＳｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　
Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ａ
ｒｇ本発明者らは生体内物質であるＦＮの機能性ドメイ
ンに関し鋭意研究を行った結果、上記式〔１〕で示され
る２７４アミノ酸残基ポリペプチドが顕著な角膜障害治
療効果を有することを見出し、本発明を完成した。

本発明で用いられる２７４アミノ酸残基ポリペプチドは
、特願昭６３−１６０９４９号明細書に記載された細胞
接着活性ポリペプチドであり、この細胞接着活性ポリペ
プチドは遺伝子工学的手法により効率よく製造可能であ
る。

以下、この２７４アミノ酸残基ポリペプチドに関して詳
述する。

２７４アミノ酸残基ポリペプチド（Ｐｒｏ１２３ｓ＾５
ｐ１５１２　）は上記式ＣＩ］で表されることを特徴と
する。その製造方法は特願昭６３−１６０９４９号明細
書に示されており、ゑ下具体的に説明する。

なお、本明細書において、アミノ酸に付された頁数字は
、ＢＭＢＬデータバンク（ＢＭＢＬ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮ
Ｋ）のＦＮアミノ酸に付与されたＮ末からのアミノ酸残
基数を示す。

２７４アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒｏ’１２３９＾
ｓ　ｐ　ｌ　５１２　）は、既に特許出願している２７
９アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒｏｌｌｆｉｌ−１ｅ
ｔｌＳＩ’ｌ　）（特開平１−２０６９９８号）のＣ末
端５アミノ酸残基を欠失させたものである。２７４アミ
ノ酸残基ポリペプチド（Ｐｒｏ＋２°−Ａｓｐ１５１２
　）を遺伝子工学的に調製する方法としては、上述した
２７９アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒ０１２３１Ｎｅ
ｔ””　）をコードするプラスミドｐＴＰロア０７を用
いるのが好都合である。２７９アミノ酸残基ポリペプチ
ドのＣ末端より５残基目の１ｙｓ１５１３のコドンＡＡ
Ａを終止コドンＴＡＡに変換することにより２７４アミ
ノ酸残基ポリペプチド（ｐｒ０＋２８ＩＩ　Ａｓｐ１５
１２　）をコードするプラスミドを調製することができ
る。この塩基の変換は、部位特異的変異の導入により行
うことができる。

２７４アミノ酸残基ポリペプチド（ｐｒｏ＋２３９＾ｓ
　ｐ　Ｉ　Ｓ　＋　２　）を発現するプラスミドを導入
した大腸菌Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ　
１０９／ｐＴＦ　？２２１は微工研条寄第１９１５号（
ＦＢＲＭ　ＢＦ−１９１５）として寄託されている。

組換え体からのこの細胞接着ポリペプチドの精製は、例
えば次のようにする。菌体ペレットをバッファーに懸濁
し、超音波処理により可溶性画分と不溶性画分に分ける
。後者は更に７Ｍ尿素を含むバッファーで可溶化する。

可溶性画分を集めて、ＦＮの細胞接着ドメインに特異的
な抗体を結合させたセファロース４Ｂのカラムにかけ、
アフィニティ精製を行う。溶出にはｐＨ２，３付近のバ
ッファーを用いる。イムノブロッティングで目的画分を
集めることにより、細胞接着活性ポリペプチドを得るこ
とができる。必要とあれば、ＦＰＬＣ又はＨＰＬＣで更
に精製することができる。

角膜潰瘍、角膜上皮はく離、角膜炎、眼球乾燥症などの
角膜障害により損傷を受けた角膜を修復する２７４アミ
ノ酸残基ポリペプチドの効果を検討するため、イン　ビ
）　Ｄ　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）実験として細胞層の伸展
効果、及びイン　ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）実験として角
膜上皮はく離による角膜創傷の治癒効果を測定した。そ
の結果、詳細は後述の薬理試験の項で述べるが、２７４
アミノ酸残基ポリペプチドは優れた角膜上皮細胞層の伸
展及び角膜創傷の治癒効果を示し、角膜障害の治療剤と
して有用であることが立証された。

本発明の角膜障害治療剤は局所投与、特に点眼剤として
投与するのが好ましい。点眼剤における２７４アミノ酸
残基ポリペプチドの濃度は、治療効果の発揮できる濃度
に設定すればよく、特に限定するものではないが、０．
００１〜１％が好ましく、より好ましくは０．０１〜０
．５％である。点眼剤としては通常の点眼液のほか、用
時溶解型の点眼液や眼軟こうの形として用いることがで
き、点眼剤に常用される防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安
定化剤、粘稠化剤、ｐＨ調整剤等の添加物を必要に応じ
て用い、製剤化することができる。投与量は、点眼液を
例にとると１回１滴〜数滴、１日１回〜数回投与するこ
とが好ましい。

〔実施例〕

以下に実施例としてその製剤例を挙げるが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

実施例１〜３ 用時溶解型の点眼液を例にとって本発明の実施例を示す
。

凍結乾燥した２７４アミノ酸残基ポリペプチドを点眼す
る時に溶解液に溶かして調製する。

溶解後の処方を下記に示す。

処方１ １００社中 ミノ酸残基ポリペプチド ２７４ア 塩化ナトリウム 滅菌精製水 処方２ １０〇−中 ２７４アミノ酸残基ポリペブチ 塩化ナトリウム 塩化カリウム リン酸ナトリウム 塩化ベンザルコニウム 希塩酸 滅菌精製水 処方３ １００ｍｉ’中 ２７４アミノ酸残基ボ 塩化ナトリウム イブシロン−アミ リペブチド　０．０１　、ｇ ｏ、５ｇ ツカプロン酸ナトリウム ０．２ｇ バラオキシ安息香酸メチル０．０２６　ｇパラオキシ安
息香酸プロピル　　０．０１４　ｇｏ、５ｇ ０．９ｇ 適量 ド　　　　　０．１　ｇ ０．７ｇ ０．２ｇ ０．２ｇ Ｏ，ＯＯ５ｇ 適量 適量 希塩酸　　　　　　　　　　　　　　適量滅菌精製水　
　　　　　　　　　　　適量〔薬理試験〕 ２７４アミノ酸残基ポリペプチドの角膜障害に対する効
果の例として、角膜上皮細胞伸展作用及び角膜創傷治癒
促進作用を調べた。

１、　角膜上皮細胞伸展作用 （実験方法） 体重２．０〜３．０　ｋｇの雄性日本白色ウサギの角膜
を用い、Ｔ、ニシダ（Ｔ、　Ｎｌ５ＨＩＤＡ＞等の方法
〔ザジャーナル　オブ　セル　バイオロジー（Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１１　Ｂｉｏｌｏｇｙ）第
９７巻、第１６５３−１６５７頁（１９８３）：ｌに従
って行った。ウサギ角膜片より切出した角膜ブロック（
ｂｌｏｃｋ）　（４〜５個）を、２７４アミノ酸残基ポ
リペプチドを１００μｉ／−の濃度で含む培養液（ＴＣ
−１９９）中で１８時間培養した後、角膜上皮細胞の伸
展長を測定した。コントロールとしては薬物を含まない
培養液で同様に培養したものを用いた。

（結果） ２７４アミノ酸残基ポリペプチドはコントロールに対し
、１．２７倍の伸展長を示し、有意な伸展促進効果が認
められた。

２、　角膜上皮創傷治癒作用 （実験方法） 体重２．０〜３．０　ｋｇの雄性日本白色ウサギ（１群
４羽＝８眼）を用いｎ−ヘプタツールにより角膜上皮は
く離を起させ、はく離直後フルオレセイン染色を行い角
膜写真撮影した。２７４アミノ酸残基ポリペプチドを基
剤［ＰＢＳ　（−））に溶解した点眼液（Ｓ度０．０５
％）、及びコントロールとして基剤を２時間間隔で１日
４回（５０μｌ／回）２日間点眼した。はく離１０．２
４．３４、及び４８時間後にフルオレセイン染色を行い
角膜の写真撮影を行った。角膜創傷面積は画像解析処理
システム〔コスモソン（Ｃ０５Ｍ０５ＯＮ巳）ＩＳ１■
ニコン〕を用いて撮影した角膜のフルオレセイン染色面
積を測定することにより算出した。

（結果） 各時間における創傷面積（ｍｍ２）を表１に示す：この
結果は２７４アミノ酸残基ポリペプチドがコントロール
に対して有意に創傷治癒を促進していることを示してい
る。

〔発明の効果〕

薬理試験の結果２７４アミノ酸残基ポリペプチドが優れ
た角膜上皮細胞伸展効果及び創傷治癒促進効果を有する
ことを示しており、２７４アミノ酸残基ポリペプチドは
角膜障害治療剤として有用であり、かつ遺伝子工学的に
大量に供給可能である点で顕著な効果を有する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式〔 I 〕： 【遺伝子配列があります。】・・・〔 I 〕 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成
   分とする角膜障害治療剤。