JPH0330670A - 形質転換体および該形質転換体を用いたネコインターフェロンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であ
るインターフェロン（以下、Ｆｅ１ＦＮと略す）を遺伝
子操作技術により量産し、以って医薬品（抗ウィルス・
ワクチン）とすることを目的とした形質転換体、および
それによるネコインターフェロンの製造法に関する。

［従来の技術］ インターフェロンは、抗ウィルス作用を示すところの蛋
白質を主成分とする生理活性物質でＩＦＮと略記され、
これまでも多数の文献が出版されている。

遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮのみならず、
ウシ、ウマ、イヌなど動物のＩＦＮも大量生産が可能と
なり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬として
のＩＦＮの用途開発研究が行なわれているものもある。

ネコについてもα、β、γ各タイプのインターフェロン
が報告されている（文献１）。

［発明が解決しようとする課題］ しかるに、ネコのＩＦＮが遺伝子操作により大量生産が
可能となったという報告は未だない。

ネコには、ＦＴＬＶ、ネコ白血病、ネコウィルス性鼻気
管炎、ネコカリキウィルス病、ネコ伝染性腹膜炎はじめ
多数のウィルス病が知られている。

そこで、ヒトのαＩＦＮやウシのβＩＦＮを経口投与し
、ＦｅＬＶ感染ネコの延命を図った事例が報告されてい
る。経口ではなく、体内注射を行なえば、より顕著な効
果が期待されるものの、異種ＩＦＨに対する中和抗体の
生産が起こることは容易に懸念される。同種ＩＦＮつま
りネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、ネコの抗ウ
ィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれ名と期待され
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる状況に鑑みＦｅＩＦＮの大量生産
を目的とし、創意工夫を成し、市販のベクターを用いて
ネコのｃＤＮＡライブラリーを作製し、この中からサル
の培養細胞をトランジェント・エクスプレジョンをさせ
、ＦｅＩＦＮを生産させるプラスミドを単離することに
成功し、さらにはこのプラスミドを用いてＦｅＩＦＮを
生産する酵母細胞の作製に成功し、以って簡便に、大量
にＦｅＩＦＮを製造する方法を確立し、かくして本発明
を完成させるに至った。

すなわち本発明は、ＦｅＩＦＮを生産させるための発現
プラスミドにより、形質転換された高発現性の動物細胞
、および該細胞によるＦｅＩＦＮの製造法を提供するも
のである。

本発明のＦ、ｅｌＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡは、
例えば次のようにして製造することができる。

すなわち、ネコの細胞からｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを
抽出し、いわゆる発現プラスミドベクターを利用したｃ
ＤＮＡライブラリーを大腸菌を宿主として作製し、この
ライブラリーの中からサルのＣＯ８細胞をトランジェン
ト会エクスプレスさせて抗ウィルス活性を生産させる能
力のあるプラスミドとして選び出すことができる。

このような活性を有するプラスミドの１つがｐＦｅｌＦ
Ｎｌであり、これを含有する形質転換体大腸菌がＥ、ｃ
ｏｌｉ　（ｐＦｅＩＦＮｌ）（微工研条寄第１６３３号
）である。ｐＦｅｌＦＮｌは４．３ｋｂの大きさで、そ
の制限酵素地図を第１図に示す。Ｆｅ１ＦＮの蛋白質を
コードするＤＮＡは、プラスミドｐＦｅｌＦＮ１を制限
酵素で分解することにより、容易に得ることができる。

本発明の発現プラスミドは、例えば次のようにして製造
することができる。

すなわち、動物細胞発現ベクターにＦｅ１ＦＮの蛋白質
をコードするＤＮＡを連結することにより作製すること
ができる。また、そのようにして作製した発現プラスミ
ドとジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をコードするＤＮＡを
組み込んだ合成プラスミドにより動物細胞を形質転換す
ることにより、Ｆｅ１ＦＮを生産する動物細胞を作製す
ることができる。

また、メソトレキセート（４−アミノ−１０−メチル葉
酸、以下ＭＴＸと略す）を用いた遺伝子増幅の手法を用
いることによって、ＦｅＩＦＮ生産能の高い動物細胞を
作製することができる。そのようにして作製した動物細
胞をマイクロキャリア上で増殖させることにより、Ｆｅ
１ＦＮを含む培養液を容易、かつ大量に得ることができ
る。

以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。

遺伝子操作技術・細胞工学技術については数多くの実装
置があり、既存の技術が適用できる。

ｃＤＮＡライブラリーは大腸菌を宿主どし、ネコの細胞
から抽出したｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを基質とし、逆
転写酵素を用いた一般的な方法で作れる。

ｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡの供与体としてのネコ
の細胞は、例えばＬＳＡ　（文献１）のよう゛な株化さ
れた培養細胞が使用に便利ではあるが、これに限らない
。培養した細胞からｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを得ると
きは、その細胞に適したインターフェロンインデューサ
ーを検討し、これを用いてｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　Ｒ
ＮＡの増収を図ると便利であり、例えばＬＳＡ細胞では
培養時に、Ｎ　Ｄ　Ｖ　（Ｎｅｗ　Ｃａ５ｔＩＣ−ｄｉ
ｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ）やＴＰＡ（１２−トｔｅｔｒ
ａｔｉｅｃａｎ。

ｙｌｐｈｏｒｂｏｌ　１３−Ａｃｅｔａｔｅ）などを誘
導剤として用いると、ｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　ＲＮＡ
の収量増大が図れ便利である。

プラスミドベクターは動物細胞用発現機構を備え、かつ
大腸菌で複製可能なもの、例えばファルマシア社製オカ
ヤマ・バーブ・ベクター類のような市販のものを使うと
便利である。宿主の細胞は大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１１）Ｋ
１２株を用いることができる。

Ｆｅ１ＦＮをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドの
クローン化は、サルの株化細胞をＣ０８１あるいはＣＯ
３７（文献２）をトランスフエクトシ、トランジェント
・エクスプレジョンでＣ０８１あるいはＣＯ３７に抗ウ
イルス活性生産能を賦与するプラスミドとして、ｃＤＮ
Ａライブラリーの中からスクリーニングすることにより
行なうことができる。プラスミドによるＦｅＩＦＮトラ
ンジェント・エクスプレジョンは、例えばＤＥＡＥ−デ
キストラン法やリン酸カルシウム法のような一般的な方
法で行なうことができる。

微工研条寄第１６３３号は、Ｃ０３Ｉ細胞をトランジェ
ント争エクスプレジョンで抗ウィルス活性を生産させる
ことのできるプラスミドを含有する形質転換体の一例で
ある。抗ウィルス活性の測定は、ネコの培養細胞と■Ｓ
Ｖとを用い（文献１）ＣＰＥ法などの常法か使用できる
。

Ｆｅ　ＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡは、微工研条
寄第１６３３号を用いると容易に作製することができる
。

すなわち、微工研条寄第１６３３号の大腸菌形質転換体
から、例えば文献３のような一般的な方法により抽出し
たプラスミドｐＦｅｌＦＮ１を制限酵素で分解し、次い
でアガロース・ゲル電気泳動により、目的とするＦｅ１
ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得
ることができる。

Ｆｅ　ＩＦＮ発現プラスミドは、例えば次の方法により
製造することができる。

Ｆｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、例えば
ハーベイ舎マウス肉腫ウィルスのエンハンサ−、モロニ
ー白血病ウィルスのエンハンサ−などのエンハンサ−１
およびプロモーターなどの発現調節部分を含む動物細胞
発現ベクターの、発現調節部分の下流に連結するという
、−船釣な遺伝子操作法に従って作製することができる
。

プロモーターとしては、動物細胞内で機能するものであ
れば特に限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、
アデノウィルス主要後期プロモーターなどが好ましく用
いられる。

プラスミドｐＬｓＶ１　（特開昭６３−２７６４９０号
公報）は、ハーベイ・マウス肉腫ウィルスのエンハンサ
−およびＳＶ４０初期プロモーターを念んでいるため、
このプラスミドにＦｅ１ＦＮをコードするＤＮＡを連結
させることにより、容易に本発明のプラスミドを得るこ
とができる。

ＦｅＩＦＮを生産する形質転換動物細胞は、以下に述べ
る方法により作製することができる。

ヒ記のようにして作製した発現プラスミドを、好ましく
はｐＡｄＤ２６ＳＶ　（Ａ）（文献４）のようにジヒド
ロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す）発現能を有す
るプラスミドとともに、例えばＤＨＦＲ欠損変異を有す
るＣＨＯ−ＤＵＫ−ＸＢ−１１株（文献２）などの動物
細胞を形質転換する。

形質転換は、リン酸カルシウム法のような一般的方法に
より可能である。また、形質転換させる細胞としては、
ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているとともに、導入したＤＨ
ＦＲ遺伝子がＤＨＦＲの拮抗阻害剤の作用で増幅するこ
とが知られている細胞が通常用いられる。具体例として
はＣＨＯ−ＤＵＫ−ＸＢ−１１株があるが、これに限定
されない。

本発明の発現プラスミドが導入されＤＨＦＲ遺伝子が発
現している細胞は、形質転換前の親細胞であるＤＨＦＲ
欠損変異を有するＣＨＯ細胞が生き残れないチミジン、
アデノシン、デオキシアデノシンを欠いた選択培地で生
育できる性質を獲得していることを利用して容易に識別
できる。

ＤＨＦＲの拮抗阻害剤の作用で、ＤＨＦＲ遺伝子が増幅
した細胞は、選択培地にＤＨＦＲの拮抗阻害剤、例えば
ＭＴＸを加えた培地で生育できるため容易に識別できる
。

すなわち、培地中に加えるＭＴＸを０．０５μＭから継
代ごとに順次０．１．０．２．０．５．１．２μＭと高
め、２μＭのＭＴＸを含む培地中で生育できる細胞を選
択する。

こうして得られたＭＴＸ耐性の高くなった細胞の中から
Ｆｅ１ＦＮの生産性の高くなった細胞を選択する。そこ
で、その細胞を用いて大量培養を行なうことにより、Ｆ
ｅＩＦＮの大量生産を達成できる。

大量培養は、シャーレおよび培養フラスコを用いた通常
の平面培養でも可能だが、好ましくはマイクロキャリア
法で行なう方が、時間、労力、場所などの点で有利であ
る。マイクロキャリア上で培養を行なうことにより、容
易に大量の培養液を得ることができる。

マイクロキャリアとしては、ジエチルアミノエチル化し
た架橋デキストラン微粒子〔例えば“サイトデックス１
”　（ファルマシア社）〕、またはコラーゲン被覆架橋
デキストラン微粒子〔例えば“サイトデックス３“　（
ファルマシア社製）〕などが最も一般的に用いられる。

この中でも、細胞増殖、Ｆｅ１ＦＮ生産などの面で、コ
ラーゲン被覆架橋デキストラン微粒子が好ましく用いら
れる。

培養装置は、市販のスピナーフラスコを用いると便利だ
が、それに限らず類似の構造を持つものは使用できる。

スピナーフラスコに培地とマイクロキャリアを入れ、細
胞を接種し、撹拌しながら培養することによりＦｅＩＦ
Ｎを含んだ培養液が得られる。撹拌を停止するとマイク
ロキャリアに接着した細胞は沈降するため、容易に培養
液を回収できる。培地としては、ＦＢＳを添加したα（
−）培地が好ましく用いられる。

生産されたＦｅＩＦＮは、通常の方法で精製することが
できる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーに
よる方法などが好ましく用いられ、特にブルー色素を結
合させた担体、銅をキレート結合させた担体、レッド色
素を結合させた担体などを用いる方法が好ましく用いら
れる。これらの担体は単独で用いてもよいが、精製効果
を上げるためには、２種以上の担体を併用する方法が好
ましい。

［実　施　例］ 以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

（１）ネコのｃＤＮＡライブラリーの作製ｐ　ｏ　１　
ｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡの供与体であるネコの細胞ＬＳＡ
−Ｄ４−に１７　（文献１）を２００ｍ１の１０％ＦＢ
Ｓを含むＭＥＭ−Ｌ１５培地〔５０％イーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）　ＭＥＭ　−５０％レイボヴイッツ（Ｌｅｉｂｏ
ｖｉｔｚ）培地〕中スピナーカルチャーで増殖させ、細
胞濃度１０５〜１０６／ｍｌのところでＴ　Ｐ　Ａ　（
１２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ
　１３−Ａｃｅｔａｔｅ、シグマ社製）を５　ｎｇ／　
ｍｌとなるように培地中に加え、さらに２０時間培養を
続けた後、遠心分離で細胞を集めた。この細胞から、グ
アニジウムチオシアネート法の変法によりｐｏｌｙ（Ａ
）　＋ＲＮＡを抽出した。

すなわち、細胞３〜５Ｘ１０Ｂを２０ｍ１の５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム−０，５％ザルコシルナトリウム−０，
１Ｍメルカプトエタノール−６Ｍグアニジンチオシアネ
ートに懸濁した後、１８Ｇの注射針を１０回通すことで
ホモジナイズした。ポリアロマ遠心管にホモジネートの
１／３容の０゜１Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）−５
，７Ｍ　　ＣｓＣ１を入れた後、この上にホモジネート
を重層し、日立ＲＰＳ４０Ｔｏ−ターで３５．００Ｏｒ
ｐｍ　。

２０℃、２０時間遠心した。チューブ底部にパックされ
たＲＮＡ画分を１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ）リス・塩酸−
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　ｐＨ７，５）に溶かし、０．１
ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム液と混ぜた後、２．５容の冷
エタノールと混ぜ一２０℃で２時間静置した。遠心分離
により生じた底部のベレットを１ｍｌのＴＥに溶かし、
６５℃、４分間インキュベートした後、氷冷し１ｍｌの
ＴＥを加えた後、等量の１．０Ｍ　　ＮａＣ１と混ぜた
。この混合物を０．５Ｍ　　ＮａＣ１−ＴＥで平衡化し
た０、５ｍｌのｏ　１　ｉ　ｇｏ　（ｄＴ）セルロース
（タイプ３）（コラボラティブ・リサーチ社製）のカラ
ムに通し、ｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを吸着させ、１０
ｍ１の０．５Ｍ　　ＮａＣ１−ＴＥで洗滌した後、５ｍ
ｌのＴＥで溶出し、エタノール沈殿法でペレット化した
ｐｏｌｙ（Ａ）　　ＲＮＡを３０ｔｔｎのＴＥに溶かし
一８０°Ｃで保存した。７Ｘ１０８個の細胞から３００
μｇのｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　ＲＮＡが得られた。

ｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　ＲＮＡのプラスミドベクター
への連結とｃＤＮＡの合成は、市販のプラスミドプライ
マーとリンカ−とを用いて行なった。

すなわち、１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに５
ｍｇ／ｍｌのｐｏ　１　ｙ　（Ａ）　　ＲＮＡを５μα
入れ、これに水を加えて２０μαとし、６５℃、３分間
インキュベートした後、室温に戻した。これに０．３Ｍ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）−８０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２−０．３Ｍ　　ＫＣｌ−３ｍＭジチオスレイトー
ルを４μひ加え、これにオリゴ（ｄＴ）ティルトｐｃＤ
Ｖ１プラスミドプライマー（ファルマシア社製）を２μ
ｇ　（３μα）、そしてそれぞれ２５ｍＭ濃度のｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの混合液を４μα、
そし３２ て［ａ　　　Ｐ］　ｄＣＴＰ　　１０ｍＣ１／ｍｌを２
μひ、そして水を３μα加えた後、１８単位／μαの逆
転写酵素（生化学工業社製）を４μひ加え、４２℃、１
時間インキュベートして酵素反応を行ない、４μαの０
．２５Ｍ　　ＥＤＴＡと２μαの１０％ＳＤＳとを加え
反応を停止した後、フェノール・クロロホルム抽出を行
ない水層を取り、４０μＵの４Ｍ酢酸アンモニウム、１
６０μαのエタノールを加え、ドライアイス中１５分間
冷却した。これを室温に戻してからマイクロ遠心機で１
０分間遠心し、上清を除いた後、ペレットを２０μ０の
水に溶解し、２０μＱの４Ｍ酢酸アンモニウム、８０μ
αのエタノールを加え、再度エタノール沈殿を行なった
。ペレットをエタノールで洗滌し乾燥させた後、１０μ
αの水に溶かした。これに、２μαの１．４Ｍカコジル
酸ナトリウム−０，３Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ６，
８）　　１ｍＭジチオスレイトール、１μαの２００μ
ｇ／ｍｌポリアデニル酸（生化学工業社製）、１μＵの
２０ｍＭ　　ＣｏＣｌ２．１．４ｕ（Ｌの１ｍＭｄ＝３
２ ＣＴＰ、０．５μαの［α　　Ｐ］ｄＣＴＰ４００　Ｃ
ｉ　／ａｕｎｏｌ　（１０ｍＣｔ　／ｍｌ）を順次加え
、さらに水を加えて２０μαとした後、２７単位／μＱ
のターミナルヌクレオチジルトランスフエラーゼを０．
８μひ加え、３７℃、５分間インキュベートし、水中で
酵素反応を止めた。末端付加したｄＣＭＰ残基数は、平
均１２と推算された。これからフェノール・クロロフォ
ルム抽出法と２回のエタノール沈殿法により核酸を回収
した。

この核酸を４０μαの１０ｍＭｈリス・塩酸（ｐＨ８，
０）−６０ｍＭ　　ＮａＣ１−１０ｍＭＭｇ　Ｃ１２−
１ｍＭ２−メルカプトエタノール溶液に溶解し、Ｈｉｎ
ｄｍ制限酵素を１０単位加え、３７°Ｃ，３時間インキ
ュベートした後、フェノール舎クロロホルム抽出、２回
のエタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、エタノールで
洗滌・乾燥した後、１０μαのＴＥ緩衝液に溶解した。

これに５μαの２ＭＮａＣ１，８１μαのＴＥ緩衝液、
４μαの市販の３′−オリゴ（ｄＧ）ティルトｐＬ１リ
ンカ−（ファルマシア社製）を順次加えた後、６５℃、
５分間、次に４２℃、１時間加温した後、水冷した。こ
れに１００μαの０．２Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）−４０ｍＭＭｇＣ１２−０，１Ｍ硫酸アンモニウ
ム−ＩＭＫＣＩ、７μｆｆの１４ｍＭ　　β−ＮＡＤ、
５０μαの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン溶液、６μ
αの１ｍｇ／ｍｌ　　Ｅ、　　ｃ　ｏ　１　ｉ　　ＤＮ
Ａリガーゼを順次加え、水を加えて１ｍｌとし、１２℃
−晩インキユベートした。

この反応液にそれぞれが２５ｍＭのｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰＳｄＴＴＰＳｄＣＴＰ混合液を２μひ、１４ｍ
Ｍ　　β−ＮＡＤを３μα、３５単位／μαのＥ、ｃｏ
ｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ■（宝酒造社製）を０．７
μα、２．５単位／μαのＥ。

ｃｏｌ　ｉ　　ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）を２．４μ
（１，，１ｍｇ／ｍｌのＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡリガー
ゼを４μαを順次加え、１２°Ｃ１１時間、次に２５０
０．１時間インキュベートした後、−２０℃で保存した
。これの１００μＱを文献５の方法でコンピテント化し
たＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１（文献６）懸濁液１ｍ
ｌに加えて形質転換反応を行なった後、１００μｇ／ｒ
ｎｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地２５０ｍ１に移し
、３７°Ｃで一晩培養し、このうちの１０ｍ１にＤＭＳ
Ｏを０．７ｍｌ加えｃＤＮＡライブラリーとし、−８０
℃で保存した。

（２）クローニング こうして作製したｃＤＮＡライブラリーの菌液の１部を
、１０個の９　ｃｍ　Ｌ　Ｂプレートのそれぞれにコロ
ニーが１，０００〜２．０００個生Ｃ６ように撒き、３
７℃で一晩培養した後、それぞれのシャーレ毎に生育し
たコロニーをかき集め、それぞれ１０ｍ１のＬＢ培地に
懸濁し、この菌液の３ｍｌを０．２１ｍ１のＤＭＳＯと
混ぜて凍結保存し、残りの菌液をそれぞれ１００μｇ　
／　ｍｌのアンピシリンを含んだ１００ｍ１のＬＢ培地
と混ぜ、３７℃で一晩培養した。それぞれの培養液から
菌体を集め、文献３の方法でプラスミドを抽出・精製し
た。これらのプラスミドの３０μｇずつにつき、ＤＥＡ
Ｅデキストラン・トランスフェクション法を用いて、９
ｃｍシャーレ内でコンフルエントにまで増殖したＣ０８
１細胞にトランジェントφエクスプレジョン（ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を試み、それぞれ
のプラスミドＤＮＡサンプルのＦｅＩＦＮ生産能を調べ
た。

すなわち、９ｃｍシャーレ内でＣ０８１細胞を１０％Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０　（ＧＩＢＣＯ社製）
培地２０ｍ１中でコンフルエントになるまで増殖させた
後、培地を除去して、７．５μｇ／ｍｌのプラスミドＤ
ＮＡサンプル、５０ｍＭ）リス◆塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４）　、４００μｇ／ｍ１ＤＥＡＥ−デキストラン（フ
ァルマシア社製）を含むＲＰＭ１１６４０培地４ｍｌを
シ培地４内ｌ入れ、３７℃、４時間、さらに培養を続け
た。次に１５０μＭクロロキンを含むＲＰＭ１１６４０
培地４ｍｌに交培地４内ｌ℃、３時間培養した後、さら
に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭ１１６４０培地に交換し、
３７℃、３日間培養を続け、培地中の抗ウィルス活性を
調べた。以上のＲＰＭ１１６４０培地には、いずれも１
００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｍ；　／
　ｍｌのストレプトマイシンを添加して用いた。

その結果、１０種の培養液のうち、２０単位／ｍ１以上
の抗ウィルス活性を示すものが３種あったため、該当凍
結保存菌液の中から、抗ウイルス活性生産性をＣ０８１
細胞に賦与するプラスミドを有する大腸菌を次のように
して探し出した。

すなわち、当該活性を生じさせるプラスミドを有する３
種凍結保存菌液の１種を希釈し、プレートあたり約６０
０個のコロニーを生じるよう１０枚の１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含んだＬＢプレートに撒き、３７℃、−
晩培養した後、保存プレートとしてのレプリカを作った
後、各プレート毎に菌体をかき取り、５ｍｌのＬＢ培地
に懸濁してから１００μｇ　／　ｍｌのアンピシリンを
含んだ１００ｍ１のＬＢ培地と混ぜ、３７℃で一晩培養
し、菌体を集めプラスミドを抽出・精製した。これら１
０種のプラスミドをシャーレあたり２０μｇずつ用い、
ＤＥＡＥ−デキストラン法でＣ０８１細胞によるトラン
ジェントφエクスプレジョンをさせ、ＦｅＩＦＮ生産能
を調べた。

その結果、１０種のプラスミドサンプルのうちの１種に
該生産能が認められたため、該当する保存プレートのコ
ロニー５９３個を別のアンピシリン含有ＬＢプレートに
爪楊子で約１００個ずつ移植し、３７℃、−晩培養した
後、各プレート毎に菌体をかき取り、１００ｍ１のアン
ピシリン含有しＢ培地中で一晩培養し、集めた菌体から
プラスミドを抽出・精製し、トランジェント・エクスプ
レジョン法により各プラスミドの該抗ウイルス活性生産
能を調べた。

その結果、１つのプラスミドサンプルに該生産能が認め
られたため、該当する保存プレート中のコロニー１００
個を各々２　ｍｌ　Ｌ　Ｂ培地で培養し、プラスミドを
抽出し、トランジェント・エクスプレジョン法で各プラ
スミドの抗ウイルス活性生産能を測定した。該生産能の
最も高いプラスミドをｐＦｅＩＦＮｌ、これを含有する
大腸菌をＥ。

ｃｏｌｉ　（ｐＦｅｌＦＮｌ）と名付け、菌は微工研に
寄託した（微工研条寄第１６３３号）。

（３）　　ｐＦｅＩＦＮｌ ｐＦｅＩＦＮｌは４．３ｋｂの大きさで、その制限地図
は第１図に示す。

（４）抗ウイルス活性測定法 ウィルスはＶｃｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｌｓ
　Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献１）を用
い、ＣＰＥ法（文献７）に従って抗ウィルス活性を測定
した。

スタンダードフエランスとしてＮＩＨのヒトの天然型α
ＩＦＮ換算したＨｕ　Ｉ　ＦＮαを用いた。

（５）ＦｅＩＦＮ構造遺伝子断片の調製第１図に示した
プラスミドｐＦｅＩＦＮ１から、第２図に示す方法でＦ
ｅ　ＩＦＮ構造遺伝子を含む断片を調製した。

すなわち、プラスミドｐＦｅｌＦＮ１　１００μｇを制
限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）で完全分解し、得られた
複数のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約
１．２ｋｂのＤＮＡ断片をエレクトロエリューションで
取り出し、約１０μｇを回収した。次に、このＤＮＡ断
片５μｇを制限酵素５ｆａＮＩ（宝酒造社製）とＢａｍ
ＨＩ　（宝酒造社製）で完全分解し、得られたＤＮＡ断
片のうち約９３０ｂｐのものを同様にして約３μｇ回収
した。この断片３μｇを、フレノウ・フラグメント（宝
酒造社製）により平滑末端化した後、ｐＥｃｏＲＩリン
カ−（宝酒造社製）を７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製
）により連結した。続いてＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で
完全分解し、エレクトロエリューションで約１．５μｇ
回収した。こうして目的のＦｅ１ＦＮ構造遺伝子断片を
得た。

（０）　　プラスミドｐＦｅｌＦＮ１１（７）作製（５
）で得たＦｅＩＦＮ構造遺伝子断片と、動物細胞発現ベ
クターｐＬｓＶ１　（特開昭６３−２７６４９０号公報
）とから、第２図に示す方法でｐＦｅｌＦＮｌｌを作製
した。

すなわち、ｐＬｓＶｌ　　５Ａ１ｇをＥｃｏＲＩで完全
分解した後、細菌アルカリフォスターゼ（宝酒造社製）
により末端を脱リン酸化した。このうち０．２μｇとり
５）で得たＦｅＩＦＮ構造遺伝子断片０．２μｇとを、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。制限酵素解析により、
断片が目的の方向に挿入されたものを選びｐＦｅＩＦＮ
、１１とした。

（７）　　ｐＦｅＩＦＮ３の作製 動物細胞発現ベクターｐＬｓＶ１と（６）で得たｐＦｅ
ｌＦＮｌｌとから、第２図に示す方法でｐＦｅＩＦＮ３
を作製した。

すなわち、ｐＦｅｌＦＮｌｌ　　２０μｇをＨｉｎｃＩ
Ｉ　（宝酒造社製）で完全分解し、Ｆｅ１ＦＮ構造遺伝
子を含む約８５０ｂｐの断片をエレクトロエリューショ
ンで回収し、約５μｇを得た。そのうち２μｇに、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化したＫｐｎＩ
リンカ−（宝酒造社製）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、ＫｐｎＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩで完
全分解した。

アガロースゲル電気泳動で目的のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
断片を分離し、エレクトロエリューションで回収し、約
１μｇ得た。

また、ｐＬｓＶｌ　　１０μｇをＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ
で完全分解し、アガロースゲル電気泳動、エレクトロエ
リューションで回収し、約３μｇ得た。このベクター０
．２μｇと先に調製したＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片ｌμ
ｇ”とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＦｅ
ＩＦＮ３を得た。

１０％ＦＢＳを含むＭＥＭアルファ培地（ギブコ社製、
Ｃａｔ、　Ｎｏ、４１０−１９００）を用いて６穴プレ
ートに１／４希釈で継代し、１６時間培養したＣＨＯ−
ＤＵＫ−ＸＢ−１１株に、リン酸カルシウム共沈法を適
用して、１０μどのｐＦｅＩＦＮ３と１μｇのｐＡｄＤ
２６ＳＶ　（Ａ）とをトランスフェクト（文献８）した
。翌日、１０％透析牛脂児血清を含むＭＥＭアルファ培
地〔ギブコ社製、Ｃａｔ、　Ｎｏ、４１０−２０００　
（以下、α（−）培地と略す）〕からなる選択培地に植
え継ぎ、３日に１回培地交換をしながら９日間培養した
ところ、約５０個のコロニーが得られた。そのうちの１
８個のコロニーを４８穴プレートに移植し、コンフルエ
ントになるまで４日間培養し、培養液中の抗ウィルス活
性を測定したところ、すべての培養液中で１万単位／［
１１１以上の活性が認められた。そのうち４培養液中に
１０万単位／ｍ１以上の活性が認められた。

（９）　　メソトレキセートによる遺伝子増幅（８）で
得た１８クローンを０．０５μＭ　　ＭＴＸおよび１０
％ＦＢＳを含むα（＝）培地を用いて、１２穴プレート
に植え継いだ。コンフルエントになるまで培養後、培地
交換し、３日後の培養液中のＦｅ１ＦＮ活性を測定した
。１８クローン中、ＦｅＩＦＮ力価が高いものを１１ク
ローン選び、０．１μＭ　　ＭＴＸおよび１０％ＦＢＳ
を含むα（−）培地を用いて、６穴プレートに植え継い
だ。

コンフルエントになるまで培養後、培地交換し、３日後
の培養液中のＦｅＩＦＮ活性を測定した。

結果を表−１に示す。

以下余白 表−１ １１クローン中、培養液中のＦｅ１ＦＮ活性が１０万単
位／ｍ１以上の５クローン（クローンＮ００６．９．１
５．１６．１７）を選び、さらに培地中のＭＴＸ濃度を
高め、遺伝子増幅を行なった。

上記の５クローンを、まず０．２μＭ　　ＭＴＸおよび
１０％ＦＢＳを含むα（−）培地に１／４希釈で継代し
、コンフルエントに達した後、０゜５μＭ　　ＭＴＸお
よび１０％ＦＢＳを含むα（−）培地に１／４希釈で継
代した。

同様の方法でＭＴＸ濃度を１μＭ、２μＭと順次高めた
。２μＭ　　ＭＴＸを含む培地でコンフルエントに達し
た後に培地交換し、３日後の培養液中のＦｅＩＦＮ活性
を測定した。結果を表−２に示す。

表−２ ２μＭ　　ＭＴＸ耐性で、４．ｌＸ１０５単位／ｍ１の
Ｆｅ１ＦＮ産生能を有するＣＨＯ細胞が得られた（クロ
ーンｋ１６）。

ＦＮの生産 ２μＭ　　ＭＴＸおよび１０％ＦＢＳを添加したα（−
）培地を含む１５０ｃ＋＃培養フラスコでコンフルエン
トまで培養したＣＨＯ細胞クローンＮα１６を０．６ｇ
マイクロキャリア（商品名：　“サイトデックス３＃、
ファルマシア社製）および１０％ＦＢＳを含むα（−）
培地１８０ｍ１の入った５００ｍ１容のスピナーフラス
コに２Ｘ１０５／ｍｌの細胞濃度になるように加え、全
量を２００ｍ１とした。３７℃、１００　ｒｐａ＋で撹
拌しながら３日間培養し、培養液を回収し、遠心上清の
抗ウィルス活性を測定した。８．３Ｘ１０５単位／ｍｌ
（培養液）のＦｅＩＦＮが生産されていた。

［発明の効果］ 本発明によれば、ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤として
期待されるＦｅＩＦＮを容易に大量生産することができ
る。

［参考文献コ １、　　Ｊ、に、Ｙａｍａｍｏｔｏら：　Ｖｅｔ、　　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ａｎｄＩｍａ＋ｕｎｏｐａｔｈｏ１
．、１１．１−１９．　（１９８Ｂ）２、　Ｇ、Ｌｌｒ
ｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ、、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　　Ｓｃ１．、　７７、　４２１６．　　（
１９８０）３、　　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編：　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　　（１９
８２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　　Ｐ２
Ｏ−９６゜４、　　Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎら：　Ｍｏ
ｔ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２゜１３０４、　　
（１９８２） ５、　　Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ　　：　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、、１６６．５７７゜（１９８３） ６、　　Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎら：　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、、　１３８゜１７９、　　（１９８０
） ７、　　　Ｓ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら　：　　Ｊ、　
　Ｖｉｒｏｌ、、　　３７．　７５５゜（１９８１） ８、　　Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍら：　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
、　５４．５３６．　　＜１９７３）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ネコインターフェロンの蛋白質をコードする
ＤＮＡを含むプラスミドｐＦｅ　Ｉ　ＦＮＩの制限地図
を示す。 第２図は、発現プラスミドｐＦｅＩＦＮ３の作製手順を
示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコインターフェロンの蛋白質をコードするＤＮ
   Ａを組み込んだ発現プラスミドと、ジヒドロ葉酸還元酵
   素遺伝子をコードするＤＮＡを組み込んだ合成プラスミ
   ドにより、動物細胞を形質転換して得られる形質転換体
   。
2. （２）動物細胞がジヒドロ葉酸還元酵素欠損変異を有す
   るＣＨＯ細胞である請求項（１）記載の形質転換体。
3. （３）請求項（１）または（２）の形質転換体をメソト
   レキセートを含む培地により選別して得られる、ネコイ
   ンターフェロンの高生産性形質転換体。
4. （４）請求項（１）〜（３）記載の形質転換体をマイク
   ロキャリア上で培養することを特徴とするネコインター
   フェロン製造法。