JPH03175983A - ヒトトリプターゼ様蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、と］〜丁細胞から得ることのできる新規ヒト
トリプターゼ様蛋白、該ヒトトリプターゼ様蛋白と特異
的に反応する抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体、該抗ヒト
トリプターゼ様蛋白抗体を有効成分とする後天性免疫不
全症候群治療剤及び該ヒトトリプターゼ様蛋白からなる
後天性免疫不全症候群用ワクチンに関する。

［従来の技術］ 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウ
ィルス（口Ｉ■）によって引き起こされる重篤な免疫不
全症であり、現在では全世界的に広がりつつありその治
療薬あるいはワクチンの開発が望まれている。

ＨｔＶは、免疫担当細胞の１種であるヘルパーＴ細胞に
結合してＩｌ！胞内へ侵入し、ヘルパーＴ細胞を死滅せ
しめて免疫不全を引き起こすと考えられている。口ＩＶ
の感染はＨＴ　Ｖのエンベロープ蛋白質であるｇｐ１２
０がヘルパーＴ細胞表面のＣＤ４抗原分子に結合するこ
とによって開始することも明らかにされている［Ｏａｌ
ｇｌｅｉｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　　３１２．７６３　（１９８４）：Ｋｌ
ａｔｚｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　３
１２．７６７　（１９８４）　：　ＨｃＤｏｕｇａｌ　
ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　　２３１．３８２　
（１９８６）］。

このような感染機構の知見から、ｇｐ１２０蛋白に対す
る抗体あるいはａｐ１２０１白と相同性の高いアミノ酸
配列を有するペプチドを）−１１Ｖ感染抑ｉ！Ｉｌｌ剤
として使用するアプローチが試みられている。

このようなアプローチの１つとして、ラットのＩＩＩ！
！満細胞から単離されたＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼイ
ンヒビターであるトリブスタチンがｏｐ１２０の可変領
域におけるアミノ酸配列の一部と高い相同性を有するこ
とから、トリブスタチンを口ＩＶの感染抑制剤として使
用し得ることが本発明者等によって明らかにされている
し特許願平底１−２５７９　：　Ｆ［ＢＳ　ＬＥＴＴＥ
Ｒ３，Ｖｏｌ、　２４８、Ｎｏ、１．２、ρ４８−５２
　（１９８９）］。

また、トリブスタチンによって阻害されるセリンプロテ
アーゼであるラットの舌肥満細胞から得られたトリブタ
ーゼに対する家兎の抗体が、口Ｉｖに感受性を持つヒト
培養子細胞に対する口ＴＶの感染を阻害することも本発
明者等により既に明かにされている［特許願平成１−６
９８５；ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ３，Ｖｏｌ、　２４８
　、Ｎｏ、　１．２、ｐ、４８−５２　（１９８９）］
。

これらの事実は口■■感受性のヒトＴ細胞上にトリブス
タチン及び杭トリブターゼ抗体により阻害されるＨＩＶ
ｒｓ染に関与するトリブターゼ様の蛋白が存在し得るこ
とを示唆していると考えることもできる。しかしながら
これまでロＩＶ感受性ヒトＴｉｔ胞由来のこの様な蛋白
の単離精製に関する報告は全く無い。

［本発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、ヒトＴｉｎに存在する新規なヒトトリ
プターゼ様蛋白を提供する事にある。

本発明の他の目的は、ヒトＴ細胞に存在する該ヒトトリ
プターゼ様蛋白と特異的に反応する抗ヒトトリプターゼ
様蛋白抗体を提供する事にある。

本発明の更に他の目的は、該抗ヒトトリプターゼ様蛋白
抗体を有効成分とするＡＩＤＳ治療剤、及びヒトトリプ
ターゼ様蛋白からなるＡＩＤＳ用ワクチンを提供する事
にある。

［課題を解決する為の手段］ 本発明者はヒトＴ細胞表面にトリブターゼ様蛋白が存在
しこの蛋白がＨｒＶ感染のレセプターとして重要な役割
を果たしていると考え研究を展開し本発明を完成するに
至った。

即ち、本発明者は抗ラツトトリプターゼ抗体と反応する
トリプターゼ様蛋白をヒト由来培養Ｔｌｌ胞から分離す
ることを試みた所、ヒト急性リンパ芽球性白血病由来の
株化培養細胞、ＭＯ１ｔ４ＩＩｌ胞より新規トリブター
ゼ様蛋白を単離精製することに成功し、この蛋白に対す
る抗体が日ＩＶ感染を強く阻害することを見出し本発明
を完成した。

本発明は、 抗うットトリブターゼ抗体と反応し、ヒトＴ細胞から得
ることのできる、約３５±３　ＫＤａのサブユニット２
個と約３０±２　ＫＤａのサブユニット４個よりなるヒ
トトリプターゼ様蛋白； 該ヒトトリプターゼ様蛋白と特異的に反応する抗ヒトト
リプターゼ様蛋白抗体またはその抗原結合部位を含むフ
ラグメント； 該抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体またはその抗原結合部
位を含むフラグメントを有効成分とする後天性免疫不全
症候群′ｌｆＩ療剤；及び該ヒトトリプターゼ様蛋白か
らなる後天性免疫不全症候群用ワクチンである。

本発明のヒトトリプターゼ様蛋白は、ヒトＴ細胞上 ができる。

ヒトＴ細胞上− 性白血病細胞由来の株化培養１［１１１ａ、　ＭＯ１ｔ
４［ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８２１を用いることがで
きる。この培養細胞をホモゲナイズし遠心して上澄を得
て抽出液とする。この抽出液を酸処理後、ポリエチレン
グリコールを添加して沈澱画分を取得し、これを以後の
クロマトグラフィーによる精製用試料とする。

得られた試料を、ＤＥＡＥ−３ＳＷカラムなどのイオン
交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに付し
、トリプシン活性測定用発色基質、例えばＢｏｃ−Ｇ　
ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＡｒＯ−ＭＣＡに対して活性を示
し、かつ抗うットトリブターゼ抗体と反応する両分を集
める。更に、ハイドロキシアパタイトカラム次いでゲル
濾過カラムを用いたクロマトグラフィーに付して同様に
して活性画分を集めることによって本発明のヒトトリプ
ターゼ様蛋白を単離精製することができる。

本発明のヒトトリプターゼ様蛋白は以下に示す特性を有
する。

（ｉ）　　分子量 ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより算定される分
子量は約１９８ＫＤａである。

（ｉｉ）　　構成 １％アガロースゲル電気泳動に付すと単一バンドが現わ
れる。還元条件下での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動では約３５±３　ＫＤａと約３０±２にＤａの
位置にバンドが現われ、これらのバンドの銀染色による
強度は１：２の比率である。

これらの事実及び分子量が約１９８　ＫＯａであること
から、本発明のヒトトリプターゼ様蛋白は約３５±３　
ＫＤａのサブユニット２個と約３０±２　ＫＤａのサブ
ユニット４個よりなる複合体であることが分かる。

（ｉ＋ｉ）抗体との反応性 ラットの舌肥満細胞から得られるトリプターゼに対する
抗体と反応する。但し、約３５±３　ＫＯａのサブユニ
ットのみがこの抗体と反応し、約３０±２にＤａのサブ
ユニットは反応しない。これらの事実から本発明の蛋白
はトリブターゼ様の蛋白であることが分かる。

（ｉｖ）　　酵素活性 トリプシン様活性の測定基質である３ｏｃ−Ｇ　ｌ　ｎ
−Ｇ　Ｉ　Ｖ−ＡｒＱ−ＭＧＡ及びキモトリプシン様活
性の測定基質である３ｕｃ−１ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ
−Ｔｙｒ−ＭＣＡとよく反応する。

従って本発明のヒトトリプターゼ様蛋白はトリプシン様
活性とキモトリプシン様活性とを合わせ持つことが分か
る。

本発明゛のヒトトリプターゼ様蛋白のトリプシン様活性
は、トリプスタチン、ロイペプチン、アンチパイン及び
キモスタチンにより阻害される。しかし、その他のシス
ティンプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、金属プロテ
アーゼ、及び酸性プロテアーゼ等の酵素に対する阻害剤
によっては殆ど影響を受けない。従って本発明のヒトト
リプターゼ様蛋白はセリンプロテアーゼの一種であると
考えられる。

（ｖｌ　　至適ｐＨ 本発明のヒトトリプターゼ様蛋白はｐＨ８，５において
最も高いトリプシン様活性及びキモトリプシン様活性を
示す。

（ｖｉ）　　安定性 ２５１１１８ギ酸アンモニウム＜１１１１５．５）１５
０％グリセロール溶液の状態で一２０℃で一ヶ月保存す
ると活性が約１／４に減少する。室温では１時間以内に
活性は完全に失なわれる。

（Ｖｉｉ）　　抗体産生 本発明のヒトトリプターゼ様蛋白を動物に注射すること
によって抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体の産生が誘導さ
れ、この抗体は以下に述べるように、口１■感染抑制の
指標である合胞体形成抑制能を有する。

以上に詳述した如く、ヒトＴ細胞から得ることのできる
本発明のヒトトリプターゼ様蛋白は種々の特徴的特性を
有する新しいタイプの蛋白である。

本発明のヒトトリプターゼＩ蛋白は、上記の如＜１−１
１ＶＩ染抑制能を有する抗ヒトトリブタービ様蛋白抗体
の産生を誘導することができる。この抗ヒトトリプター
ゼ様蛋白抗体は）ＩＩＶ感染抑制能を有することからＡ
ＩＤＳ治療剤として用いることができる。

本発明の抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体は、ヒトトリプ
ターゼ様蛋白を動物に免疫しその血清から得ることが出
来る。ヒトトリプターゼ様蛋白の約３５±３にＤａのサ
ブユニットまたは約３０±２ＫＤａのサブユニットを用
いても本発明の抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体を得るこ
とが出来る。

ヒトトリプターゼ様蛋白を免疫するのに使用される動物
はいずれでもよく、例えばウサギ、マウス、ヒツジ、ウ
マなどが用いられる。免疫するに際しては、例えばヒト
トリプターゼ様蛋白とフロイントの完全アジュバントと
を混合し、該混合物を一定明間の間隔をおいて複数回皮
肉投与することによって行なわれる。免疫後、血清を採
取し、例えば硫安分画、ＤＥ５２カラムクロマトグラフ
ィーなどによりＩｇＧ分画を得ることにより抗ヒトトリ
プターゼ様蛋白抗体を調製することができる。あるいは
、エタノール分画法［Ｃｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、　　Ａｓ、　　Ｃｈｅｔ　　Ｓｏｃ、　　６８．　
４　５９　　（１９４６）　　］により血清からガンマ
グロブリンを含む分画を得、次いでポリエチレングリコ
ール、エタノールなどで沈澱することによりＩａＧ分画
を得ることもできる［　５ｃｈｕｌｔｚｅ　ｅｔ　ａｔ
、、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒＨ
ｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”　、　　Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ、　　Ａｍ５ｔｅｒｄａａ＋　　２　、　２５６　　
（１９６６）］。

本発明の抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体はモノクローナ
ル抗体であってもよく、かかるモノクローナル抗体はケ
ーラーとミルシュタインの方法［Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　
ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５　（１９７５
〉］として知られる通常の手法により調製することが出
来る。即ち、ヒトトリプターゼ様蛋白で免疫した動物か
ら牌臓細胞を得、これとミエローマ細胞とを融合してハ
イブリドーマを得、１ｎｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ
で培養することによってモノクローナル抗体を得ること
が出来る。

更に該モノクローナル抗体の抗原性を低下させる為に、
既知の方法によって作成し得る、可変領域がマウスの抗
体に由来し定常領域がヒトの抗体に由来するキメラ抗体
を用いることも可能である［Ｓａｈａｇａｎ　ｅｔ　ａ
ｔ、　Ｊ、　ｔｌｌｕｎｏｌＯｇｙ　　１３７　、１０
６６　（１９８６）　：ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　ａｔ　ａ
ｔ、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　　４７．９９
９　（１９８７）　：Ｒｉｅｃｈｓａｎｎ　ｅｔ　ａｌ
、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２　、３２３　（１９８８）］
　。

本発明の抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体は、その抗原結
合部位を含むフラグメントであってもよく、例えばペプ
シンで抗体を５１！ｌ理して［Ｎ１５ｏｎｏｆｆｅｔ　
ａｌ、、＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　　８９、　２３０　（１９６０）　　：　ｌ５ｈｉ
ｚｕｋａ　ｅｔ　ａｔＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ（ＩＶ　
１２０．８００　（１９７８）　］、Ｆ（ａｂ’＞２７
ラグメントとして用いることもでき、パパインで処理し
て［Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅｒ。

Ｂｉｏｃｈｅｉｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　７３　、　
１１９　　＜　１９５９）］、Ｆａｂフラグメントとし
てもよい。

抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体またはそのフラグメント
は、ＨＩＶの感染を強く抑制することが、本発明者によ
り明らかにされた。即ち、ヒト急性リンパ芽球性白血病
細胞であるＭＯＬＴ−４細胞＜ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１
５８２）と、同様の白血病ｍ胞であるＣＣＲＦ−０５Ｍ
細胞（ＡＴＣＣ番＠ＣＣＬ−１１９）ｋＨＩＶ（Ｆ）一
種テアルＬ　Ａ　Ｖ　−１［８ａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓ
ｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２２０．８６８
　（１９８３）］を持続感染しているＯＥＭ／ＬＡＶ−
１とを一緒に培養すると口ＩＶの感染の指標である合胞
体が形成される。

これに対して抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体またはその
フラグメントを添加して同様に培養した場合には合胞体
の形成が抑ｔ＋１され、従って抗ヒトトリプターゼ様蛋
白抗体またはそのフラグメントがＨＩ　Ｖの感染を抑制
することが確認された。

しかして、本発明の抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体また
はそのフラグメントはＡＩＤＳ治療剤として極めて有用
である。

抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体またはそのフラグメント
は、ＡＩＤＳ患者に対して通常、静脈内、筋肉内、皮下
あるいは経鼻などの非経口投与により投与することがで
きる。非経口投与用製剤としては、注射剤が挙げられる
。注射剤は、前記したようにして得られるＩａＧ分画ま
たはそのフラグメントを、必要に応じて透析または濾過
滅菌等に付し、水性媒体に溶解もしくは分散することに
よって調製することができる。また純度をより高めるた
めに、ヒトトリプターゼ様蛋白を吸着したアフイニテイ
ー力ラムを用いて更に精製したＩＯＧ分画またはそのフ
ラグメントを用いることもできる。注射剤にはマンニト
ール、ラクトース、アルブミンなどを適宜加えることが
できる。また通常使用される保存剤、安定化剤、防腐剤
、界面活性剤などを必要に応じて添加することができる
。

抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体またはそのフラグメント
の投与量は、患者の年令、体重、症状等によって変動し
得るが、通常、そのＩｏＧまたはそのフラグメントとし
て、２０〜２，０００！Ｒｇ／　Ｋｆ１体重７日、好ま
しくは５０〜１．０００Ｒｇ／Ｋｇ体重７日である。

以上に詳述した所から明らかなように、ヒトトリプター
ゼ様蛋白を動物に免疫することによってｉｎ　ｖｉｖｏ
で抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体が産生きれ、この抗ヒ
トトリプターゼ様蛋白抗体はＨＩＶの感染を強く抑制す
る。かかる事実からヒトトリプターゼ様蛋白そのものを
ＡＩＤＳ用のペプチドワクチンとして使用し得ることが
当業者にとって明らかであろう。

ヒトトリプターゼ様蛋白のワクチン製剤としてｔよ、ヒ
ト１〜リブターゼ様蛋白または、該蛋白を公知の方法に
よって変性あるいは修飾したものを単独で用いてもよく
、あるいは更にアジュバントを補助剤として添加したも
のでもよい。かかるアジュバントとしては、例えば水酸
化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウ
ム、あるいは結核菌の細胞壁の構成成分であるムラミル
ジベプヂドの講導体などが挙げられる。

ワクチンとしてのヒトトリプターゼ様蛋白は、抗ヒトト
リプターゼ様蛋白抗体の場合と同様に、通常静脈内、筋
肉内、皮下あるいは皮肉な′どの非経口投与により投与
することが出来る。その投与量は、ヒトトリプターゼ様
蛋白として１回当り０．２〜２０μｇ／体重Ｋｇ、好ま
しくは１〜１０μｇ／体重Ｋｇである。

［発明の効果］ ヒトＴ細胞から、抗ラツトトリプターゼ抗体と反応する
新規なヒトトリプターゼ様蛋白を単離することができる
。

このヒトトリプターゼ様蛋白と特異的に反応する抗ヒト
トリプターゼ様蛋白抗体は、）ＩＩＶの感染を強く抑制
する作用を有するため、ＡＩＤＳ治療剤として極めて有
効である。ヒトトリプターゼ様蛋白はｉｎ　ｖｉｖｏで
抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体の産生を誘導し、抗ヒト
トリプターゼ様蛋白抗体は口ＩＶの感染を強く抑制する
ことから、ヒトトリプターゼ様蛋白はＡＩＤＳ用のワク
チンとしで用いることが出来る。

［実施例１ 以下、試験例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

実施例１ ヒトトリプターゼ様蛋白のＱＩＩＩＩｔ精製及びその性 １　ヒトリンパ芽球性白血病由来の株化培養細胞、Ｈｏ
１ｔ４細胞の培養と該ａｍからの抽出ヒトリンパ芽球性
白血病由来培養細胞株、Ｍｏ１ｔ４を、ＲＰＭ１１６４
０培地（ＧＩＢＣＯ社製）２５１にて１０６細胞／Ｉｄ
まで培養し、遠心（７５０ｇ、１０分）により湿重量的
１８ｇの細胞を得た。これに２０１Ｈトリス塩酸緩衝液
（１）ｔｌ７．０）９０１１を加えホモゲナイズし遠心
（２０，０００９，１５分〉により上澄を取得した。こ
の抽出操作を２回繰り返し、上澄を合わせ抽出液とした
。

この抽出液を酢酸でｐＨ５，５に合わせた後、１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐｔ１５．５＞を最終濃度５０ｇＨになる
ように加えて、生じた沈殿を遠心（２０，０００ｇ、１
５分）により除去し、その上澄にポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ−６０００＞を最終Ｓ度２％になるように加
え水中で３０分間放置した。生じた沈澱を遠心（２０，
０００９，１０分）除去後、上澄に更にＰＥＧ−６００
０を１０％になるように加え水中で３０分間撹拌後、遠
心（２ｏ、ｏｏｏｇ、１５分〉により沈澱を集めた。上
澄をきれいに取り除いた後、沈澱を２５ＩＨトリス塩酸
！！衝液（ｐＨ６，５）小容量に溶解しクロマトグラフ
ィーによる精製用試料とした。

２　クロマトグラフィーによるｔｌ［ １で得られた試料をイオン交換カラム、ＤＥＡＥ３ＳＷ
を用いた高速液体クロマトグラフィー（）−ＩＰＬｃニ
ア、５順×７．５律〉により分画した。溶出法はトリス
塩酸緩衝液の２５１１８から１Ｍの濃度勾配により、１
　ｄ／ｌ１ｌｉｎ　／１ｌｌｂｅにて溶出した。トリプ
シン活性測定用発色基質、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒａ−ＭＣＡに対して活性を示し、かつ抗うット舌肥満
細胞トリブターゼ抗体［ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ３，Ｖ
ｏｌ、　　２４８　、　Ｎｏ、　１２、ρ、４８−５２
　（１９８９）］と反応する両分を集め、限外′ａ過膜
、ＹＭ−１０（アミコン社製〉にて小容量に濃縮した。

次ぎにこの濃縮液をハイドロキシアパタイトカラム（Ｈ
ＣＡ−カラムＡ−７６１０，７，６ｍＸ　１０α）によ
り分画した。溶出液は燐□カリウム緩衝液（ｐｌ＋６．
７）の１０ｍＭから０．８Ｍまでの濃度勾配で１ｄ／ｉ
＋ｎ／　ｔｕｂｅの溶出条件により行い、Ｂｏｃ−Ｇ　
ｌ　ｎＧ　Ｉ　Ｖ−ＡｒＱ−ＭＣＡに対し活性を示す画
分を集め限外濾過により小容量に濃縮した。更にこの濃
縮液を口ＰＬＣのゲル濾過カラムＧ３０００ＳＷ（トー
ソー社製、７．５αｗＸ６０ａ＋、２本）にて、展開液
として２５ｍＨギ酸アンモニウム（ｐＨ５，５）／ＩＭ
尿素を用い０．４５ｍ／ｉｉｎ　／１ｕｂｅで分画し、
紫外部（２８０ｎｍ）吸収の山と−致しＴＢｏｃ−Ｇ　
ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＡｒＱ−ＭＣＡで活性を示しかつ
抗うット舌肥満細胞トリプターゼ抗体と反応する画分を
集めて限外濾過により小容量に濃縮した。この試料は１
％アガロースゲル電気泳肋で単一バンドが（第１図参照
）、又、還元条件での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動では約３５±３　ＫＤａと約３０±２　ＫＤａ
の２本のバンドが泳動後の銀染色により認められた（第
２図参照）。蛋白染色の強度からサブユニット約３５±
３　Ｋ［ｌａと約３０±２　ＫＤａは１：２の比率で存
在することが分かった。一方、前述したゲル濾過カラム
クロマトグラフィーの溶出パターンからヒトトリプター
ゼ様蛋白の分子量は約１９８　ＫＤａと推定された。従
って該ヒトトリプターゼ様蛋白は約３５±３　ＫＤａの
サブユニット２個と約３０±２ＫＤａのサブユニット４
個よりなる複合体であることが分かった。サブユニット
の内、抗うット舌肥＊１［１胞トリブタ一ゼ抗体と反応
するのは約３５±３　ＫＤａのサブユニットのみで、約
３０±２　ＫＤａのサブユニットは反応しなかった。即
ち、５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し
たトリブターゼ様蛋白をメンブレンフィルターに転写し
、抗うットトリブターゼ抗体と反応させてウェスタン分
析を実施した所、約３５±３ＫＤａのサブユニットだけ
が該抗体と反応した（第２図参照）。

３　酵素活性の測定と活性に及ぼす添加物の影響精製途
中の、及び精製したヒトトリプターゼ様蛋白の酵素活性
の測定は、通常２５ｍＨ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ
トリス塩酸！ｔｌｉ液（ｐＨ７，８）に酵素試料を加え
、分解されることによって螢光を発する合成基質を最終
１１度１００μＭとなるように加えて撹拌し励起波長３
８０ｎｍを用い４６０ｎｉ＋の蛍光強度を経時的に測定
することにより行った。阻害剤の酵素活性に対する影響
は、１０μＭの阻害剤を上記反応液に加えることにより
検討した。

酸素活性、即ちヒトトリプターゼ様蛋白の基質特異性に
ついての測定結果は第１表に示した通りである。

第１１ 基質特異性 （３ｏｃ： ＭＣＡ： Ｓｕｅ　： Ｇｌｔ： Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル ４−メチルクマリル−７−アミド スクシニル グルタリル 第１表から明らかなように、基質としては、トリプシン
様活性に対しては第）ｌａ因子の基質として開発された
３０Ｃ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　￥−Ａｒ（Ｊ　−ＭＣＡ
　（ペプチド研究新製〉が調べた内で最も良い基質であ
ることがわかった。一方キモトリブシン様活性の基質と
してはＳｕ　Ｃ−Ｌ　６ｕ−Ｌ　ｅＵ−Ｖａ　ｌ−Ｔ’
ｙｒ−ＭＣＡ　（ペプチド研究新製）が最も良い基質で
あった。

このため、酵素活性のｐｔ１依存性の検討にはこれらを
基質として使用した。酵素活性のｐｌ＋依存性の検討は
、緩衝液としてｐＨ６，５からｐＨ９，５までｐｔ＋を
変えて調製したＯ、１Ｍトリス塩酸緩衝液を用いて行っ
た。至適ｐＨはトリプシン様活性もキモトリプシン様活
性も共にＤＨ８，５であった（第３図参照）。

ＢＯＣ−Ｇｌｎ−ＧＩＶ−ＡｒＱ−ＭＣＡを基質として
用いて検討した、ヒトトリプターゼ様蛋白のトリプシン
様活性に対する阻害剤の影響は第２表に示した通りであ
る。

阻害剤 第２表　阻害剤の影響 活性（μＵ／ｄ） 阻害（％） トリブスタチン ロイペプチン アンチパイン ８４３、１ ６７．４ １１０．９ ４４ Ａ４−インヒビター アプロチニン α１−アンチトリプシン ６８２．９ ６２１．３ ６８７、８ ベンズアミジン キモスタチン ８Ｂ！ （ボウマン−バ フィンヒビター） ８１７．８ ４４３．８ ６６５．６ α１−アンチキモトリプシン エラスタチナール アマスタチン ペプスタチン ベスタチン −６４０ ボスホラミドン ８４５．１ ７１０．０ ７６７．２ ８４５．０ ４３０ ７５４．４ ８２０．９ 第２表から明らかなように、ヒトトリプターゼ様蛋白の
トリプシン様活性は、トリブスタチン、ロイペプチン、
アンチパイン、各１０μＭにより強く阻害を受けたが、
その他のトリプシン型蛋白分解酵素阻害剤ではそれほど
強い阻害は受けなかった。キモトリプシン型蛋白分ｗｉ
ｗ＃素阻害剤のキモスタチンによってもトリプシン様活
性は阻害された。一方、その他のシスティンプロテアー
ゼ、アミノペプチダーゼ、金属プロテアーゼ、及び酸性
プロテアーゼ等に対する阻害剤によっては殆ど阻害を受
けなかった。

ヒトトリプターゼ様蛋白の安定性について検討した所、
２５１１８ギ酸アンモニウム（ＤＨ５，５１５０％グリ
セロール溶液の状態で一２０℃で一ケ月保存すると活性
が約１／４に減少し、室温では１時間以内に活性は完全
に失なわれることが分かった。

実施例２ 抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体の作成 １　抗ヒトトリプターゼ様蛋白血清の３１製実施例１の
方法で得られたヒトトリプターゼ様蛋白１００μ９　（
０，１ｍ＞をフロイントの完全アジュバントＯ，！Ｍと
良く混合し、０．１５ｄずつウサギの４足蹟に皮肉注射
した。３週間後にヒトトリプターゼ様蛋白６０μグを同
じく７０インドの完全アジュバントと混合し、同じウサ
ギに同様にして皮肉注射した。さらに３週間後にヒトト
リプターゼ様蛋白６０μ９を同様に同じウサギに皮肉注
射した。最終免疫の４日後に採血して血清を調製した。

２　抗ヒトトリプターゼ様蛋白１ｏＧの調製１で得られ
たウサギ抗ヒトトリプターゼ様催白血清に４倍Ｗｋ（Ｄ
Ｐ１３Ｓ　＜’）＞Ｍ＊衝液（ｐＨ７，２）１０．１８
塩化ナトリウム）を添加し、全量と等量の３６％′Ｉａ
酸ナトリウムを添加し、更に室温で３０分間撹拌した。

１２０００Ｘ９．２０分遠心し、沈澱を少量の５０１リ
ン酸緩衝液（＋）１１７．６）１０．１５８塩化ナトリ
ウムに懸濁した。これをウルトロゲルＡｃＡ３４　（Ｌ
Ｋ８社製〉を通過させた。ＩａＧが溶出する画分を集め
、１０ｉＨトリス塩酸緩衝液（１）Ｈ８，Ｏ）に対して
４℃で１晩透析した。これをＤＥ５２　（ワットマン社
製）に吸着させ、１０１１Ｈ１−リス塩酸！１Ｉｌｉｉ
液（＋）ｌ＋８．０）でよく洗い、１０１１［−リス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）／塩化ナナトリウム０１→１０
０ｍＭ）で溶出した。

ＩａＧが溶出する画分を集めて限外濾過器で濃縮した。

この両分にＩａＧが含まれていることは、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉ、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　２　２　７．　６８０　　（１９７０）
　　］で確認した。

（３）　　抗ヒトトリプターゼ様蛋白ＩｇＧの性質（１
）　　オフタロニー法による抗ヒトトリプターゼ様蛋白
ＩｇＧとヒトトリプターゼ様蛋白の反応性の確認 （２）で得られる精製した抗ヒトトリプターゼ様蛋白Ｉ
ＱＧがヒトトリプターゼ様蛋白と反応することはオフタ
ロニー法［０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、　Ｐｒｏｇｒ。

Ａｌｌｅｒｇｙ、　Ｖｌ、　　３０　（１９６２）　］
で確認した。

アガロースをＰＢＳに１％（Ｗ／Ｖ）になるように溶解
し、ガラス板の上に注いで固化させた。つぎにパンチャ
ーで穴をあけて、抗体と精製したヒトトリプターゼ様蛋
白を分注し、室温で数時間放置したところ、抗ヒトトリ
プターゼ様蛋白１ａＧを入れたウェルと精製ヒトトリプ
ターゼ様蛋白をいれたウェルの間に沈降線を観察するこ
とができた。

非免疫ウサギの血清から精製したＩＧＧを入れたウェル
と精製ヒトトリプターゼ様蛋白をいれたウェルの間には
沈降線を観察することができなかった。

（Ｄ　ウェスタン、プロッティング法による抗ヒトトリ
プターゼ様蛋白ＩＱＧとヒトトリプターゼ様蛋白の反応
性の確認 ２で得られるＦ＃製した抗ヒトトリプターゼ様蛋白１ａ
Ｇがヒトトリプターゼ様蛋白と反応することは「クエス
タン、プロッティング法［Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔａｌ、、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕ
ｓＡ　７６．４３５０　（１９７９）１によっても確認
した。精製したヒトトリプターゼ様蛋白を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分画し、２５ｉＨトリス
塩酸緩衝液（ｐｔ１８．３　）　／１９２ｍＮグリシン
／２０％メタノールの組成を有する緩衝液中で電気泳動
的にニトロセルロース膜にトランスファーした。

ＴＢＳ（５０ｉＨトリス塩酸緩衝液（ｐｆ１８．Ｏ）／
１５０１Ｎ　　塩化ナトリウム）／１０％生胎児血清で
室温で１晩ブロツキングした後、ＴＢＳ／１％ウシ血清
アルブミンで希釈した抗ヒトトリプターゼ様蛋白ＩｇＧ
を室温で５時間結合させた。

ＴＢＳｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で室温で５分間の
洗浄を５回繰り返した後、５ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＰ
ｉｃｏＢＩｕｅ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎキッ
トで抗体が結合した蛋白のバンドを検出した。その結果
、抗ヒ１〜トリプターゼ様蛋白ＴＱＧが精製ヒトトリプ
ターゼ様蛋白と反応することが確認できた。

４　抗ヒトトリプターゼ様蛋白ＩＱＧからのＦ（ａｂ′
　）２のＩ製 抗ヒトトリプターゼ様蛋白１ａＧをペプシンで分解して
Ｆ（ａｂ’）２を調製した［Ｎ１５ＯｎＯＮｅｔ　ａｍ
、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａ＋ｏｐｈｙｓ、
　８９　、２３０（１９６０）　：　）４ａｎｄｙ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ２３８．２
０６　（１９６３）］。抗ヒトトリブタ−ゼ様蛋白ＩＱ
Ｇに１１５０ｆｆｉのペプシンを加え、０．１Ｍ酢！！
！！衝溶液（ｐＨ４，５＞中で３７℃で１８時間消化し
た。反応液にＩＮ水酸化ナトリウムを滴下してｐｌ＋を
８．０に調整した後、遠心して不溶物を除き、上清に硫
酸ナトリウムを終Ｉ’１１度０．１８ｇ／ｄになるよう
に添加して沈澱を得た。

コノ沈澱ヲ５０ＩｌｌＨトリス塩［１衝液（ｐｔ（８，
０）／１５０ｍＭ塩化ナトリウムに溶解して同じ緩衝液
で平衡化したセファデックスＧ−１５０（ファルマシア
社製）を通過させ、Ｆ　（ａｂ’　）２が溶出する画分
を集めた。このＦ　（ａｂ’　＞２が抗ヒトトリプター
ゼ様蛋白ＩＱＧと同様にヒトトリプターゼ様蛋白と反応
することが３−　＋１）で示した方法によって確認でき
た。

く試験例〉 目ＴＶ感染の抑制試験 １、使用した細胞 ヒト急性リンパ芽球性白血病ＩＩｌ胞、ＭＯＬＴ−４細
胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８２）およびＣＣＲＦ−
ＣＥＭＩＢ胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１１９〉にＨｆＶ
の一種であるしＡ　Ｖ　−１［Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕ
ｓｓｉ　　ｅｔ　　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　　２２０
．８６８　　（１９８３）］を持続感染させたＯＥＭ／
ＬＡＶ−１細胞を使用した。

２、細胞の培養 細胞は１０％牛脂児血清を添加したＲＰＭＩＩ６４０培
地で３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％の条件で培養
した。

３、合胞体形成の抑１ｔｉ１１試験 （１）　　方法 合胞体形成の抑制試験はＬｉｆＳＯｒｌらの方法に準じ
た［Ｌｉｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　
Ｈｅｄ、　１６４．２１０１　（１９８６）］、ＭＯＬ
Ｔ−４１！Ｉｖｉ（７）培養液の一部を２０００　ｒｏ
ｍで５分間遠心して細胞を集め、上清を除去した後、細
胞をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）で懸濁し、細胞数
が５×１０５／−になるように調製した。この細胞懸濁
液に、実施例２の（２）で得られる抗ヒトトリプターゼ
様蛋白ＩｇＧを各種の倍率で希釈して得た種々の濃度の
抗ヒトトリプターゼ様蛋白１ｇＧ、あるいは抗ヒトトリ
プターゼ様蛋白ＩｇＧのＦ（ａｂ′）２を添加して９６
ウエルのマイクロタイタープレートに細胞数がｌＸ１０
５／ウエルになるように分注し、３７℃で３０分放置し
た。抗体はあらかじめＡＳＦ１０４培地（味の素社製）
で希釈した後、同培地に対して４℃で１晩透析しておい
た。これにＯＥＭ／ＬＡＶ−１１８１ｎ　＜１１胞１１
１ｘ１０７／−）を２μｌ添加して良く混合して３７℃
、５％ＣＯ２で１２時間培養し、開立顕微鏡で各ウェル
を２００倍で観察した。合胞体形成が６０％以上阻害さ
れる場合を＋＋：３０〜６０％阻害される場合を＋；Ｏ
〜３０％阻害される場合を士；全く阻害が見られない場
合を−として含胞体形成抑＆１１能を評価した。

（２）結果 合胞体形或抑ｉ＋１１能の評価結果を下の表に示した。

抗ヒトトリプターゼ様蛋白１ａＧの合胞体形成抑制能上
記の如く抗ヒトトリプターゼ様蛋白ＬＯＧは８０ｍに依
存して合胞体形成を抑ＩＩＩ　Ｌ、た。抗ヒトトリプタ
ーゼ様蛋白１ａＧのＦ（ａｂＭ２を添加した場合にも同
程度の合胞体形成の抑υ１が見られた。しかし、非免疫
ウサギの血清からＩｌ！ｌ！シたＩＱＧでは合胞体形成
の抑υ１が見られなかった。

実施例３　抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体の注射剤 １、アフィニティーカラムの作成 活性化Ｃ日−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）１
９に１−Ｈ塩酸を添加して膨潤させ、洗浄した。精製し
たヒトトリプターゼ様蛋白２００μ９　（０，１８炭酸
水素ナトリウム（ＥＩＨ８，Ｏ）溶液）を添加して、膨
潤させたゲルと混合し、室温で１時ｌＩｌ混合した。５
０１Ｈトリス塩１！！ｌｌｊ液（＋）Ｈ８，０）１０．
５８塩化ナトリウムでゲルを洗浄した後５ＱｉＨ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４，０）１０．５Ｎ塩化ナトリウムで洗
浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。

２、アフィニティーカラムを用いた抗ヒトトリプターゼ
様蛋白ＩＱＧの精製 １８で作成したアフィニティーカラムに実施例２の２と
同様にしてｒＡ製した抗ヒトトリプターゼ様蛋白１ａＧ
を含む溶液を通過させて洗浄した後０．１Ｍリン酸緩衝
液（ＤＨｌｏ、８）でカラムに結合した抗ヒトトリプタ
ーゼ様蛋白ＩＧＧを溶出した。この溶液のＤＨをただち
に７．５に調整した後、限外濾過器で濃縮して透析し、
凍結乾燥して１６％水溶液を調製した。

このようにしてｔＢ！！Ｌ、た抗ヒトトリプターゼ様蛋
白１ａＧの合胞体形成抑制能を、試験例に示した方法で
検討したところ、活性が見られた。

３、抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体の注射剤の作成 ２、でＩＩ製した抗ヒトトリプターゼ様蛋白ＩＱＧを公
知の注射剤の製造法に従い、グリシンを安定化剤とし、
メチルチオレートを防腐剤として添加して、注射剤を作
成した。

投与量はＩａＧ又はそのフラグメントとして２０〜２０
００１１ｇ／Ｋｇ体重７日、好ましくは５０〜１０００
１１ｇ／＊ｇ体重７日を筋肉注射する。

実施例４　抗ＡＩＤＳワクチンの　剤の　成実施例１と
同様にして精製したヒトトリプターゼＩＩ白を水に対し
て透析し、凍結乾燥してＡＩＤＳワクチンを得た。

水剤は使用時に生理食塩水で溶解して皮下注射する。投
与量はヒトトリプターゼ様蛋白として、１回当たり０．
２〜２０μｇ／Ｋ１体重、好ましくは１〜１０ｕ’ｊ／
Ｋｇ体重である。

この溶液を実施例２の１に示した方法でウサキに投与し
、実ｆＭＶＡ２の３に示した方法で検討したところ、抗
体の産生を確認できた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトトリプターゼ様蛋白を１％アガロースゲ
ル電気泳肋に付した時の結果を示す。 第２図は、ヒトトリプターゼ様蛋白を還元条件下で５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した時の結果
及びウェスタン分析の結果を示す。 第３図は、ヒトトリプターゼ様蛋白の至ＪｐＨを示すグ
ラフである。 第１図 アガロース ゲル 第２図 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ ウェスタン分析 ７５に−１− ５０に− ４ ３９に−”− −４ ２７に− １７に− ｂ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ラツトトリプターゼ抗体と反応し、ヒトＴ細胞
   から得ることのできる、約３５±３ＫＤａのサブユニッ
   ト２個と約３０±２ＫＤａのサブユニット４個よりなる
   ヒトトリプターゼ様蛋白。
2. （２）トリプシン様活性及びキモトリプシン様活性を有
   する請求項１記載のヒトトリプターゼ様蛋白。
3. （３）ヒト急性リンパ芽球性白血病由来の株化培養細胞
   Ｈｏｌｔ４から得られる請求項１または２記載のヒトト
   リプターゼ様蛋白。
4. （４）請求項１記載のヒトトリプターゼ様蛋白の約３５
   ±３ＫＤａのサブユニットあるいは約３０±２ＫＤａの
   サブユニット。
5. （５）請求項１記載のヒトトリプターゼ様蛋白と特異的
   に反応する抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体またはその抗
   原結合部位を含むフラグメント。
6. （６）請求項５記載の抗ヒトトリプターゼ様蛋白抗体ま
   たはその抗原結合部位を含むフラグメントを有効成分と
   する後天性免疫不全症候群治療剤。
7. （７）請求項１記載のヒトトリプターゼ様蛋白からなる
   後天性免疫不全症候群用ワクチン。