JPS62263199A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域含む組換えプラスミド、該プラス
ミドによって形質転換された組換え微生物Ｉ１１！及び
該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規
ポリペプチド（以下、新規抗ｌ１ＩＷＡ活性ポリペプチ
ドと略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡＩ域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を
用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの＃Ｊｌ造方決方法
する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡｌａＬ−アラニン Ａｒり　し−アルギニン Ａｓｎ１−−アスパラギン ＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｉｎ　　Ｌ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン １−１ｉｓＬ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １−ｅｕｌ−−０イシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン １ｙｌａｔ　　Ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒｏ　　Ｌ−プロリン Ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｔ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）（２発明の背景 ＣａｒＳＷ１３１１Ｓらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　Ｃ
ａｌｍｃｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで
前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与し
た後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫によ
る癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し
、この物質を！ＩＩ瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　
ｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記する
こともある）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌ
ｌら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ｔＪ　ＳＡ、　７２．３６６６（
１９７５）　］　、　コｆ）ＴＮＦはマウス、ウサギ９
ヒト等多くの動物中に見られ、ｍｍ細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になって、ｐ　０ｎｎｉＣａらは、ヒトＴＮＦのｃ
ＤＮ八クへ−ニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一次
構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮＦ
遺伝子の発現について報告した［０．　　Ｐｅｎｎ１ｃ
ａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４（１
９８４）］。その後、自弁ら［Ｔ、　５ｉｒａｉら、　
Ｎａｔｕｒｅ　。

３１３、　８０３（１９８５）　］　、宗村ら［家相ら
、癌と化学療法、　１２．　１６０（１９８５）　］　
、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ。

Ｗ　ａｎｇら、　３ｃ＋ｅｎｃｅ、ユ２８．　１４９（
１９８５）　］及びＭ　ａｒｌｏｎｏｔｌｔら［Ａ　、
　　Ｍ　ａｒｌｅｎｏｔｌｔら、Ｅ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１５（１９８５）　
］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌における発現について
相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［８，Ｂｅｕｌｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

ユ阻、　　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセライドｍが増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。

また、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についても
、特開昭６１−４０２２１明ｍ１ｉｉにその可能性につ
いての記載があるが、比活性等の詳細な記載はない。

そこで、本発明者らは比活性及び安定性の向上。

反応スペクトルの広域化、　ｆ１作用の低減化等を目的
として、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行
ない、本発明を完成するに至った。

０）　発明の目的 本発明の目的は、新規抗！１１ｍ活性ポリペプチドを提
供することにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む粗換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された紺換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ）　−Ｖａｌ　　ＡｒＯＳｅｒ　　Ｓｅｒ　　
ＳｅｒＡｒｇＴｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　
　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　
Ａｌａ　　Ａｓｎｐｒｏ　　　Ｇｌｎ　　　Ａｌａ　　
　Ｇｌｕ　　　Ｑｌｙ　　　Ｇｉｎ　　　１ｅｕＧｌｎ
　　ＴｒＤ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　ＡｒＯＡｒｏ　　
ＡｌａＡｓｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　ｌｅｕ　　Ａｌ
ａ　　Ａｓｎ　　ＧＩｙＶａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　
　Ａｒｏ　　ＡＳＤ　　Ａｓｎ　　ＧｌｎＬｅｕ　　Ｖ
ａｌ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｙＬｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ｌｌｅ　　Ｔｙｒ
　　Ｓｅｒ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　
Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙｃｙｓ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｌｅ
ｕｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　ＩＩＯＳ
ｅｒ　　Ａｒ１Ｊ１１ｅ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　３ｅ
ｒ　　７ｙｒ　　Ｑｌｎ　　ＴｈｒＬｌ／Ｓ　　Ｖａｌ
　　Ａｓｎ　　１−ｅｕ　　Ｌｅｕ　　３ｅｒ　　Ａｌ
ａｌｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　
　Ｇｉｎ　　ＡｒｇＧｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｌａ　　Ｌｙｓ
　　Ｐｒｏ　　Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒ。

１１ｅ　　”ｒｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｒｙ　　Ｇｌｙ　
　Ｖａｌ　　ＰｈｅＱｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌ
ｙｓ　　ａｎｙ　　Ａｓｐ　　Ａｒ（ＩＬＯｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　　１＋ｅ　　Ａｓｎ　　Ａ
ｒ１ｅｌＰｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｓｐ　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ
　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＧｌｙ　　
Ｉ　ｌｅ　　Ｉ　Ｉｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　−（ＣＯ
ＯＨ）または （８２Ｎ）　　Ｖａｌ　　Ａｒり　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ
　　５ｅｒＡｒｃ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　３ｅｒ　　
ＡＳＥ）　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　　　Ａｌａ　　　　Ｈｉｏｓ　　　　Ｖａｌ
　　　　Ｖａｌ　　　　Ａｌａ　　　　ＡｓｎＰｒｏ　
　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　
　ＬｅｕＧｌｎ　　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　ＡＳｎ　　Ａ
ｒ９　　ＡｒｇＡｌａＡｓｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　ＧＩｙＶａｌ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　ＡＢ　　Ａｓｎ　　Ｑｌｎ
Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　３ｅｒ　　
Ｇｌｕ　　ＧｌｙＬｅｕ　　　Ｔｙｒ　　　Ｌｅｕ　　
　ｌｌｅ　　　Ｔｙｒ　　　３ｅｒ　　　ＧｌｎＶａｌ
　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ
　　ＧｌｙＣｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　
Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉ
ｓ　　Ｔｈｒ　　ｌｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇｌｌｅ　
　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　
　ＴｈｒＬｙｓ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａｌｌｅ　　Ｌｙｓ　　３ｅｒ
　　ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　ＡｒｇＧｌｕ　　
Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　
ＧｌｕＡｌａ　　Ｌｌ／Ｓ　　Ｐｒｏ　　ｒｒｐ　　Ｔ
ｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒ。

１１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇ、Ｉｙ　
　Ｖａｌ　　ＰｈｅＧｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌ
Ｖ３　　ＧＩＶ　　ＡＳＤ　　Ａｒ！ＩＩＬｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｌａ　　Ｑｌｕ　　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　
ＡｒｇＰｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ＡＳ
ＥＩ　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　Ｓｅｒ　　ＧＩＶ
　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＧｌｙ　　
　Ｉ　　Ｉｅ　　　Ｉ　ｌｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ−（
ＣＯＯＨ）または （８２Ｎ）−Ｖａｌ　　Ａｒ！ＩＩ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅ
ｒ　　３ｅｒＡｒｃ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　３ｅｒ　
　ＡＳＥＩ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　）ｌｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　
　Ａｌａ　　ＡｓｎＰｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｑ
ｌｕ　　ａｌｙ　　Ｇｌｎ　　１ｅｕＧｌｎ　　Ｔｒｐ
　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｒｏ　　Ａｌａ
Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　ｌａｕ　　Ａｌａ　　
Ａｓｎ　　ＧｌｙＶａｌ　　Ｇｌｕ　　ｌｅｕ　　Ａｒ
１Ｊ　　ＡＳＤ　　Ａｓｎ　　ＧｌｎＬｅｕ　　Ｖａｌ
　　Ｖａｔ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ
Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　
　Ｓｅｒ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　ｔ
−ｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＧｌｙＡｌａ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　　Ｌ
ｅｕＬｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ
　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇｌｌｃ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　
Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　ＴｈｒＬｙｓ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌ
ａｌｉｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　
　Ｇｌｎ　　ＡｒｇＧｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｌａ　　　Ｌｙ
ｓ　　　Ｐｒｏ　　　Ｔｒｐ　　　Ｔｙｒ　　　Ｇｌｕ
　　　Ｐｒ。

１１６　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ＧＩＶ　　ＧＩＶ　　
Ｖａｔ　　ＰｈｅＧｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｇｌｙ　　ＡＳＤ　　Ａｒ。

しｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　
ＡＳｎ　　ＡｒＱＰｒｏ　　ＡＳＥＩ　　Ｔｙｒ　　ｔ
−ｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　３ｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｔ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈ
ｅＧｌｙ　　Ｉ　Ｉｅ　　Ｉ　ｌｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅ
ｕ　−（ＣＯＯＩ−１）または （８２Ｎ＞　−Ｖａｌ　　ＡｒＱ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ
　　３ｅｒＡｒｇＴｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ａｓ
ｐ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　
Ａｌａ　　ＡｓｎＰｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＬｅｕＧｌｎ　　７ｒｐ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　八ｒ！］　　ＡｒＯＡｌａＡｓ
ｎ　　ＡＩａ　　Ｌｅｕ　　ＬＯＬＩ　　ＡＩａ　　Ａ
ｓｎ　　ＧｌｙＶａｔ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　ＡｒＯ
ＡＳＤ　　ＡＳｎ　　ＧｌｎＬｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｖａ
ｌ　　Ｐｒｏ　　Ｓｃｒ　　Ｇｌｕ　　ＧｌｙＬｅｕ　
　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　　Ｓｃｒ　
　ＧｌｎＶａｌ　　Ｌｅｕ　　ＰｈＣＬｙｓ　　ｅｌｙ
　　Ｇｌｎ　　ＧｌｙＣｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　
Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＬ、ｅｕ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｒｇｌｌｅ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ
　　Ｇｌｎ　　ＴｈｒＬｙｓ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａｌｌｏ　　ｔ−
ｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　ｃｙｓ　　Ｇｌｎ　　Ａ
ｒａＧｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ
　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｌａ　　Ｌ’／Ｓ　　Ｐｒｏ　
　Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ　　Ｇ１１ｊ　　Ｐｒ。

Ｔｌｅ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　
Ｖａｌ　　ＰｈｅＧｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙ
ｓ　　ＧＩＶ　　Ａｓｐ　　Ａｒ。

Ｌｅｔｌ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　
　Ａｓｎ　　Ａｒ０Ｐｒｏ　　ＡＳＥＩ　　Ｔｙｒ　　
ｌｃｕ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈ
ｅＧｌｙ　　Ｉ　Ｉｅ　　Ｉ　Ｉｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅ
ｕ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドまたはそのアミノ末端にＭＱｔが結合した新規抗
１１１Ｍ４活性ポリペプチドを提供することによって達
成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供すること
によって達成され、更にかくして得られた組換えプラス
ミドによって形質転換された組換え微生物細胞、その微
生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを産生する方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を含有する医薬組成物を提供することによって達成され
ることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ３ｉ伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺
伝子は、ヒトＴＮＦＩ白質を構成するアミノ酸［０，Ｐ
ｃｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主ａｍに最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当なｉｌｌ限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦｍ転子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素を用いることにより、適当なベクター
のりＯ−ン化が可能になる。このようなヒトＴＮＦ遺伝
子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“５ｏｌｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　ＤｅＶ８１０１）ｌｅ
ｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｔｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ　ｈ
ｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒＳ　　ｏｒ［３ｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　　ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ”、　Ｊｏｈｎ
　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　Ｉｎｃ、、
Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　　Ｃｈｅｇｉ、　　　Ｓａｃ、、８９．　４
８０１（１９６７）　　］　　及びホスファイト法［Ｍ
、　Ｄ、　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２１．７１９
（１９８０）　１があるが、合成時間、収率、操作の簡
便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスファ
イト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌクレオ
チドの精製は、ゲル濾過、イオン交換りＯマドグラフィ
ー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体りＯマド
グラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いること
ができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢ　Ｒ３２２［Ｆ　、　
　Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が
好ましい。このようなヒトＴＮＦＩ伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ、３が用
いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した侵、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーターＢｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ＩｐｐブＯモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。この発現型ヒトＴＮＦ遺
伝子を、たとえばｐＢＲ３２２のようなベクターにクロ
ーン化することにより、発現型プラスミドが作成できる
。ヒトＴＮＦｍ伝子発現型プラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦ　４０１ＮＮが用いられる。

（Ｂ）新規抗ｓｓｉ活性ポリペプチド遺伝子のクローン
化； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ３ｉ伝子内の特定
な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはＩ）ＴＮＦ　４１２．　
　Ｅ）ＴＮＦ　４１３゜ＤＴＮＦ４１８または１）ＴＮ
Ｆ４１４が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価： ヒトＴＮ　Ｆ３Ｗ伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子を発現させるための微生物宿主としては、大１１
ａｉ！ｉ、枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大
腸菌［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌｉ）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、
　Ｎｏｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６ＧＯｒ
−トａ　（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカヂミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉＳら編、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ”　
　、Ｐ　　４４Ｇ、Ｃｏ１ｄ　　　５ＤｒｉｎＯＨａｒ
ｂｏｒ　　　ＬａｂＯｒａｔＯｒＶ　　、ＮｅＷ　　Ｙ
ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に応じ
て、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ましい。

培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振と
うによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３６時
間行なう。また、培ＩＩ開始時または培養中に、プロモ
ーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インドー
ルアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物ＩＩｌ胞のライゼートを得る。得られ
たライゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（
以下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋
白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（ＣａｒＳＷＯＩＩら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見ルｔｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

ｌ　ａｕ＋ｕｎｏｌ、、ユ２６．　２３５（１９８１）
　］等により行なえるが、測定時開、定石性、測定の簡
便さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による
評価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とはその性質を異にし、なおかつ抗ｍ瘍活性を有する新
規生理活性ポリペプチドを得ることが可能になる。従っ
て、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いることによ
って抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供すること
が可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦｍ転子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎｉＣａら［Ｄ。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　旦、　　
７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前駆
体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤とし
て、適当なυ１限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′
側に２ｖＡの翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳聞始コドン上流には
制限酵素Ｃ１ａ工による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン問を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［による切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて一ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保Ｉ
Ｉをはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５Ｉ１１の溶出用ｔ＜ｙ　７７−［５０
０ｍＭ　　ＮＨＪ　ＯＡＣ−１１ＭＥＤＴＡ−０，１％
ＳＯ８（ｐＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩撮とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。＠後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を冑だ。

なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をは
かった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のり０−ン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦｍ転
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を・、５〜１５ユニツトの
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｓ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ｐＨ９，５）　　、　　１０
　　ｇｉＭ　　　Ｍり　　ＣＩ　２　。

５１１Ｍジチオスレイトール、１０鵬Ｍ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、　３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＩ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ皇の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ａ）−１７，６）　、　　６．６
　ａＭ−ＭＯＣＩ２゜１０　ｍＭジチオスレイトール、
１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトの７４
−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１５時
１１！連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジ
ウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行な
う。目的とする大きさく約２２０ｂｐ　）のバンド部分
を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミ
ドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μシの大腸菌用プラスミドＩ）Ｂ　Ｒ３２２（
約４．４Ｋ　ｈａ）を３０Ｌｌの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣｆ（ｐｌ−ｌ　　７．５＞　　、　　らＯｍ
Ｍ　　　Ｎａ　　Ｃ１，７１ＭＭＱＣ１ｚ水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングラ
ンド・バイオラブズ）を添加して、３１℃で１時間切断
反応を行なった。

υ１限醪素Ｃ１ａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０Ｍ文の５０−ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｆ　（ｐＨ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　Ｎａ
　Ｃｊ、　１０１Ｍ　　ＭＯ８Ｏ４水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加して
、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、
エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの観察
を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を含む約３
，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出し
、そのアガロースゲル断片を３倍両（ｖｏｌ　／ｗｔ）
のａＭ　　ＮａＣｌ０ｓ水溶液に溶解させた。Ｃｈｅｎ
らのグラスフィルター法［０，Ｗ。

Ｃｈｅｎ　　ら、　　Ａｎａｌ　　、　［３ｉｏｃｈｅ
ｓ、　　　１０１．　　３３９（１９８０）　］により
、豹３．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａｌ→５ａｌＩ）
をアガロースゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｌｌのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドＤＢＲ３２２の
大部分を含む約３，７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−１株の形質転換は、通
常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　ＮＯｒｇａｒｄらの方
法）の改良法で行なった。すなわち、５−のし培地（１
％トリプトン、０．５％酵母エギス、０．５％Ｎａ　Ｃ
１，ＤＨ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６００ｒ１−
株の１８時間培！！基を接種し、菌体を含む培養液の６
００ｎｓ＋における濁度（ＯＤ　６００）　　０．３ま
で生育させる。国体を冷たいマグネシウム・バッファー
［０，ＩＭ　　ＮａＣｊ、５　１１Ｍ　　ＭＱＣｌｚ　
　、５　　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ７，６，０℃
）］中で２回洗い、２ａｅの冷したカルシウム・バッフ
ｖ　−［１００１ＭＣａ　Ｃｆｚ　、　２５０　１Ｍ　
　ＫＣｆ、　５１Ｍ　　Ｍ（ｌ　Ｃ１ｚ　。

５　ｌｌ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ７，６，０
℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に
菌体をこの容ａの１７１０にカルシウム・バッファーの
中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２　：　１　（ｖ
ｏｌ、：ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間、
０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン。

０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１，０，０８％グルコ
ース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間撮と
う培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シグ
マ）３０Ｍｇ／Ｉ１１を含むし培地プレート］に１００
ｕ、Ｑ　／プレートの割合で接種する。プレートを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。

得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法
を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動によ
り、目的のプラスミドＤＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂ
ｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ
ＩＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミド１）ＴＮＦ２
Ｎ（約３．ＩＫｂＤ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びＥＩＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。

こうし得られたヒトＴＮＦｍ転子の一部を含むプラスミ
ドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、合
成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通りで
あることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、Ｍａｘ
ａｍら、　ＭｅｔｈＯｄｓεｎｚｙｍｏ１．．６５．　
４９９（１９８０）　１によって離党した。

実施例４（ヒトＴＮＦＭ伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＩａＩ及び３ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
Ｉ＜−＋５ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回
収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μ９を１００μｌの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐｉ−１７，５）　　、　　６０ｇ＋　　Ｍ　　　Ｎ
ａ　　Ｃ１，７ｍＭＭｇＣｆｚ水溶液に溶解させ、４０
ユニツトの制限酵素ＰＶＩＩＩ［（宝酒造）を添加し、
３７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３
の方法に準じて＆ＩＩ限酊素５ａｌＩによる切断、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実
施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む
約１７０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＳａｌＩＨＰｖｕｌＩ）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドＤＴＮＦ３　１０
μｇもｉｏｏμｚの１０　ｓＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，７ｍ
ＭＭ！ＪＣｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限
酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄｌ［
［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行な
った。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
８１度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕ［ｅＨｉｎｄ　ＩＩＩ）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ３を、上記と同様
にｌｌｌ１ｌ限酵素ＣｆａＩ及びト１ｉｎｄｍで切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲルｍ１度０．８％）の後
、実施！１４３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３１
Ｎの大部分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆ
ａ工←Ｈｉｎｄｌｌｌ）をアガロースゲルより回収した
。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１ｒｏｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドＤＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む約
４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１−株に導
入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂＥｌ
＞を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミドＤＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ　２０μ３を、実施例３の
方法に準じてＩＩＩ限酵素ＣＪａＩで切断した後、５０
１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣｆ　（１）Ｈ７，４）　、
　　１００　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１゜１０１Ｍ　　ＭＱ　
８０４水溶液中で１０ユニツトのυ１限酵素５ａｌＩを
添加、２０℃で３０分四部分切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）及びアガロースゲル電気泳ｖＪ（ゲル濃度０．８％
）を行ない、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子８１　手部分！含む約２２０ｂｐ　（
ＤＣｌａ　Ｉ？５ａｌＩ　−（１１のＤＮＡ断片及びヒ
トＴＮＦ１！転子前半部分以外を含む約５．０Ｋ　ｂｐ
（７）　Ｓ　ａｌ　Ｉ　−（１）＋　Ｃ１ａ　ＩのＤＮ
Ａ断片をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ３！！転子前半部分を含む約
２２０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μ旦の１０　ｍＭＴｒｉ
ｓ−１１ｃｆ　（ｐＨ７，４）　、　１０　ｓＭ　　ｖ
ｏ　ＳＯｓ　。

１　　ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）を添加して、３
７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行ない、
実施ＩＭ２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の前半部
分を含む約１６０ｂｐのＣｆａＩｈＫｐｎ工のＤＮＡ断
片をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施ＩＭ２の方法に準じて合成、精製した。得ら
れた４本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μグ
について、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を
行ない、アニーリングの侵、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによ
る連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約５．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片［５ａｌＩ　
−（ＩＩＧ４ｃｆａ　工］及びヒトＴＮＦ遺伝子の前半
部分を含む約１ｅｏｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａＩ＠ＫＤ
ｎ工）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法
に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行な
った。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒ
ア・コリＣ６ＧＯｒ−１−株に導入し、形質転換株の中
より目的のプラスミドｐＴＮＦ４１２（約５．２Ｋ　ｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。

このプラスミドはヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ末端からか
ぞえて６９番目のＣｙｓがＡｌａに置換した形の新規抗
腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、第７図にその
作成方法を示した。

同様な手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質のア
ミノ末端からかぞえて１０１番目のＣｙｓがＡｌａに置
換した形の新規抗＋ｔｉｓｉ活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミドＤＴＮＦ４１３（約５．２Ｋｂｐ）を、
ヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ末端からがぞえて６９番目と
１０１Ｍ目のＣｙｓが共にＡｔａに置換した形の新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮ
Ｆ４１Ｂ（約５．２Ｋ　ｂＤ）を、そしてヒト蛋白質の
アミノ末端からかぞえて１２２番目のＧｌｙがＡｌａに
置換した形の新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドＩＩＴＮＦ４１４（約５．２Ｋ　ｂＤ）をそ
れぞれ生成した。第８図、第９図及び第１０図に、新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮ
Ｆ　４１３．　　ｐＴＮＦ４１８及びＤＴＮＦ４１４の
作成方法を、それぞれ示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４及び５で得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドＤＴＮＦ　４Ｇ１ＮＮ及び本発明の新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ
　４１２．　　ｐＴＮＦ　ａｌ８またはｐＴＮＦ４１４
のそれぞれを有するエシェリヒア・コリ（：、　６００
ｒ−ｍ−株を、それぞれ３０〜５０μｇ／Ｉｄｌのアン
ピシリン、０．２％のグルコース及び４＃ｊｌ／−のカ
ザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａｚ、ＨＰＯ４−
０．３％ＫＨ２ＰＯ４−０，０５％ＮａＣ１−０，１％
ＮＨａＣｊ水溶液（ＤＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭ（ＩＳＯ４
水溶液及びＣａＣ１ｚ水溶液をそれぞれ最終濃度２１Ｍ
及び０．１１Ｍになるように加える。］２００ｄに接種
し、００６００が０．７に達するまで、３７℃で振どう
培養を行なった。次いで、最終ｍ度５０μ９／ｄの３−
β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し、さらに
３７℃で１２時時間上う培養を続けた。

遠心分離により大ｌ！１菌菌体を集めた後、ＰＢＳハッ
７７−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２１Ｍリン酸
バッファー、　　ＥＩＨ７，４）を用いて菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０ｓｄ！のＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体９
５？ｌ！の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
１１ｃｊバツフｐ　−（＋）８６．８）　、　ＳＯ８，
２−メルカプトｉタノール、グリセ０−）しを、それぞ
れ最終濃度６０１Ｍ、２％、４％、１０％になるように
加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木
、遺伝１月−，４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＯ８
，Ｔｒｉｓ−グリシン系［ＬＪ、　Ｋ、　Ｌａｅｗｎｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。この結果の一部を複写して第
１１図に示した。

第１１図に示した結果については、染色後のゲルのりＯ
マドスキャナー（島津、Ｃ８−９３０型）を用いた解析
を行なったところ、ヒトＴＮＦ蛋白質は大腸菌全細胞質
蛋白質の９．０％、新規抗腫瘍活性ポリペプチドは大腸
菌全細胞質蛋白質の６．９〜１０．１％のレベルにまで
、それぞれ産生されていた。

実施例７（活性の評価） ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドそれ
ぞれの活性測定は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった
。すなわち、実施例６で得られたヒトＴＮ　Ｆｌｊｉ白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ートを順次培地で希釈した試料１００μ文と、４　Ｘ　
１０’個／ｄの濃度のマウスＬ−９２９１１緒芽細胞（
ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μｍを、９６穴
の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合
した。なおこの際に、最終濃度１μ９７ｄ、のアクチノ
マイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で２０時間培養した後、ク
リスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　
）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）の
クリスタル・バイオレットを溶解させたもの１を用いて
生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを
洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレット
を１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５
９５１−における吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東
洋測器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、
生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値に
相当する大腸菌ライゼートの希釈率をグラフ（第９図）
によって求め、その希釈率を１ユニツトと定義する。第
９図より、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質を含む
大腸菌ライゼート１００μ磨は４．２Ｘ　１０６ユニツ
トの活性を、同じ〈実施例６で得られた新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む各大腸菌ライゼート　１００μ磨は
８．２Ｘ　１０２〜１．８Ｘ　１Ｇ！ユニツトの活性を
、それぞれ有していることが明らかになった。

実施例６で得られたヒトＴＮＦ遺伝子又は新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋
白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラ
ッド）を用いて定ｍし、ウシ血清アルブミンを用いた検
量線より計算した。

実施例６で得られた発現量の値、上記で得られた活性の
値及び蛋白質定量結果を総合し、ヒトＴＮＦ遺伝子質及
び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの比活性を計口したとこ
ろ、表１のような値が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ３１伝子の一部を有するプラスミドＤ
ＴＮＦＩＢＲ，ＥＩＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの
作成方法を示したものであり、第７図、第８図、第９図
及び第１０図は、それぞれ新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４１２．　　ｐＴＮ
Ｆ　４１３゜１）ＴＮＦ４１８及び１）ＴＮＦ４１４の
作成方法を示したものである。第１１図は発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　　４Ｇ１ＮＮ、　　Ｉ）ＴＮＦ　　４１
２．　１）ＴＮＦ　　４１３及び　ｐＴＮＦ４１８の発
現確認結果を示したものである。 第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新ＪＪＩ抗腫瘍活性ポ
リペプチドの活性測定結果を示したものである。 第４図 Ｆ’ｖｕ肛 第５図 悄Ｔｌ１ＯＢ ｂ４１五−（２） ’ｊ（８萌ＯＢ 鴇１ ’；、’／：、＠ｌ’ｊ　−Ａｌｔｓ １１０１ｍＩｒ１Ｂ ｖ１２０ ４　釈イ音　１閂

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチドまたはそのア
   ミノ末端にＭｅｔが結合している新規生理活性ポリペプ
   チド。 （２）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合している新規生理活性ポリペプチ
   ド。 （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチドまたはそのア
   ミノ末端にＭｅｔが結合している新規生理活性ポリペプ
   チド。 （４）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチドまたはそのア
   ミノ末端にＭｅｔが結合している新規生理活性ポリペプ
   チド。 第１項、第２項、第３項または第４項記載の新規生理活
   性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプ
   ラスミド。 該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第５
   項記載のプラスミド。 （７）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第５
   項記載のプラスミド。 （８）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第５
   項記載のプラスミド。 （９）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第５
   項記載のプラスミド。 （１０）該プラスミドがｐＴＮＦ　４１２、ｐＴＮＦ　
   ４１３、ｐＴＮＦ　４１８またはｐＴＮＦ　４１４であ
   る第５項記載のプラスミド。 （１１）第１項、第２項、第３項または第４項記載の新
   規生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む
   組換えプラスミドにより形質転換された組換え微生物細
   胞。 （１２）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
   ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする第
   １１項記載微生物細胞。 （１３）第１項、第２項、第３項または第４項記載の新
   規活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換
   えプラスミドにより形質転換された組換え微生物細胞を
   培養し、培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄
   積せしめ、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチ
   ドを分離することを特徴とする、新規生理活性ポリペプ
   チドの製造方法。 （１４）抗腫瘍に有効な量の第１項、第２項、第３項ま
   たは第４項記載の新規生理活性ポリペプチドを含有する
   医薬組成物。