JPH0330692A - ネコインターフェロンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であ
るインターフェロンを遺伝子組換え技術により量産し、
以って医薬品（抗ウィルス剤）とすることを目的とした
ネコインターフェロン（以下、Ｆｅ１ＦＮと略す）の製
造法および発現プラスミドに関する。

［従来の技術］ インターフェロンは、抗ウィルス作用を示すところの蛋
白質を主成分とする生理活性物質でＩＦＮと略記され、
これまでも多数の文献が出版されている。

遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮのみならず、
ウシ、ウマ、イヌなど動物のＩＦＮも大量生産が可能と
なり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬として
のＩＦＮの用途開発研究が行なわれているものもある。

ネコニついてもα、β、γ各タイプのインターフェロン
が報告されている（文献１）。

［発明が解決しようとする課題］ しかるに、ネコのＩＦＮが遺伝子操作により大量生産が
可能となったという報告は未だない。

ネコには、ネコエイズ、ネコ白血病、ネコウィルス性鼻
気管炎、ネコ力すキウィルス病、ネコ伝染性腹膜炎はじ
め多数のウィルス病が知られている。

そこで、ヒトのαＩＦＮやウシのβＩＦＮを経口投与し
、ネコ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報
告されている。経口ではなく、体内注射を行なえば、よ
り顕著な効果が期待されるものの、異種ＩＦＮに対する
中和抗体の生産が起こることは容易に懸念される。同種
ＩＦＮつまりネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、
ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれる
と期待される。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる状況に鑑みＦｅ１ＦＮの大量生産
を目的とし、創意工夫を成し、市販のベクターを用いて
ネコのｃＤＮＡライブラリーを作製し、この中からサル
の培養細胞をトランジェント・エクスプレジョンをさせ
、Ｆｅ１ＦＮを生産させるプラスミドを単離することに
成功し、以つて簡便に、大量にＦｅ１ＦＮを製造する方
法を確立し、かくして本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、ＣＯ８細胞をミクロキャリヤ上で培
養・増殖させ、次いで、ネコインターフェロンの蛋白質
をコードするＤＮＡを組込んだ発現プラスミドを添加し
培養することを特徴とするＦｅ１ＦＮの製造方法、およ
び高生産性の発現プラスミドを提供するものである。

以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。

ｃＤＮＡライブラリーは大腸菌を宿主とし、ネコの細胞
から抽出したｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを基質と
し、逆転写酵素を用いた一般的な方法で作れる。

ｐ　ｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡの供与体としてのネ
コの細胞は、例えばＬＳＡ　（文献１）のような株化さ
れた培養細胞が使用に便利ではあるが、これに限らない
。培養した細胞からｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを得る
ときは、その細胞に適したインターフェロンインデュー
サーを検討し、これを用いてｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋
ＲＮＡの増収を図ると便利であり、例えばＬＳＡ細胞で
は培養時にＮ　Ｄ　Ｖ　（Ｎｅｗ　Ｃａ５ｔ１、”ｅ−
ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ）やＴ　Ｐ　Ａ　（１２−
０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎ。

ｙｌｐｈｏｒｂｏｌ　１３−Ａｃｅｔａｔｅ）などを誘
導剤として用いると、ｐ　ｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ＲＮ
Ａの収量増大が図れ便利である。

プラスミドベクターは動物細胞用発現機構を備え、かつ
大腸菌で複製可能なもの、例えばファルマシア社製オカ
ヤマ・バーブ・ベクター類のような市販のものを使うと
便利である。宿主の細胞は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１
２株を用いることができる。

Ｆｅ１ＦＮをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドの
クローン化は、サルの株化細胞Ｃ０８１あるいはＣ０８
７をトランスフェクトし、トランジェント・エクスプレ
ジョンでＣ０８ＩあるいはＣＯ３７に抗ウイルス活性生
産能を賦与するプラスミドとして、ｃＤＮＡライブラリ
ーの中からスクリーニングすることにより行なうことが
できる。

プラスミドによるＦｅ１ＦＮ）ランジエント舎エクスプ
レジョンは、例えばＤＥＡＥ−デキストラン法やリン酸
カルシウム法のような一般的な方法で行なうことができ
る。

このようにして選び出した活性を有するプラスミドの１
つがｐＦｅ　Ｉ　ＦＮＩであり、これを含有する形質転
換体大腸菌がＥ、ｃｏｌｉ　（ｐＦｅＩＦＮＩ）（微工
研条寄第１６３３号）である。ｐＦｅｌＦＮｌは４．３
ｋｂの大きさで、その制限地図を第１図に示す。

Ｆｅ１ＦＮをコードするＤＮＡを組込んだ発現プラスミ
ドは、ＣＯ８細胞中で増幅しうる性質を有するものであ
り、好ましくは大腸菌中での複製が可能なものが用いら
れる。例えば、微工研条寄第１６３３号の大腸菌形質転
換体から文献２のような一般的な方法により抽出したプ
ラスミドｐＦｅｌＦＮ１は、その−例である。また、プ
ラスミドｐＦｅ　ＩＦＮＩから切り出したＦｅ１ＦＮの
蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、例えばハーベイ・マ
ウス肉腫ウィルスのエンハンサ−、モロニ白血病ウィル
スのエンハンサ−などのエンハンサ−と、ＳＶ４０初期
プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーターな
どの発現調節部分を含む動物細胞発現ベクターの発現調
節部分の下流に連結するという、−膜内な遺伝子操作法
に従って作製される発現プラスミドを使用すると、生産
性を上げることができる。

好ましくは、エンハンサ−としてハーベイ・マウス肉腫
ウィルスの工〕／ハンサー、プロモーターとしてＳＶ４
０初期プロモーターを用いることが望ましく、例えばベ
クタープラスミドｐＬｓＶ１（文献３）は、ハーベイ・
マウス肉腫ウィルスのエンハンサ−およびＳＶ４０初期
プロモーターを含んでいる。

ｐＬｓＶｌにＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを連結させ
ることにより、Ｆｅ１ＦＮをコードするＤＮＡを組込ん
で発現プラスミドを作製することができる。その−例が
ｐＦｅＩＦＮ３であるが、特にこれに限定されるもので
はない。

本発明で用いる細胞は、サルの株化細胞Ｃ０８１あるい
はＣ０８７である。

また、ミクロキャリアとしては、例えばジエチルアミノ
エチル化した架橋デキストラン微粒子、またはコラーゲ
ン被覆架橋デキストラン微粒子が一般的に用いられるが
、この中でも細胞増殖、Ｆｅ　ＩＦＮ生産などの面でコ
ラーゲン被覆架橋デキストラン微粒子〔例えば“サイト
デックス３”（ファルマシア社製）〕が好ましく用いら
れる。

ＦｅＩＦＮの製造は以下のように行なう。

すなわち、フラスコ培養でコンフルエントまで増殖した
ＣＯ８細胞を、ミクロキャリアを含む培地に加え、スピ
ナーピンで培養し、ミクロキャリア上で細胞がコンフル
エントになったとき、例えばＤＥＡＥ−デキストラン法
でＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを組込んだ発現プラス
ミド、例えばｐＦｅｌＦＮ３を導入し、新鮮な培地と交
換し、スピナーピンで培養する。培養後、培養液を遠心
分離し、その上清からＦｅＩＦＮを回収する。

培地としては、増殖培地としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）
２〜１０％添加したＲＰＭ１１６４０を、生産培地とし
てＦＢＳ０．２〜１０％添加したＲＰＭ１１６４０培地
を用いることが好ましい。

ここで生産培地とは、ＦｅＩＦＮを生産するための培地
であり、通常は増殖培地に比べ、ウシ胎児血清の添加が
微量でよい。

生産されたＦｅ１ＦＮは、通常の方法で精製することが
できる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーに
よる方法などが好ましく用いられ、特にブルー色素を結
合させた担体、銅をキレート結合させた担体、レッド色
素を結合させた担体などを用いる方法が好ましく用いら
れる。これらの担体は単独で用いてもよいが、精製効果
を上げるためには、２種以上の担体を併用する方法が好
ましい。

［実　施　例コ 以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例１ （１）　　ネコのｃＤＮＡライブラリーの作製ｐｏ　ｌ
ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡの供与体であるネコの細胞ＬＳＡ
−Ｄ４−に１７　（文献１）を２０００１１の１０％Ｆ
ＢＳを含むＭＥＭ−Ｌ１５培地〔５０％イーグル（Ｅａ
ｇｌｅ）　ＭＥＭ　−５０％レイボヴケイツ（Ｌｅｉｂ
ｏｖｆｔｚ）培地〕中スピナーカルチャーで増殖させ、
細胞濃度１０５〜１０６／　ｍｌのところでＴ　Ｐ　Ａ
　（１２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂ
ｏｌ　１３−Ａｃｅｔａｔｅ、シグマ社製）を５　ｎｇ
／　ｍｌとなるように培地中に加え、さらに２０時間培
養を続けた後、遠心分離で細胞を集めた。この細胞から
、グアニジウムチオ、シアネート法の変法によりｐｏｌ
ｙ（Ａ）　＋ＲＮＡを抽出した。

すなわち、細胞３〜５×１０８を２０ｍ１の５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム−０，５％ザルコシルナトリウム−０，
１Ｍメルカプトエタノール−６Ｍグアニジンチオシアネ
ートに懸濁した後、１８Ｇの注射針を１０回通すことで
ホモジナイズした。ポリアロマ遠心管にホモジネートの
１／３容の０゜１Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）−５
，７Ｍ　　ＣｓＣ１を入れた後、この上にホモジネート
を重層し、日立ＲＰＳ４０Ｔｏ−ターで３５．００Ｏｒ
ｐｍ、２０℃、２０時間遠心した。チューブ底部にパッ
クされたＲＮＡ画分を１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス・
塩酸−１ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　ｐ　Ｈ７、５）
に溶かし、０．１ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム液と混ぜた
後、２．５容の冷エタノールと混ぜ一２０°Ｃで２時間
静置した。遠心分離により生じた底部のペレットを１＋
ｎｌのＴＥに溶かし、６５℃、４分間インキュベートし
た後、水冷し１ｍｌのＴＥを加えた後、等量の１．ＯＭ
　　ＮａＣ１と混ぜた。この混合物を０．５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１−ＴＥで平衡化した０、５ｍ１のｏ　１　ｉ　ｇｏ
　（ｄＴ）セルロース（タイプ３）（コラボラティブ・
リサーチ社製）のカラムに通し、ｐｏｌｙ（Ａ）　　Ｒ
ＮＡを吸着させ、１０ｍ１の０．５Ｍ　　ＮａＣ１−Ｔ
Ｅで洗滌した後、５ｍｌのＴＥで溶出し、エタノール沈
殿法でペレット化したｐＯ１ｙ（Ａ）　＋ＲＮＡを３０
μαのＴＥに溶かし一８０°Ｃで保存した。７Ｘ１０Ｂ
個の細胞から３００μｇのｐｏ　ｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮ
Ａが得られｊこ。

ｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡのプラスミドベクター
への連結とｃＤＮＡの合成は、市販のプラスミドプライ
マーとリンカ−とを用いて行なった。

すなわち、１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに５
ｍｇ／ｍｌのｐｏ　ｌｙ　（Ａ）　　ＲＮＡを５μα入
れ、これに水を加えて２０μＵとし、６５℃、３分間イ
ンキュベートした後、室温に戻した。これに０．３Ｍ）
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）−８０ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ２−０．３Ｍ　　ＫＣＩ　−３ｍＭジチオスレイトー
ルを４μひ加え、これにオリゴ（ｄＴ）ティルトｐｃＤ
Ｖ１プラスミドプライマー（ファルマシア社製）を２μ
ｇ　（３μＱ）、そしてそれぞれ２５ｍＭ濃度のｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰＳｄＧＴＰＳｄＣＴＰ（７）混合液を４　
μＬ　’ＣＬ３２ て［α　　ＰＩ　ｄＣＴＰ　　１０ｍＣ１／ｍｌを２μ
Ｕ、そして水を３μα加えた後、１８単位／μαの逆転
写酵素（生化学工業社製）を４μα加え、４２℃、１時
間インキュベートして酵素反応を行ない、４μαの０．
２５Ｍ　　ＥＤＴＡと２μαの１０％ＳＤＳとを加え反
応を停止した後、フェノール・クロロホルム抽出を行な
い水層を取り、４０μαの４Ｍ酢酸アンモニウム、１６
０μαのエタノールを加え、ドライアイス中１５分間冷
却した。これを室温に戻してからマイクロ遠心機で１０
分間遠心し、上清を除いた後、ペレットを２０μαの水
に溶解し、２０μαの４Ｍ酢酸アンモニウム、８０μα
のエタノールを加え、再度エタノール沈殿を行なった。

ペレットをエタノールで洗滌し乾燥させた後、１０μ０
の水に溶かした。これに、２μひの１．４Ｍカコジル酸
ナトリウム−０，３Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ６，８
）−１ｍＭジチオスレイトール、１μαの２００μｇ／
ｍｌポリアデニル酸（生化学工業社製）、１μαの２０
ｍＭ　　ＣｏＣｌ２．１．４μＱのｌｍＭｄ３２ ＣＴＰ、０．５μｆｆノ［αＰ］　ｄＣＴＰ　　４００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ　（１０ｍＣｉ／ｍｌ）を順次加え、さ
らに水を加えて２０μαとした後、２７単位／μＵのタ
ーミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼを０．８μ
α加え、３７℃、５分間インキュベート・し、水中で酵
素反応を止めた。末端付加したｄＣＭＰ残基数は、平均
１２と推算された。これからフェノール・クロロフォル
ム抽出法と２回のエタノール沈殿法により核酸を回収し
た。

この核酸を４０μαの１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐＨ８，
０）−６０ｍＭ　　ＮａＣ１−１０ｍＭＭｇＣ１２１ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール溶液に溶解し、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ制限酵素を１０単位加え、３７℃、３時間インキュ
ベートした後、フェノールΦクロロホルム抽出、２回の
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、エタノールで洗
滌・乾燥した後、１０μαのＴＥ緩衝液に溶解した。こ
れに５μαの２ＭＮａＣ１，８１μαのＴＥ緩衝液、４
μａの市販の３′−オリゴ（ｄＧ）ティルトｐＬ１リン
カ−（ファルマシア社製）を順次加えた後、６５℃、５
分間、次に４２℃、１時間加温した後、水冷した。これ
に１００μ０の０．２Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）−４０ｍＭＭｇＣ１２０，１Ｍ硫酸アンモニウム−
ＩＭＫＣＩ、７μαの１４ｍＭ　　β−ＮＡＤ、５０μ
Ｕの１■／ｍｌウシ血清アルブミン溶液、６μＵの１ｍ
ｇ／ｍｌ　　Ｅ、　　ｃ　ｏ　１　ｉ　　ＤＮＡリガー
ゼを順次加え、水を加えて１ｍｌとし、１２℃−晩イン
キユベートした。

この反応液にそれぞれが２５ｍＭのｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰＳｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ混合液を２μα、１４ｍ
Ｍ　　β−ＮＡＤを３μα、３５単位／μαのＥ、ｃｏ
ｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（宝酒造社製）を０．
７μ（１，２，５単位／μｆｆ（７）Ｅ。

ｃｏｌｉ　　ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）を２．４μα
、１ｍｇ／ｍｌのＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡリガーゼを４
μαを順次加え、１２℃、１時間、次に２５℃、１時間
インキュベートした後、−２０℃で保存した。これの１
００μαを文献４の方法でコンピテント化したＥ、ｃｏ
ｌｉ　　ＭＣ１０６１（文献５）懸濁液１ｍｌに加えて
形質転換反応を行なった後、１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含んだＬＢ培地２５０ｍ１に移し、３７℃で一
晩培養し、このうちの１０ｍ１にＤＭＳＯを０．７ｍｌ
加えｃＤＮＡライブラリーとし、−８０℃で保存した。

（２）クローニング こうして作製したｃＤＮＡライブラリーの菌液の１部を
、１０個の９ｃｍＬＢプレートのそれぞれにコロニーが
１，０００〜２，０００個生じるように撒き、３７°Ｃ
で一晩培養した後、それぞれのシャーレ毎に生育したコ
ロニーをかき集め、それぞれ１０ｍ１のＬＢ培地に懸濁
し、この菌液の３ｍｌを０．２１ｍ１のＤＭＳＯと混ぜ
て凍結保存し、残りの菌液をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含んだ１００ｍ１のＬＢ培地と混ぜ、
３７℃で一晩培養した。それぞれの培養液から菌体を集
め、文献２の方法でプラスミドを抽出・精製した。これ
らのプラスミドの３０℃ｇずつにつき、ＤＥＡＥデキス
トラン・トランスフェクション法を用いて、９ｃｍシャ
ーレ内でコンフルエントにまで増殖したＣ０８１細胞（
文献６）にトランジェント・エクスプレジョン（ｔｒａ
ｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を試み、それぞ
れのプラスミドＤＮＡサンプルのＦｅＩＦＮ生産能を調
べた。

すなわち、９ｃｍシャーレ内でＣＯ８１細胞を１０％Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０　（ＧＩＢＣＯ社製）
培地２０ｍ１中でコンフルエントになるまで増殖させた
後、培地を除去して、７．５μｇ　／　ｍｌのプラスミ
ドＤＮＡサンプル、５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）　、４００μｇ／ｍ１ＤＥＡＥ−デキストラン
（ファルマシア社製）を含むＲＰＭ１１６４０培地４ｍ
ｌをシ培地４内ｌ入れ、３７℃、４時間、さらに培養を
続けた。次に１５０μＭクロロキンを含むＲＰＭ１１６
４０培地４ｍｌに交培地４内ｌ℃、３時間培養した後、
さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地に交
換し、３７℃、３日間培養を続け、培地中の抗ウィルス
活性を調べた。以上のＲＰＭ１１６４０培地には、いず
れも１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｚ
　／　ｍｌのストレプトマイシンを添加して用いた。

その結果、１０種の培養液のうち、２０単位／ｍ１以上
の抗ウィルス活性を示すものが３種あったため、該当凍
結保存菌液の中から、抗ウイルス活性生産性をＣ０８１
細胞に賦与するプラスミドを有する大腸菌を次のように
して探し出した。

すなわち、当該活性を生じさせるプラスミドを有する３
種凍結保存菌液の１種を希釈し、プレートあたり約６０
０個のコロニーを生じるよう１０枚の１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含んだＬＢプレートに撒き、３７℃、−
晩培養した後、保存プレートとしてのレプリカを作った
後、各プレート毎に菌体をかき取り、５ｍｌのＬＢ培地
に懸濁してから１００μｇ　／　ｍｌのアンピシリンを
含んだ１００ｍ１のＬＢ培地と混ぜ、３７℃で一晩培養
し、菌体を集めプラスミドを抽出・精製した。これら１
０種のプラスミドをシャーレあたり２０℃ｇずつ用い、
ＤＥＡＥ−デキストラン法でＣＯ３１細胞によるトラン
ジェント・エクスプレジョンをさせ、Ｆｅ１ＦＮ生産能
を調べた。

その結果、１０種のプラスミドサンプルのうちの１種に
該生産能が認められたため、該当する保存プレートのコ
ロニー５９３個を別のアンピシリン含有ＬＢプレートに
爪揚子で約１００個ずつ移植し、３７℃、−晩培養した
後、各プレート毎に菌体をかき取り、１００ｍ１のアン
ピシリン含有しＢ培地中で一晩培養し、集めた菌体から
プラスミドを抽出・精製し、トランジェント・エクスブ
レジョン法により各プラスミドの該抗ウィルス活性生産
能を調べた。

その結果、１つのプラスミドサンプルに該生産能が認め
られたため、該当する保存プレート中のコロニー１００
個を各々２ｍ１ＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し
、トランジェント・エクスブレジョン法で各プラスミド
の抗ウイルス活性生産能を測定した。該生産能の最も高
いプラスミドをｐＦｅ　ＩＦＮＩ、これを含有する大腸
菌をＥ。

ｃｏ　１　ｉ　　（ｐＦｅ　ＩＦＮＩ）と名付け、菌は
微工研に寄託した（微工研条寄第１６３３号）。

〈３）　　抗ウィルス活性７ｉや１定法ウイルスはＶｅ
ｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｌｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ、
感受性細胞はネコＦＣ９（文献１）を用い、ＣＰＥ法に
従って抗ウィルス活性を測定した。スタンダードリフエ
ランスとして、ＮＩＨのヒトの天然型αＩＦＮ換算した
Ｈｕ　Ｉ　ＦＮαを用いた。

形質転換大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　（ｐＦｅｌＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から文献２の方法で抽出したプ
ラスミドｐＦｅ　Ｉ　ＦＮｌｏｏｕｇを制限酵素Ｘｈｏ
Ｉで完全分解し、得られた複数のＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動で分け、約１゜２ｋｂのＤＮＡ断片をエ
レクトロエリューションで取り出し、約１０μｇを回収
した。このＤＮＡ断片５μｇを制限酵素５ｆａＮＩとＢ
ａｍＨＩで完全分解し、得られたＤＮＡ断片のうち約９
３０ｂｐのものを同様にして約３μｇ回収した。このＳ
ｆａＮｌ−ＢａｍＨＩ断片３μｇを、フレノウ・フラグ
メント（宝酒造社製）により平滑末端化した後、ｐＥｃ
ｏＲＩリンカ−（宝酒造社製）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造社製）により連結し、続いてＥｃｏＲＩ　（宝酒
造社製）で完全分解し、エレクトロエリューションでＦ
ｅＩＦＮをコードするＤＮＡを含む約９３０ｂ９のＥｃ
ｏＲＩ−Ｅｃ。

ＲＩ断片で約１．５μｇ回収した。

次に、動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＬＳＶＩ　
（文献３）５μｇをＥｃｏＲＩで完全分解した後、細菌
アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）により末端を
脱リン酸化した。このうち０゜２１１ｇと、上記ＦｅＩ
ＦＮをコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
断片０．２μｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーシ
ョンした。この反応液をコンピテント化したＥ、ｃｏｌ
ｉ　　ＨＢｌｏｌ（宝酒造社製）と混合し、形質転換を
行なった。１００μｇ　／　ｍｌのアンピシリンを含む
ＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、アルカリ
ミニスクリーン法で抽出したプラスミドの制限酵素解析
により、目的のプラスミドを得た。

このプラスミドを形質転換大腸菌から文献２の方法で抽
出し、そのうち２０μｇを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで完全
分解し、ＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを含む約８５０
ｂｐの断片をエレクトロエリューションで回収し、約５
μｇ得た。そのうちの２μｇにＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによりリン酸化したＫｐｎＩリンカ−（宝酒造社
製）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、Ｋｐｎ　Ｉ
およびＥｃｏＲＩで完全分解し、ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動で分け、エレクトロエリューションで目
的のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片約１μｇを回収した。

また、ｐＬＳｖｌ　１０μｇをＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで
完全分解し、アガロースゲル電気泳動、エレクトロエリ
ューションで大きい方のＤＮＡ断片３μｇを回収した。

このベクター０．２μｇと先に調製したＥｃｏＲＩ−Ｋ
ｐｎＩ断片１μｇとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてラ
イゲーションした。この反応液をコンビチット化したＥ
、ｃ。

１ｉ　　ＨＢＩＯＩと混合し、形質転換を行なった。

１００μｇ　／　［０１のアンピシリンを含むＬＢプレ
ート上に生育するコロニーの中から、アルカリミニスク
リーン法で抽出したプラスミドの制限酵素解析により目
的のプラスミドを得た。この組換え体プラスミドをｐＦ
ｅＩＦＮ３とした。ｐＦｅｌＦＮ３の作製法を第２図に
示す。

＜５）ミクロキャリアを用いた培養によるＦｅ１ＦＮの
生産 １５０ｃＪ培養フラスコでコンフルエントまで培養した
ＣＯ３１細胞を０．６ｇミクロキャリア（商品名“サイ
トデックス３″、ファルマシア社製）および１０％ＦＢ
Ｓを含むＲＰＭ１１６４０培地を１８０ｍ１の入ったス
ピナービンに３×１０５／ｍ１の細胞濃度になるように
加え、全量を２００ｍ１として、３７℃、１００　ｒｐ
ｍで撹拌しながら、ミクロキャリア上でＣ０８１細胞が
コンフルエントになるまで培養した。培養液を除去し、
４０ｍ１の１μｇ／ｍｌ　　ｐＦｅｌＦＮ３．５０ｍＭ
トリス塩酸ｐＨ７，５，１ｍｇ／ｍｌ　　ＤＥＡＥデキ
ストテランを含むＰＲＭ１１６４０培地を加え、３７°
Ｃで４時間保温した。次いで培養液を除去し、４０ｍ１
の１５０μＭクロロキンを含むＲＰＭＩＩ６４０培地を
加え、３７℃で３時間保温後、０゜２％ＦＢＳを含むＲ
ＰＭ１１６４０培地と培地交換し、２００ｍ１の培養液
量で、３７℃、１１００ｒｐで撹拌しながら４日間培養
し、培養液を回収し、遠心上清の抗ウィルス活性を測定
した。２゜４×１０５単位／ｍｌ（培養液）のＦｅＩＦ
Ｎが生産された。

［発明の効果］ 本発明によれば、ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤として
期待されるＦｅ１ＦＮを大量生産することができる。

［参考文献］ １、　　Ｊ、に、ＹａｌＩｌａｍｏｔｏら：　Ｖｅｔ、
　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ）ａｔ
ｈｏｌ、、　１１．１−１９．　（１９８Ｂ）２、　　
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　（１９８
９）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｐ２Ｏ−９
６゜３、須藤ら：特開昭６３−２７８４９０４、　　Ｄ
、１Ｉａｎａｈａｎ　：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、
、　１６６、５７７−５８０゜（１９８３） ５、　　Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎら：　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｌｏｌ、、　１３８゜１７９−２０７．　（１
９８０） ６、　　Ｙ、ＧＩｕｚｍａｎ　：Ｃｅ１１．２３．１７
５−１８２．　（１９８１）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ネコインターフェロンの蛋白質をコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｐＦｅＩＦＮ１の制限地図を示
す。 第２図は、ネコインターフェロンをコードするＤＮＡを
組込んだ発現プラスミドｐＦｅＩＦＮ３の作製例の概略
図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＣＯＳ細胞をミクロキャリア上で培養・増殖させ
   、次いで、ネコインターフェロンの蛋白質をコードする
   ＤＮＡを組込んだ発現プラスミドを添加し培養すること
   を特徴とするネコインターフェロンの製造方法。
2. （２）発現プラスミドが、ネコインターフェロンの蛋白
   質をコードするＤＮＡと、ハーベイ・マウス肉腫ウィル
   スのエンハンサーを組込んだものである請求項（１）記
   載のネコインターフェロンの製造方法。
3. （３）ネコインターフェロンの蛋白質をコードするＤＮ
   Ａと、ハーベイ・マウス肉腫ウィルスのエンハンサーを
   組込んだ発現プラスミド。