JPH0866194A - ヒト腫瘍壊死因子ミューテインをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なヒト腫瘍壊死因子ミューテインをコー
ドする遺伝子の提供。 【構成】 ヒト腫瘍壊死因子において、６９位のＣｙｓ
が他のアミノ酸により置換されているミューテイン、６
９位のＣｙｓと１０１位のＣｙｓが他のアミノ酸により
置換されているミューテイン、Ｎ−末端の４個のアミノ
酸が除去されているミューテイン、又はＮ−末端の８個
のアミノ酸が除去されているミューテインをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクター、並びに該ベク
ターにより形質転換された宿主。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はヒト蛋白質因子の組換
生産に関する。これは特に、腫瘍に対して選択的に毒性
である蛋白質及び比活性について改良されているそのミ
ューテインの製造に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）としてよく知ら
れるようになった因子は最初Carswell等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.(USA) (1975) 72：3666により見出された。バシ
ルス・カルメッテ−グリン (Bacillus Calmette-Gurin)
(BCG) のごとき免疫増強剤によりあらかじめ感作された
マウス、ラビット又はラットであってエンドトキシン処
理されたものの血清が、移植された腫瘍を担持するマウ
スに注射された場合に受容者に不所望の副作用を伴わな
いで該腫瘍の広範な出血を惹起する物質を含有すること
が見出された。

【０００３】従って、この血清は腫瘍細胞に対して選択
的に壊死作用を有しそして正常な組織とのその反応につ
いては中立的であり、それ故にＴＮＦと称される物質を
含有することが予想された。全体動物に注射された場合
にこの選択的な腫瘍破壊を生じさせる能力がＴＮＦを定
義する標準的なインビボアッセイ法となった。

【０００４】ＴＮＦはまた細胞培養物中にも生産され
た。Matthews等、Brit.J.Cancer (1981) 44：418 は、
ＢＣＧ注射されたラビット由来の単核食細胞の培地中に
ＴＮＦ活性を得ることができた〔Mannel等、Infect.Imm
un.(1980) 30：523 ；同 (1981) 33：156 〕。細胞培養
後にＢＣＧ感染されたマウスからのマクロファージ富化
腹腔滲出細胞から得られるＴＮＦ活性はエンドトキシン
により誘導された。

【０００５】新生物細胞に対する選択的細胞毒性を担当
する因子を精製する試みが行われたが全体動物の血清中
又は組織培養培地中に極めて小量のみ存在する様である
ため完全な精製を行うことは不可能であった。さらに、
蛋白質（１又は複数）は明らかに不安定であり、そして
２つの最近の米国特許 No.４，４４７，３５５及び No.
４，４５７，９１６は、例えばアルブミン又は炭水化物
材料の添加により調製物の活性を安定化する方法に向け
られている。

【０００６】他人によって開発された標準的精製法を用
いるこれらの開示の方法においては、約１×１０⁶ ユニ
ット／mgのＴＮＦ調製物の比活性を得ることが可能であ
り、このユニットはネズミＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １．２）に対する細胞毒性についてのインビトロ・
アッセイにおいて定義されたものである。しかしなが
ら、ＴＮＦについてのインビボ（Carswell）腫瘍壊死ア
ッセイにおいて活性であり、且つアミノ酸配列情報を得
ることができるために十分な純度を有する材料を得るこ
とは不可能であった。

【０００７】確かに、純粋な細胞毒性蛋白質が入手不可
能であるため、現在のところ、癌細胞に対して選択的な
壊死作用を有する蛋白質をいかに多く得ることができる
か明らかでない。Carswell等（前掲）のインビボ法はＴ
ＮＦを定義する標準として承認されている。これらの因
子の種間交差活性（cross species activity) のため、
このアッセイ法はある意味において便利で診断的であ
る。

【０００８】しかしながら、細胞毒性についての一層便
利なインビトロアッセイ法がＴＮＦ活性の指標としてし
ばしば使用される。この方法は、このインビトロアッセ
イ法とＴＮＦを定義する試験との間に１：１の相互関係
が存在するか否かについてかなりの混乱があるにもかか
わらず使用されている。確かに、インビトロアッセイに
おいて活性である形質転換されたＢ−セルライン由来の
蛋白質が“リンホトキシン”と命名され、均一に精製さ
れ、そして部分的に配列決定された（ゼネンテック、ヨ
ーロッパ特許出願公開 No.０１００６４１、１９８４年
２月１５日公開）。

【０００９】リンホトキシンは、それが非マクロファー
ジ由来であるため、“ＴＮＦ”とは異る蛋白質であると
予想されている。さらに、リンホトキシンに対して調製
された抗−血清はマクロファージから精製された細胞毒
性因子（ＴＮＦ）と交差反応しない〔 Stone-Wolff, D.
等、J.Exp.Med. (1984) 159 ：828 〕。

【００１０】腫瘍細胞に対して特異的に向けられた細胞
毒性効果を発揮することができる明確にされた蛋白質配
列を提供することは、言うまでもなく、悪性疾患の診断
及び治療の両者のために大きな利益をもたらすであろ
う。さらに、これらの因子の幾つかは抗−寄生活性を有
するようであり、ＢＣＧを注射されたマウスの血清由来
のＴＮＦと称する蛋白質が、インビボ及びインビトロに
おいてマラリア寄生体〔プロスモジウム・ファルシパリ
ウム（Plasmodium falciparium) に対して細胞毒的影響
を示すことが示されている〔 Haidans等、Infect.Immu
n.(1983) 42：385〕。

【００１１】

【発明の開示】ヒト前骨髄球性白血病セルライン（ＨＬ
−６０，ＡＴＣＣ No ＣＣＬ２４０）が、適切に誘導さ
れた場合、腫瘍壊死因子を有意な量で生産することが示
された。この因子が精製され、配列決定され、そして組
換技法によって生産された。従って、第１に、ヒト腫瘍
細胞に対して選択的に細胞毒性である化学的に定義され
た因子が存在する。

【００１２】これは、医療において使用するために十分
な量の材料を提供し、活性を改良するためにプログラム
された変形を行い、そして生物中の腫瘍の存在を検出す
るための適切な診断試験を設計する機会をもたらす。す
なわち、この蛋白質の組換源の入手可能性は、この有用
なペプチドの治療及び診断のための操作の実施可能性を
もたらす。以上の形態のＴＮＦが腫瘍形態に応答してヒ
トによりおそらく天然に生産されるであろうが、組換生
産によりもたらされる柔軟性並びに質及び量の保証がな
ければ、その性質を利用する手段を手にすることができ
ない。

【００１３】従って、１つの観点において、この発明は
組換ヒトＴＮＦミューテインをコードするＤＮＡ配列、
形質転換宿主にＴＮＦを発現する能力を付与することが
できる形質転換ベクター、こうして形質転換された組換
体宿主に関する。他の観点において、この発明は特にグ
リコシル化された形又はグリコシル化されていない形の
ミューテインに関する。これらのミューテインは、腫瘍
細胞を選択的に殺すそれらの能力において、図１に示す
一次配列のＴＮＦ（ｍＴＮＦ）に匹敵し、又はそれより
活性が高い。これらのミューテインは、４個又は８個の
Ｎ−末端アミノ酸残基が除去されている対応する蛋白
質、及び６９位のＣｙｓ又は６９位と１０１位のＣｙｓ
が他のアミノ酸により置換されているミューテインを包
含する。

【００１４】

【発明を実施するための態様】

Ａ．定義 この明細書において使用する場合、“腫瘍壊死因子”
（ＴＮＦ）は、腫瘍細胞に対して選択的細胞毒性である
ことができ、図１に示されるものと実質的に同等のアミ
ノ酸配列に関する。この定義に合致するアミノ酸配列は
後に記載する連続性ネズミ結合組織セルラインＬ−９２
９に基くインビトロ細胞毒性アッセイにおいて活性でな
ければならない。ＴＮＦ活性のこの定義は、Carswell等
（前掲）によるこの用語を造り出した開示中に示されて
いるそれとは正確に同一ではない。

【００１５】しかしながら、ヒト腫瘍細胞に対するこの
インビトロ細胞毒性アッセイにより確認される活性は、
このアッセイを用いる腫瘍壊死因子としての性質決定が
正当化されるに十分な有用性の保証をもたらす。下記の
ごとく、Ｌ−９２９に対する細胞毒性は他のヒト腫瘍に
一般化されるようである。上に特定した細胞毒性アッセ
イにおいて活性な因子とCarswellにより要約されている
インビボアッセイにおいて活性な因子との間に実質的な
オーバーラップが存在すると予想される。

【００１６】この発明のＴＮＦ蛋白質は、懸濁されてい
るか又は溶液であればその環境のpHに依存して、あるい
は固体の形であれば結晶化又は沈澱の際のその環境のpH
に依存して、医薬として許容される塩の形であることが
でき、又は中性の形であることができる。この蛋白質の
遊離アミノ基は言うまでもなく、例えば無機酸、例えば
塩酸、リン酸もしくは硫酸、又は有機酸、例えば酢酸、
グリコール酸、コハク酸もしくはマンデル酸と共に酸付
加塩を形成することができる。

【００１７】遊離カルボキシル基は、塩基、例えば無機
塩基、例えばナトリウム、カリウム又はカルシウムの水
酸化物、及び有機酸、例えばピペリジン、グルコサミ
ン、トリメチルアミン、コリン又はカフィインと共に塩
を形成することができる。さらに、蛋白質は他の生物学
的物質、例えばリピド及びサッカライドとの結合によ
り、又は側鎖修飾、例えばアミノ基のアセチル化、ヒド
ロキシル側鎖のリン酸化、又はスルヒドリル基の酸化に
より修飾され得る。ＴＮＦ活性が保持される限り、これ
らの修飾のすべてがこの発明の範囲に属する。

【００１８】最後に、一次アミノ酸配列のある種の変形
がなお、図１に示される配列に比べて実質上同等の又は
増強された活性を有する蛋白質をもたらすことができる
ことが理解される。これらの変形は、部位特定変異誘発
によるごとく意図的であってもよく、又はＴＮＦ生産宿
主中における変異によるごとく偶然的であってもよい。
特定の変形がＴＮＦ活性を有する蛋白質を導くであろう
ことは予想されず、そしてどの変形が許容されるかをあ
らかじめ予想することはできないが、上記のようにＴＮ
Ｆ活性が保持されている限りこれらの変形のすべてが
“ＴＮＦ”の定義に含まれる。

【００１９】特に、図１に示される配列のＮ−末端の最
初の１０個までのアミノ酸（１０番目のアミノ酸を含
む）を欠くミューテインが示されている構造のＴＮＦに
匹敵するか又はそれより高い比活性を有することが見出
され、そして後で説明する。比活性のパターンは、６〜
８個のＮ−末端アミノ酸が除去された場合に最適活性を
伴って、ベル形曲線に従うようである。従って、ＴＮＦ
の定義は特にこれらの切り取られた形態を包含する。明
らかに、Ｎ−末端からの１０個までのアミノ酸の除去は
生物学的活性を破壊せず、しかし事実、しばしばそれを
増強するからである。

【００２０】従って、この明細書においてＴＮＦの定義
は特に、図１に示すものと実質上同じアミノ酸配列を有
するが、しかしその図中に示されるＮ−末端配列におい
て１〜１０個のアミノ酸を欠く蛋白質を包含する。Shir
ai, T.等、Nature (1985) 313 ：803-806 が、ヒト−ゲ
ノムバンクから得られたＤＮＡから造成された発現ベク
ターを用いて組換ＴＮＦを製造したことが注目される。
この造成物においては、コードされた蛋白質は図１に示
されるＮ−末端配列の最初の２アミノ酸を欠いている。

【００２１】明らかではないがしかしラビットＴＮＦゲ
ノム構造に関連するらしい理由で、Shirai等は、正しい
Ｎ−末端はこの明細書において示されている位置の３位
から始まると予想し、そしてこのために前記ベクターを
造成した。その結果、Shiraiにより製造されたＴＮＦは
Ｎ−末端配列 Ser-Ser-Ser-Arg-Thr等を有する。Shirai
により製造されたＴＮＦはインビボ活性を有することが
示された。この蛋白質の活性と、この発明の組換生産さ
れたｍＴＮＦ及びＴＮＦミューテインのそれとの直接比
較は現在のところ得られていない。

【００２２】さらに、図１に示すＴＮＦのＣ−末端から
の除去も無害であると予想される。１７個までのアミノ
酸の除去をコードする遺伝子の造成も行われた。米国特
許 No.４，５１８，５８４は生物学的に活性な蛋白質の
システインが除去されたミューテインを記載している。
ＴＮＦの場合においては、６９位のシステインの中性ア
ミノ酸による置き換えが活性なＴＮＦ蛋白質をもたら
す。１０１位のシステインも不必要なようであり、そし
てこの位置にこれに代る中性アミノ酸を有するミューテ
イン、並びにシステイン６９及び１０１の両者が置き換
えられたミューテインも調製された。

【００２３】これらのミューテインもまた、この発明の
方法に従って、変形してＴＮＦ活性を保持しておりそし
てインビボ及びインビトロにおいて増強された比活性を
有するであろう切り取られた形を得ることができる。こ
れらのミューテインはＮ−末端の１〜１０個のアミノ
酸、Ｃ−末端におけるアミノ酸の配列、又はこの両者を
欠いている。これらのミューテインもまた特徴的にＴＮ
Ｆの定義に属する。

【００２４】最後に、天然源から精製されたＴＮＦをモ
デルとして使用して遺伝子が造成された。３位及び４位
の２個のセリン残基が除去されているミューテインをコ
ードする遺伝子及び１５位及び１６位の his-valカプレ
ットが val-serにより置換されているミューテインをコ
ードする遺伝子が調製された。

【００２５】記号に関し、便宜上図１中１〜１５７と番
号を付したアミノ酸配列を有する蛋白質を参照として使
用し、そしておそらく勝手にｍＴＮＦ（成熟ＴＮＦ）と
称されるであろう。ｍＴＮＦとの相同性を有しそしてＴ
ＮＦの生物学的活性を示す他のすべてのアミノ酸配列は
ｍＴＮＦのミューテインと称され、そして図中に示され
る残基の番号を用いてｍＴＮＦからの差異にしいて示さ
れるであろう。

【００２６】例えば、６９位のシステインの置換を有す
るミューテインは置換された残基及び位置の番号を用い
て示され、例えば６９位においてシステインの代りにセ
リンを有するペプチドはｓｅｒ₆₉ＴＮＦとして示される
であろう。残基が単に欠失している場合には、それはｄ
ｅｓ−残基として命名され、従って例えば、３位及び４
位のセリンが除去されているミューテインはdes-ser₃de
s-ser₄ＴＮＦと称されるであろう。

【００２７】Ｎ−末端の除去は、▽及びそれに次ぐ欠失
の数を用いて対応する数のアミノ酸を欠くものとして示
されるであろう。例えば、図１に示した蛋白質に比較し
て１個のＮ−末端アミノ酸を欠くミューテインは▽１Ｔ
ＮＦとして命名されるであろう。Ｃ−末端の欠失につい
ては、▽の次に最後の残っている残基の番号及びマイナ
ス記号が付されるであろう。従って、Ｃ−末端から７個
のアミノ酸が除去されているミューテインについては名
称は▽１５０−ＴＮＦであろう。上記の変化の組み合わ
せが行われる場合、名称はそのすべてを示し、例えば△
1des-ser₃des-ser₄ser₆₉▽１５０−ＴＮＦとなるであろ
う。

【００２８】ｍＴＮＦのミューテインのすべてが組換に
より又は意図的に製造されるわけではない。確かに、
Ｄ．１．ｈ．に後記するＨＬ−６０により分泌されるＴ
ＮＦの２２個のＮ−末端アミノ酸について得られた配列
を図１に示される推定される配列の対応する部分と比較
することにより、両蛋白質はＴＮＦ活性を示すにもかか
わらず一次構造中にわずかな変化が存在することがわか
る。

【００２９】具体的には、推定される配列は、ＨＬ−６
０由来の蛋白質の４〜１２位と推定れる配列の６〜１４
位の間で示される相同性を回復する前に３位のセリンの
次に追加の一対のセリン残基を有する。さらに、ＨＬ−
６０由来蛋白質の１３位及び１４位は var-serであり、
推定される配列の対応する１５位及び１６位は his-var
である。“作用可能に連結された”とは、複数の構成成
分がそれらの通常の機能を行うように配置されている並
置を意味する。従って、コード配列に作用可能に連結さ
れている制御配列は該コード配列の発現を行うことがで
きる。

【００３０】“制御配列”は、１又は複数のＤＮＡ配列
であって、目的のコード配列に作用可能に連結された場
合に、該ＤＮＡ配列と適合性の宿主中で該コード配列の
発現を行うことができるものを意味する。このような制
御配列は原核生物及び真核生物宿主の両者におけるプロ
モーター、及び原核生物においてはさらにリボゾーム結
合部位配列、そして真核生物においてはターミネーショ
ンシグナルを含む。発現を行うために必要であるか又は
好ましい追加のファクターも後で特定されよう。この明
細書において使用する場合、“制御配列”は単に、使用
される特定の宿主において発現を行うために必要とされ
るすべてのＤＮＡ配列に関する。

【００３１】“細胞”、“組換宿主”、又は“宿主細
胞”はしばしば交換可能に使用され、そして文脈から明
らかになるであろう。これらの用語は直接の対象細胞、
及び言うまでもなくそれらの子孫を包含する。環境中で
の偶然変異及び変化のため、すべての子孫が親細胞と正
確に同一というわけではないことが理解される。しかし
ながら、上記の用語が使用される場合、このような変化
した子孫も含まれる。

【００３２】Ｂ．一般的記載 ヒトＴＮＦをコードするＤＮＡ配列を得るために下に示
される方法は例示的であり且つ典型的なものである。他
の方法を使用することもできる。完全なＤＮＡ配列がイ
ントロンを含まない形で得られたので、そしてこの明細
書中に開示するので、言うまでもなく目的とするＤＮＡ
配列を得るために同じ方法を反復する必要はない。

【００３３】のみならず、発現のためにこの明細書に例
示するのと同じ系を使用する必要もない。Ｃ項において
さらに詳細に示すように、目的とするＴＮＦの生産を行
うために使用され得るであろう種々の宿主及び制御配列
が当業界において入手可能である。例示される方法にお
いて、Ｂ．１．項に記載するようにＴＮＦを分泌するよ
うに、ヒト前骨髄球性白血病セルラインＨＬ−６０が改
良された誘導法によって誘導された。この蛋白質は、
Ｂ．２．項において記載するように新規な精製法を用い
て均一に精製され、そして生ずる精製された蛋白質がア
ミノ酸配列決定にかけられた。

【００３４】これがプローブ混合物の造成を可能にし、
このプローブが次に、Ｂ．３．項に記載するように適切
なコード配列を得るために使用された。このコード配列
は、適当な原核性制御系を含有しそして哺乳類細胞での
発現のためにウィルスプロモーターを用いるベクター中
に連結することにより、この例示における発現のために
使用された。

【００３５】ｃＤＮＡ配列の検索からすでに得られてい
るＤＮＡ配列のミューテインを生じさせるためコード配
列中の変形を行った。このような変形はプライマー指令
変異誘導により行われ、そして増強された活性を示す短
縮された形のＴＮＦが提供された。

【００３６】Ｂ．１．改良された誘導法 誘導にかけるセルラインＨＬ−６０ヒト前骨髄球性白血
球セルラインはそれ自体比較的未分化である。分化する
ことが許容されれば、このものは一層特異的に規定され
た細胞タイプのコロニーを形成する。その後の事象に依
存して、このものは顆粒球に、又は単球に成熟し、この
単球は次にさらに分化してマクロファージになることが
できる。マクロファージ画分がＴＮＦのインビボ生産を
担当すると予想される。他方、見かけ上密接に関連して
いるリンホトキシンはＢリンパ球により生産されると考
えられる。

【００３７】対象細胞により生産されるＴＮＦのレベル
は誘導法の改良により１０〜２０倍増加し得ることが見
出された。Gifford, G等により考案された既知の方法
（私信）は２０％血清中で３７℃、３０分間、１０μｇ
／mlでのホルボル（ｐｈｏｒｂｏｌ）エステル１２−Ｏ
−テトラデカノイルホルボル−１３−アセテート（ＴＰ
Ａ）による処理を用いる。

【００３８】次に、細胞培養物が回転沈降され、そして
インシュリン及びトランスフェリン（各１０μｇ／ml）
が補充された無血清培地中１０μｇ／mlのエンドトキシ
ンにより処理される。最初のインキュベーションにおい
て無血清培地を用いてホルボルエステルの濃度を１００
μｇ／mlに低下せしめることにより、そしてエンドトキ
シン処理の段階において１０μＭカルシウムイオノホー
レＡ２３８１７を添加することにより、エンドトキシン
と共にインキュベートした後の上清中のＴＮＦの含量が
実質的に増加する。

【００３９】Ｂ．２．ＴＮＦの精製 さらに、誘導された細胞培養物からＴＮＦを精製するた
めの改良された方法が開示される。この方法はＴＮＦを
含有する上清を、ＴＮＦの吸着を許容しない条件下で陰
イオン交換樹脂により処理し、次にＴＮＦ含有画分をサ
イズ分画用ゲルで処理して活性画分を得、次にこれをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにかけることを含んで成る。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥからのＴＮＦ含有画分をＨＰＬＣによりさらに精
製する。

【００４０】第１段階において、陰イオン交換樹脂に適
用する前に、ＴＮＦを含有する上清を場合によっては例
えば市販の濃縮用フィルター、例えばアミコン中空繊維
又はミリポアペリコン限外濾過ユニットで処理すること
により濃縮する。次に、濃縮物を適当な陰イオン交換樹
脂、例えばＤＥＡＥアガロース、ＤＥＡＥセルロース、
又はＱＡＥアガロース、好ましくはＤＥＡＥアガロース
で処理する。処理条件、すなわちpHが約７〜９で合計塩
濃度が約０．０１〜０．０７Ｍの溶液は、ＴＮＦ活性が
支持体に吸着しないようなものである。

【００４１】次に、非結合画分を、例えば任意の市販の
サイズ分画用ゲル、例えば約７０，０００ダルトンの分
子量排除を有するセファデックスＧ−７５スーパーファ
イン（ファルマシア）を用いるゲル濾過によりさらに精
製する。ゲルで処理した後のＴＮＦ含有画分を次に適当
な条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてＴＮＦ活性
を含有するゲルスライスを回収する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
は Laemmli等、Nature(1970) 227 ：680 の方法に従っ
て行われそしてこれは当業界においてよく知られている
技法である。適切な範囲内での特定の条件の変更は可能
でありそしてよく理解される。

【００４２】次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの活性含有画
分を逆相ＨＰＬＣにかけ、そして０．１％ＴＦＡ中０〜
６０％アセトニトリルグラジエントにより溶出する。使
用することができる他のグラジエント溶出系は酢酸及び
ｎ−プロパノールを含む。こうして得られるヒトＴＮＦ
はＮ−末端アミノ酸の配列決定を可能にするのに十分に
純粋である。

【００４３】Ｂ．３．コード配列の単離 ＨＬ−６０細胞から調製されたｍＲＮＡは、標準的な卵
母細胞翻訳系に加えられた場合、Ｌ−９２９細胞毒性ア
ッセイにおいて活性なＴＮＦ因子の生産を行うことがで
きる。オリゴマープローブの相対効率を、このｍＲＮＡ
調製物と前インキュベートした場合にこの翻訳系におけ
るＴＮＦの生産に負の影響を与えるそれらの能力により
試験することができた（“ハイブリド捕捉”）。

【００４４】卵母細胞系での画分の翻訳により所望のＴ
ＮＦコードｍＲＮＡがすでに同定されている場合、キナ
ーゼ処理されたプローブへハイブリダイズするｍＲＮＡ
グラジエントのラジオオートグラフィーにより、前記の
基準を一層精密なものにすることができる。蛋白質中の
配列 Asp-Lys-Pro-Val-Alaをコードする４個のプール
（それぞれがｍＲＮＡに相補的であるように設計された
１６個の１４−マーを含む）のいずれが正しい配列を含
有しているかを決定することが可能であった。

【００４５】１６個のオリゴマーのこの混合物がＴＮＦ
コードｍＲＮＡのみにハイブリダイズするために十分に
特異的ではないことをＮｏｒｔｈｅｒｎブロットにより
示すことができたので、これらの“ハイブリド捕捉”実
験を８対の１４−マーを用いて反復した。１対がｍＲＮ
Ａを特異的にハイブリダイズするのに好結果をもたらし
た。

【００４６】一旦十分に特異的なプローブが同定した
後、目的のＴＮＦをコードするｍＲＮＡ画分から形成さ
れたｃＤＮＡライブラリーを検索するためにこれを使用
した。２８個の好結果のハイブリダイズするコロニを拾
い、プラスミドＤＮＡを単離し、そして幾つかの挿入部
を配列決定した。完全なコード配列を含有するプラスミ
ド調製物をｐＥ４と命名し、そしてコード配列源として
使用した。追加のプラスミド調製物ｐＢ１１を哺乳動物
発現のために使用した。

【００４７】Ｂ．４．ＴＮＦの発現 ｐＥ４の挿入部のヌクレオチド配列決定は、言うまでも
なく、コード配列の位置及び挿入部中の利用可能な制限
部位の分析を可能にした。相同性は完全ではなかった
が、正しい置き換えを容易に行うことができた。操作を
容易にするため、成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸のため
のコドンと位相を合わせて且つそのすぐ前にＡＴＧ開始
コドンを置き、そしてこのＡＴＧのすぐ上流にＨｉｎｄ
III 部位を含有せしめるのが望ましかった。これは部位
特定変異誘発により達成された。

【００４８】その詳細は後で記載する。次に、この適切
な開始シグナルを有するコード配列を２つの部分、すな
わちＨｉｎｄIII ／ＰｓｔＩ断片及びＰｓｔＩ／Ｂａｍ
ＨＩ断片に切り取り、そしてこれらの断片を制御配列を
含有する宿主発現ベクターに挿入することが可能であっ
た。他の方法として、完全な配列をＨｉｎｄIII 断片と
して切り取ることができた。使用される特定の宿主発現
ベクターは、ＨｉｎｄIII 部位の上流のｔｒｐプロモー
ター及び下流ＢａｍＨＩ部位を含有するｐＴＲＰ３、並
びに同様に配置されたＰ_L プロモーターを含有するｐＦ
Ｃ５４．ｔ及びｐＰＬＯＰである。

【００４９】これらの発現ベクターを適当なＥ．コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に形質転換し、そして得られた形
質転換体をＴＮＦの生産をもたらす条件下で培養した。
音波処理し、そして次に音波処理物をチャオトロピック
剤（chaotropic agent) で処理して目的のＴＮＦを可溶
化することによりＴＮＦを細胞から回収することがで
き、又は該音波処理物を直接アッセイすることができ
る。

【００５０】最初の発現はＥ．コリ中で達成された。し
かしながら、Ｃ．１項において非常に詳細に記載するご
とく、ｐＥ４又はｐＢ１１からのコード配列を、他の原
核生物、酵母、組織培養物、又は植物細胞中での発現に
適する制御配列に連結することもできた。哺乳動物細胞
中での発現は実際にｐＢ１１のＳＶ４０プロモーターを
用いて達成された。適切な宿主の選択は、分泌を行う可
能性、翻訳後プロセシングを行う可能性、及び適切な増
殖条件下での目的の蛋白質を高レベルで生産する能力を
含む多くの因子に依存するであろう。

【００５１】Ｂ．５．アッセイ Ｂ．５．ａ．細胞毒性アッセイ法 Ｌ−９２９アッセイ系は、ＴＮＦ活性の迅速な測定を可
能にする改良された便利なインビトロアッセイ法であ
る。Carswellのインビボ腫瘍壊死アッセイとの相関の程
度は現在のところ知られていない。しかしながら、これ
は特にネズミ腫瘍細胞を使用するので、相関性は高いと
予想される。ＥＰＯ公開 No.０１００６４１（前掲）に
おいてリンホトキシンと称される蛋白質もこのアッセイ
において活性を与える。

【００５２】このアッセイ法は概念において、ネズミＬ
−Ｍ細胞及びメチレンブルー染色を使用する米国特許 N
o.４，４５７，９１６に開示されているものに類似す
る。Ｌ−９２９アッセイ法はヒト腫瘍セルライン細胞毒
性と相関する（ＨＬ−６０由来ＴＮＦについて）ことが
示された（Ｄ．１．ｂ項を参照のこと）。

【００５３】この発明のＬ−９２９アッセイ系におい
て、Ｌ−９２９細胞はミクロタイタープレート中で単層
として一夜調製される。試験サンプルをプレートにわた
って２倍稀釈し、ＵＶ照射し、そして次に調製された細
胞単層上に加える。次に、ウエル中の培地を１μｇ／ml
アクチノマイシンＤにする。プレートを３７℃にて１８
時間インキュベートし、そしてプレートを顕微鏡下で視
覚的にスコアーする。ウエル中の細胞死の程度を示す２
５％，５０％，７５％及び１００％の標示を各ウエルに
与える。ＴＮＦ活性の１ユニットを５０％の死滅を生じ
させる稀釈の逆数として定義する。

【００５４】さらに、このアッセイ法の一層高感度の変
法が開発された。この方法は、試験サンプル及びアクチ
ノマイシンＤにより処理された場合に、前ラベルされた
細胞からの³⁵Ｓでラベルされたペプチドの放出をモニタ
ーする。アッセイ法のこの変法は力価を定量するため、
例えば卵母細胞により翻訳された物質の相対力価を評価
するために使用することができる。

【００５５】要約すれば、活発に増殖しているＬ−９２
９の培養物を、２％の透析されたウシ胎児血清が補充さ
れたメチオニン不含有培地中で³⁵Ｓ−メチオニン（２０
０μCi／ml）により３時間ラベルする。次に細胞を洗浄
し、そして９６ウエルプレート中にプレートし、そして
一夜インキュベートし、そして次の日に試験サンプルの
２倍稀釈物及び１μｇ／mlのアクチノマイシンＤで処理
する。

【００５６】次に、培養物を３７℃にて１８時間インキ
ュベートする。次に、各ウエルからの１００μｌの上清
アリコートを他の９６ウエルプレートに移し、酸（ＴＣ
Ａ）沈澱せしめ、そしてガラス繊維フィルター上に回収
する。フィルターを９５％エタノールで洗浄し、乾燥
し、そして計数する。すべてのアッセイにＮＰ₄₀洗剤対
照を含めて細胞からの放射能の最大放出を測定する。次
に、³⁵Ｓ放出（％）を処理細胞と未処理対照との間のカ
ウントの差をＮＰ₄₀処理細胞と未処理細胞との間のカン
トンの差で除した比率、すなわち、

【００５７】

【数１】 で表わされる比率により計算する。ＴＮＦの力価が高く
なるに従ってこの比率が高い値となる。上記のアッセイ
法は、対象細胞としてヒト腫瘍セルラインを使用するた
めに便利に変更される。上記のＬ−９２９細胞の場合と
同様にしてユニットを定義し、そして放出（％）を計算
する。

【００５８】Ｂ．５．ｂ．インビボアッセイ 調製物はまた、腫瘍を殺し又はその成長を抑制し、そし
て該腫瘍を担持する動物を死亡から保護するその物質の
能力を用いて、ＴＮＦ活性について試験することができ
る。Ｂａｌｂ／ｃマウスに種々のタイプの腫瘍細胞を皮
下注射することにより局在化した腫瘍を形成せしめた。
腫瘍セルラインは腹水からの細胞懸濁物として得られる
ＭｅｔｈＡマウス線維肉腫、及び１mm³ の細胞塊として
投与されるＭＣＦ−７ヒト乳癌を包含した。

【００５９】アッセイのため、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス
（１９〜２２ｇ）に２６ゲージ針により０．１mlの媒体
中に５×１０⁵ 個の線維肉腫細胞を含有する懸濁液又は
ＭＣＦ−７塊を皮下注射した（繊維肉腫懸濁液は８日目
の腹水から細胞の計数及び血清不含有培地による稀釈に
より調製した）。９〜１０日後、腫瘍が触知可能になっ
たとき、試験すべきＴＮＦの量（マウス当り１μｇの範
囲）を注射し、そしてその後の日に所望によりＴＮＦ投
与を反復した。腫瘍の体積を測定することにより、及び
生存率により結果を評価した。

【００６０】Ｂ．６．ＴＮＦミューテインの生産 この発明は、最適活性の蛋白質を得るために有利なｍＴ
ＮＦの多数の変形を意図する。前記Ｂ．５．ａ項の細胞
毒性アッセイにおいて匹敵する又は増加した比活性をも
たらす一次アミノ酸配列の幾つかの特定の変化を得た。
ｍＴＮＦの配列からの最初の１０個又はそれより少い数
のアミノ酸の除去の幾つかは、“天然”組換蛋白質の比
活性と同等か又は数倍高い比活性を有する蛋白質をもた
らす。ｍＴＮＦのシステイン除去ミューテインもまた、
これらのミューテインのＮ−末端除去形がそうであると
同様に、ＴＮＦ活性を示す。

【００６１】これらのミューテインの幾つかの製造は、
ＴＮＦのためのコード配列を含有する発現ベクターを所
望のコード配列に対応するプライマーを用いて部位特定
変異誘発にかけることにより行われる。こうして、コー
ド配列中に適切な変化を有する変形された発現ベクター
が得られる。得られた変形されたベクターを適当な宿主
に形質転換し、次にこれをコードされたミューテインの
生産をもたらす条件下で培養する。次に、これらのミュ
ーテインは“天然蛋白質”と同様に細菌培養物から精製
され、そして低下していないか又は増強されている活性
を有することが示される。

【００６２】特に、▽４ＴＮＦミューテイン及び▽６−
１０ＴＮＦミューテインは２つの点においてｍＴＮＦに
明らかに卓越している。すなわち、これらは一層高い比
活性を有し、そしてこれらは“きれいな”生成物として
生産される。後に一層詳細に示すように、これらの好ま
しい具体例の幾つかについて、精製された蛋白質の活性
は細胞毒性アッセイにおいてｍＴＮＦにより示されるそ
れよりも数倍高い。さらに、等電点電気泳動ゲル上での
挙動により証明されるように、精製された組換ｍＴＮＦ
は側鎖の変形を有するらしい一群の蛋白質を示すのに対
して、これらのミューテインはこの方法にかけられた場
合本質的に１個のバンドを与える。

【００６３】Ｃ．標準的方法 細胞を形質転換し、ベクターを造成し、メッセンジャー
ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを調製する等の
ために使用される技法のほとんどは当業界において広く
実施されており、そしてほとんどの実施者は特定の条件
及び方法を記載する標準的手段に親しんでいる。しかし
ながら、便宜上次の項がガイドラインとして役立つであ
ろう。

【００６４】Ｃ．１．宿主及び制御配列 原核生物はほとんどの場合Ｅ．コリの種々の株により代
表される。しかしながら、他の微生物株、例えばバシル
ス、例えばバシルス・ズブチリス（Bacillussubtili
s）、シュードモナス(Pseudomonas) の色々な種、又は
他の細菌株を使用することもできる。このような原核生
物系において、宿主と適合性の種に由来する複製開始点
及び制御配列を含有するプラスミドベクターが使用され
る。

【００６５】例えば、Ｅ．コリは、 Boliver等、Gene
(1977) ２：95によるＥ．コリ株由来のプラスミドであ
るｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢ
Ｒ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のた
めの遺伝子を含有しそしてそれ故に所望のベクターの造
成において維持されるか又は破壊されることができる追
加のマーカーを提供する。

【００６６】この明細書において転写開始のためのプロ
モーター及び場合によってはオペレーターをリボゾーム
結合配列と共に包含するものとして定義される一般に使
用される原核性制御配列には、α−ラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーター系
〔 Chang等、Nature (1977) 198 1056 〕、及びトリプ
トファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔 Goeddel等、Nucl
eic Acids Res. (1980) ８：4057〕、並びにラムダ由来
Ｐ_L プロモーター及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位
〔 Shimatake等、Nature (1981) 292 ：128 〕（これ
は、１９８４年２月８日に出願され、そして同じ承継人
に承継された係属中の出願 No.５７８，１３３中に記載
されているようにポータブル制御カセットとして有用に
されている）のごとき一般に使用されるプロモーターが
含まれる。しかしながら、原核生物に適合性の任意の入
手可能なプロモーター系を使用することができる。

【００６７】細菌のほかに、真核性微生物、例えば酵母
を宿主として使用することもできる。パン酵母であるサ
ッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisi
ae）の実験室株が最も使用される。但し他の多くの菌株
も一般に入手可能である。２ミクロン複製開始点を用い
るベクターが例示される（Broach, J.R., Meth.Enz.(19
83) 101 ：307 ）が、酵母での発現のために適当な他の
ベクターが知られている〔例えば、Stinchcomb等、Natu
re (1979) 282 ：39；Tschempe等、Gene (1980) 10：15
7 ；及びClarke, L.等、Meth.Enz.(1983) 101 ：300 を
参照のこと〕。

【００６８】酵母ベクターのための制御配列には解糖系
酵素の合成のためのプロモーターが含まれる〔Hess等、
J.Adv.Enzyme Reg.(1968) ７：149 ； Holland等、Bioc
hemistry (1978) 17：4900〕。当業界において知られて
いる他のプロモーターには３−ホスホグリセレートキナ
ーゼのプロモーター〔Hitzeman等、J.Biol.Chem. (198
0) 255 ：2073〕、並びに他の解糖系酵素、例えばグリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイ
ソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベ
ートキナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモ
ーターが含まれる。

【００６９】増殖条件により転写が制御されるという追
加の利点を有する他のプロモーターはアルコールデヒド
ロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファター
ゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及
びガラクトースの資化を担当する酵素(Holland、前掲）
である。さらに、コード配列の３′末端においてターミ
ネーター配列が望ましいと信じられる。

【００７０】このようなターミネーターは酵母由来配列
中コード配列に続く３′非翻訳領域中に見出される。例
示されるベクターの多くがエノラーゼ遺伝子含有プラス
ミドｐｅｎｏ４６〔 Holland, M.J.等、J.Biol.Chem.
(1981) 256 ：1385〕又はＹＥｐ１３から得られるＬＥ
Ｕ２遺伝子〔Broach, J.等、Gene (1978) ８：121 〕が
含まれるが、酵母適合性プロモーター、複製開始点及び
他の制御配列を含有する任意のベクターが適当である。

【００７１】言うまでもなく、多細胞生物由来の真核宿
主細胞培養物中でポリペプチドをコードする遺伝子を発
現せしめることも可能である。例えば、Tissue Culture
s 、アカデミックプレス、Cruz及び Patterson編 (197
3）を参照のこと。有用な宿主セルラインにはベロ細
胞、ヒーラ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞が含まれる。

【００７２】このような細胞のための発現ベクターは一
般に哺乳類細胞と適合性のプロモーター及び制御配列、
例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の一般に
使用される初期及び後期プロモーター〔 Fiers等、Natu
re (1978) 273 ：113 〕、及び他のウイルスプロモータ
ー、例えばポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピロ
ーマウイルス、又は鳥肉腫ウイルス由来のプロモーター
が含まれる。

【００７３】哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的観点は
１９８３年８月１６日に与えられたAxel等の米国特許 N
o.４，３９９，２１６に記載されている。今やさらに、
発現を最適化するために“エンハンサー”領域が重要な
ようであり、これらは一般に非コードＤＮＡ領域中プロ
モーター領域の上流又は下流に見出される配列である。

【００７４】必要であれば、複製開始点はウイルス源か
ら得ることができる。しかしながら、染色体への組込み
が真核生物におけるＤＮＡ複製の一般的機構である。植
物細胞も今や宿主として使用することができ、そして植
物細胞と適合性の制御配列、例えばノパリン・シンサー
ゼプロモーター及びポリアデニレーションシグナル配列
〔Depicker, A.等、J.Mol.Appl.Gen.(1982) １：561 を
使用することができる。

【００７５】Ｃ．２．形質転換 使用される宿主細胞に依存して、そのような細胞に適す
る標準的技法を用いて形質転換が行われる。 Cohen, S.
N., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) (1972) 69：2110により
記載されるような塩化カルシウムを用いるカルシウム処
理、又はManiatis等、Molecular Cloning ：A Laborato
ry Manual (198) コールドスプリングハーバープレス、
２５４頁に記載されているＲｂＣｌ₂ 法を原核細胞、又
は実質的な細胞壁障壁を含有する他の細胞のために使用
した。

【００７６】アグロバクテリウム・チュメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens）による感染〔Shaw, C.
H.等、Gene (1983) 23：315 〕をある種の植物細胞のた
めに使用する。このような細胞壁を有しない哺乳類細胞
のためには、Graham及びvander Eb, Virology (1978) 5
2：546 のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。酵母へ
の形質転換はVan Solingen, P.等、J.Bact.(1977) 130
：946 及び Hsiao, C.L.等、Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A) (1979) 76：3829の方法に従って行う。

【００７７】Ｃ．３．ｃＤＮＡ及び遺伝子ライブラリー
の検索 ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーはコロニーハイブリダ
イゼーション法を用いてスクリーニングする。各ミクロ
タイタープレートを２株のニトロセルロース濾紙（Ｓ＆
ＳタイプＢＡ−８５）上にレプリカし、そしてコロニを
３７℃にて１４〜１６時間、５０μｇ／mlのＡｍｐを含
有するＬ寒天上で増殖せしめる。コロニを細胞溶解し、
そして５００mM ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌにて５
分間処理することによりＤＮＡをフィルターに固定し、
そして５×標準食塩クエン酸塩（ＳＳＣ）により２回そ
れぞれ５分間ずつ洗浄する。

【００７８】フィルターを空気乾燥し、そして８０℃に
て２時間加熱する。２枚のフィルターを４２℃にて６〜
８時間、フィルター当り１０mlのＤＮＡハイブリダイゼ
ーション緩衝液〔５×ＳＳＣ、pH７．０、５×デンハー
ト溶液（ポリビニルピロリドン＋フィコール及びウシ血
清アルブミン；１×＝各０．０２％）、５０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液、pH７．０、０．２％ＳＤＳ、２０μｇ
／mlポリＵ、及び５０μｇ／ml変性サケ精子ＤＮＡ〕と
ハイブリダイズせしめる。

【００７９】サンプルを、所望の厳しさに依存する条件
下でキナーゼ処理されたプローブとハイブリダイズせし
める。典型的な中程度の厳しさの条件は、プローブを含
有するＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１〜５ml／
フィルターと共に２４〜３６時間４２℃の温度を用い
る。より高い厳しさのためには高い温度及びより短い時
間が用いられる。フィルターを、３７℃にて３０分間ず
つ４回、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ及び５０mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７）により洗浄した。次に２×Ｓ
ＳＣ及び０．２％ＳＤＳにより２回洗浄し、空気乾燥
し、そして−７０℃にて２〜３日間オートラジオグラフ
処理する。

【００８０】Ｃ．４．ベクターの造成 所望のコード配列を及び制御配列を含有する適当なベク
ターの造成は当業界においてよく理解されている標準的
連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、Ｄ
ＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは開裂さ
れ、仕立てられ、そして所望の形に再連結される。

【００８１】部位特異的ＤＮＡ開裂は、適当な制限酵素
（１種又は複数種）で処理することにより、当業界で一
般に理解されている条件下で行い、そして具体的な条件
はそれらの市販制限酵素の製造者により特定されてい
る。例えば、ニューイングランドビオラブスの製品カク
ログを参照のこと。一般に約１μｇのプラスミド又はＤ
ＮＡ配列を１ユニットの酵素により約２０μｌの緩衝液
中で行う。この発明の例においては、典型的には過剰の
制限酵素を用いてＤＮＡ基質の完全な消化を保証する。

【００８２】３７℃にて約１〜２時間のインキュベーシ
ョン時間が実施可能であるが、これと異ることもでき
る。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホ
ルムを用いる抽出により蛋白質を除去し、そして次にエ
ーテル抽出することもでき、そしてエタノールにより沈
澱せしめることにより水性画分から核酸を回収し、次に
セファデックスＧ−５０スピンカラムに通す。所望によ
り、開裂された断片のサイス分離を標準的技法を用いる
ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動に
より行うことができる。サイズ分離の一般的技法は Met
hods in Enzymology (1980) 65：499-560 に見出され
る。

【００８３】制限酵素開裂された断片は、Ｅ．コリＤＮ
Ａポリメラーゼの大断片（Ｋｌｅｎｏｗ）を用いて、４
種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴ
Ｐ）の存在下で２０〜２５℃にて約１５〜２５分間のイ
ンキュベーション時間を用いて、５０mM Ｔｒｉｓ（pH
７．６）、５０mM ＮａＣｌ、６mM ＭｇＣｌ₂ 、６mM
ＤＴＴ及び５〜１０μＭ ｄＮＴＰ中で処理すること
により平滑末端化することができる。Ｋｌｅｎｏｗ断片
は５′接着末端をフィルインするが、４種類のｄＮＴＰ
が存在していても突出３′単鎖をチューバックする。

【００８４】所望により、接着末端の性質により指定さ
れる制限内で唯一の又は選択されたｄＮＴＰを供給する
ことにより選択的修復を行うことができる。Ｋｌｅｎｏ
ｗで処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、そしてエタノール沈澱を行い、次にセファデッ
クスＧ−５０スピンカラムに通す。適当な条件下でのＳ
１ヌクレアーゼによる処理が単鎖部分の加水分解をもた
らす。

【００８５】合成オリゴヌクレオチドは、 Matteucci
等、J.Am.Chem.Soc. (1981) 103 ：3185のトリエステル
法により、又は市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を
用いて調製する。アニーリングに先立つ、又はラベル化
のための単鎖のキナーゼ処理は、５０mM Ｔｒｉｓ（pH
７．６）、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、５mMジチオスレイトー
ル、１〜２mM ＡＴＰ、１．７pmole ³²Ｐ−ＡＴＰ
（２．９ mCi／mmole)、０．１mMスペルミジン、０．１
mM ＥＤＴＡの存在下で、過剰の、例えば０．１nmole
の基質に対して約１０ユニットのポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて達成される。

【００８６】連結は１５〜３０μｌの容積中で次の標準
的条件及び温度で行う：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１０mM ＤＴＴ、３３
μｇ／ml ＢＳＡ、１０mM〜５０mM ＮａＣｌ；及び
“接着末端”連結のためには４０μＭ ＡＴＰ、０．０
１〜０．０２(Weiss) ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガーゼ、
０℃、又は“平滑末端”連結のためには１mM ＡＴＰ、
０．３〜０．６(Weiss)ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼ、１４℃。分子間“接着末端”連結は通常、３３〜１
００μｇ／mlの全ＤＮＡ濃度（５〜１００nM全末端濃
度）で行う。分子間平滑末端連結（通常、１０〜３０倍
モル過剰のリンカーを用いる）は１μＭ全末端濃度で行
う。

【００８７】“ベクター断片”を用いるベクターの造成
において、ベクター断片は一般に細菌アルカリホスファ
ターゼ（ＢＡＰ）で処理して５′のリン酸を除去し、そ
してベクターの再連結を防止する。ＢＡＰ消化は、pH８
にて約１５０mM Ｔｒｉｓ中で、Ｎａ⁺ 及びＭｇ⁺⁺の存
在下１μｇのベクター当り約１ユニットのＢＡＰを用い
て６０℃にて約１時間行う。

【００８８】核酸断片を回収するため、調製物をフェノ
ール／クロロホルムで抽出しそしてエタノール沈澱を行
い、そしてセファデックスＧ−５０スピンゲルに適用し
て脱塩する。別の方法として、不所望の断片の追加の制
限酵素消化により２重消化されたベクターにおいて再連
結を回避することができる。

【００８９】配列の変更を必要とするｃＤＮＡ又はゲノ
ムＤＮＡ由来のベクターの部分のために、部位特定プラ
イマー指令変異誘発を用いる。これは、目的の変異を代
表する限定されたミスマッチを除くほか変異すべき単鎖
ファージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレ
オチドを用いて行う。要約すれば、ファージに相補的な
鎖の合成を指令するためのプライマーとして合成オリゴ
ヌクレオチドを用い、そして得られた２本鎖ＤＮＡをフ
ァージを支持する宿主細菌中に形質転換する。形質転換
された細菌の培養物を上層寒天中にプレートし、ファー
ジを担持する単一細胞からのプラークを形成せしめる。

【００９０】理論的には、新しいプラークの５０％は単
一鎖として変異した形を有するファージを含有し、５０
％はもとの配列を有するであろう。得られたプラーク
を、正確にマッチするハイブリダイゼーションを許容す
るがしかしもとの鎖とのミスマッチがハイブリダイゼー
ションを回避するのに十分であるような温度において、
キナーゼ処理された合成プライマーとハイブリダイズせ
しめる。次に、プローブとハイブリダイズするプラーク
を拾い、培養し、そしてＤＮＡを回収する。部位特定変
異法の詳細は具体的な例において後記する。

【００９１】Ｃ．５．造成物の確認 下記の造成物において、プラスミド造成物の正しい連結
の確認においてはまず、Ｅ．コリゼネティック・ストッ
ク・センターから得られるＥ．コリＭＭ２９４株（ＣＧ
ＳＣ＃６１３５）を連結混合物により形質転換する。好
結果の形質転換体を、アンピシリン、テトラサイクリン
もしくは他の抗生物質耐性により、又はプラスミド造成
の態様に依存して他のマーカーを用いて選択する。

【００９２】次に、形質転換体からのプラスミドを、場
合によってはクロラムフェニコール増幅〔 Clewell, D.
B., J.Bacteriol. (1972) 110 ：667 〕の後、 Clewel
l, D.B.等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) (1969) 62：115
9の方法に従って調製する。単離されたＤＮＡを制限酵
素処理により分析し、そして／又は Messing等、 Nucle
ic Acids Res (1981) ９：309 によりさらに記載された
Sanger, F.等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) (1977) 74：
5463のジデオキシ法により、又は Maxam等、 Methods i
n Enzymology (1980) 65：499 の方法により配列決定す
る。

【００９３】Ｃ．６．例示される宿主 この発明においてクローニング及び発現のために使用さ
れる宿主菌株は次の通りである。クローニング及び配列
決定、並びにほとんどの細菌プロモーターの制御のもと
での造成物の発現のため、Ｅ．コリＭＭ２９４株（前
掲）、Talmadge, K.等、Gene (1980) 12：235 ；Mesels
on, M.等、Nature (1968) 217 ：1110を宿主として使用
した。Ｐ_L Ｎ_RBS プロモーターの制御のもとでの発現の
ため、Ｅ．コリＫ１２ ＭＣ１０００ラムダ溶原株Ｎ₇
Ｎ₅₃ｃＩ８５７ Ｓ_usＰ₈₀、ＡＴＣＣ ３９５３１（以
後、ＭＣ１０００−３９５３１と称する場合がある）を
使用する。

【００９４】Ｍ１３ファージ組換体のため、ファージ感
染に感受性のＥ．コリ株、例えばＥ．コリＫ１２株ＤＧ
９８を使用する。ＤＧ９８株は１９８４年７月１３日に
ＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号１９６５を有す
る。 Ｄ．ヒトＴＮＦのクローニング及び発現 次に、ヒト−ＴＮＦ−１のためのコード配列を取得し、
この配列の発現ベクターへ配置し、そして目的の蛋白質
の発現を得るための方法を例示する。

【００９５】Ｄ．１．ヒトＴＮＦの調製及び精製 Ｄ．１．ａ．ＴＮＦの誘導 高濃度（約２×１０⁶ 細胞／ml）の定常期のＨＬ−６０
細胞を遠心分離し、血清の非存在下でＲＰＭＩ１６４０
培地で洗浄し、そして次に１×１０⁷ 細胞／mlの濃度に
再懸濁した。次に、細胞を一定撹拌を伴って３７℃にて
３０分間、懸濁培養において、１００ng／mlのホルボー
ルエステル、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−
１３−アセテート（ＴＰＡ）で処理した。

【００９６】培養物を遠心し、上清をデカントし、細胞
を１０μｇ／mlの細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）
及び１０μＭのＣａイオノホーレ（Ａ２３８１７）を含
有するＲＰＭＩ中に１×１０⁷ 細胞／mlで一定撹拌のも
とで３７℃にて４時間再懸濁した。細胞を１２００rpm
にて１０分間回転沈降せしめ、そして上清を８０００rp
m にて２０分間再遠心分離した。得られた上清をＤ．
１．ｂ項の精製法において用いて天然ＴＮＦを得た。

【００９７】Ｄ．１．ｂ．ＴＮＦの精製 Ｄ．１．ａ．項において誘導されたＨＬ−６０から調製
された約４〜８ｌの上清をアミコン中空繊維（１平方フ
ィートのカートリッジ／１０，０００MWカットオフ）に
より約３００mlに濃縮した。濃縮された培養液を遠心し
て細胞破片を除去し、そして上清を３０mM炭酸水素アン
モニウム緩衝液（pH８．２）により６．２mSの電導度に
調製した。この溶液をＰＭ１０（アミコン）膜を用いる
限外濾過によりさらに濃縮し、そして濃縮された液を遠
心分離（２０，０００×ｇ、１０分間）により透明にし
た。

【００９８】次に、上清を、３０mM炭酸水素アンモニウ
ム／１mM ＮａＣｌ（pH８．２）中で平衡化したＤＥＡ
Ｅイオン交換カラムに適用し、そしてカラムを同じ緩衝
液で洗浄した。画分を集め、そして蛋白質を２８０nmで
モニターした。これらの非結合画分をＬ−９２９細胞毒
性アッセイを用いてアッセイし、そしてＴＮＦ活性を有
する画分をプールし、そして限外濾過により再度濃縮し
た。

【００９９】この濃縮物を、３０mM炭酸水素アンモニウ
ム緩衝液（pH７．４）中で平衡化したセファデックスＧ
７５スーパーファイン（ファルマシア）に適用した。同
じ緩衝液により洗浄することによって得られた非結合画
分を２８０nmにおいてモニターし、そしてＴＮＦについ
てアッセイした。ピークＴＮＦ生物活性を含有する画分
を凍結乾燥した。

【０１００】凍結乾燥された蛋白質をLaemmli ＳＤＳサ
ンプル緩衝液中で再懸濁し、そしてＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルを２mmの切片に細
断し、そして各切片からの蛋白質を１mlの３０mM炭酸水
素アンモニウム緩衝液（pH７．４）中へ浸漬しそして室
温にて一夜振とうすることにより溶出した。

【０１０１】ＴＮＦ生物活性を有する切片を、０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で平衡化されたバイダッ
ク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−４逆相ＨＰＬＣカラム上に適用
し、そして０．１％ＴＦＡ中０％〜６０％アセトニトリ
ルの直線グラジエントを用いて活性を溶出した。蛋白質
を２８０nm及び２１４nmにおいてモニターし、そして画
分を凍結乾燥後にバイオアッセイし、そして３０mM炭酸
水素アンモニウム緩衝液（pH７．４）中に懸濁した。Ｔ
ＮＦ活性を含有する画分を再度凍結乾燥した。得られた
蛋白質は配列決定分析のために使用するのに十分な純度
を有していた。ガス相シーケンサー（アプライド・ビオ
システムス社）を用いて配列を決定した。最初の２２個
のアミノ酸から得られた配列を次に示す。

【０１０２】

【表１】

【０１０３】さらに、精製された蛋白質（Ｇ−７５ゲル
から）を他のヒト腫瘍及び正常セルラインを基材（ｓｕ
ｂｓｔｒａｔｅ）として用いるＬ−９２９細胞毒性アッ
セイの変法を用いて試験した。Ｌ−９２９細胞に対する
このアッセイにおいて毒性であったＧ−７５画分は、Ｈ
_S ９３９Ｔ（黒色腫系）、ＢＴ−２０（乳癌）、Ａ４２
７（肺癌）、ＨＴ−１０８０（結腸癌）、及びＨＴ−２
９（結腸癌）に対しても毒性であった。これらの画分は
Ｈ_S ９３９_S ｋ（皮膚線維芽細胞）、ヒーラ細胞（頸
癌）、Ｈ_S ２７Ｆ（包皮線維芽細胞）、又はＣＯＳ７
（ＳＶ−４０で形質転換されたサルの細胞）に対して毒
性でなかった。

【０１０４】Ｄ．２．コード配列の調製 ヒトＴＮＦをコードするイントロン不含有ＤＮＡ配列を
この明細書に記載する方法により調製した。誘導された
場合に大量のＴＮＦを生産するヒト前骨髄球性白血病セ
ルラインＨＬ−６０系(No ＣＣＬ２４０としてＡＴＣＣ
から入手）を、ｃＤＮＡライブラリーを得るためのｍＲ
ＮＡ源として使用した。これらの細胞から精製されたＴ
ＮＦから決定された蛋白質配列に基いて造成されたオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いてこのｃＤＮＡライブラ
リーを検索し、蛋白質の完全コード配列を回収した。

【０１０５】Ｄ．２．ａ．濃縮されたｍＲＮＡの調製 次の様にしてＨＬ−６０細胞から全メッセンジャーＲＮ
Ａを抽出しそして精製した。ＨＬ−６０細胞をＴＮＦ生
産のためにＤ．１．ａ．に記載したようにして誘導し、
そして４時間の細胞懸濁液を遠心分離により収得した。
全細胞質性リボ核酸（ＲＮＡ）を次のようにして単離し
た。すべての段階は４℃で行う。細胞をＰＳＢ（リン酸
緩衝化塩溶液）で２回洗浄し、そして１０mMバナジルア
デノシン錯体〔Berger, S.L.等、Biochem.(1979) 18 ：
5143〕を含有するＩＨＢ（１４０mM ＮａＣｌ、１０mM
Ｔｒｉｓ、１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、pH８）に懸濁す
る。

【０１０６】エチレンオキシドポリマータイプの非イオ
ン性洗剤を０．３％になるように加えて核膜ではなく細
胞膜を溶解した。１，０００×ｇにて１０分間遠心分離
することにより核を除去した。核後の上清をＴＥ〔１０
mM Ｔｒｉｓ、１mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、pH７．５〕で飽和したフェノール／クロロホルム
（１：１）〔０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）及び１０mM ＥＤＴＡを含有する〕等容量に加え
た。

【０１０７】上清を４回再抽出しそして２，０００×ｇ
にて１０分間遠心して相分離した。サンプルを０．２５
Ｍ ＮａＣｌに調製し、２容量の１００％エタノールを
添加し、そして−２０℃に貯蔵することによりＲＮＡを
沈澱せしめた。ＲＮＡを５，０００×ｇにて３０分間ペ
レット化し、７０％及び１００％のエタノールで洗浄
し、そして乾燥した。ポリアデニル化（ポリＡ⁺ ）メッ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を全細胞質ＲＮＡからオ
リゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーにより得
た〔Aviv, J.等、Proc.Natl.Acad.Sci.(1972) 69：1408
-1412 〕。

【０１０８】すなわち、ＲＮＡをＥＴＳ（１０mM Ｔｒ
ｉｓ、１mM ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、pH７．５）に
２mg／mlの濃度で溶解した。この溶液を６５℃にて５分
間加熱し、次に迅速に４℃に冷却した。ＲＮＡ溶液を室
温にした後、これを０．１ＭＮａＣｌに調整し、そして
結合緩衝液（５００mM ＮａＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ、
１mM ＥＤＴＡ、pH７．５）によりあらかじめ平衡化し
たｄＴセルロースカラムに通した。

【０１０９】流過液をさらに２回カラムに通し、そして
カラムを１０容量の結合緩衝液で洗浄した。ポリＡ⁺ ｍ
ＲＮＡをＥＴＳのアリコートにより溶出し、ＴＥを飽和
したフェノール・クロロホルムにより１度抽出し、そし
て０．２ＭへのＮａＣｌ及び２容量の１００％エタノー
ルの添加により沈澱せしめた。ＲＮＡを２回再沈澱せし
め、７０％エタノール中で１回、そして次に１００％エ
タノール中で洗浄した後に乾燥した。

【０１１０】ポリＡ⁺ ｍＲＮＡを、１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、１mM ＥＤＴＡ、１０mM ＮａＣ
ｌ及び０．１％ＳＤＳ中でのシュークロースグラジエン
トにより分画した。ベックマンＳＷ４０ローター中３
８，０００rpm にて１７時間遠心した後、ｍＲＮＡをグ
ラジエントからエタノール沈澱により回収した。ｍＲＮ
Ａを卵母細胞に注入しそして卵母細胞抽出物を細胞毒性
活性についてアッセイすることによりＴＮＦｍＲＮＡを
含有する画分を同定した。ピーク活性を含有する画分を
プールしてｃＤＮＡライブラリーの造成のために使用し
た。

【０１１１】Ｄ．２．ｂ．ｃＤＮＡライブラリーの造成 ポリＡテイルのオリゴｄＴプライミング及びＡＭＵ逆転
写酵素を用い、 Okayama, H.等、Mol.Cell Biol. (198
3) ３：280(引用によりこの明細書に組み入れる）を用
いて濃縮された１６ＳｍＲＮＡ画分からｃＤＮＡを調製
した。この方法は高い比率の十分に長いコドンをもたら
し、そして宿主ベクターとしてそこに記載されておりそ
して著者から容易に入手することができる２つのベクタ
ー、すなわちｐｃＤＶ１及びｐＬ１の部分を使用する。
得られたベクターは近位ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部
位を含むベクター断片間に挿入部を含有する。このベク
ターはｐＢＲ３２２の複製開始点及びＡｍｐ耐性遺伝子
を含有する。

【０１１２】ｃＤＮＡライブラリーを調製するための他
の方法は、言うまでもなく当業界において良く知られて
いる。今や古典的となった１つの方法は、オリゴｄＴプ
ライマー、逆転写酵素、ポリｄＧによる２本鎖ｃＤＮＡ
のテイル形成、及び所望の制限部位において開裂されて
おりそしてポリｄＣによりテイル形成されているｐＢＲ
３２２又はその誘導体のごとき適当なベクターへのアニ
ーリングを用いる。この代替可能な方法の詳細な記載は
例えば本承継人と同じ承継人に承継された米国特許出願
No.５６４，２２４中に見られる（これを引用によりこ
の明細書に組み入れる）。

【０１１３】この発明において使用される方法において
は、濃縮されたｍＲＮＡ（５μｇ）を、２２℃にて５分
間１０mMメチル水銀で処理することによって変性し、そ
して１００mM ２−メルカプトエタノールを添加するこ
とにより解毒した〔Payvar,F.等、J.Biol.Chem. (1979)
254 ：7636-7642 〕。プラスミドｐｃＤＶ１をＫｐｍ
Ｉで開裂せしめ、ｄＴＴＰでテイル形成し、そして変性
したｍＲＮＡをアニールした。このオリゴｄＴプライム
ドｍＲＮＡを逆転写酵素で処理し、そして新しく合成さ
れたＤＮＡ鎖にｄＣＴＰによりテイル形成した。

【０１１４】最後に、ｐｃＤＶ１ベクターの不所望の部
分をＨｉｎｄIII による開裂によって除去した。これと
は別に、ｐＬ１をＰｓｔＩにより開裂せしめ、ｄＧＴＰ
によりテイル形成し、ＨｉｎｄIII により開裂せしめ、
そして次にｐｃＤＶ１ベクター断片により延長されたポ
リＴテイル形成されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンプレック
スに、Ｅ．コリ・リガーゼを用いて連結し、そしてこの
混合物をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）、Ｅ．
コリ・リガーゼ、及びＲＮアーゼＨで処理した。生じた
ベクターをＥ．コリＫ１２ ＭＭ２９４に形質転換して
Ａｍｐ^R とした。

【０１１５】Ｄ．２．ｃ．プローブの選択 精製されたＴＮＦ配列のアクリル酸８−１２のコード配
列に相補的なオリゴマーを調製した。コドンの冗長性の
ため、合計６４種類の１４−マーをこの部分をコードす
るメッセンジャーに対する相補性の候補とする。合計６
４種類の１４−マーを調製し、そして１６種類ずつの４
個のプールに分けた。

【０１１６】各プールを、上記のようにして調製したシ
ュークロースグラジエント画分した濃縮されたｍＲＮＡ
調製物と混合し、そしてこの混合物を卵母細胞翻訳系に
注入した。未処理のメッセンジャーＲＮＡを用いて対照
試行を行った。卵母細胞系で生産された蛋白質をＬ−９
２９細胞毒性アッセイ（³⁵Ｓ放出）にかけ、対照及びｍ
ＲＮＡと３つのオリゴマープールとの混合物を注射され
た卵母細胞由来の蛋白質が活性を示した。この“ハイブ
リド捕捉”アッセイにおいて、次の配列：

【０１１７】

【表２】 を有するプールで処理されたメッセンジャーを注入され
た卵母細胞のみ不活性であった。このオリゴマープール
の特異性を、誘導されたＨＬ−６０細胞及び未誘導ＨＬ
−６０細胞の両者から上記のようにして調製した濃縮し
たｍＲＮＡ、並びにリンホトキシンを生産することが知
られている細胞から得られた対応するｍＲＮＡ画分との
“ドット・ブロット”ハイブリダイゼーションを用いて
さらに決定した。

【０１１８】このプールは誘導されたｍＲＮＡには良好
にハイブリダイズしたが、しかし未誘導細胞又はリンホ
トキシン生産細胞からの対応する画分とはハイブリダイ
ズしなかった。しかしながら、プローブとしてキナーゼ
処理されたプールを用いるＮｏｒｔｈｅｒｎブロット
は、これが１８Ｓ（リボゾーム）ＲＮＡ画分及びｐＢＲ
３２２ＤＮＡと交差ハイブリダイズする配列を含有する
ことを示した。

【０１１９】従って、この好結果のプールを、８対の１
４−マーとしてその構成員を合成し、その各対を用いて
上記のようにして“ハイブリド捕捉”アッセイを行うこ
とによりさらに分画した。次の配列：

【０１２０】

【表３】 を有する対のみが、卵母細胞中でのＴＮＦの合成の阻害
において好結果であった。分画された誘導されたＨＬ−
６０ｍＲＮＡ画分、誘導された全ＨＬ−６０ポリＡ⁺ Ｒ
ＮＡ、未誘導ＨＬ−６０ポリＡ⁺ ＲＮＡ、及びｐＢＲ３
２２ＤＮＡを用いるドット・ブロット実験は、目的のメ
ッセンジャーにハイブリダイズするために前記の１４−
マー対が特異的であること、及び他の対が不能であるこ
とを確認した。

【０１２１】Ｄ．２．ｄ．コード配列の回収 上に調製したｃＤＮＡをＤ．２．ｃ．において同定した
１４−マー対を用いて検索した。プローブとハイブリダ
イズする２８個のコロニーを拾い、培養し、そしてプラ
スミドＤＮＡを単離した。

【０１２２】全配列をコードするのに十分な長さの挿入
部を含有するプラスミドを選択し、そしてＢ．５項にお
いて前記したようにして、細胞毒性アッセイの³⁵Ｓ放出
形式と組合わせたハイブリド翻訳を用いて正しい配列に
ついて幾つかのプラスミドをアッセイした。ハイブリド
翻訳アッセイは、試験配列が未分画調製物から正しいｍ
ＲＮＡを回収することを利用し、これは回収されたメッ
センジャーを注入した卵母細胞翻訳系により生産された
蛋白質をアッセイすることにより確認される。

【０１２３】試験すべきプラスミドｃＤＮＡをフィルタ
ーに結合せしめ、そして誘導されたＨＬ−６０細胞から
単離されたポリＡ⁺ ＲＮＡにより前記フィルターを処理
する。次に、フィルターを溶出し、溶出物を卵母細胞翻
訳系に注入する。卵母細胞を蛋白質について抽出し、次
にこれをＬ−９２９毒性アッセイの³⁵Ｓ形式において試
験する。Ｅ２〜Ｅ４，Ｅ６、及びＥ８と称する若干のハ
イブリダイズするクローンについての結果を下に示す。

【０１２４】

【表４】

【０１２５】（Ａ₊ 及びＢ₊ はシュークロースグラジエ
ントにより得られた濃縮されたｍＲＮＡを用いる対照で
あり、Ｅ１及びｐＢＲ３２２は陰性対照である。） 挿入部の制限分析及び部分配列決定は、２つの候補プラ
スミドｐＥ４及びｐＢ１１が完全なＴＮＦコード配列を
有するらしいことを示した。ｐＥ４についてのこの分析
の結果を図２に示す。

【０１２６】ｐＥ４を配列決定し、そして３つの可能な
リーディングフレームすべての翻訳から推定されるアミ
ノ酸配列を、精製された蛋白質のＮ−末端配列決定によ
り決定された天然成熟ＴＮＦの既知のＮ−末端配列とマ
ッチさせることにより、ＴＮＦのための正しいリーディ
ングフレームを同定した（図１を参照のこと）。成熟蛋
白質中のアミノ酸配列には、１位のバリンから出発して
番号を付す。

【０１２７】前記のごとく、相同性は完全ではなかっ
た。しかしながら、高度の相同性により正しいｃＤＮＡ
が選択されていたことが示された。図２に示す実験的に
決定された制限開裂部位の証明も与えられる。１．１kb
ＰｓｔＩ断片中の３′ＰｓｔＩ部位の上流のＨｉｎｄ
III は終止コドンの下流にあり、従って後記のごとき上
流領域の変形の後コード配列をＨｉｎｄIII カセットと
して切り出すことを可能にする。

【０１２８】Ｄ．３．ＤＮＡ配列から決定されるヒトＴ
ＮＦの特徴付け 図１中に示されるｃＤＮＡ配列から推定されるように、
成熟ＴＮＦ蛋白質は１５７個のアミノ酸残基を含有し、
そしてグリコシル化を伴わないで約１７，３５４の分子
量を有する。リーダー配列は、最初の利用可能なＭｅｔ
出発コドンから始まっておよそ７６個のアミノ酸を含有
する様である。６９位及び１０１位に２個のシステイン
残基が存在し、活性構造がジスルフィド結合を含有する
可能性を導く。

【０１２９】Ｄ．４．発現ベクターの調製 Ｄ．４．ａ．Ｎ−末端コドンの変形 成熟蛋白質の発現を行うために、成熟蛋白質のＮ−末端
バリン（図１中ｌとして示される）をコードするＧＴＣ
配列にすぐ先行してＡＴＧ開始コドンを導入し、そして
適当な宿主発現ベクターへの連結のためにＡＴＧのすぐ
上流にＨｉｎｄIII 部位を設けるのが便利であった。こ
れは、Ｃ．４項に記載した部位特定変異誘発により達成
した。さらに詳細には、コード配列の上流部分を含有す
るＤＮＡ断片をＰｓｔＩによりｐＥ４から切り出し、ア
ガロースゲル電気泳動により単離し、電気溶出により回
収し、そしてバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８のＰｓ
ｔＩ部位に連結した。

【０１３０】連結されたファージを凍結されたコンピテ
ントＥ．コリＫ１２株ＤＧ９８（ＡＴＣＣ＃３９７６
８）に形質導入し、そしてシグマ社（セントルイス）か
ら入手したイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
５×１０^-4Ｍ及び４０μｇ／mlのＸ−ｇａｌを含有する
培地上にプレートすることにより培養した。非−α−補
完白色プラークは新たな培地に拾い上げた。予想される
（１．１kb）サイズの挿入部を含有する組換体単鎖ファ
ージＤＮＡについてミニ−カルチュアーをスクリーニン
グした。クローン４．１と称する目的とする組換体ファ
ージの構造を制限酵素分析を用いて確認した。

【０１３１】次の配列： ５′−GAAGATGATCTGACCATAAGCTTTGCCTGGGCC −３′ を有する化学合成された精製された３３−マーオリゴデ
オキシリボヌクレオチドを用いて、成熟ＴＮＦ蛋白質の
第１アミノ酸（バリン）をコードするＧＴＣコドンの前
にＨｉｎｄIII 制限酵素部位及びＡＴＧ−開始コドンを
導入した。

【０１３２】１０pmole のオリゴヌクレオチドを、１０
mM ＮａＣｌ、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
９）、２０mM ＭｇＣｌ₂ 及び２０mM β−メルカプト
エタノールを含有する混合物１５μｌ中で、６７℃にて
５分間及び４２℃にて２５分間加熱することにより２．
６μｇのｓｓクローン４．１ＤＮＡとハイブリダイズせ
しめた。

【０１３３】このアニールされた混合物を氷上で冷却
し、そして次に０．５mMの各ｄＮＴＰ、１７mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．９）、１７mM ＭｇＣｌ₂ 、８３mM
ＮａＣｌ、１７mM β−メルカプトエタノール、５ユ
ニットのＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ断片を含有
する反応混合物２５μｌの初期容量に調製し、３７℃に
て１時間インキュベートした。８０℃に加熱することに
より反応を停止し、そしてこの反応混合物を用いてコン
ピテントＤＧ９８細胞を形質転換し、寒天プレート上に
プレートし、そして一夜インキュベートしてファージプ
ラークを得た。

【０１３４】変異したクローン４．１プラークを含有す
るプレート、及び変異していないクローン４．１ファー
ジプラークを含有する２枚のプレートを４℃に冷却し、
そして寒天プレート上に第１の乾燥フィルターを５分間
置き、そして第２のフィルターを２５分間置くことによ
って、各プレートからファージプラークを２枚のニトロ
セルロースに移した。

【０１３５】次に、このフィルターを、０．２Ｎ Ｎａ
ＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．２％トリトンＸ−１
００に浸漬した厚いフィルター上に５分間置き、そして
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）及び１．５Ｍ
ＮａＣｌに浸漬したフィルター上にさらに５分間置く
ことによって中和した。このフィルターを、２×ＳＳＣ
浸漬したフィルター上で同様にして洗浄し、乾燥し、そ
して真空オーブン中で８０℃にて２時間加熱した。

【０１３６】２枚のフィルターを４２℃にて４時間、フ
ィルター当り１０mlのＤＮＡハイブリダイゼーション緩
衝液〔５×ＳＳＣ、pH７．０、４×デンハート溶液（ポ
リビニルピロリドン、フィコール及びウシ血清アルブミ
ン、１×＝各０．０２％）、０．１％ＳＤＳ、５０mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH７．０、及び１００μｇ／ml
変性サケ精子ＤＮＡ〕により前ハイブリダイズせしめ
た。

【０１３７】プライマーをラベルされたＡＴＰと共にキ
ナーゼ処理することにより³²Ｐ−ラベル化プローブを調
製した。フィルターを、フィルター当り１〜５mlのＤＮ
Ａハイブリダイゼーション緩衝液中５×１０⁶cpm／mlの
³²Ｐ−ラベル化プライマーに６４℃にて８時間ハイブリ
ダイズせしめた。

【０１３８】フィルターを室温にて１０分間、０．１％
ＳＤＳ、２０mMリン酸ナトリウム（緩衝剤）及び６×Ｓ
ＳＣ中で１回；３７℃にて２０分間、緩衝剤及び２×Ｓ
ＳＣ中で１回；５０℃にて２０分間、緩衝剤及び２×Ｓ
ＳＣ中で１回；並びに最後に６０℃にて２０分間、緩衝
剤及び１×ＳＳＣ中で洗浄した。フィルターを空気乾燥
し、そして−７０℃にて４時間オートラジオグラフ処理
した。

【０１３９】変異したクローン中に新たなＨｉｎｄIII
制限部位を形成するためにオリゴヌクレオチドプライマ
ーを選択したので、このプライマーとハイブリダイズし
た多数のクローンからのＲＦ−ＤＮＡをこの制限酵素に
より消化した。新しいＨｉｎｄIII 制限部位を有する変
異したクローン４．１プラークの１つを拾い、そしてＤ
Ｇ９８の培養物中に接種し、ｓｓＤＮＡを培養上清から
調製し、そしてｄｓＲＦ−ＤＮＡを細胞ペレットから調
製した。正しい配列をジデオキシ配列決定法により確認
した。

【０１４０】正しく合成された鎖を単離し、そしてＰｓ
ｔＩ及びＨｉｎｄIII （部分的）により、又はＨｉｎｄ
III のみにより開裂せしめて発現ベクターに連結した。

【０１４１】Ｄ．４．ｂ．発現ベクターの造成 原核性発現のため、コード配列（幾らかの３′非翻訳ヌ
クレオチドと共に）をｄｓＭ１３−ＡＷ７０１から２つ
の方法で切り出した。第１の方法においては、ｄｓＭ１
３−ＡＷ７０１をＰｓｔＩで消化し、そして次にＨｉｎ
ｄIII で部分消化してＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ ＴＮＦ
コード配列を得た。（Ｍ１３−ＡＷ７０１中には幾つか
のＨｉｎｄIII 部位が存在するためＨｉｎｄIII 部分消
化が必要である。）

【０１４２】ＤＮＡ断片の部分消化は、ＤＮＡの完全消
化のために必要な制限酵素量の１／１０を用いることに
より行うことができる。混合物をその酵素について適当
な温度においてインキュベートし、そして消化混合物の
アリコートを１０分間の間隔で１時間まで取り出した。
次に、これらのアリコートをゲルに負荷し、そしてＤＮ
Ａ断片を分析した。必要とされるＤＮＡ断片の最高収量
をもたらした時点を制限酵素による調製的消化のために
使用し、そして適切な断片を電気溶出によりゲルから精
製した。

【０１４３】ＴＮＦ遺伝子の３′−非コード配列を含有
するＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥ４から、酵素Ｐ
ｓｔＩ及びＢａｍＨＩによるＤＮＡの消化の後に精製し
た。ＨｉｎｄIII ／ＰｓｔＩ断片及びＰｓｔＩ／Ｂａｍ
ＨＩ断片は一緒になってコード配列＋ＤＮＡの６００bp
３′非翻訳部分を構成する。２つの断片を次のようにし
て、ＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ消化した宿主ベクターｐ
ＴＲＰ３に連結した。

【０１４４】ｐＴＲＰ３（下記を参照のこと）はＥ．コ
リｔｒｐプロモーター及びリボゾーム結合部位を含有す
る。ｐＴＲＰ３をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化
し、そしてベクター断片をアガロースゲル上で精製し
た。次に、単離された断片を上記のＨｉｎｄIII ／Ｐｓ
ｔＩセグメント及びＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩセグメントと
共に３方連結により連結し、そしてこの混合物を用いて
Ｅ．コリＭＭ２９４をＡｍｐ^R に形質転換してｐＡＷ７
０１を得た。

【０１４５】第２の方法においては、ｄｓＭ１３−ＡＷ
７０１をＨｉｎｄIII により消化し、そして遺伝子を含
有する断片をアガロースゲル上で単離した。この単離さ
れた断片を、ＨｉｎｄIII により開裂されＢＡＰにより
処理されたｐＴＲＰ３に連結し、そしてＥ．コリＭＭ２
９４に形質転換してｐＡＷ７０２を得た。

【０１４６】Ｐ_L プロモーター及びバシルス・ポジティ
ブ・レトロレギュレトリー配列を含有するｐＦＣ５４．
ｔ（ＡＴＣＣ３９７８９）又はｐＰＬＯＰ（下記を参照
のこと）を宿主ベクターとして使用することもできる。
これらのベクターをＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより
消化し、そして制御配列を含有する大プラスミド断片を
アガロース上で精製する。上記のようにして調製したＴ
ＮＦ遺伝子のＨｉｎｄIII ／ＰｓｔＩ部分及びＰｓｔＩ
／ＢａｍＨＩ部分を、３方連結により、これらのベクタ
ーのＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩ部位に連結してそれぞ
れプラスミドｐＡＷ７１１及びｐＡＷ７１２を得る。

【０１４７】他の方法として、ｐＥ４からの精製された
ＨｉｎｄIII 断片を、ＨｉｎｄIIIで開されＢＡＰで処
理されたｐＦＣ５４．ｔ又はｐＰＬＯＰに連結してそれ
ぞれｐＡＷ７１３及びｐＡＷ７１４を得る。

【０１４８】Ｄ．４．ｃ．原核性宿主中でのＴＮＦの発
現 ｐＡＷ７０１及びｐＡＷ７０２をＥ．コリＭＭ２９４に
形質転換し、そしてｔｒｐプロモーターを抑制する条件
下で培養物を増殖せしめる。トリプトファンの涸渇によ
る誘導の後、ＴＮＦの生産が開始された。同様にして、
ｐＡＷ７１１を造成し、そしてＥ．コリＭＣ１０００−
３９５３１中に形質転換し、そして細胞を高温により誘
導した。誘導条件下で数時間培養した後、細胞を音波処
理し、Ｌ−９２９細胞毒性アッセイにより音波処理物が
ＴＮＦを含有することを確認した。結果は次の通りであ
る。

【０１４９】

【表５】 ＩＮＦ活性のユニットはＢ．５．項に定義した通りであ
る。

【０１５０】Ｄ．４．ｄ．真核性宿主中でのＴＮＦの発
現 前記Ｄ．２．ｄ項のｃＤＮＡライブラリーから単離され
たベクターｐＢ１１はＴＮＦコード配列に作用可能に連
結されたＳＶ４０プロモーターを含有する。２８個の陽
性にハイブリダイズするコロニーのすべて（特にｐＥ４
及びｐＢ１１を含む）はこの連結を含有すると予想さ
れ、そしてそれ由に適当な哺乳動物宿主中で発現するこ
とができる。

【０１５１】従って、ｐＢ１１を用いてＣＯＳ−７モン
キー腎細胞を形質転換し、そしてこの細胞をＳＶ４０プ
ロモーターの誘導を行う条件下で培養した。シグナル配
列がｐＢ１１中になお存在し、そして哺乳動物細胞系に
おいて機能するため、ＴＮＦは培地に分泌された。単層
を形成したＣＯＳ−７細胞上の上清中のＴＮＦをＬ−９
２９細胞からの³⁵Ｓの放出によりアッセイし、次の結果
を得た。

【０１５２】

【表６】

【０１５３】Ｄ．５．組換ＴＮＦの特徴付け Ｄ．５．ａ．精製 ｐＡＷ７１１により形質転換されたＥ．コリＤＧ９５
（ＭＣ１０００−５９５３１に類似するラムダ溶原株）
を３７℃にて標準的増殖培地中で約０．５のＯＤ₆₀₀ に
増殖せしめ、そして次に温度を４２℃に上昇せしめるこ
とにより誘導した。

【０１５４】２時間後、細胞を音波処理し、そしてＬ−
９２９細胞毒性アッセイ（前記）を用いて音波処理物が
ＴＮＦ活性を含有していることを確認した。次に、音波
処理物をＤＥＡＥセファロースカラム（ファルマシア）
に適用し、そして緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ、pH８．
２、１mM ＮａＣｌ）により洗浄した。１０mM Ｔｒｉ
ｓ（pH８．２）中０．０２Ｍ，０．０４Ｍ，０．１Ｍ、
及び０．８Ｍ ＮａＣｌによる段階的滴出によりＴＮＦ
活性を含有する画分を得た。

【０１５５】ＴＮＦ活性のほとんどが０．０４Ｍ Ｎａ
Ｃｌにおいて溶出した。これらの画分を限外濾過により
濃縮し、そして次にフェニルＴＳＫ−５ＰＷカラム（Ｌ
ＫＢ）を用いるＨＰＬＣによりさらに精製した。ＴＮＦ
は０．１Ｍリン酸ナトリウム（pH７．０）中１．８Ｍ硫
酸アンモニウムの存在下でカラムに結合し、そして０に
まで低下する硫酸アンモニウム濃度によりカラムを展開
した場合約０．４Ｍ塩化アンモニウムにおいて溶出し
た。ＴＮＦを含有する画分を限外濾過により濃縮し、そ
してＧＨ７５サイズ分画カラム（アミコン）に適用して
純粋なＴＮＦを得た。

【０１５６】Ｄ．５．ｂ．ＴＮＦミューテインの分離 等電点電気泳動は、前項に記載したようにして調製され
たＴＮＦが５．８〜６．５の間の異るｐＩ値の幾つかの
種から成ることを示した。すべての主要な種は予想され
た成熟ＴＮＦ（ｍＴＮＦ）であることが示されたが、汚
染ミューテイン形▽４ＴＮＦも存在した。等電点電気泳
動ゲルの結果はＴＮＦの多数の変形体が存在することを
示した。

【０１５７】調製的規模において▽４ＴＮＦからｍＴＮ
Ｆを分離するため、Ｄ．５．項に記載したＥＤＴＡセフ
ァロースカラムを高度の分画を用いて溶出し、主ｍＴＮ
Ｆピークの溶出の前に、約０．０３Ｎ ＮａＣｌにおい
て▽４ＴＮＦが富化された画分を得た。富化された▽４
ＴＮＦ画分を濃縮し、そして前記の条件のもとでＨＰＬ
ＣのためにフェニルＴＳＫ−５ＰＷカラムに適用した。

【０１５８】富化された画分のＨＰＬＣは上記のように
約０．４硫酸アンモニウムにおいてｍＴＮＦ含有ピーク
をもたらし、そして０．１Ｍホスフェート（pH７）から
脱イオン水への逆グラジエントの場合に溶出する精製さ
れた▽ＴＮＦを脱イオン水と共にカラムに適用した。▽
４ＴＮＦピーク画分を濃縮し、そして前記のようにして
ＧＨ７５上でさらに精製し、ゲル上での等電点電気泳動
において５．８のｐＩを有する均一な▽４ＴＮＦを得
た。２８０nmにおける吸収により同定される、前記のＧ
Ｈ７５精製段階から得られる▽ＴＮＦピークを含む画分
の比活性を試験した。次の結果が得られた。

【０１５９】

【表７】 純蛋白について予想されるピークにわたって一貫してい
る平均比活性は１．３×１０⁸ Ｕ／mgである。これはｍ
ＴＮＦのそれに比べて約１０倍高い。 Ｄ．５．ｃ．ｍＴＮＦ及び▽４ＴＮＦの確認 ２種類のＴＮＦのアミノ酸組成が下記の結果をもって比
較された。

【０１６０】

【表８】

【０１６１】両蛋白質は組成について比較した場合ｃＤ
ＮＡ配列から予想される組成と合理的に一致するが、し
かしながら▽４ＴＮＦは２個のセリン、１個のバリン、
及び１個のアルギニン残基を欠いているようであった。
Ｎ−末端配列からのこれらの残基の除去は自動蛋白質シ
ーケンサー上での▽４ＴＮＦの配列決定により確認さ
れ、最初の１０個のアミノ酸の配列が次のように与えら
れた。 Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala この配列と図１中の推定アミノ酸配列との比較は、この
配列が最初の４個のアミノ端残基Val-Arg-Arg-Ser を欠
くがこれに続く位置に一致するＮ−末端配列を有するこ
とを示している。

【０１６２】Ｄ．６．▽４ＴＮＦの遺伝子の調製及び
Ｅ．コリによるその発現 次の配列： ５′−CACTCGGGGTTCGAGACATAAGCTTTGCCTGGGCC −３′ を有する化学合成された精製された１５−マーオリゴデ
オキシリボヌクレオチドを用いてプールアウトし、そし
てこれによってメチオニン開始コドンから下流の４個の
Ｎ−末端アミノ酸をコードする１２ヌクレオチドを除去
した。

【０１６３】１０pmole のオリゴヌクレオチドを２．６
μｇのｓｓクローンＭ１３−ＡＷ７０１ ＤＮＡに、１
００mM ＮａＣｌ、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
９）、２０mM ＭｇＣｌ₂ 及び２０mM β−メルカプト
エタノールを含有する混合物１５μｌ中で、６７℃にて
５分間及び４２℃にて２５分間加熱することによりハイ
ブリダイズせしめた。

【０１６４】アニールされた混合物を氷上で冷却し、そ
して次に０．５mMずつのｄＮＴＰ、１７mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．９）、１７mM ＭｇＣｌ₂ 、８３mM Ｎ
ａＣｌ、１７mM β−メルカプトエタノール、及び５ユ
ニットのＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片を含
有する反応混合物の２５μｌの最終容量に調製し、３７
℃にて１時間インキュベートした。８０℃に加熱するこ
とにより反応を停止し、そして反応混合物を用いてコン
ピテントＤＧ９８細胞を形質転換し、寒天プレート上に
プレートし、そして一夜インキュベートしてファージプ
ラークを得た。

【０１６５】変異したクローンＭ１３−ＡＷ７０１プラ
ークを含有するプレート、及び非変異クローンＭ１３−
ＡＷ７０１ファージプラークを含有する２枚のプレート
を４℃に冷却し、そして第１の乾燥したフィルターを寒
天プレート上に５分間置き、そして第２のフィルターを
２５分間置くことにより各プレートからファージプラー
クを２枚のニトロセルロースフィルターに移した。

【０１６６】次に、これらのフィルターを、０．２Ｍ
ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．２％トリトンＸ
−１００中に浸漬した厚いフィルター上に置き、そして
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）及び１．５Ｍ
ＮａＣｌに浸漬したフィルター上に５分間置くことに
より中和した。フィルターを同様にして２×ＳＳＣに浸
漬したフィルター上で２回洗浄し、乾燥し、そして次に
真空オーブン中で８０℃にて２時間加熱した。

【０１６７】２枚のフィルターを４２℃にて４時間、フ
ィルター当り１０mlのＤＮＡハイブリダイゼーション緩
衝液〔５×ＳＳＣ（pH７．０）４×デンハート溶液（ポ
リビニルピロリドン、フィコール及びウシ血清アルブミ
ン、１×＝それぞれ０．０２％）、０．１％ＳＤＳ、５
０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）及び１００μ
ｇ／mlの変性サケ精子ＤＮＡ〕と前ハイブリダイズせし
めた。フィルターを、フィルター当り１〜５mlのＤＮＡ
ハイブリダイゼーション緩衝液中５×１０⁶cpm／mlの³²
Ｐ−ラベル化プライマーに６４℃にて８時間ハイブリダ
イズせしめた。

【０１６８】フィルターを、室温にて１０分間、０．１
％ＳＤＳ、２０mMリン酸ナトリウム（緩衝剤）及び６×
ＳＳＣ中で１回；３７℃にて２０分間、緩衝剤及び２×
ＳＳＣ中で１回；５０℃にて２０分間、緩衝剤及び２×
ＳＳＣ中で１回；及び最後に６０℃にて２０分間、緩衝
剤及び１×ＳＳＣ中で洗浄した。フィルターを空気乾燥
し、そして−７０℃にて４時間オートラジオグラフ処理
した。

【０１６９】陽性クローンからのＲＦ−ＤＮＡをＨｉｎ
ｄIII で処理し、そして変異したＴＮＦコード配列を含
有する断片をゲル電気泳動により単離した。回収された
配列をＨｉｎｄIII 開裂されそしてＢＡＰ処理されたｐ
ＡＷ７１１に連結してｐＡＭ７３６を得た。１２個のヌ
クレオチドの除去の存在をＨｉｎｄIII 及びＰｖｕIIに
よる制限分析により確認した。ｐＡＷ７１１により生成
される１４６bp ＨｉｎｄIII ／ＰｖｕII断片に比べて
ｐＡＷ７３６は１３４bp ＨｉｎｄIII ／ＰｖｕII断片
を含有する。ｐＡＷ７３６は１９８５年４月１０日にＡ
ＴＣＣに寄託され、そしてNo. ５３０９２の受託番号を
有する。

【０１７０】ｐＡＷ７３６で形質転換されたＥ．コリＤ
Ｇ９５を前記のようにして増殖せしめそして誘導した。
音波処理物を前記のようにして調製し、そしてアリコー
トを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。▽
４ＴＮＦを正確に前記のようにして音波処理物から精製
し、そして前に調製した▽４ＴＮＦと同一であることが
等電点電気泳動により示された。単離された▽４ＴＮＦ
をＬ−９２９細胞毒性アッセイを用いて試験し、そして
約２×１０⁸ Ｕ／mgの比活性を有することが示された。

【０１７１】Ｄ．７．ＴＮＦのその他のミューテインの
造成及び活性 Ｄ．７．ａ．造成 Ｄ．６項に前記したのと正確に同様の方法により、図１
に示される配列に比べて最初の３〜１１個のアミノ酸残
基を欠くＴＮＦ除去ミューテインを調製した。図３は得
られるベクターの名称、及び除去を生じさせるために使
用した部位特異的変異誘発において使用したオリゴマー
を示す。この図はまた、▽１５６−、▽１５０−、及び
▽１４０−ＴＮＦ、並びにdes-ser₃des-ser₄及びval₁₅s
er₁₆ミューテインのベクターの名称及びこれらの造成の
ために使用したオリゴマーを示す。

【０１７２】ｓｅｒ₆₅又はｓｅｒ₁₀₁ ミューテイン 同様にして、オリゴヌクレオチド指令変異誘発を用い
て、ＴＮＦ活性を有するがしかしｃｙｓ₆₉が他のアミノ
酸に変えられているか又は除去されており、そして／又
はｃｙｓ₁₀₁ が置き換えられているか又は除去されてい
るミューテインをコードする変異ＴＮＦ遺伝子を得る。
ｃｙｓ₆₉からｓｅｒ₆₉への例示的な転換のために好まし
いオリゴヌクレオチドプライマーは、 ５′−CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT −３′ である。

【０１７３】このオリゴヌクレオチドはＴＮＦ遺伝子の
コドン６９と対合するトリプレット中にＴ→Ａの変化を
有する。同様にして、１０１位のコドンと対合するトリ
プレットに対応する変化を含むプライマーを用いてｃｙ
ｓ₁₀₁ をｓｅｒ₁₀₁ に転換することができる。

【０１７４】Ｄ．４．ａ項に記載したようにしてｐＥ４
のＰｓｔ処理により調製されたクローン４．１を、Ｄ．
４．ａ項に記載したのと実質上同様であるがしかし次の
プライマー： ５′−CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT −３′ （これは６９位のシステインに隣接する配列に相補的で
あるがしかしＴＧＣからＡＧＣへの変化を行うコドンに
相補的なヌクレオチドを含有する）を用いる部位特定変
異誘発にかけた。変異したプラークを前記のようにして
同定しそして配列決定により確認した。

【０１７５】目的とする変異を含有する１つのプラーク
ＭＢ−ＡＷ７３１をＡｖａＩ及びＰｓｔＩで消化し、そ
してこの断片をＰｓｔＩ／ＡｖａＩで消化したｐＡＷ７
１１に連結した。連結混合物をＥ．コリＭＣ１０００・
３９５３１に形質転換してＡｍｐ^R にし、そしてプライ
マープローブを用いて形質転換体を正しい配列について
スクリーニングした。ｐＡＷ７３１と称する１つのコロ
ニーを変形された配列の発現のために用いた。ｐＡＷ７
３１は１９８５年１月２５日にＡＴＣＣに寄託され、そ
して受託番号No. ５３００７を有する。同様にして、ｓ
ｅｒ₁₀₁ ＴＮＦのための発現ベクターであるｐＡＷ７４
１を調製した。

【０１７６】システイン−６９及び／又はシステイン−
１０１が除去されたＴＮＦミューテインをコードするＤ
ＮＡ配列を用いてＮ−末端又はＣ−末端が除去されたミ
ューテインを変形して対応する“ダブル”ミューテイン
形を得る。これらのミューテインのための発現ベクター
を、これらの変形を含有するＤＮＡコード領域のスイッ
チ部分を適切な制限酵素を用いて断片化して上に調製し
たベクターに入れることにより造成する。

【０１７７】ｓｅｒ₆₉，ｓｅｒ₁₀₁ 、及びｓｅｒ₆₉ｓｅ
ｒ₁₀₁ ＴＮＦ形をそれぞれプラスミドｐＡＷ７３１，ｐ
ＡＷ７３２、又はｐＡＷ７３５から得る。特に、プラス
ミドｐＡＷ７３１は広範に前記されており、ｐＡＷ７３
２及びｐＡＷ７３５はｓｅｒ₁₀ＴＮＦ及びｓｅｒ₆₉ｓｅ
ｒ₁₀₁ ＴＮＦをコードし、そして同様にして製造され
る。こうして得られた発現ベクターをＥ．コリに形質転
換し、そして細胞を培養し、そして上記のようにして誘
導して目的の蛋白質を得る。得られるＴＮＦミューテイ
ンはｍＴＮＦに匹敵して活性である。

【０１７８】Ｄ．７．ｂ．他のミューテインの発現 ｐＡＷ７３１を担持するＥ．コリＭＣ１０００−３９５
１を増殖せしめそしてＤ．５．ａ．項に記載したように
して高温において誘導した。誘導された細胞からの音波
処理物をアッセイし、そしてｐＡＷ７１１形質転換体と
およそ同じml当りのＴＮＦ活性を有することが見出され
た。しかしながら、ＳＤＳ分析は、これらの抽出物中の
１７kb ＴＮＦ蛋白質の量は約５倍少なく、ｓｅｒ₆₉Ｔ
ＮＦの比活性は変化していない蛋白質のそれよりも高い
ことが示された。

【０１７９】後に記載する方法に従って、精製され（９
５％）た未変化の蛋白質をＤＴＴ及びヨードアセテート
で処理することにより還元しそしてアルキル化した。未
処理の蛋白質は２．６×１０⁴ Ｕ／mlの活性を有してい
たが、還元された蛋白質、又は還元されアルキル化され
た蛋白質は４．４〜４．８×１０⁴ Ｕ／mlの活性を有し
ていた。

【０１８０】

【表９】

【０１８１】ｐＡＷ７１１について前記したのと全く類
似する方法により、ＴＮＦのＮ−末端除去ミューテイン
をコードする図３に記載するプラスミドをＥ．コリに形
質転換し、そして形質転換された細胞を培養し、そして
誘導して目的蛋白質の生産を得た。ｍＴＮＦ及び▽４Ｔ
ＮＦについて前記したのと同様にして、こうして得られ
た組換蛋白質を精製しそしてアッセイした。Ｌ−９２９
細胞毒性アッセイにおいて、これらのミューテインの比
活性は▽６−８ＴＮＦを最高とするベル形曲線を示し
た。これらのミューテインの比活性はｍＴＮＦのそれよ
りも５〜１０倍高いと算定される。これらの結果を図４
に示す。

【０１８２】さらに、これらのミューテインは、組換生
産の条件下でｍＴＮＦよりも均一な形で生産されるよう
である。これは図５及び図６に例示されており、これら
はそれぞれ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及
び等電点電気泳動ゲルにかけられた場合のｍＴＮＦ及び
種々のミューテインの精製された調製物を示す。各図
は、ｐＡＷ７１１（ｍＴＮＦ）、並びにそれぞれ４，
６，７，８，９、及び１０個のＮ−末端アミノ酸を欠く
ｐＡＷ７３６，ｐＡＷ７３９，ｐＡＷ７３７，ｐＡＷ７
４０，ｐＡＷ７４１及びｐＡＷ７４２の発現生成物につ
いての結果を示す。

【０１８３】図５において、すべての蛋白質は均一のよ
うであり、調製物が単離された蛋白質のサイズに関して
純粋であることを示している。しかしながら、図６の結
果は、ｐＡＷ７１１（ｍＴＮＦ）発現の生成物がｐＩ値
を異にする蛋白質の混合物であること示し、従って一次
配列の側鎖の変形を示している。ｐＡＷ７３６の生成物
は変形した側鎖を有する少量の蛋白質を含有するようで
あるが、その他のプラスミドの発現生成物はきれいなよ
うである。

【０１８４】Ｄ．８．インビボアッセイの結果 組換生産されたｍＴＮＦ（ｒＴＮＦ）はＢ．５．ｂ．項
に前記したインビボアッセイにおいて活性であった。図
７及び図８は、ネズミの線維肉腫及びの増殖及び宿主の
生存に対するｒＴＮＦの０．５，１．０及び２．０μｇ
の注射の効果を示す。これらのアッセイにおいて、ＴＮ
Ｆの各示された投与レベルは個々の注射当たりの量を示
す。注射は腫瘍を移植した後９日に開始し、そして１日
おきに合計６回の注射の間継続した。

【０１８５】図７は、ＴＮＦ注射の開始を示す０時点か
ら始まる腫瘍の増殖に対するＴＮＦの効果を示す。底線
にそう矢印は投与時を示す。これらの結果は、静脈内投
与された６×０．５μｇのｒＴＮＦさえ、対照と比較し
て腫瘍体積の有意な増加を防止することを示している。
図８は、ＴＮＦ注射の最終日としての０時点（すなわち
図７の１０日目）から始まる生存率を示す。この結果は
生存率（％）が３投与レベルのすべてにおいて劇的に改
良されることを示している。

【０１８６】ＭＣＦ−７腫瘍を移植されたマウスにおい
て、腫瘍移植後７日に静脈内ＴＮＦ注射を始めた。第１
の注射（２μｇ）は毒性であり（１０マウス中５マウス
が死亡）、そして合計５回の追加の間１日おきに行われ
たその後の注射は、１μｇ／マウスで行った。マウスに
はさらに、１μｇのエストラジオールを筋肉内に０日、
２日、４日、７日、９日及び１１日目に注射した。１４
日間にわたり、ＴＮＦを注射されたマウスの腫瘍体積は
３０mm³ から５０mm³ にわずかに増加したが、対照のそ
れは３０mm³ から１３０mm³ に増加した。

【０１８７】Ｄ．９．ｐＰＬＯＰの造成 ｐＰＬＯＰは１９８４年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託
され、そして受託番号No. ３９９４７を有する。その造
成を下に記載する。 Ｄ．９．ａ．複製開始点 ｐＣＳ３は高温においてｐＰＬＯＰ宿主ベクターの高コ
ピー数をもたらす複製開始点を提供する。その造成は１
９８３年１０月１４日に出願された米国特許出願No. ５
４１，９４８に広範に記載されている（これを引用によ
りこの明細書に組み入れる）。ｐＣＳ３は１９８２年６
月３日に寄託されており、そして受託番号ＡＴＣＣ N
o. ３９１４２を有する。

【０１８８】ｐＣＳ３はｐＥＷ２７及びｐＯＰ９に由来
する。ｐＥＷ２７はE.M.Wong, Proc.Natl.Sci. (USA)
(1982) 79：3570に記載されている。このものはその複
製開始点の近傍にコピー数の温度制御をもたらす変異を
含有する。これらの変異の結果として、高温において高
コピー数の複製が生ずるが、しかし低温においては低コ
ピー数の複製が生ずる。

【０１８９】ｐＯＰ９は全温度において高コピー数のプ
ラスミドであり、このものはＣｏｌＥ１タイプのプラス
ミドｐＯＰ６〔Gelfand, D. 等、Proc.Natl.Acad.Sci.
(USA) (1978) 75 ：5869〕からのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕII
開始点含有断片をｐＢＲ３２２に挿入することにより造
成された。挿入前に、この断片は次のようにして変形さ
れた。５０μｇのｐＯＰ６を２０ユニットずつのＢａｍ
ＨＩ及びＳｓｔＩにより完全消化した。

【０１９０】ＳｓｔＩ ３′突出末端を除去しそしてＢ
ａｍ５′末端をフィルインするため、消化されたｐＯＰ
６ ＤＮＡをＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）により、まず３′ＳｓｔＩ突出末端を除去するた
めに２０℃における、及び次に５′末端を修復するため
に９℃における２段階反応において処理した。

【０１９１】平滑末端断片を消化しそして０．０２pmol
e を使用してコンピテントＤＧ７５〔O'Farrell, P. 等
J.Bacteriology (1978) 134 ：645-654 〕を形質転換し
た。形質転換体を５０μｇ／mlアンピシリンを含有する
Ｌプレート上で選択し、そして３．３kbの除去、Ｓｓｔ
Ｉ部位の喪失、及び新たに形成されたＢａｍＨＩ部位の
存在についてスクリーニングした。

【０１９２】ｐＯＰ７と称する１つの候補を選択し、そ
して２５μｇのｐＯＰ７を２０ユニットのＢａｍＨＩで
消化し、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ断片（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）で修復し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼにより再連
結することによりＢａｍＨＩ部位を除去した。コンピテ
ントＤＧ７５を０．１μｇのＤＮＡで処理し、そして形
質転換体を５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬプ
レート上で選択した。候補をＢａｍＨＩ制限部位の喪失
についてスクリーニングした。ｐＯＰ８を選択した。ｐ
ＯＰ９を得るため、ｐＢＲ３２２からのＡｖａＩ（修
復）／ＥｃｏＲＩＴｅｔ^R 断片を調製し、そして単離
し、そしてｐＯＰ８からの単離されたＰｖｕII（修復）
／ＥｃｏＲＩ ３５６０bp断片に連結した。

【０１９３】１．４２kb ＥｃｏＲＩ／ＡｖａＩ（修
復）Ｔｅｒ^R （断片Ａ）と３．５６kbＥｃｏＲＩ／Ｐｖ
ｏII Ａｍｐ^R （断片Ｂ）の連結はＥｃｏＲＩ末端の分
子間連結を促進するため２段階反応において０．５μｇ
の断片Ｂ及び４．５μｇの断片Ａを用いた。

【０１９４】コンピテントＤＧ７５を５μｌの連結混合
物で形質転換し、そして形質転換体をアンピシリン（５
０μｇ／ml）含有プレート上で選択した。Ａｍｐ^R Ｔ
ｅｔ^R 形質転換体から単離されたｐＯＰ９は、高コピー
数、コリシン耐性、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＰｖｏII
及びＨｉｎｄIII のための１個の制限部位、ＨｉｎｃII
のための２個の制限部位、並びに適切なサイズ及びＨａ
ｅIII 消化パターンを示した。

【０１９５】ｐＣＳ３を得るため、５０μｇのｐＥＷ２
７ ＤＮＡをＰｖｕII及びＥｃｏＲＩにより完全消化し
た。同様に、５０μｇのｐＯＰ９をＰｖｕII及びＥｃｏ
ＲＩにより完全消化し、そして３．３kb断片を単離し
た。０．３６μｇ（０．３２７pmole ）のｐＥＷ２７断
片及び０．３５μｇ（０．１６pmole ）のｐＯＰ９断片
を連結し、そしてＥ．コリＭＭ２９４を形質転換するの
に用いた。Ａｍｐ^R Ｔｅｔ^R 形質転換体を選択した。
好結果のコロニーをまず３０℃及び４１℃においてβ−
ラクタマーゼアッセイプレート上でスクリーニングし、
そして次に３０℃及び４１℃における増殖の後にプラス
ミドＤＮＡレベルについてスクリーニングした。ｐＣＳ
３と称する好結果の候補を配列決定により確認した。

【０１９６】Ｄ．９．ｂ．Ｐ_L Ｎ_RBS 挿入部の調製 Ｐ_L ファージプロモーター及びＮ−遺伝子（Ｎ_RBS ）の
ためのリボゾーム結合部位を含有するＤＮＡ配列をｐＦ
Ｃ５から、そして最終的にShimatake 及び Rosenberg,
Nature (1981) 292 ：128 により掲載されたｐＫＣ３０
の誘導体から得た。ｐＫＣ３０はｐＢＲ３２２からのＨ
ｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩベクター断片中にクローン化さ
れたラムダファージからの２．３４kb断片を含有する。
Ｐ_L プロモーター及びＮ_RBS はｐＫＣ３０中ＢｇｌII及
びＨｐａＩ部位間を占める。ｐＫＣ３０はＥｃｏＲＩ部
位に転換されたＢｇｌII部位を有する。

【０１９７】Ｐ_L プロモーターにすぐ先行するＢｇｌII
を次のようにしてＥｃｏＲＩ部位に転換した。ｐＫＣ３
０をＢｇｌIIにより消化し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰ
で修復し、そしてＴ４リガーゼによりＥｃｏＲＩリンカ
ー（ニューイングランド ビオラブスから入手）に連結
し、そしてＥ．コリＫ１２株ＭＭ２９４ラムダ⁺ に転換
した。プラスミドをＡｍｐ^R Ｔｅｔ^R 形質転換体から
単離し、そして所望の配列を制限分析及び配列決定によ
り確認した。

【０１９８】生じたプラスミドｐＦＣ３をＰｖｕＩ及び
ＨｐａＩにより２重消化して約５４０bpの単離された断
片を得、そしてＫｌｅｎｏｗ及びｄＡＴＰで処理し、次
にＳ１ヌクレアーゼで処理して３′末端配列−AGGAGAA
（−AGGAGA部分はＮ_RBS である）を有する平滑末端断片
を生成せしめた。この断片をＥｃｏＲＩで制限処理して
５′−ＥｃｏＲＩ（接着末端）及びＨｉｎｆＩ（部分修
復、Ｓ１平滑）−３′末端を有する３４７塩基対ＤＮＡ
断片を得る。

【０１９９】ｐＦＣ５を完成するため、ｐβＩ−Ｚ１５
を用いてＮ_RBS の３′にＨｉｎｄIII 部位を形成した。
ｐβＩ−Ｚ１５は１９８４年１月１３日にＡＴＣＣ N
o. ３９５７８として寄託された。これは、ＡＴＧ＋ｌ
ａｃＺに融合したβ−ＩＦＮの１４０bpを含有する配列
をｐＢＲ３２２に融合せしめることによって調製され
た。ｐβＩ−Ｚ１５においては、ｐＢＲ３２２のＥｃｏ
ＲＩ部位が維持されており、そして挿入部はβ−ＩＦＮ
のＡＴＧ開始コドンにすぐ先行するＨｉｎｄIII 部位に
含有する。ｐβＩ−Ｚ１５をＨｉｎｄIII で制限処理
し、Ｋｌｅｎｏｗ及びｄＮＴＰで修復し、そして次にＥ
ｃｏＲＩにより消化した。

【０２００】生じたＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII （修復）
ベクター断片を上記のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ（修復）
断片に連結し、そして連結混合物を用いてＭＣ１０００
−３９５３１を形質転換した。好結果の造成物を含有す
る形質転換体を、ラクトース最少培地上で３４℃にて増
殖するが３０℃にて増殖しない能力により同定した。

【０２０１】（形質転換体を３０℃及び３４℃において
Ｘ−ｇａｌ−Ａｍｐプレート上に、並びに３０℃及び３
４℃において最少ラクトースプレート上にプレートし
た。適切な造成物を有する形質転換体は両温度において
Ｘ−ｇａｌ−Ａｍｐプレート上で青色であるが、最少ラ
クトース培地上では３４℃においてのみ増殖する。）良
結果の造成物をｐＦＣ５と称した。

【０２０２】Ｄ．９．ｃ．ｐＰＬＯＰの完成 次に、Ｐ_L 及びＮ_RBS 制限配列を設けるためにｐＣＳ３
を変形した。ｐＣＳ３をＨｉｎｄIII で消化し、そして
次にＥｃｏＲＩで消化した。ベクター断片をＰ _L Ｎ_RBS
を含有するｐＦＣ５からの単離されたＥｃｏＲＩ／Ｈｉ
ｎｄIII と連結し、そしてＥ．コリＭＭ２９４に形質転
換した。単離されたプラスミドＤＮＡの正しい構成を制
限分析及び配列決定により確認し、そしてプラスミドを
ｐＰＬＯＰと命名した。

【０２０３】Ｄ．１０．ｐＴＲＰ３の造成 ｐＴＲＰ３は１９８４年１２月１８日にＡＴＣＣに寄託
され、そして受託番号No. ３９９４６を有する。この造
成は次の通りである。ＨｉｎｄIII 部位の後にｔｒｐ制
御配列を含有する宿主ベクターを造成するため、アテヌ
エーター領域を欠くｔｒｐプロモーター／オペレーター
／リボゾーム結合部位配列を、スタンホード大学C.Yano
fskyから入手したｐＶＨ１５３から得た。ｔｒｐ配列は
当業界においてよく知られた種々のプラスミドから得ら
れる。

【０２０４】ｐＶＨ１５３をＨｈａＩ（これは、露出さ
れた３′接着末端を残してｔｒｐプロモーターのちょう
ど５′を切断する）により処理し、Ｋｌｅｎｏｗにより
平滑末端化し、そしてＴａｇＩにより部分分解した。ｔ
ｒｐリーダーのＡＴＧ開始コドンに先行する６ヌクレオ
チドであるＴａｇＩ部位における制限に対応する９９bp
断片を単離し、そして次にＥｃｏＲＩ（修復）／Ｃｌａ
Ｉ消化されたｐＢＲ３２２に連結してｐＴＲＰ３を得
た。

【０２０５】下記のプラスミドがアメリカン・タイプ・
カルチュア・コレクション，ロックビル，ＭＤ，米国
（ＡＴＣＣに寄託された。これらの寄託は特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約及び
その規則（ブタペスト条約）の規定のもとになされた。
これは、寄託の日から３０年間にわたる生存培養物の維
持を保証する。

【０２０６】これらの生物は、ブタペスト条約に基き、
そして該当する米国特許が発効した後に無制限の入手可
能性を保証する出願人とＡＴＣＣとの合意に従って、Ａ
ＴＣＣから入手可能にされるであろう。寄託された菌株
の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとにその特
許法に従って与えられた権利を侵害して発明を実施する
許諾であると解釈してはならない。

【０２０７】

【表１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はｐＥ４の完全ヌクレオチド配列及びヒト
ＴＮＦの推定されるアミノ酸配列を示す。

【図２】図２はｐＥ４中の挿入部の制限地図を示す。

【図３】図３は発現用プラスミド及び種々のＴＮＦミュ
ーテインのためのそれらを造成するために使用されたオ
リゴマーを示す図である。

【図４】図４は幾つかのＴＮＦミューテインの比活性の
比較を示すグラフである。

【図５】図５は精製された組換ＴＮＦ（ｒＴＮＦ）ミュ
ーテインに対して行われたＳＤＳゲルを示す電気泳動図
である。

【図６】図６は精製されたｒＴＮＦミューテインに対し
て行われた等電点電気泳動ゲルの結果を示す図である。

【図７】図７は腫瘍担持マウスにおけるＴＮＦ活性のイ
ンビボ試験の結果を示すグラフである。

【図８】図８は腫瘍担持マウスにおけるＴＮＦ活性のイ
ンビボ試験の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (31)優先権主張番号 ７６０６６１ (32)優先日 1985年７月30日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ワング，アリス エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596, ウォールナット クリーク，プロビデンス コート 2423 (72)発明者 ラドナー，マーサ ビー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94804, リッチモンド，バレット アベニュ 2800 (72)発明者 クリーセイ，アブラ エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, ピードモント，ランドン コート ８ (72)発明者 リン，レオ エス. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94539, フリーモント，ロス ピノス ストリート 40880 (72)発明者 バン アレスデル，ジャネル エヌ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94804, リッチモンド，サーティファースト スト リート 519

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列： Ｘ−Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly X₀₁ Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro X₀₂ Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu （上記アミノ酸配列において： （１）Ｘはアミノ酸配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg T
   hr Proを表わし、Ｘ₀₁はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わ
   し、そしてＸ₀₂はＣｙｓを表わすか；あるいは（２）Ｘ
   はアミノ酸配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Proを
   表わし、Ｘ₀₁はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わし、そして
   Ｘ₀₂はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わし；あるいは（３）
   Ｘはアミノ酸配列： Ser Arg Thr Proを表わし、Ｘ₀₁は
   Ｃｙｓを表わし、そしてＸ₀₂はＣｙｓを表わし；あるい
   は（４）Ｘは存在せず、Ｘ₀₁はＣｙｓを表わし、そして
   Ｘ₀₂はＣｙｓを表わす）により表わされる腫瘍壊死因子
   ミューテインをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 次のアミノ酸配列： Ｘ−Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly X₀₁ Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro X₀₂ Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu （上記アミノ酸配列において： （１）Ｘはアミノ酸配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg T
   hr Proを表わし、Ｘ₀₁はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わ
   し、そしてＸ₀₂はＣｙｓを表わすか；あるいは（２）Ｘ
   はアミノ酸配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Proを
   表わし、Ｘ₀₁はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わし、そして
   Ｘ₀₂はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わし；あるいは（３）
   Ｘはアミノ酸配列： Ser Arg Thr Proを表わし、Ｘ₀₁は
   Ｃｙｓを表わし、そしてＸ₀₂はＣｙｓを表わし；あるい
   は（４）Ｘは存在せず、Ｘ₀₁はＣｙｓを表わし、そして
   Ｘ₀₂はＣｙｓを表わす）により表わされる腫瘍壊死因子
   ミューテインをコードするＤＮＡを含んで成るベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 次のアミノ酸配列： Ｘ−Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly X₀₁ Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro X₀₂ Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu （上記アミノ酸配列において： （１）Ｘはアミノ酸配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg T
   hr Proを表わし、Ｘ₀₁はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わ
   し、そしてＸ₀₂はＣｙｓを表わすか；あるいは（２）Ｘ
   はアミノ酸配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Proを
   表わし、Ｘ₀₁はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わし、そして
   Ｘ₀₂はＣｙｓ以外のアミノ酸を表わし；あるいは（３）
   Ｘはアミノ酸配列： Ser Arg Thr Proを表わし、Ｘ₀₁は
   Ｃｙｓを表わし、そしてＸ₀₂はＣｙｓを表わし；あるい
   は（４）Ｘは存在せず、Ｘ₀₁はＣｙｓを表わし、そして
   Ｘ₀₂はＣｙｓを表わす）により表わされる腫瘍壊死因子
   ミューテインをコードするＤＮＡを含んで成るベクター
   により形質転換された宿主。