NO174776B - Fremgangsmåte for isolering av vevsfaktorinhibitor (TFI) - Google Patents

Abstract

Renset vevfaktorinhibitor som har følgende kjennetegn: A. den foreligger i to former, TFIsom migrerer ved ca. 37-40.000 dalton,. og TFI2 ved 25-26.000 dalton, bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese,. B. den har en partiell N-ende-aminosyresekvens som er:. hvor X-X ikke er blitt bestemt, og C. den uviser inhibitoraktivitet mot faktor X.

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av vevsfaktorinhibitor (TFI).

Koagulasjonskaskaden som oppstår i pattedyrblod om-fatter to adskilte systemer, det såkalte indre og det så-

kalte ytre system. Det sistnevnte system aktiveres ved ekspo-nering av blod mot vevthromboplastin (faktor III), heretter referert til som vevfaktor (TF). Vevfaktor er et lipoprotein som oppstår i plasmamembranen til mange celletyper, og som hjernen og lungene er særlig rike på. Etter å ha kommet i kontakt med TF, danner plasmafaktor VII eller dens aktiverte form, faktor VIIa, et kalsiumavhengig kompleks med TF, og aktiverer proteolytisk faktor X til faktor X a, og faktor IX

til faktor IX .

a

Tidligere undersøkelser vedrørende reguleringen av TF-initiert koagulering viste at inkubasjon av TF (i urene vev-thromboplastinpreparater) med serum inhiberte dens aktivitet in vitro og forhindret dens dødelige virkning når den ble sprøytet inn i mus. Grundige undersøkelser av Hjort, Scand.

J. Clin. Lab. Invest., 9, Suppl. 27, 76-97 (1957) bekreftet

og utvidet tidligere arbeide på området, og førte til den konklusjon at en inhibitorrest i serum gjenkjente faktor VII/ TF-komplekset. I overensstemmelse med denne hypotese er de

fakta at inhiberingen av TF som oppstår i plasma, krever til-stedeværelse av Ca 2+ (som også er nødvendig for bindingen av faktor VII/VII cltil TF), og at inhibering kan forhindres og/ eller reverseres ved chelatdannelse av divalente kationer med EDTA. Nyere undersøkelser av foreliggende oppfinner og andre har vist at ikke bare faktor VII CL, men også katalytisk aktiv faktor X aog en ytterligere faktor er påkrevet for frem-bringelsen av TF-inhibering i plasma eller serum. Se Broze og Miletich, Blood, 69_, 150-155 (1987) og Sanders et al.,

Ibid., ^6, 204-212 (1985). Denne ytterligere faktor, her definert som vevfaktorinhibitor (TFI), er til stede i barium-absorbert plasma og synes å være forbundet med lipoproteiner, ettersom TFI funksjonell aktivitet segregerer med lipoprotein-fraksjonen som flyter opp når serum sentrifugeres ved en densitet på 1,21 g/cm 3. Ifølge Broze og Miletich, se ovenfor, utskiller HepG2-celler (en human hepatomcellelinje) en inhibitorrest med de samme kjennetegn som den TFI som er til stede i plasma.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny fremgangsmåte for fremstilling av vevsfaktorinhibitor (TFI) som er kjennetegnet ved at SK-HEP-1-celler eller Chang-leverceller dyrkes, hvoretter den produserte TFI isoleres ved immunoaffinitetskromatografering av det kondisjonerte medium på anti-TFI-peptid-Ig koblet til CNBr-aktivert Sepharose 4B, hvor det syntetiske TFI-peptid anvendt som immunogen har aminosyresekvensen 3-25 i TFIs partielle N-endeaminosyre-sekvens

Den nye TFI fremstilt ifølge oppfinnelsen er blitt isolert i høyrensede former som den ikke forelå i, i celle- og vevskildene hvorfra den er blitt erholdt. Det vil si at den er blitt fremstilt i rensede former som er i det vesentlige frie for andre proteiner, og frie for andre cellebestanddeler og vevsinnhold. Den har videre de følgende kjennetegn:

A. den foreligger i to former, TFIX som migrerer ved

ca. 37.000-40.000 dalton, og TFI2 ved ca. 25.000-26.000 dalton, bestemt ved hjelp av natriumdodecyl-sulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS PAGE), og

B. den utviser inhibitoraktivitet mot faktor X 3..

Den nye TFI oppviser biologisk aktivitet som antyder

at den er viktig for medisinsk vitenskap i undersøkelsen av koagulasjonskaskaden. Særlig har den nye TFI fremstilt ifølge oppfinnelsen indikert terapeutisk bruk som en koagulasjons-inhibitor og et anti-thrombosemiddel.

Egnede cellekilder for TFI er f.eks. SK-HEP-l-cellen ATCC HTB 52 og Chang-levercellen ATCC CLL 13.

Cellene kan dyrkes ved ca. 37°C i vanlig dyrknings-medium med næringsstoffer for å uttrykke TFI. Et foretrukket medium er Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), som er kommersielt tilgjengelig. Andre egnede kommersielt tilgjengelige medier er beskrevet f.eks. av Helen J. Morton, In Vitro, 6( 2), 89-108 (1970). Disse næringsstoffholdige dyrkningsmedier inne-holder aminosyrer, mineraler, carbohydrater, vitaminer og er ofte forsterket med pattedyrserum, f.eks. kalvefosterserum eller kalveserum, og forskjellige vekstfaktorer. Slik de her brukes, dyrkes cellene fortrinnsvis først i serumholdig medium og overføres så til serumfritt medium supplert med stimulerende mengder av transferrin, selen, insulin, levercelle-vekstfaktor og lactalbuminhydrolysat.

Selv om beskrivelsen etterfølges av krav som spesielt peker ut og klart krever gjenstanden som ansees for å ut-gjøre foreliggende oppfinnelse, antas det at oppfinnelsen vil bli bedre forstått ut fra den følgende beskrivelse av foretrukne utførelsesformer sett i sammenheng med den led-sagende tegning hvor i korte trekk: Figur 1(A) viser SDS-PAGE av TFI isolert fra Chang-leverceller (felt 2) og SK-HEP-1 (feltene 3 og 4) ved immunoaffinitetskromatografering, med standard molekylvektmarkører vist i felt 1. Figur 1 (B) viser "Western blotting" (elektroforetisk overføring) på nitrocellulosepapir og farging med <1>25I-Xa etterfulgt av autoradiografering av elektroforetiske sepa-rerte proteiner fra feltene 2, 3 og 4 i figur 1(A) i feltene henholdsvis 1, 2 og 3.

For å illustrere bestemte foretrukne utførelsesformer

av oppfinnelsen nærmere, ble det etterfølgende eksempelvise preparative laboratoriearbeid utført. I eksemplet isoleres TFI fra to cellekiider ved immunoaffinitetskromatografi.

Eksempel

Isolering av TFI fra to cellekiider, nemlig Chang-leverceller og SK-HEP-l-celler ble utført ved immunologisk affinitetskromatografering under anvendelse som immunogen av et syntetisk peptid med en aminosyresekvens 3-25 fra den fullt ferdige TFI som er beskrevet ovenfor, på følgende måte:

Immunisering

Et TFI-peptid inneholdende en sekvens svarende til aminosyresekvensen 3-25 i den fullt ferdige TFI ble synteti-sert ved å bruke Biosystems fastfase-peptidsyntese. TFI-peptidet (5 mg) ble konjugert til 10 mg Keyhold limpet hemo^ cyanin ved hjelp av glutaraldehyd. To New Zealand hvite kaniner ble hver immunisert ved intradermal injeksjon med et homogenat inneholdende 1 ml Freunds fullstendige adjuvans og 1 ml av konjugatet (200 ug TFI-peptid). En måned senere ble kaninene på nytt injisert med et homogenat inneholdende 1 ml Freunds ufullstendige adjuvans og 1 ml av konjugatet (100 ug TFI-peptid). Antiserum ble samlet opp hver uke der-etter. Fornyet injeksjon ble utført månedlig inntil kaninene ble tappet for blod etter 3 måneder.

Isolering av anti- TFI- peptid lg

Det syntetiske TFI-peptid (3 mg) ble koblet til 0,8 g CNBr-aktivert Sepharose 4B under anvendelse av produsentens publiserte fremgangsmåte. For å isolere spesifikt antistoff, ble sammenslått antiserum (15 ml) blandet med et like stort volum av en oppløsning (PNBT) inneholdende PBS, 0,4 M NaCl, 0,1 M benzamidin og 1% Triton X-100, og kromatografert på TFI-peptid Sepharose 4 B kolonnen ved værelsetemperatur. Kolonnen ble vasket med 30 ml PNBT-oppløsning og så med den samme oppløsning uten Triton X-100. Det bundne antistoff ble eluert med 0,1 M glycin/HCl, pH 2,2, nøytralisert øyeblikke-lig ved tilsetning av 1/10 volum av 1 M Tris-OH og grundig dialysert mot saltoppløsning. Omtrent 6,5 mg anti-TFI-peptid-Ig ble isolert fra 15 ml antiserum.

Cellekultur

Chang-lever- og SK-hepatomceller ble dyrket til sammenløping i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 10% bovint fosterserum, 50 enheter/ml penicillin og 50 yg/ml streptomycin i 175 cm<3> kolber. 5 kolber med hver av cellene ble trypsinisert og bragt til å inokulere en 10-kammers celle-"fabrikk". Etter sammenløping (ca. 1 uke) ble cellene vasket med PBS 2 ganger og inkubert i et serumfritt medium. Det serumfrie medium besto av DMEM supplert med 0,5% lactalbuminhydrolysat, 50 enheter/ml aprotinin, ITS-for-blanding (insulin-transferrin-selen), 20 mg/ml levercelle-vekstfaktor (glycyl-histidyl-lysin) og 100 mg/ml forbol-12-myristat-13-acetat. Det serumfrie medium ble erstattet med friskt medium hver 3. dag. Cellene kan holdes under disse betingelser i mer enn 2 måneder. De sammenslåtte kondisjonerte medier ble bragt til 0,02% NaN^ og 0,01% Triton X-100, og lagret ved 4°C. Noen medier ble oppkonsentrert 20-100 ganger ved ultrafiltrering under anvendelse av YM3 0 spiralmembran-systernet.

Immunologisk affinitetsrensing av TFI

Isolert anti-TFI-peptid-Ig (20 mg) ble koblet til 2 g CNBr-aktivert Sepharose 4 B ved hjelp av produsentens publiserte fremgangsmåte. Lagvolumet av gelen var 7 ml. For å isolere TFI ble de kondisjonerte medier (ikke-konsentrert eller konsentrert) fra Chang-lever- og SK-hepatomceller kromatografert på anti-TFI-peptid-Ig Sepharose 4 B kolonnen ved en hastighet på 2 ml/minutt i kjølerom, inntil betyde-lig TFI-aktivitet fremkom i gjennomstrømningen. Kolonnen ble så vasket med 70 ml PNBT og 70 ml av den samme oppløsning uten Triton X-100. Den bundne TFI ble eluert med 0,1 M glycin/ HC1, pH 2,2, og oppkonsentrert til omtrent 0,6 ml ved vakuum-dialyse mot 0,1 M glycin/HCl, pH 2,2.

Resultater

Ved immunologisk affinitetskromatografering på en anti-TFI-peptid-Ig Sepharose 4 B kolonne ble TFI isolert fra et antall cellelinjer utvunnet fra Chang-lever og SK-hepatom. Figur IA viser SDS-PAGE av proteinene eluert fra anti-TFI-peptid-Ig Sepharose-kolonnen. I forskjellige preparater ble det observert noe forskjellige proteinprofiler. I noen preparater er et 40 kDa protein det eneste hovedprotein (felt 4), i andre foreligger en rekke proteinbånd sammen og et 38 kDa protein er et dominerende bånd i stedet for 40 kDa-proteinet. For å fastslå hvilke proteiner som er TFI-beslektet ble <125>I-Xa-bindingsundersøkelsene utført. De isolerte TFI-prøver ble elektroforesebehandlet i en 12 % SDS-polyacrylamidgel, og proteinene ble så elektroforetisk "transblottet" over på et nitrocellulosepapir og undersøkt med hensyn på <125>I-Xa-bindingsaktivitet. Det ble funnet at 3 hovedbånd med til-synelatende molekylvekter på 40, 38 og 25 kDa har 12<5>I-Xa-bindingsaktivitet, mens andre bånd ikke har (figur IB). Sekvensanalyse av 38 kDa båndet fra SK-hepatomceller viser at det har den samme aminoendesekvensen som 40 kDa TFI isolert fra HepG2-celler. Basert på immunoaffiniteten, aminosyre-sekvense<ringen> og <125>I-Xa-bindingsundersøkelser, synes det som om 40, 3 8 og 25 kDa inhibitorene kan være avledet fra det samme molekyl.

Resultatene fra det ovenfor nevnte preparative labora-toriearbeide som førte til isoleringen av TFI fra flere cellekiider ved immunologisk affinitetskromatografering, er ytterligere eksemplifisert ved hjelp av den følgende nærmere beskrivelse i figurene 1' (A) og 1; (B) i tegningene.

Figur 1. Denne figuren viser SDS-PAGE av immunoaffi-125

nitet-isolert TFI og undersøkelse av I-X CL-bindmgsaktxvi-tet. (A) SDS-PAGE. Elektroforese ble utført på en 12% polyacrylamidgel. Felt 1, molekylvektmarkører; felt 2, Chang-lever-TFI; felt 3, SK-hepatom-TFI (preparat 1) og felt 4, SK-hepatom-TFI (preparat 2). (B) Undersøkelse av <125>I-X -bindingsaktivitet. Prøver ble elektroforesebehandlet på en 12% polyacrylamidgel. Proteinene ble elektroforetisk "transblottet" over på et nitrocellulosepapir under anvendelse av Bio-Rad trans-blott-apparat og -fremgangsmåte. Etter overføringen ble nitrocellulosepapiret først forsiktig rystet i PBB-oppløsning (PBS inneholdende 5 mg/ml BSA og 2,5 mg/ml bovint gammaglobulin) og så i PBB-oppløsning inneholdende 400 ng/ml<125>I-Xa, hver ved værelsetemperatur i 1 time. Nitrocellulosepapiret ble så tørket og autoradiografert i 3 dager under anvendelse av Kodak XAR-5-film. Felt 1, Chang-lever-TFI; felt 2, SK-hepatom-TFI (preparat 1) og felt 3, SK-hepatom-TFI (preparat 2).

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av vevsfaktorinhibitor (TFI),

   karakterisert ved at SK-HEP-l-celler eller Chang-leverceller dyrkes, hvoretter den produserte TFI isoleres ved immunoaffinitetskromatografering av det kondisjonerte medium på anti-TFI-peptid-Ig koblet til CNBr-aktivert Sepharose 4B, hvor det syntetiske TFI-peptid anvendt som immunogen har aminosyresekvensen 3-25 i TFIs partielle N-endeaminosyresekvens