JPH0334935A - 抗トリプターゼ抗体及びそれを用いた後天性免疫不全症候群治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗トリプターゼ抗体及びそれを用いた後天性
免疫不全症候群治療剤に関し、更に詳しくはトリプシン
型セリンブ臼テアーゼの１つであるトリブタ−ぜと特異
的に反応する抗トリブタゼ抗体、該抗トリプターゼ抗体
を有効成分とする後天性免疫不全症候群治療剤及びトリ
プターゼからなる後天性免疫不全症候群用ペプチド１ノ
クチンに関する。

［従来の技術］ 後人性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｌｌｌｍ
ｔｌｎ。

ｄｅ４ｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　：　Ａ　Ｉ
　Ｄ　Ｓ　）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ　）
によって引き起こされる重篤な免疫不全症であり、現在
では全世界的に広がりつつありその治療薬あるいはワク
チンの開発が望まれている。

ＡＩＤＳの病因ウィルスである口１■はＲＮＡを遺伝子
として持つレトロウィルスの１種であり、具体的には、
リンパ腺腫患者のリンパ球からヒト免疫不全ウィルス１
型（ロＩＶ−１）が、また西アフリカのＡＩＤＳ患者よ
りヒト免疫不全ウィルス２型（ロＩＶ−２）が単離され
ている［　Ｈｉｒｅｉｄｌｌｅ　ｅｔａｌ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３２６　、６６２（１９８７）ｌ。

口ＩＶは、免疫担当細胞の１種であるヘルパー１細胞に
結合して細胞内へ侵入し、ヘルパーＴ細胞を死滅せしめ
て免疫不全を引き起こづと占えられている。ｌ−１１Ｖ
の感染はＨＩ　Ｖのエンベロープ缶白質であるｇｐ１２
０がヘルパー丁細胞表面の０１〕４抗涼分子に結合する
ことによって開始することも明らかにされている［　Ｄ
ａｌｇｌｅｉｓ　ｅｔ　ａＮａｔｕｒｅ　　３１２．７
６３　（１９８４）　；Ｋｌａｔｚｍａｎｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　　３１２．７６７　（１９８４
）　　：　Ｈｃｌ）ｏｕｏａｌ　ａｔ　ａｌ、、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２３１　。

３８２　（１９８６）１゜このような感染機構の知見か
ら、１．１１）１２０に対する抗体をＨＩ　Ｖ感染抑制
剤として使用するアブ１］−ヂが考えられている［Ｒｏ
ｂｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ８３．７０２３　（１９
８６）］。

史に、ｏｐｉ　２０に対するモノクローナル抗体どｇｌ
）１２０を構成するノ７ミノ酸配列の一部を含む各種の
合成オリゴペプチドとの反応性を倹約したところ、ｇｐ
ｌ　２０のＮ末端から３０８−３３１番［１のアミノ酸
に対応する合成オリゴペプチドとのみ該モノクローナル
抗体が反応したことが報告されている［Ｈａｔｓｕｓｈ
ｉｔａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｖｉｒ。

（３２，２１０７（１９８８）］　　。

逆にｇｐ１２０を構成つるアミノ酸配列の−・部を含む
各種のオリゴペプチドを合成し、それぞれに対する抗体
を作成したところ、ｇｌ−１１２０のＮ末端から３０３
−３２１番目」のアミノ酸に対応する合成オリゴペプチ
ドに幻する抗体が目ＩＶ感染抑制の指標である、合胞体
形成抑制能を有していたことが報告されている［Ｐａ１
ｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８５．１９３２　（１９８
８）］。他方、Ｎ末端から３０３−３２１番目のアミノ
酸に対応づるこの領域は０ｐ１２０とＣＤ４との結合に
関１−ｊ、　している領域ではないことが知られている
［Ｋｏｗａｌｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　
２３７　。

１３５１　（１９８７）　；Ｌａ５ｋｙ　ｅｔ　ａｔ、
、　Ｃｃｌｌ　　５０　９７５（’１９８７）］。従つ
−（、ｇｐ１２０の分子中のＣＤ４と結合すると完えら
れている領域以外の領域に対する抗体でｂｇｐ１２０と
結合づることによって、その立体構造を修飾し、ｇｐ１
２０とＣＤ４との結合を阻害すると考えることも［１丁
能である。しかしながら上述した領域以外の領域、例え
ばｇｆ）１２０のＮ末端から５（Ｌ／ｌ−５１８番１」
の）７ミノ酸に対応１」る合成オリゴペプチドに幻づる
抗体はｇｐ１２０自身との反応ゼ１は４ｊしているもの
の、合胞体形成抑制能は有していなかったことが報告さ
れている［　Ｐａ１ｋｅｒ　ｅｔ　ａｔＰｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｌｌ５Ａ　
　　Ｂｂ、　　　１　９３２（１９８８）１゜ これらの事実から、００１２０分子の中で、例えばＮ末
端から５０４−５１８番目のノノミノ酸に対応づる領域
と、３０３−３２１番目或いは３０８−３３１番１−１
のアミノ酸に対応する領域を比較リ−ると、両省とも立
体構造の−Ｌで抗体にＪ：つて認識され得る部位に位置
しでいながら、後右に対する抗体が（ＪＤ１２０とＣＤ
／Ｉとの結合を阻害したことから、後壱の領域が両名の
結合に深く関すしている可能性が考えられる。この領域
は相変領域と呼ばれ、臨床的に分離されｆｉｌ−１１Ｖ
の間でアミノ酸配列の違いがしばしば見出されている領
域である。

他方、新しいブ１」アアーゼ阻害剤の一つとして、最近
においてラットのＩＩＩ！満細胞からトリプスタヂンが
単離精製されその一次構造が決定されている１Ｋｉｄｏ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　
２６３．１８１０／１−（１９８８）：木戸ら、細胞工
学ヱ、８５１（１９８８）：木戸ら１代謝２５．臨時増
刊号゛′代謝病ハイライト″″１８７　（１９８８）１
゜トリブタヂンは新しいトリプシン型ヒリンプロテアー
ゼの一つである、トリプターゼの特異的な阻害剤である
。トリプリターゼはラットの肥満細胞の顆粒より単離精
製された分子ｆｉｌ　４００００のセリンプ［１テアー
ピであり、分子ｆｆ１３５０００のザ１．１ニツトから
なる４最体である［ＫｉｄｏａＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　２３９．４３６　（１９
８５）；木戸ら１代謝え互、臨時増刊号゛代謝病ハイラ
イト’Ｍ８７．（１９８８）］。

トリプスタヂン及びトリプターゼの生理作用としては、
血液凝固系においてプロトンビンからαトロンビンへの
変換をトリプターゼが触媒し、トリプスタヂンがこの作
用を抑制すること、またこの酵素がアレルギー性炎症像
威立に深く関ちしていることなどが知られているし木戸
ら１代謝２互、臨時増１１１シー）゛代謝病ハイライ１
へ”１８７（１９８８）；木戸ら、細胞工学ヱ、８５１
　（１９８８）コ。しかしながら、トリブスタチン及び
１〜リブターぜがＡＩＤＳの病因ウィルスであるトＩＩ
Ｖに対してどのように作出づるかについては全く知られ
ていない。

［発明が解決しようとする設題］ 本発明の１１的は、ｉ〜リプタ−ぜと特ｖく的に反応す
る抗トリプターゼ抗体を提供づることにある。

本発明の他の目的は、該抗トリプタービ抗体を有効成分
とづるＡＩＤＳ治療剤、及びトリプターゼからなるＡＩ
ＤＳ用ワクチンを１足供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者（よ、１−１１　Ｖ感染の初期段階であるｇｐ
１２０とヘルパーＦ細胞表ｍ１のＣＤ４抗原分子との結
合に深く関与していると考えられる前記Ｑｐ１２０の可
変領域に注目し、その中で比較的良く保存されている配
列としてＧｌｙ−Ｐｒ。

Ｇ　ｌ　ｙ−ＡｒＱ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅという配列を
見出した。Ｉす変領域におけるこの配列がＯｐ”ｌ　２
０とＣＤ４との結合に深く関与していると考えられ、こ
の配列とカ１似の配列を右づる物質はｇｐｌ　２０とＣ
Ｄ４との結合を阻害することが期待される。

本発明者は、そのｊ、うな物質として１〜リプスタチン
に注１］シ、ｌ−１１Ｖ感染抑制の指標である合胞体形
成抑制能について調べた所、トリプスタチンが強い合胞
体形成抑制能をイイしていることを見出し１こ　。

従って１細胞表層には１〜リプスタヂンによって阻害さ
れる１−リプターゼ様の酵素が存在し、この酵素が１−
１１　Ｖの１細胞への感染に深く関与していることが示
唆されたので、トリプターゼに対する抗体もまた同様の
抑制能を有づ−る可能性が考えられた。そこで本発明者
は、トリプターゼを動物に免疫して栂られる抗トリプタ
ーゼ抗体の合胞体形成抑制能について鋭意検討した結果
、抗トリプターゼ抗体が強い合胞体抑制能を為しＡＩＤ
Ｓ治療剤として有効であり、他方トリブターピそのもの
がＡＩＤＳ川のワクチンとして使用し得ることを見出し
本発明を完成した。

即ち、本発明は、 トリブターピと特異的に反応する抗１〜リブタゼ抗体ま
たはその抗原結合部位を含むフラグメン１〜： トリプターゼと特異的に反ゐする抗１〜リプタゼ抗体ま
たはその抗原結合部位を含むフラグメン１〜を有効成分
とするＡＩＤＳ治療剤； 及びトリプターゼからなるＡＩＤＳＪ４４ベプヂドワク
ヂンである。

本発明の抗トリプターゼ抗体は、トリプターゼを動物に
免疫しその血清から得ることが出来る。

ここで用いるトリプターゼはυブユニット約３５゜００
０の四は体からなる分子量約１４．０．０００のトリプ
シン型の新プ［Ｉテアーゼであり、例えば、ヒトの肺肥
満細胞、フッ１への腹腔的肥満細胞などから単離精製す
ることが出来る［Ｋｉｄｏ　ｅｔ　ａＪ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈａｍ、　　２５６．　１１９３９　（１９８１）
　　：　　Ｋｉｄｏ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　へｒｃｈ
、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｐ。

３９．４３６　（’１９８５）］。また実施例１に示す
ようにラットの舌肥満細胞などからも１９ることができ
る。トリプターゼは、例えば舌、腹膜、肺などのホモジ
ネートから、Ｓ−セファ［１−ス、アルギニンセノアロ
ース、アブロチニンセノアロースなどのカラムクロマト
グラフィ等の手段を使用することによっで単離精製する
ことが出来る。ここで言うトリプターゼは特に限定され
ず、いずれの動物から得たものでもよく、またＩ１１換
えＤＮＡ技術を用いて得られるものであってもよい。

トリプターゼを免疫するのに使用される動物はいずれで
もよく、例えばウサギ、マウス、ヒツジ、ウマなどが用
いられる。免疫するに際しては、トリプターゼと７０イ
ン１〜の完全アジュバントとを一定期間の間隔をおいて
複数回皮内投与することによって行なわれる。免疫後、
血清を採取し、例えば硫安分画、Ｄ　Ｅ　ｂ　２カラム
クロマトグラフイーなどによりＩｇＧ分幽を得ることに
より抗トリプターゼ抗体を１ｉｌＩｉ製することができ
る。あるいは、０ エタノール分画法［Ｃｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　
Ａｍ、　ＣｈｅｍＳｏｃ　、旦旦、４５９　（１９４６
）］により血清からガンマグロブリンを含む分画を得、
次いでポリエチレングリ」−ル、エタノールなどで沈澱
することによりＩｑＧ分画を得ることもできる［５ｃｈ
ｕｌｔｚｅ　ｅｔ　ａｌ、、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏａｙ　ｏｆＨｕｍａｎ　Ｐｒ０ｔｅｉｎＳ”、
　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　ＡＩＩｌｓｔｅｒｄａｍ　２．
２５６　（１９６６）］。

本発明の抗１−リブターゼ抗体はモノクローナル抗体で
あってもよく、かかるモノクロ−ナル抗体はケーラーと
ミルシュタインの方法ＩＫｏｈｌｅｒ　ｅｔａｔ、、　
Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４．９５　（１９７５）コとし
て知られる通常の手法にＪ：り調製することが出来る。

即ち、トリプターゼで免疫した動物から肺臓細胞を得、
これとミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得
、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養すること
によってモノクローナル抗体を得ることが出来る。

更に該モノクローナル抗体の抗原性を低下させる為に、
既知の方法によって作威し得る、用変領１ 域がマウスの抗体に由来し定常領域がヒトの抗体に由来
するキメラ抗体を用いることも可能である［Ｓａｈａｇ
ａｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ（ＩＶ　
　１３７　、１０６６　（１９８６）　；　ＮｉｓｈＮ
１５ｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　　生７．９９９　（１９８７）：Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２　、３２３　
（１９８８）〕。

本発明の抗トリプターゼ抗体は、その抗原結合部位を含
むフラグメントであってもよく、例えばペプシンで抗体
を処理して［Ｎ１５ｏｎｏｆｆ　ｅｔ　ａ＾ｒｃｈ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８９．２３０　
（１９６０）　；　ｌ５ｈｉｚｕｋａ　ａｔ　ａｌ、、
　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ（１１２０゜８００　（１９
７８）］、「（ａｂ’）２　フラグメントとして用いる
こともでき、パパインで処理して［Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅ
ｒ、　ＢｉｏｃｈｅＬＩｌｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
７３　。

１１９　（１９！：）９）１、Ｆａｂフラグメントとし
でもよい。

抗トリプターゼ抗体またはそのフラグメントは、１−１
１　Ｖの感染を強く抑制することが、本発明者により明
らかにされた。即ち、ヒト急性リンパ芽球２ 性白血病細胞であるＭ　ＯＬ　Ｔ　−４細胞（ＡＴＣＣ
番号ＣＲＬ−１５８２）と同様の白血病細胞であるＣ　
ＣＲＦ−ＣＥ　Ｍ細胞（ＡＴＣＣ？Ｊｉ号ＣＣＬ−１１
９）に目ＩＶの一種であるＬＡＶ−１［Ｂａｒｒｅ−３
ｉｎｏｕｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２
０　、８６８　（１９８３）１を持続感染しているＯＥ
Ｍ／しＡ　Ｖ−１とを一緒に培養すると１−１１　Ｖの
感染の指標である合胞体が形成され、これに対して抗１
ヘリプターゼ抗体またはそのフラグメントを添加して同
様に培養した場合には合胞体の形成が抑制され、従って
抗トリプターゼ抗体またはそのフラグメントが１」Ｉ　
Ｖの感染を抑制することが確認された。

しかして、本発明の抗トリプターゼ抗体またはそのフラ
グメントはＡＩＩ）Ｓ治療剤として極めて有用である。

抗トリプターゼ抗体またはそのフラグメントは、ＡＩＤ
Ｓ患習に刻して通常、静脈内、筋肉内、皮下などの弁杆
「、１投与により批与することができる。

非杼１］投与用製剤とし″（は、注射剤が挙げられる。

３ 注射剤は、前記したようにして得られるＩＱＧ分画また
はそのフラグメン１〜を、必要に応じて透析または濾過
滅菌等に付し、水性媒体に溶解もしくは分散することに
よって調製することができる。

また純度をより高めるために、トリプターゼを吸着した
アフィニティーカラムを用いて更に精製したＩＱＧ分画
またはそのフラグメントを用いることもできる。注射剤
にはマンニトール、ラクトース、アルブミンなどを適宜
加えることができる。

また通常使用される保存剤、安定化剤、防腐剤、界面活
性剤などを必要に応じて添加することができる。

杭トリプターゼ抗体またはそのフラグメントの投与量は
、患者の年令、体重、症状等によって変動し得るが、通
常、そのＩＯＧまたはそのフラグメントとして、２０〜
２，０００■／に９体重／日、好ましくは５０〜１．０
ＯＯＩｙＪ／ｌ（ｇ体重／日である。

以上に詳述した所から明らかなように、トリプターゼを
動物に免疫することによってｉｎ　ｖ＋ｖｏで４ 抗１〜リブターぜ抗体が産生きれ、この抗トリプターゼ
抗体は１１１Ｖの感染を強く抑制する。かかる事実から
トリゾターゼそのらのをＡＩＤＳ用のペプチドワクチン
として使用し得ることが当業者にとって明らかであろう
。

トリプターゼをヒトＡＩＤＳ患者用のワクチンとして用
いる際には、その抗原性の面からラットなどの動物出来
のトリプターゼを用いるのが望ましい。

トリプターゼのワクチン製剤としては、１〜リプターゼ
そのものを単独で用いでもよく、あるいはアジュバント
を補助剤として添加したものでもよい。かかるアジュバ
ントとしては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アル
ミニウム、リン酸カルシウム、あるいは結核菌の細胞壁
の構成成分であるムラミルジペブヂドの誘導体などが挙
げられる。

ワクチンとしてのトリプターゼ（よ、抗トリゾターゼ抗
体の場合と同様に、通常静脈内、筋肉内、皮ドなどの非
経口投与により投与することが出来る。その投与量は、
トリプターゼとして１回当り５ ０．２〜２０μｇ／体重に９、好ましくは１〜１０μｇ
／体重Ｋｇである。

［発明の効果］ トリプターゼと特異的に反応する抗トリブターぜ抗体は
、ｌ］ｌ　Ｖの感染を強く抑制する作用を有するため、
ＡＩＤＳ治療剤どして極めて有効である。トリプターゼ
は　ｉｎ　ｖｉｖｏで抗トリプターゼ抗体の産生を誘導
し、抗トリプターゼ抗体は口ＩＶの感染を強く抑制する
ことから、トリプターゼはＡＩＤＳ用のワクチンとして
用いることが出来る。

［実施例コ 以下、試験例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

実施例１ 抗トリプターゼ抗体及びそのフラグメントの調製 ■　トリプターゼの調製 Ｋｉｄｏらの方法［Ｋｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｒｃｈ
ｉｖｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　　２３９．４３６　（１９８５）１で調製した
。

　６ ラットの舌に２０（ｆ［の０．１Ｍリン酸カリウム緩！
ｊ液（ｐＨ８，０＞を添加して小モグナイズし、その遠
心上清に酢酸を添加してｐＨを４．５に調整した。生成
した沈澱を除去した上清に硫安を添加して遠心し、沈澱
を５０＋ｎＨ酢酸緩衝液（ｐＨ１４，５）に対して透析
した。これをＳ−セファロース（ファルマシア社製）に
吸着させ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）／ＮａＣ
ｌ　　（０→ＩＭ　＞で溶出した。

活性画分をブルーセファロース（ノアルマシア社製）に
吸着さ吐、２０＋ｎＨ酢酸緩衝液（ｐＨ４，、５）／Ｎ
ａＣｌ　　（０→１Ｍ）で溶出した。活性画分のｐＨを
６．５に調整した後、ＣａＣｌ２を１１０ｌ１１添加し
てアルギニンセファロース（ノアル７シア社製）に吸着
させた。５０　ｍＨＴｒｉｓ、　ＩＩＣｌ　（ｐＨ６，
５）／１０ｍＨＣａＣｌ２／ＮａＣ１（０→１Ｍ）で溶
出した。活性画分を限外濾過器で濃縮した後、液体り［
１マドグラフイー（東洋曽達社製Ｇ３０００ＳＷ）で精
製した。

液体クロマトグラフィーの溶出位置とＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動［Ｌａｅｍｍ７ Ｎａｔｕｒｅ　　２２７．６８０　（１９７０）　］の
泳動パターンから、ラット舌山来のトリプターゼは分子
量約３５０００のサブ１ニツトからなる４量体と考えら
れた。

■、抗トリプターゼ抗体の調製 １、抗トリプターゼ血清のｉ１ｇＪ製 上記の方法で得られたトリプタービ１００μ９（０，１
ｄ）をフロイントの完全アジュバント０゜５成と良く混
合し、０．１５成ずつウサギの４足踏に皮肉注射した。

３週間後にトリブタ−ゼロ。

μ９を同じくフロイントの完全アジュバントと混合し、
同じウサギに同様にして皮肉注射した。さらに３週間後
に１〜リプタ−ゼロ０μ９を同様に周じウサギに皮肉注
射した。最終免疫の４日後に採血して血清を調製した。

２、抗トリプターゼＩ（ＩＩＧの調製 １、で得られたウサギ抗トリブターぜ血清に４倍量のＰ
ＢＳ（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）１０．１８
　ＮａＣｌ　）を添加し、全量と等損の３６％１ａ酸ナ
トリウムを添加し、更に室温で３０分８ 間撹拌した。１２０００Ｘｇ、２０分遠心し、沈澱を少
量の５０ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）１０．１５８
　ＮａＣｌに懸濁した。これをウル１〜［１ゲルＡｃＡ
３４１ＬＫ１３社製）を通過させた。

ＩＱＧが溶出づる画分を集め、１０ｍＨＴｒｉｓ。

１−ＩＣｌ　（ｐ１１８．０＞に対して刈°Ｃで１晩透
析した３゜これをＤＥ５２　（ワットマン社製）に吸着
させ、１０ｍＨＴｒｉｓ、ｌ−ｔ　Ｃｌ　　（Ｄｌ１８
　、　Ｏ）でよく洗い、１０ｍＨＴｒｉｓ、口Ｃｌ　　
（ＤＨ８，０＞／ＮａＣｌ　　（ＯｍＨ→１００ｍＭ）
で溶出しノζ。ＩＣＩＧが溶出する両分を集めて限外濾
過器で濃縮した。この画分にＩＱＧが含まれていること
は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［１ａｅ
ｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｃ　２２７．６８０　（１９７
０）］で確認した。また、抗体の温度は５２７μＳｉ／
Ｉｎ！！、であった。

■、抗トリプターゼＩＱＧの性質 １、オフタロニー法による抗トリプターゼＩｇＧとトリ
プターゼの反応性の確認 ■、２で得られる精製した抗トリプターゼ１０Ｇがトリ
プターゼと反応することはオクタロゴ９ ニー法　［０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、Ｐｒｏｇｒ、　　
へ１ｌｅｒＯＶ、　　Ｖｌ、　　３０（１９６２）］で
確認した。アガロースをＰＢＳに１％（ｗ／Ｖ）になる
ように溶解し、ガラス板の上に注いで固化させた。つぎ
にパンチャーで穴をあけて、抗体と精製したトリブター
ビを分注し、室温で数時間放置したところ、抗トリプタ
ーピＩＣＩＧを入れたウェルと精製トリプターゼをいれ
たウェルの間に沈降線を観察りることができた。

非免疫ウサギの血清から精製したｌｑ（’＋を入れたつ
１ルと精製トリプターゼをいれたウェルの間には沈降線
を観察することができなかった。また、抗トリプターゼ
ＩｇＧはウシ及びラットのすい臓由来のトリプシンとは
反応しなかった。

２８　ウェスタン、プロッティング法による抗トリプタ
ーゼＩＣＩＧとトリブタ−ぜの反応性の確認１．２で得
られる精製した抗トリプターゼＩ（ＩＧがトリプターゼ
と反応することはウェスタン、プロッティング法［Ｔｏ
ｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃ
ａｄｉ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６．４３５０　（１９７９
）］によっても＊ｇした。精製したトリブタ−０ ゼを５ＤＳ−ポリアクリル７ミドゲル電気泳動で分画し
、２５ｍＨＴｒｉｓ、ｔ」Ｃｌ　／　１９２ｎｒｆ４グ
リシン（ｐｔ＋８．３＞／２０％メタノールの組成を有
する緩衝液中で電気泳動的にニトロレルロース膜に１−
ランスファーした。ｒ　Ｂ　Ｓ　（５０ｍ１４　Ｔｒ＋
ｓ、ｌ−Ｉ　Ｃ（ｐＨ８，ｏ）　／　１５０ｍＨＮａＣ
ｌ　）　／１０％「Ｃ８で室温で１晩ブロツキングした
後、「８８７１％８Ｓ八（ウシ血消アルブミン）で希釈
した抗ｌ−リブターゼＩｇＧを室温で５時間結合させた
。

１’Ｂｓ１０．０５％Ｔｗｅｃｎ　２０　テ？　Ｈａ　
テ５分間の洗浄を５回繰り返した後、Ｓ　Ｔ　ＲＡ　１
’　Ａ　Ｇ　Ｅ　Ｎ　ＩＥ社のＰｉｃｏＢｌｕｅ　ＩＩ
Ｉ１ｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎキッｌ−で抗体が結合
した蛋白のバンドを検出した。その結果、抗トリプター
ゼＩｇＧが精製１〜リプターゼと反応することが確認−
ＣきＩこ。また、抗トリプターゼＩｇＧはウシ及びフッ
１〜のづい臓由来の１−リブシンとは反幅しなかった。

ＩＶ　、抗］・リプターゼ抗体からのＦ（ａｂ’＞２の
調製 抗１〜す゛ブターｔｘｏＧをペプシンで分解し−（１ Ｆ　（ａｂ’　）２を調製した［Ｎ１５ｏｎｏｆｆ　ｅ
ｔ　ａＡｒｃｈ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　　８９．　２３０　（１９６０）　；　Ｈａｎ
ｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　　旧ｏｆ、　Ｃｈｃｍ、　　
２３８．２０６（１９６３）］。抗トリプターゼ［ＱＧ
に１／　５０　ｆｆｉ　（７）　ヘｌ　シンヲ加’ｘ、
０．１）１酢１１ｉ緩ｗＩＪｗＪ液（１）１１４．５）
中で３７°Ｃで１８時間消化した。

反応液にＩＮ　Ｎａ０口を滴下してｐｌ＋を８．０に調
整した後、遠心して不溶物を除き、上清に硫酸ナトリウ
ムを終濃度０．１８ｇ／ｄになるように添加して沈澱を
得た。この沈澱を５０ｍＨＴｒ＋Ｓ口ＣＩ　（ＤＩＩ８
．Ｏ＞／１５０ｍＨＮａＣ１に溶解して同じ緩衝液で平
衡化したセノ７デツクスＧ１５０（ファルマシア社製）
を通過させ、Ｆ（ａｂ’）２が溶出する両分を集めた。

この「（ａｂ′　）２が抗トリプターゼＩｇＧと同様に
トリプターゼと反応することがＩ［［−１で示した方法
によって＊認できた。

〈試験例〉 ＋１１　Ｖ感染の抑制試験 １、使用した細胞 ２ ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞、Ｍ　ＯＬ　Ｔ４細胞
（ＡＩＣＣ番号ＣＲＬＣ１５８２）およびＣＣＲＦ　−
Ｃｌ三Ｍ細胞（Ａ　１−　ＣＣ番シ号ＣＣＬ−１１９〉
に１−１１　Ｖの−・種であるＬ　ＡＶ−１［Ｂａｒｒ
ｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ　ａｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ
　２２０．８６８　（１９８３）］を持続感染さぜたＣ
　Ｅ　Ｍ　／　Ｌ　Ａ　Ｖ　−１細胞を使用した。

２、細胞の培養 細胞は１０％ＦＣ３を添加したＲ１）Ｍ１１６４０培地
で３７℃、５％ＣＯ，，、相対湿度９５％の条件で培養
した。

３、合胞体形成の抑制試験 （１）　　方法 合胞体形成の抑制試験はＬｉｆｓｏｎらの方法に準じた
［Ｌｉｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｒ
ｅｄ、　　１６４．２１０１　（１９８６）］。ＭＯＬ
Ｔ−４細ｊ抱の培養液の一部を２００　Ｏｒｐｍで５分
間遠心して細胞を集め、上清を除去（）た後、細胞をＡ
　Ｓ　Ｆ　１０４培地（味の素姓製）で懸濁し、細胞数
が５Ｘ１０’／赦になるように調製した。この細胞懸濁
液に、３ 実施例１の■、２で１９られる抗体濃度５２７μり／−
の抗トリプターゼＩＱＧを各種の倍率で希釈して得た種
々の濃度の抗トリプターゼＩＯＧ、あるいは抗トリプタ
ーゼＩＱＧのＦ（ａｂ’＞２を添加して細胞濃度が１×
１０５／ウエルになる上うに９６ウエルのマイクロタイ
タープレートに分注し、３７°Ｃで３０分放置した。抗
体はあらかじめＡＳＦ１０４培地（味の素姓製）で希釈
した後、同培地に対して４℃で１晩透析しておいた。こ
れにＯＥＭ／ＬＡＶ−１細１１１（Ｉｌｌｌｔｌ１度１
×１０７／ｄ）を２μｌ添加して良く混合して３７℃、
５％ＣＯ２で１２時間培養し、倒立顕微鏡で各ウェルを
２００侶で観察した。合胞体形成が６０％より多く阻害
される場合を４−＋、３０％より多く且つ６０％以下阻
害される場合を＋、３０％以下阻害される場合を士、全
く阻害されない場合を−として合胞体形成抑制能を評価
した。

（２）結果 合胞体形成抑制能の評価結果を下の表に示した。

４ 抗トリプタ ゼ１ｇＧの合胞体形成抑制能 上記の如く抗トリプターゼＩｏＧは濃度に依存して合胞
体形成を抑制した。抗１〜リプター１！ＩＱＧのＦ（ａ
ｂ’）２を添加した場合にも同程度の合胞体形成の抑制
が見られた。しかし、非免疫ウサギの血清から精製した
ＩＱＧで１よ合胞体形成の抑制が見られなかった。

実施例２　抗１〜リプターピ抗体の注射剤１　アフィニ
ティーカラムの作成 活性化Ｃｌ−１−ｔファロ−ス４Ｂ（ファルマシア社製
）１りに１ｍＨＩ−ＩＣＩを添加して膨潤させ、洗浄し
た。精製したトリプターゼ２００μｑ（０，１）Ｉ　Ｎ
ａＨＣＯ３（ｐＨ８，Ｏ＞溶液〉を添加して、膨潤させ
たゲルと混合し、室温でＩＩＺｔ間混合した。、５０ｎ
＋ＨＴｒｉｓ、１−ＩＣＩ　　（ｐＨ８，Ｏ）　１０．
５ＨＮａＣ１でゲルを洗浄した後５０ｍＨ酎酸耐 一＋−ｔ−！Ｊウム（ｐＨ４，０）１０．５８　ＮａＣ
ｌで洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。

２、アフィニティーカラムを用いた抗トリプターゼＩｏ
Ｇの精製 １　で作成したアフィニティーカラムに実施例１のＩＩ
、２と同様にして調製した抗トリブターぜＩＱＧを含む
溶液を通過させて洗浄した後、０．１Ｈリン酸緩衝溶液
（ｐＨｉｏ、８）でカラムに結合した抗トリプターゼＩ
ＱＧを溶出した。この溶液のｐｔ＋をただちに７．５に
調整した後、限外濾過器で１１１ｉ！シて透析し、凍結
乾燥して１６％水溶液を調製した。

このようにして精製した抗１ヘリブターゼＩｑＧの合胞
体形成抑制能を、試験例に示した方法で検吋したところ
、活性が見られた。

３、抗トリプターゼ抗体の注射剤の作成２、でｔｆ’ｉ
製しに抗１〜リプター１２１ｇＧを公知の注射剤の製造
法に従い、グリシンを安定化剤とし、メチルチオレート
を防腐剤として添加して、注射剤を作成した。

６ 投与量はＩｏＧ又はそのフラグメントとして２０〜２０
００■／に９体重／日、好ましくは５０〜１０００＃Ｉ
ｇ／ｌ（ｇ体重／口を筋肉性ｇ）ｌする。

実施例３　抗ＡＩＤＳワクヂンの製剤の作成実施例１の
■、と同様にして精製したラットトリプターゼを水に対
して透析し、凍結乾燥してＡＩＤＳワクチンを得た。

本則は使用時に生理食塩水で溶解して皮下往側する。投
与量はトリプターゼとして、１回当たり０．２〜２０μ
ｆｊ／に９体重、好ましくは１〜１０μ’ｊ／に９体重
である。

この溶液を実施例１の■、１に示した方法でウサギに投
与し、実施例１の１．２に示した方法で検討したところ
、抗体の産生をＮ１認できた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）トリプターゼと特異的に反応する抗トリプターゼ
   抗体またはその抗原結合部位を含むフラグメント。
2. （２）トリプターゼと特異的に反応する抗トリプターゼ
   抗体またはその抗原結合部位を含むフラグメントを有効
   成分とする後天性免疫不全症候群治療剤。
3. （３）トリプターゼからなる後天性免疫不全症候群用ペ
   プチドワクチン。