JPS63301788A - α−１，３−グルカナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、う蝕原性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓｍｕｔａｎｓ）が産生ずる歯垢などに含まれる１、
３−１゜６−α−Ｄ−グルカンのα−１，３−グルコシ
ド結合を特異的に切断分解する酵素であるα−１，３−
グルカナーゼを製造する方法に関する。

とりわけ、バチルス属の細菌或いはその突然変異株、特
にバチルス　サーキユランス　ＢＣ−８菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　ＢＣ−８）或いはその突
然変異株を培養し、該培養物よりα−１，３−グルカナ
ーゼを製造する方法に関する。

（従来の技術） 虫歯の原因となろう蝕原性連鎖球菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ｕｔａｎｓ）は、該
菌が産生ずる不溶性グルカン（ムタンとも言う）によっ
て、該菌と不溶性グルカンの複合体であるデンタルプラ
ーク（ｄｅｎｔａｌ　ｐｌａｑｕｅ　）即ち歯垢を形成
して、歯の表面に付着し、該菌が口腔内に存在する蔗糖
を分解して生じる有機酸の作用により、歯牙エナメル質
を溶解することによって虫歯が起こることが判明してい
る。

従って、虫歯を予防するためには、歯垢の主成分である
前記不溶性グルカンを分解して、前記苗の歯への付着を
阻止すればよいことが提案されている。

さらに、この不溶性グルカンは、１．３−１．６−α−
Ｄ−グルカン及び１，６−α−Ｄ−グルカンよりなって
おり、これらを分解するにはそれぞれ、α−１，３−グ
ルコシド結合を特異的に切断分解する酵素であるα−１
，３−グルカナーゼ〔正式名は１，３−（１，３：　１
，４　）−α−Ｄ−グルカン３−グルカノハイドロラー
ゼ（ＥＣ３，２，１，５９）　、単にグルカナーゼ或い
はムタナーゼともいう）と、α−１，６−グルコシド結
合を特異的に切断分解する酵素であるα−１，６−グル
カナーゼ（単にデキストラナーゼともいう）の単独或い
は両酵素の共同作用が有効であることが判明している。

（発明が解決しようとする問題点） 従来よりα−１，３−グルカナーゼの産生菌株の報告は
いくつかなされている。例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒ翔ａ）属〔例えばトリコデルマ　ハリジア
ヌムＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ　　
ＣＢ−５２４３，７１（ＦＥＲＭ−Ｐ−１１６１＞　）
に属する糸状菌、ストレプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔ
ｏｔｒｒｙｃｅｓ　）属に属する放線菌、フラボバクテ
リウム属 （Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ）　　（例えばフラボ
バクテリウムＩＩ！に−０１（微工研菌寄第２５０６号
）〕、シュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属（
例えば１シュドモナス５Ｋ−０１（漱工研菌寄第４２７
３号）〕に属する細菌などがそれである。

尚、バチルス属に属する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓＦＥＲＭ−Ｐ−４７６５）がα
−１，６−及びα−１，３−グルコシド結合を分解する
新規酵素を産生ずることについても報告されている（特
開昭５５−８８６９３号参照）が、その新規酵素が報告
通りであれば、本発明のα−１，３−グルカナーゼとは
基質特異性の点で相違しており別個の酵素であると考え
られる。

バチルス属の細菌は従来より食品の加工等に広く利用さ
れており、人体への病原性や毒素産生性がないこと、さ
らに有用酵素の生産などで工業的にもよく利用されてお
り、その大量培養法に関する知見は広（集積されている
。一方バチルス属の細菌は形質転換が容易なことから遺
伝学的、生化学的知見も大腸菌についで集積されている
。

従って、バチルス属の細菌を用いて、口腔内の歯垢を分
解するα−１，３−グルカナーゼを産生させることがで
きれば好都合である。従来バチルス属の細菌を用いてα
−１，３−グルカナーゼを工業的生産に供し得る製造方
法を開′示しているものはなかったわけで、本発明の解
決しようとする問題点はここにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明のα−１，３−グルカナーゼの製造方法の要旨と
するところは、不溶性グルカンなどに含まれるα−１，
３−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵素である
α−１，３−グルカナーゼを産生ずるバチルス属に属す
る細菌或いはその突然変異株を、培養培地に接種して所
定の培養条件下で培養した後、該培養物を遠心分離して
、菌体を分離除去し、α−１，３−グルカナーゼを採取
するようにしたことである。

まず、本発明者は、不溶性グルカンを炭素源として分解
利用する微生物を検索した結果、バチルス（Ｂａｃｔｌ
ｌｕｓ）属に属する細菌の中で、とりわけバチルス　サ
ーキュランスＢＣ−８菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃ
ｕｌａｎｓ　ＢＣ−８（微工研条寄第７３３号）（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−７３３）（以下ＢＣ−８菌と言う）が、強
力にα−１，３−グルカナーゼを産生ずることを見出し
た。このＢＣ−８菌を用いた本発明のα−１，３−グル
カナーゼを製造する方法について、以下により詳細に説
明する。

まず、本発明の方法に利用する前記ＢＣ−８菌は下記の
通りの菌学的性状を有するものであることが判明してい
る。

（ＢＣ−８の　・ ＋１）　　細胞 グラム陽性桿菌、大きさ０．５　Ｘｌ、３〜２．６μｍ
、運動性なし、胞子（ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ）を形成。

胞子は長楕円形で、端に片寄って存在、好気的に増殖。

（２）コロニーの性状 ペプトン・イーストエキス寒天上で、円形で平滑な淡黄
白色集落を形成する。

（３）化学的性質 ・カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）　　：　　（＋　）
・オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ）　　：弱（＋）・ホ
ーケス−ブロスカラエル （Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｌ）試験：（−）・イ
ンドール（Ｉｎｄｏｌｅ）産生：（−）・グリセリンか
らジヒドロキシアセトン（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔ
ｏｎｅ）産生：（−）・硝酸還元：（−） ・カゼイン加水分解＝（−） ・澱粉加水分解＝（＋） ・チロシン（７ｙｒｏｓｉｎｅ）加水分解：（−）・ゼ
ラチン加水分解：（−） ・０．００１％リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙ＋ｗｅ）を含
む液体培地での増殖：（−） ・ＮａＣ１を含む培地での増殖：　５％ＮａＣ１で（＋
）７％ＮａＣ１で（−） ・ブドウ糖、乳糖、マンニット（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）ト
レハローズ（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　）から酸を産生ずる
が、ガスは発生しない。

・アラビノーズ（Ａｒａｂｉｎｏｓｅ　）　、果糖、マ
ンノーズ（Ｍａｎｎｏｓｅ　）　、キジローズ（Ｘｙ　
１ｏｓｅ）からは酸もガスも発生しない。

・増殖温度：１７℃〜３７℃で増殖するが、１０℃及び
４５℃では増殖は認められな い。

・ビタミン：ビオチン要求性あり。

・ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量：　４９．５　ｍｏ１％上記し
た諸性質によって、ＢＣ−８菌は好気性有芽胞桿菌バチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、分類上バチルス　
サーキュランス　ジヨルダン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓ　Ｊｏｒｄａｎ　）と分類されると判明
した。

１、観」回■豊墨 （ａ）　　ＢＣ−８菌培養のための培地α−１，３−グ
ルカナーゼを製造するためには、まず上記ＢＣ−８菌を
天然、または人工培地に接種して培養するが、工業的生
産には液体培地で通気攪拌培養法によって実施するのが
、コスト、収率の上からも有利である。

培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものが
使用される０例えば、炭素源として、う蝕原性連鎖球菌
が産生ずる不溶性グルカンが最も有効で、窒素源として
は、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプトン
、酵母エキス等が用いられる。無機塩としては、リン酸
、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等
の塩類が用いられる。

特に、不溶性グルカン（後記不溶性グルカンの調製例を
参照）を培地中に、培養基質及び酵素産生誘導物質とし
て０．１％（Ｗ／Ｖ）以上、粉砕、懸濁状態で添加する
ことによって、α−１，３−グルカナーゼを高収率で得
ることができる。

（ｂ）　　ＢＣ−８菌の培養 上記（ａ）項にて調製した培地に、ＢＣ−８菌を接種し
、所定の培養温度、好ましくは３０℃〜３７℃で、培養
基のｐｎを６〜７で、α−１，３−グルカナーゼが培養
液中で最も高い活性を示すまで、所定の培養時間（培養
条件によって異なるが、通常通気攪拌培養では、１〜３
日）培養する。

２、戸　　からα−１，３−グルカナーゼのこのように
して、充分にα−１，３−グルカナーゼが産生された培
養物から、遠心分離によって菌体を取り除けば、粗酵素
液が得られる。

また、前記培地中に予め不溶性グルカンを培養基質とし
て添加した場合には、培養終了時に若干の不溶物が残存
し、これにα−１，３−グルカナーゼが吸着されてしま
うため、予め培養前に、無菌濾過した適当量のデキスト
ラナーゼを加えるか、或いは培養後に、培養液にデキス
トラナーゼを加えて、不溶物を分解した後、遠心分離に
かけて粗酵素液を調製する。

さらに、水可溶性低分子グルカン溶液（後記水可溶性低
分子グルカン溶液の調製例を参照）で、培養液中に沈殿
した前記不溶物（沈殿）を洗い、吸着したα−１，３−
グルカナーゼを溶出させて、その後遠心分離にかけて粗
酵素液を調製する方法も有効である。

このように、デキストラナーゼ処理、水可溶性低分子グ
ルカン処理の両者を適宜組み合わせて、調製することに
よって、α−１，３−グルカナーゼの採取の収率を上げ
ることが可能である。

前述のようにして得られた粗酵素液は、そのままでも製
品として充分に使用可能であるが、さらに該酵素液を公
知の分離精製方法、例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧ｔ
ＨＷ法、硫安等による塩析法、エタノール等による溶媒
分画法、等電点沈殿法、カラムクロマト分画性などを、
単独或いは適宜組み合わせることによって精製酵素液を
採取することが可能である。

゛　グルカンの８１ トフドヘビットブロス（Ｔｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔ　Ｂｒ
ｏｔｈ）〔ディフコ（Ｄｉｆｃｏ　）社製〕３％を含む
液体培地に、う蝕原性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓａｅｕｔａｎｓ）　ＯＭＺ−１７６株を接種し、
３７℃にて２４時間静置培養する。得られた培養液から
、遠心分離によって、菌体を除去した後、５０％飽和の
硫安塩析を実施し、生じた不溶物を遠心分離にかけて沈
殿物として集める。これを５０−一クエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）に溶解し、同緩衝液にて透析して、これを不
溶性グルカン合成酵素液とした。

透析終了後、この酵素液に基質として、１０％の蔗糖を
含有する５０　ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を加
えて、３７℃で２４〜４８時間反応させて、不溶性グル
カンを合成した。遠心分離によって不溶性グルカンを集
め、蒸留水にて洗浄し、次いでエタノール、アセトンで
洗浄した後、１００℃以下で加熱通風乾燥して不溶性グ
ルカンを調製した。

口″　　　　　グルカンのζ１ 前述の不溶性グルカンの調製例と同様にして調製したう
蝕原性連鎖球菌の不溶性グルカン合成酵素液を、透析チ
ューブにいれ、透析外液に１０％の蔗糖を含む５０　ｍ
Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）を用いて、３７℃で
２４〜４８時間、攪拌しながら低分子グルカンの合成と
透析とを同時に行った。

この透析終了後の透析外液には、水可溶性低分子グルカ
ンが含まれているので、そのままでも前述のα−１，３
−グルカナーゼの採取に用いることが可能であるが、必
要な場合には、透析外液に６６％（Ｖ／Ｖ）となるよう
にエタノールを加え、遠心分離によって沈殿物を集めて
、エタノール、アセトンで洗浄した後、１００℃以下で
加熱通風乾燥すれば、より良質の水可溶性低分子グルカ
ンを分取することができる。

Ｂ、ＢＣ−８いて′　゛れたα−１３−グルカーゼの 本発明の製造方法によって得られるＢＣ−８菌のα−１
，３−グルカナーゼは、下記の通りの理化学的性質を有
する。

（１）　　作用及び基質特異性 α−１，３−グルコシド結合を有する多糖基質を、エン
ドタイプに加水分解する性質を有し、特にう蝕原性連鎖
球菌の産生ずる不溶性グルカンをよく分解する。

（ａ）　　高分子基質に対する作用 表Ｉに示した各種基質０．５　ｍｇ、０．２ＭＭＢ５緩
衝液（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォネート
、ｐＨ６，５）或いは５０　ｍＭリン酸ナナトリウム緩
衝液ｐＨ７，０）　、ＢＣ−８菌のα−１，３−グルカ
ナーゼ溶液１０μｌを含む反応液１００μｌを３７℃、
１時間インキエベートし、生成した還元糖をソモギーネ
ルソン（Ｓｏｓｏｇｙｉ　Ｎｅ１ｓｏｎ）法で比色定置
した。

その結果、表■に示したように、α−１，３−グルコシ
ド結合を有する１、３−α−Ｄ−グルカン、１．３−１
．６−α−Ｄ−グルカンには非常によく作用する。しか
しながら、他のα−１，６−グルコシド結合を含む基質
にはほとんど作用せず、またニゲラン〔ニゲロース（Ｎ
ｉｇｅｒｏｓｅ）単位でα−１，３−グルコシド結合が
含まれている〕にもほとんど作用しなかった。

これは、α−１，３−グルコシド結合部分しかも連続的
にα−１，３−グルコシド結合が並んだようなグルカン
のα−１，３−グルコシド結合部分に対して特異的に作
用することを示している。

（ｂｌ　　低分子基質に対する作用 表■に示した各種基質０．２　ｔａｇ、５０　ｍＭＭＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ６，５）　、ＢＣ−８菌のα−１，３−
グルカナーゼ溶液１０μＥを含む反応液５０μｌを３７
℃、１５時間インキエベートし、その後５分間無溝して
酵素反応を停止し、遠心分離にかけ、遠心上清を、シリ
カゲル（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ　７０　ＦＭプレート、和
光純薬社製）又はセルロース（）ＩＰＴＬＣ−ｃｅｌｌ
ｕｌｏｓｅプレート、Ｍｅｒｃｋ社製）の薄層にスポッ
トした。シリカゲル薄層の場合は、ｎ−プロパツール（
ｎ−ｐｒｏｐａｎｏｌ）　ｓエチルアセテート（ｅｔｈ
ｙｌａｃｅｔａｔｅ）　、水（６：１：３）で、セルロ
ース薄層の場合には、エチルアセテ−、ト、酢酸、水（
３：２：２）で展開し、ジフェニルアミン−アニリン（
ｄｉｐｈｅｎｙｌａｗ＋１ｎｅ−ａｎｉｌｉｎｅ）試薬
を用いて分離された糖を検出した。

その結果、表■に示したように、ニゲ ロース、イソマルトース、イソマルトヘプタオースを全
く分解しない、これは、デキストラナーゼ活性を全く有
しないことを示している。

（２）　　至適ｐＨ及び安定ｐＨ 第１図は、ＢＣ−８菌のα−１，３−グルカナーゼの各
ｐＨにおける活性を示すグラフで、ｐＨ７，０の燐酸緩
衝液を用いた時のグルカナーゼ活性を１００％として、
各ｐＨでの相対的活性値を比較したものである０作用ｐ
Ｈは、第１図のような曲線として得られ、ｐ）１４．０
〜９．０の広範囲にわたってその活性が認められる。特
に、ｐＨ５，０付近において最大の活性を示す。

第２図は、ＢＣ−８菌のα−１，３−グルカナーゼの各
ｐＨにおける安定性を示すグラフで、α−１，３−グル
カナーゼを各ｐＨにおいて、４０℃で５時間放置した後
、残存活性を測定（ｐｉｔ　７．０の燐酸緩衝液を用い
て時間を置かなかったものを１００％とした）したもの
である、ｐＨ安定性は、第２図に示したように、ｐＨ６
，０〜１０．０にわたる広範囲において安定であり、特
にＰ１１７．０〜９．０において非常に安定である。

（３）　　至適温度及び安定温度 作用至適温度は、第３図に示したように、４５℃〜５０
℃である。

第４図は、各温度におけるＢＣ−８菌のα−１，３−グ
ルカナーゼの安定性を示すグラフで、α−１，３−グル
カナーゼを各温度に５時間保った後、残存活性を測定（
ｐＨ７，０の燐酸緩衝液にて時間を置かなかったものの
活性を１００％とした）したものである、第４図に示し
たように４０℃以下の温度において安定である。

（４）金属塩、酵素阻害剤の影響 Ｆｅ　”、ｐｂ”、Ｈｇ　ｇ　＊、Ａｇｔ＊によって阻
害を受け、特にＨｇ　ｚ　＋、Ａｇ　ｚ　＊は著しい阻
害を示す。またｐＣＭＢ　（ｐ−クロロ安息香酸第二水
銀）も著しい阻害を示す。

（５）　　フェノール硫酸法を用いるα−１，３−グル
カナーゼの活性測定法 通常、６　ｍｇ／＋ｗｌの１．３−α−Ｄ−グルカン（
表■脚注参照）（５０ｍＭ燐酸緩衝液。

ｐＨ７，０）懸濁液０．２＋１１に、０．１　ｍｌのα
−１，３−グルカナーゼ溶液を加えて、４０℃で１６時
間反応を行い、エタノール（最終濃度６０％）で反応を
停止した後、可溶性となった糖をフェノール硫酸法で定
量した。

上記反応条件において、１００　ｎｍｏ＋のブドウ糖に
相当する６０％エタノール可溶性の糖を生成する酵素量
を１単位とした。実際的には、各種濃度のα−１，３−
グルカナーゼを用いて、標準曲線を作成して、それによ
って酵素活性値を読み取った。

（６）分子量 本酵素の分子量は、第５図に示したように、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって、１８０，０
００と決定された。

本発明者は、上述のようにＢＣ−８菌から初期の目的で
あるα−１，３−グルカナーゼを製造することができた
が、より効率良くα−１，３−グルカナーゼを製造する
ために、誘導基質（ｉｎｄｕｃｅｒ）を培地中に加えな
ければならないＢＣ−８菌の代わりに、炭素源として一
般に用いられるブドウ糖を加えるだけで、α−１，３−
グルカナーゼを構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）に
産生ずる突然変異株を利用できれば好都合である。

そこで、本発明者は、ＢＣ−８菌を突然変異誘起剤にて
処理し、ブドウ糖を炭素源として分解利用してα−１，
３−グルカナーゼを産生ずる突然変異株を検索した結果
、バチルス　サーキュランスＢＣ−８−０３３（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　ＢＣ−８−０３３（
徽工研条寄第１５１５号”）　（ＰＥＲＭ　ＢＰ−１５
１５）　（以下、ＢＣ−８菌変異株と言う）〕が構成的
（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）に、かつ強力にα−１，
３−グルカナーゼを産生ずることを見出した。以下にこ
のＢＣ−８菌変異株を用いた本発明のα−１，３−グル
カナーゼを製造する方法について詳細に説明する。

１、　８Ｃ−８菌変異株の分離 前記ＢＣ−８菌を、１．０％ブドウ糖、１．０％バタト
トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）　、０．５％酵母エキス
（Ｄｊｆｃｏ社製）、０．５％食塩から成るｐＨ７，０
に調製し滅菌した液体培地に植菌し、３７℃で振盪培養
した。対数増殖期で培養を停止し、遠心分離によりＢＣ
−８菌体を集めた。これを冷却した（４℃）　５０　ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）で洗浄した後、５０μｇ／
隋ｌのＮ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（５０ｎ＋Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６，５）溶液に懸濁
し、３７℃で２０分間処理した。その後、５０　＋ｗＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）でよく洗菌し、さらに菌体を
上記液体培地に植菌し、３７℃、３時間、振盪培養し、
菌体を３０％グリセロール溶液に懸濁させて、−８０℃
で保存した。この菌体保存溶液を随時溶解し、この中か
ら炭素源として、不溶性グルカンの代わりにブドウ糖の
みを培地成分として用いた場合でも、多量にα−１，３
−グルカナーゼを産生ずる突然変異株の検索を行った結
果、このような性質を有するＢＣ−８菌変異株を分離し
た。

２、８Ｃ−８菌変異株の菌学的性状 構成的にα−１，３−グルカナーゼを産生ずる性質以外
は、前記ＢＣ−８菌と同じ。

３．８Ｃ−８菌変異株の培養 （ａｌ　　ＢＣ−８菌変異株培養のための培地α−１，
３−グルカナーゼを製造するためには、まず上記ＢＣ−
８菌変異株を天然、または人工培地に接種して培養する
が、工業的生産には液体培地で通気攪拌培養法によって
実施するのが、コスト、収率の上からも有利である。

培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものが
使用される０例えば、炭素源としてブドウ糖が最も有効
で、窒素源としては、リン酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。無機
塩としては、リン酸、ナトリウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛、コバルト、銅などの塩類が用いられる。

（ｂｌ　　ＢＣ−８菌変異株の培養 上記（ａ）項にて調製した培地に、ＢＣ−８菌変異株を
接種し、所定の培養温度、好ましくは３０℃〜３７℃で
、培養基のｐＨを６〜７で、α−１，３−グルカナーゼ
が培養液中で最も高い活性を示すまで、所定の培養時間
（培養条件によって異なるが、通常通気攪拌培養では１
〜３日）培養する。

４、培養物からのα−１，３−グルカナーゼの採取精製 このようにして、充分にα−１，３−グルカナーゼが産
生された培養物から、遠心分離によって菌体を取り除け
ば、粗酵素液が得られる。

得られた粗酵素液は、そのままでも製品として充分に使
用可能であるが、さらに該酵素液を公知の分離精製法、
例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧濃縮法、硫安などによ
る塩析法、エタノールなどによる溶媒分画法、等電点沈
澱法、カラムクロマト分画法などを、単独或いは適宜組
合わせることによって精製酵素液を採取することが可能
である。

本発明の製造方法によって得られるＢＣ−８菌変異株の
α−１，３−グルカナーゼは、下記の通りの理化学的性
質を有する。

（１）　　作用及び基質特異性 ＢＣ−８菌の産生ずるα−１，３−グルカナーゼと同じ
。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ ＢＣ−８菌の産生ずるα−１，３−グルカナーゼと同じ
。

（３）至適温度及び安定温度 ＢＣ−８菌の産生ずるα−１，３−グルカナーゼと同じ
。

（４）金属塩、酵素阻害剤の影響 ＢＣ−８菌の産生ずるα−１，３−グルカナーゼと同じ
。

（５）分子量 ＢＣ−８菌の産生ずるα−１，３−グルカナーゼと同じ
。

（６）還元糖増加活性測定方法 通常、５Ｉｌ１ｇ／ＷａＩｌの１．３−α−Ｄ−グルカ
ン（表Ｉ脚注参照）（５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７，０
）懸濁液５０μｌに、４０μｌの５０　ｍＭ燐酸緩衝液
、ｐＨ７，０を加え、さら？、ＺＩＯｔｔ　Ｉｔ　（７
）　α−１，３−グルカナーゼ溶液を加えて、３７℃で
６０分間反応させ、ソモギー銅試薬１００μｌを加えて
反応を停止させた。これを煮沸水中に１ｏ分間放置した
後冷却し、ネルソン試薬１００μｌを加えよく攪拌後、 １＋ｓＪのイオン交換水を加えて遠心分離を行った。遠
心分離上清の５５０　ｎｓにおける吸光度を測定し還元
糖の増加量を求めた。

上記の反応条件において、６０分間に６０　ｎｍｏｌの
ブドウ糖に相当する還元糖を遊離させるα−１，３−グ
ルカナーゼの活性を１単位とした。

実際的には、各種濃度のα−１，３−グルヵナーゼを用
いて標準曲線を作成し、それによって還元糖増加活性を
求めた。

尚、還元糖増加活性法により求めた酵素活性１単位は、
フェノール硫酸法を用いる活性測定法による２８０単位
の酵素活性に相当する。

（実施例） たα−１３−グル力　−ゼの１゛６ 叉ｌ拠上 前記不溶性グルカンの調製例によって調整し、超音波で
破砕懸濁した不溶性グルカン０．５％（乾燥重量の−／
Ｖ）、燐酸２アンモニウム（（ＮＨ４）ｔＨＰＯ４）　
０．５％、燐酸１カリウム（ＫＨｚＰＯ＊）　０．１％
、食塩０．１％、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．１
％を含有する液体培地（ｐＨ７，０）　１００　ｍｌを
５００ｍｆ容の綿栓をしたエルレンマイヤーフラスコに
入れる。加熱減菌後、別に滅菌した１Ｍ硫酸マグネシウ
ム水溶液及び０．１　Ｍ塩化カルシウム水溶液をそれぞ
れ１ｍｌずつ添加して、予め同じ培地で２４時間培養し
たＢＣ−８菌培養液５ｍｌを接種して、３７℃でロータ
リー型振盪培養法にて４８時間培養した。

培養液に対して、前記水可溶性低分子グルカン溶液の調
製例にて調製した当量の水可溶性低分子グルカン溶液を
添加し、その後遠心分離を行い、培養上清を得た。この
培養上清中のα−１，３−グルカナーゼの活性は、元の
培地１ｍｌ当たりに換算してフェノール硫酸法を用いる
活性測定法において７７０単位／ｎ＋１であった。

大施斑主 上記実施例１と同様の液体培地を、綿栓をした３１容の
エルレンマイヤーフラスコに５００　ｓ＋１入れ、加熱
滅菌後、実施例１と同濃度になるように、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、を加え、さらにペニシリウム （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　　属に属するかびの生産
したデキストラナーゼ（生化学工業社製）水溶液を、フ
ラスコ１本当たりデキストラナーゼが４ｎ＋ｇとなるよ
うに、無菌濾過して加えた。

同様の培地で２４時間培養したＢＣ−８菌培養液を２５
ａ＋１接種して、３７℃にてロータリ型振盪培養法にて
４８時間培養した。培養終了後、実施例１の場合と同様
に、水可溶性低分子グルカン溶液による処理を行い、培
養上清を得た。

得られた培養上滑中のα−１，３−グルカナーゼ活性は
、元の培地１　＋ｗｌ当たりに換算して、フェノール硫
酸法を用いる活性測定法において７７５単位／ｓ＋１で
あった。培地中に予めデキストラナーゼを加えておいた
場合には、培養終了後、ＢＣ−８菌菌体以外の残存不溶
物は殆ど存在しなかった。

実施■ユ 実施例１と同じ液体培地を綿栓をした３１容のエルレン
マイヤーフラスコに５００　ｍｌｉ’つ　・分注し、加
熱滅菌後、実施例１と同濃度になるように、硫酸マグネ
シウム、塩化カルシウムを加え、同様の培地で２４時間
培養したＢＣ−８菌培養液を、フラスコ１本あたり２５
　ｍｌ接種して、３７℃にてロータリー型振盪培養法に
より、４８時間培養した。この様にして培養した培養液
４．５　ｊ！を遠心分離にかけ、上清（１）とＢＣ−８
％体及びグルカン残留物を含む沈殿画分に分けた。この
沈殿画分に、水可溶性低分子グルカン溶液（前記調製側
参照）２５０　ｍｌを添加し、沈殿をこの溶液中に懸濁
して、０℃で１０分間放置した。これを遠心分離にかけ
、上清（２）と沈殿画分に分けた。この沈殿画分に対し
、再び水可溶性低分子グルカン溶液を２５０　ｍｌ加え
て、前述と同様の処理を行い、上清（３）と沈澱画分に
分けた。上記上清（１）、　（２）、　（３）を合わせ
、０〜４０％（Ｖ／Ｖ）のエタノール分画を行い、沈殿
物を遠心分離により集め、少量の５０　ｎ＋Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）中に懸濁した。この懸濁液を同緩衝液
を外液にして透析し、透析後、遠心分離により、上滑（
４）と沈殿画分に分けた。この沈殿画分を水可溶性低分
子グルカン溶液（１００ａｌｌずつ）により、上記と同
様に二層処理を行い、上清（５）、　（６１を得た。上
清（４１，（５）、　（６）を集め、これにデキストラ
ナーゼＣＧ　（生化学工業社より市販）２．０００　　
生化学工業単位を加え、３７℃で６時間反応させた。遠
心分離を行い、上清（７）と沈殿画分に分け、沈殿画分
に対しては、２００　ｍｌずつの水可溶性低分子グルカ
ン溶液による処理を二層行い、遠心上清（８）、　（９
１を得た。　（７）、　（８１，（９）を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、濃縮液を５０　ｍＭ燐酸緩衝液（
ｐＨ７，０）を外液にして透析した。この透析液を同緩
衝液で平衡化したセファアクリルＳ　−２００カラムに
入れ、同緩衝液を用いて溶出した。デキストラナーゼは
、セファアクリル樹脂に親和性を持つため、この処理に
よって酵素液に加えたデキストラナーゼを取り除くこと
ができた。溶出されてきたグルカナーゼ画分を集め、５
０−Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７゜０）で平衡化したＤＢＡｆ
！−セファセルカラムに加え、吸着されずに同緩衝液で
溶出されてくるグルカナーゼ画分を集めた。限外濾過に
よってこの両分を濃縮し、５０　ｓＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，５）を外液として透析した。これを、同緩衝液で平
衡化したＣトセファロースＣＬ−６Ｂカラムに入れ、酢
酸緩衝液で充分カラムを洗浄した後、０〜０．６　Ｍの
食塩（５０＋＊Ｍ　　酢酸緩衝液、ｐＨ４，５）の直線
濃度勾配により溶出した。

グルカナーゼ活性を示す両分を集め、ＳＯ３−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行ったところ、１本のタンパ
クバンドのみが検出された、以上の精製操作によって、
ＢＣ−８菌のグルカナーゼは、電気泳動的に均一にまで
精製され、フェノール硫酸法を用いる活性測定法におい
て４９．４００単位（タンパク質として３３８μｇ）の
精製グルカナーゼが得られた。このグルカナーゼ標品の
比活性は、フェノール硫酸法を用いる活性測定法におい
て１４４，０００（単位／ｌ１ｇタンパク）であった。

ｍ汰 実施■」 １．０％ブドウ糖、１．０％ポリペプトン（大豆栄養化
学社製）　、０．５％酵母エキスＳ　（大豆栄養化学社
製）　、０．５％食塩、０．４％燐酸１カリウム、０．
４％硫酸アンモニウム、０．１％グリシン、２５　ＰＰ
Ｍ　　塩化第二鉄、７．８　ＰＰＭ硫酸マンガン、８．
３５　ＰＰＭ　　塩化亜鉛、１０　ＰＰＭ　　塩化コバ
ルト、６　ＰＰＭ硫酸銅、５　ＰＰＭモリブデン酸ナト
リウム、５　ＰＰＭホウ酸ナトリウム、からなるｐＨ７
，０の滅菌した培養液３ｊ！の入ったミニジャーファー
メンタ−にＢＣ−８菌変異株を植菌した（植菌量は、前
記培養液で予め前培養したもの２％）０次にこれを３７
℃で水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨを６．３５以
上に調整しながら通気撹拌培養を行った。培養３０時間
でα−１，３−グルカナーゼの活性は、前記還元糖増加
活性測定法で３６４．８本位／−１（フェノール硫酸法
を用いる活性測定法で、１０２．０００単位／１１１）
となり、ＢＣ−８菌変異株は、ＢＣ−８菌を不溶性グル
カンを炭素源として用いて培養した場合に比較して、１
３０倍以上の活性のα−１，３−グルカナーゼを構成的
に生産することが判明した（第６図参照）。

前記培養開始後３０時間の培養液を、ミニジャーファー
メンタ−から取り出し、遠心分離によって菌体を取り除
いて培養上清２４７０ｓｊ！を得た、この全α−１，３
−グルカナーゼ活性は、前記還元糖増加活性測定法で９
０１．０００単位であった。

この培養上清を限外濾過器により濃縮し、濃縮酵素液に
０．１モル濃度となるように、塩化アンモニウムを添加
して、濃アンモニア水でｐＨを８゜５に調整した。これ
に５０％（Ｖ　／Ｖ　）となるように冷エタノールを加
え、エタノール分画を行った。沈殿画分を遠心分離によ
って集めて、少量の０．１Ｍ塩化アンモニウム−アンモ
ニア緩衝液（ｐＨ８，５）に懸濁溶解した。不溶物を遠
心分離によって取り除いた後、上清を５０１１Ｍ　燐酸
緩衝液（ｐＨ７，０）を外液として透析した。透析終了
後、再び遠心分離を行い、不溶物を取り除き上清のα−
１，３−グルカナーゼを含む溶液１３０　ｔａｌを得た
。この溶液の全α−１，３−グルカナーゼ活性は、還元
糖増加活性測定法で５５９．０００単位であった。

このエタノール分画後のα−１，３−グルカナーゼ溶液
を用いてさらに硫酸アンモニウム分画を行った。硫酸ア
ンモニウム８０％飽和において、析出してくる物質を遠
心分離により集め、少量の５０　ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解した。同じ緩衝液で透析し、不溶物を遠
心分離によって取り除き、上清のα−１，３−グルカナ
ーゼ溶液を得た。この全α−１，３−グルカナーゼ活性
は、還元糖増加活性測定法で５０３，０００単位、比活
性は５２６単位／ｍｇタンパクであった。以上の精製操
作によるα−１，３−グルカナーゼの回収率は５６％で
あった。

一■Ｂｃ−８菌変異株のα−１，３−グルカナーゼのオ
リゴＩＪ！、二１人−に対する１ｔ、”：ｎ　　　　　
　　　　　　ｚＳｒＩＱ）十陥　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５’ｒ％Ｗｉイソマルトヘ
プタオース８１　　ブドウ需力（α−１，６−結合でつ
ながったヘプタオース　　　　　　−デキストリン１　
　　　　　ブドウｗＪ＜主としてα−１，４−１６合で
つなＡ（Ｉｌｌ＋、田炒預ｆこα−１，６−Ｉ給でつな
力（ったオリコ゛を店　　　　　　　　　　　−イソマ
ルトース１　　　　　ブドウＰ６’ｆｆ−１，６−結合
でつながった二塘−ニゲロース１４　　　　　　　　　
］゛ドドウ切ｂ−１，３−結合−ｃつなめ鳴った三糖　
　　　　　　　　　　−セロビオース０Ｓ　　　　　　
　ブドウ糖がβ−１，４−結合でつながった二塘−マル
トース１　　　　　　　　フ゛ドウＰ／ｌ（α−１，４
−結合でつながった二ｔｉ　　　　　　　　　　　　−
１，３−α−シグルカン１　　　ブドウ糖が主としてα
−１，３−結合でつながった多糖　　　　　　＋１．３
−１．６−α−シグルカン１　ブドウ糖がα−１，３−
結合又はα−１，６−結合でつな力くった多り３　　＋
本１　　＝４ｓａ＋ａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ（生（ヒ
与ζエゴ荏１Ｐ失Ｄ　、＊’ｌ　　−Ｄｅｘｔｒｉｎ（
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イＥフａ、４　・・−Ｎｔｇαな遁（シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）仕顆、柘　・・伽１１ｏｂｉｏｓｅ（利洸剥］諸じ
■、４　・・情旧勇ｅ…紡珈Ｕ瞬封Φ、 率７　・・−ζ二、シリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ−デ
キストラナーゼで４のα−Ｌ６−４＆合０附を宗Ｗ肖匁
４　・・・ストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　＋ｎｕｔａｎｓ）Ｏｒｔｉ：１
７６の産生する水工）割生り゛ルカン。

Ｕ　　のα−１３−グルカナーゼ　　　　　　に・　る
−基質　　　　　　　　　　　結合　　　　　　　　用
いた１１踵ν夜　　生成しｆ３ｙｄ）ＭＷＣ（資）り デキストラ％ｌ　　　　　　　　α−１，６と若干のｃ
ｒ−１，３ＭＥＳ”　　　　　　　　０．６ｐｕ　　　
　　　　　１−１ デキストランａ２　　　　　　　α−１，６と若干のα
−１，３４３２，８Ｏ さミオ１　　　　　　　　　　　α−１，４と若干のα
−１，６１３０Ｏ グリコーゲン１　　　　　　α−１，４とα−１，６旧
　　　　　　　Ｏニゲラン”　　　　　　　　α−１，
３とα−１，４１３０，６Ｐ１．４ ニゲ、：、　ン＊　ｈ　　　　　　　　　　ｅｔ−１＋
　３とα−１，４ＭＥＳ　　　　　　　　　　２．０Ｐ
１．７ プルラン１　　　　　　　　α−１，４とα−１，６恋
　　　　　　　　ＯＦ２ １．３−α−Ｄ−グルカン１　　　α−１，３と若干の
α−１，６遣１　　　　　　　　６５．ＩＰ　　　　　
　　　　　６２．３ １．３−１．６−α−〇−グルカン１　α−１，３とα
−Ｌ６　　　　　　　ＭＥＳ　　　　　　　　　５４．
９Ｐ　　　　　　　　　　５３．７ ｍｌ　　−Ｄｅｘｔｒａｎ印功）シ鉢聾象ＭｓｌＯ〜２
０居、１１２　−ｆ）ｅｘＬｒａｎ（ファルマシ７　（
Ｐｈｎａ：ｉａ）巳ＤｅｘＬｒａｎ　Ｔｌ０）、４　・
・−５ｔａｒｃｈ（メルクね１幻社製、（至）、−・・
弔１ｙｃｏｇｅｎ（メルク昨πω仕肋、ｆ＋　　−−−
Ｎｉｇｅｔａｎ（シグマ（Ｓｉｇｍ）社製、アスペルギ
ルス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　￥ｒｉ）　
ＦｆｋｌＥ）、４　−−−Ｎｉｇｉｎ（シグマ（Ｓｉ−
ω社製、アスペルギルス　ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｊａｐａｗｉｃｕｓ）由来、４　・・・ス
トレプトコアカス　ミュータンス（ＳＬｒｅｏ＋以＊工
ＵＳ利ｂμｓ）ＯりＩＺ　１７６の産生ずる沖３１羽生
グルカン、１・・反応系０．２門の橿３媛几夜（ｐｌ＋
６．５）を使用。

井・・反応系０．０５　Ｍの塙酸ナトリウム＄！１１腋
（ｐＨ７，０）を使用。

（効果） α−１，３−グルカナーゼは、虫歯の原因となろう蝕原
性連鎖球菌が産生ずる不溶性グルカンのα−１，３−グ
ルコシド結合を特異的に切断する酵素である。本発明に
よるα−１，３−グルカナーゼの製造方法によれば、こ
のような作用のあるα−１，３−グルカナーゼを産生ず
るバチルス属に属する細菌或いはその突然変異株、特に
バチルスサーキエランスＢＣ−８菌或いはその突然変異
株を培養して、容易にα−１，３−グルカナーゼを分離
採取することができる。

さらに、本発明に使用されるバチルス属に属する細菌或
いはその突然変異株、特にバチルスサーキュランスＢＣ
−８菌或いはその突然変異株は、下記の通り、他の細菌
に比較して優れている。

（１１バチルス属の細菌には、炭厄菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を除いて、
病原菌や毒性のある菌は全く見当たらない。従って、工
業的な各種の酵素生産や食品類〔例えば、納豆菌（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ）　）の生産によく利用され
ている。それらの経験を生かして本発明と結合して生か
せる可能性が高い。また、本発明を工業的に使用する場
合、安全性の点においても、優れた方法であることを示
している。

（２）バチルス属の細菌の中でも、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）は、形質転換（ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｗ＋ａｔｉｏｎ）が可能で、数ある細菌の中でも
、大腸菌についで遺伝学的背景がよく研究されている。

バチルス属の細菌はそれらの知見を利用できるので、今
後本発明を遺伝子工学的に、或いは遺伝生化学的に発展
させる上で有利である。

以上の二点を勘案すれば、本発明は従来のものに比べて
、一段と工業的にも安全に使用し得る優れた製造方法を
提供できるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＣ−８菌のα−１，３−グルカナーゼの各
ｐＨにおける活性を示すグラフ、第２図は、ＢＣ−８菌
のα−１，３−グルカナーゼの各ｐＨにおける安定性を
示すグラフ、第３図は、ＢＣ−８菌のα−１，３−グル
カナーゼの各温度における活性を示すグラフ、第４図は
、ＢＣ−８菌のα−１，３−グルカナーゼの各温度にお
ける安定性を示すグラフ、第５図は、ＳＯ３−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動でのＢＧ−８菌のα−１，３−
グルカナーゼの分子量の決定を示すグラフ、第６図は、
ＱＣ−８菌変異株の培養時間と培養液中に生産されたα
−１，３−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフで
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）歯垢などに含まれる１，３−α−Ｄ−グルカンの
   α−１，３−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵
   素であるα−１，３−グルカナーゼを産生するバチルス
   属に属する細菌或いはその突然変異株を、培養培地に接
   種して所定の培養条件下で培養した後、該培養物を遠心
   分離して、該培養物から菌体を分離除去し、α−１，３
   −グルカナーゼを採取することを特徴とするα−１，３
   −グルカナーゼの製造方法。
2. （２）前記バチルス属に属する細菌が、バチルスサーキ
   ュランスＢＣ−８菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌ
   ａｎｓＢＣ−８）である特許請求の範囲第１項に記載の
   α−１，３−グルカナーゼの製造方法。