JPH0335920B2 - - Google Patents
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- JPH0335920B2 JPH0335920B2 JP61267907A JP26790786A JPH0335920B2 JP H0335920 B2 JPH0335920 B2 JP H0335920B2 JP 61267907 A JP61267907 A JP 61267907A JP 26790786 A JP26790786 A JP 26790786A JP H0335920 B2 JPH0335920 B2 JP H0335920B2
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- creatine kinase
- control
- serum
- activity
- standard serum
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明はジスルフイド変性による安定化クレア
チンキナーゼを使用したクレアチンキナーゼ対照
及び標準血清の製法及び該血清に関する。 従来技術 クレアチンキナーゼの測定は臨床化学分析にお
いて重要である。この種の分析の対照及びクレア
チンキナーゼ活性の測定用自動分析装置の較正の
ために、既知クレアチンキナーゼ活性含量を有す
る対照及び標準血清（Kontroll−und
Eichseren）を提供することは必要である。この
ことは対照もしくは標準血清中の成分が所定の時
間の間安定であり、かつこの時間の間クレアチン
キナーゼ活性があまり変化しないということが前
提である。更に、対照もしくは標準血清中に含有
されるクレアチンキナーゼは患者材料中に含有さ
れるクレアチンキナーゼと同じ挙動を示すという
ことも重要である。 対照もしくは標準血清は通常人血清、動物血清
又は牛血清アルブミンを基礎として構成される。
良好な測定性及び精確性及び最適な装置較正を得
るために、クレアチンキナーゼ含量を外来クレア
チンキナーゼ活性の添加により高めなければなら
ない。 この外来クレアチンキナーゼ活性は対照血清中
で不安定であるということはすでに公知である。
従つて、対照血清中でのクレアチンキナーゼ活性
を安定化するための実験は多くなされている。酵
素固有の不安定性のために、酵素を含有する対照
及び標準血清を貯蔵安定性改良のために凍結乾燥
させることは通常行なわれる。使用のためには凍
結乾燥対照及び標準血清を再構成する。一般に、
この再構成し、凍結乾燥物質から得られた溶液は
比較的短かい安定性を有し、この安定性はそれぞ
れのパラメーターにより約24時間〜約５日間であ
る。冷蔵庫温度での貯蔵は多くの場合前提であ
る。一般に行なわれるように、自動分析装置で同
時、もしくは短時間の間隔で多くのパラメーター
に関して対照もしくは較正を行なう場合、更に多
くの制限がある。この場合にはこの対照もしくは
標準血清を使用することのできる時間は最も短か
い安定性を有するパラメーターにより決定され
る。 冷蔵庫貯蔵、すなわち温度２〜８℃において、
液体媒体中での長期安定性は少なくとも１年であ
るのがよい。しかしながら今日まで、この問題は
解決されず、従つて溶液の形で存在し、ただちに
使用可能であり、かつ充填物を開封した後も長時
間、すなわち数週間冷蔵庫中での貯蔵において安
定である対照もしくは標準血清に対する要求があ
る。 従つて、再構成した対照もしくは標準血清の使
用可能期間を延長するための実験及び対照もしく
は標準血清パラメーターの安定性を、凍結乾燥が
もはや必要でなくなるまで改良するための実験が
多くなされている。 こうして、特にチオール化合物の添加によりク
レアチンキナーゼを酸化から、こうして活性損失
から守ることが実験されている。チオール化合物
の添加の欠点は、チオール化合物は還元剤とし
て、例えばH2O2の測定のための程色反応に影響
を与えることにより分析法を妨げるのでこのチオ
ール化合物を含有する血清中で多くのパラメータ
ーを同時に測定することができないということで
ある。 ヨーロツパ特許公開第0045122号公報は、対照
もしくは標準血清中のクレアチンキナーゼ安定性
の改良のために、好適な変性試薬、例えばジスル
フイドによる酵素の反応性SH−基の可逆的な変
性が次式により可逆的に変性することを記載して
いる。 酵素サブユニツト−SH＋Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ （酵素サブユニツト）−Ｓ−Ｓ−Ｒ＋Ｒ−SH このようにして酵素の反応性SH−基は酸化及
び他の血清阻害物質から保護される。 更なる可能性は西ドイツ国特許公開第2856988
号公報に記載されており、該方法においては凍結
乾燥対照又は標準血清をエチレングリコール又は
同族体約20〜40％の水溶液で再構成する。エチレ
ングリコールは対照及び標準血清マトリツクスの
凝固点を、該生成物を−20℃で液体で貯蔵するこ
とができるようになるまで低下させる。この形
で、酵素及び他のパラメーターは生成物中で数ケ
月以上安定である。低温冷蔵庫から取り出した
後、該生成物を加温するとすぐに使用できる。エ
チレングリコールは優れた殺菌剤であるので、対
照及び標準血清は冷蔵庫貯蔵において数週間安定
である。この方法で構成された生成物はデシジヨ
ン・コントロール（Decision Control）という市
販名で売られている。しかしながらこの方法は重
大な欠点を有する。高含量のエチレングリコール
により、生成物は患者血清と同様に挙動しない。
エチレングリコールの高い粘度は対照及び標準血
清のピペツト採取における挙動を変えるので、分
析誤差が生じることがある。更に、種々の分析的
検出法はエチレングリコールの添加により妨害さ
れる。この生成物はなおいくつかの欠点を有する
ので、対照又は標準血清として一般的に使用する
ことができない。 その他の提案としては“アドバンシズ・イン・
ビオケミカル・エンジニアリング（Advances in
Biochemical Engineering）”、スプリンガー出版
（Springer−Verlag）、第12巻、1979年、第83〜
90頁に記載されており、酵素を炭水化物に結合さ
せることにより安定化する。しかしながら、この
安定化は不十分である。 更に、ヨーロツパ特許公開第0049475号公報か
ら安定化のために、酵素を、官能基単位として無
水物を有するポリマーに共有結合させることが公
知である。この方法の欠点は、安定化反応の後、
酵素のはじめの活性のわずか約５〜10％のみが保
持されるということである。 発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は安定化したクレアチンキナーゼ
を使用したクレアチンキナーゼ測定用対照及び標
準血清の製法及び該血清に関する。ここで使用す
るクレアチンキナーゼは冷蔵庫の温度で少なくと
も１年間活性の損失なしに貯蔵することができ、
かつ充填容器を開封する際にも安定化のために凍
結乾燥することなしに長時間安定性であるのがよ
い。更に、安定化されたクレアチンキナーゼは液
体の形で存在し、ただちに使用可能であるのがよ
い。更に、安定化の際に活性がほぼ低下しないよ
うにクレアチンキナーゼが安定化されるのがよ
い。 問題点を解決するための手段 この目的のためにはまず安定化クレアチンキナ
ーゼを製造する。この際クレアチンキナーゼを任
意の順序で、 (a) ジスルフイド又はチオスルホネートのモル過
剰量と反応させ、かつ (b) 担体として水溶性多糖類のモル過剰量と反応
させることを特徴とするジスルフイド変性によ
るクレアチンキナーゼの安定化法を行う。 対照及び標準血清中のクレアチンキナーゼを２
安定価工程、すなわちジスルフイド交換による
SH基の保護及び水溶性多糖類への固定による酵
素安定化により、対照もしくは標準血清中の酵素
を液体の形で４〜８℃で重大な活性低下なしに長
期間貯蔵可能となるように安定化することができ
るということが見い出された。溶液の形のクレア
チンキナーゼを添加物なしに安定化することがで
きるという点にこの方法の大きな利点がある。こ
うして、公知法の欠点は克服された。 前記クレアチンキナーゼの安定化法は次にあげ
た、任意の順序で適用すべき工程からなる： (a) 人又は動物組織から単離したクレアチンキナ
ーゼをジスルフイド又はチオスルフオネートの
過剰量と反応させる。この際遊離したクレアチ
ンキナーゼのSH基はジスルフイドもしくはチ
オスルホネートと混合ジスルフイドの形成下に
反応する。この保護基は該当する対照又は標準
血清を使用する時、公知薬剤を添加することに
より再び容易に切断され、酵素の活性は再び示
される。 (b) クレアチンキナーゼを水溶性多糖類の過剰量
と反応させる、有利に多糖類を公知法で活性化
する。この活性化多糖類にクレアチンキナーゼ
は共有結合する。 両方の工程(a)及び(b)の順序は任意である。しか
しながら、はじめにSH基をジスルフイド又はチ
オスルホネートと反応させることにより保護し、
引き続きこのように得られたクレアチンキナーゼ
ジスルフイドを活性化多糖類と反応させることが
有利である。 この方法に関しては種々の動物種のクレアチン
キナーゼプレパレートを使用することができる。
こうしてクレアチンキナーゼは家兎筋肉、豚筋
肉、豚心臓、オランウータン−骨格筋肉、ニワト
リ筋肉、牛心臓又は他のものから得られた。この
方法において家兎筋肉又はニワトリ筋肉からの又
は豚心臓又は牛心臓からのクレアチンキナーゼが
有利である。 前記方法の工程(a)を実施する際、クレアチンキ
ナーゼとジスルフイド又はチオスルホネートと反
応させる。ジスルフイドとしては有利にシスチ
ン、ホモシスチン、又はシスチン誘導体、ペニシ
リナミンジスルフイド及び／又はビス−（２−ピ
リジル−Ｎ−オキシド）−ジスルフイドを使用す
る。シスチン誘導体としては有利にシスチンメチ
ルエステル及びシスタミンを使用する。ジスルフ
イド成分を酵素対ジスルフイド１：５〜１：20の
モル比（SH基に関して）で使用する。 同様に、チオスルホネートとの反応も好適であ
る。この際、チオスルホネートとしてはメタンチ
オスルホン酸−Ｓ−メチルエステルを使用する。
チオスルホネートを酵素対チオスルホネート１：
0.5〜１：５のモル比（SH基に関して）で使用す
る。 クレアチンキナーゼとジスルフイド又はチオス
ルホネートとの反応においては酵素は有利に0.01
〜１ｍmol／溶液の濃度で存在する。特に有利
であるのは0.05〜0.5ｍmol／の酵素濃度であ
る。 該方法の工程(b)においては、クレアチンキナー
ゼもしくはクレアチンキナーゼジスルフイドを水
溶性多糖類に共有結合させる。 有利な多糖類はデキストランである。しかしな
がら、非常に良好な結果は他の水溶性多糖類、例
えば特に溶解性デンプンでも達せられる。例えば
エピハロゲンヒドリンとの反応により得られた単
及び二糖類の高分子ポリマー（例えばFicoll）
も非常に好適であるとされている。 最も有利な実施形においては、クレアチンキナ
ーゼもしくはクレアチンキナーゼジスルフイドは
分子量4000〜500000の水溶性デキストランに共有
結合される。 クレアチンキナーゼと担体との反応において担
体として使用した多糖類は水中に溶けて存在す
る。水溶性中の担体の濃度は有利に１〜10％の範
囲である。 多糖類を自体公知法で活性化する。活性化は有
利に多糖類とトリクロルトリアジン、ブロムシア
ン又は１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジ
ニウム−テトラフルオロボレートとの反応により
行なわれる。活性剤対多糖類の比は両方の成分の
重量に関して１：５〜１：10の範囲が有利であ
る。次いで、この活性化多糖類をクレアチンキナ
ーゼと反応させる。この際、酵素対多糖類の比
を、重量に関して１：10〜１：30の範囲で使用す
るのが有利である。 前記両方の工程を実施することにより得られた
クレアチンキナーゼ誘導体はこの形で溶液中全く
安定化添加物なしに長期間、すなわち少なくとも
１年間、４〜８℃で、すなわち冷蔵庫中で保存す
ることができ、この際酵素の活性はほとんど変化
しない。 SH基がジスルフイド交換により保護されてい
る、溶解多糖類に結合したクレアチンキナーゼの
安定性を更に改良するために、特に有利な実施形
においては、酵素を含有する溶液を充填し、引き
続き不活性保護ガスで覆う。不活性保護ガスとし
ては窒素が有利に使用される。一定の炭酸塩／炭
酸水素塩−目標値が所望である場合、保護ガスと
して窒素及びCO2からの混合物を使用するのが有
利である。 このように安定化したクレアチンキナーゼ誘導
体は対照又は標準血清の製造に使用される。クレ
アチンキナーゼ活性の測定のためには、酵素の
SH基保護のために導入したジスルフイド橋を再
び切断しなければならない。このことは自体公知
法でチオール化合物の添加により行なわれる。ク
レアチンキナーゼ活性の公知測定法においては一
般にチオール化合物が添加され、このチオール化
合物は試料中に酸化されているか又は抑制された
形で存在するクレアチンキナーゼ酵素の再活性化
に働らく。試薬中に含有されるチオール化合物
は、本発明において得られた安定なクレアチンキ
ナーゼ誘導体をテスト実施のための所定の時間内
に活性誘導体に完全に変換するために十分であ
る。この際チオール化合物としては有利にＮ−ア
セチルシステインを使用する。 クレアチンキナーゼ測定のための対照又は標準
血清の製造において、好適なマトリツクスが選択
される。通常、人血清、動物血清又は純粋な蛋白
溶液をベースとする対照及び標準用血清を常法で
構成する。このマトリツクスに本発明において製
造した、安定化クレアチンキナーゼ誘導体を使用
目的に好適な活性で添加する。更に、対照血清の
製造のために常用の添加物、例えば保存剤及び／
又は抗生物質を添加する。対照又は標準血清はこ
の形で４〜８℃で貯蔵することができる。対照又
は標準血清を凍結乾燥させ、次いで使用するため
に水で再構成することもできる。 対照又は標準血清の製造用マトリツクスとして
人血清又は動物血清を使用する場合、血清中に内
因的に含有される酵素活性を好適な処置により不
活性化することは有利である。この際、血清中の
残留活性を、後に対照又は標準血清中に所望な活
性の３％以下となるように低下させることが特に
有利である。 対照又は標準血清の製造のためには純粋な蛋白
質溶液を使用するのが特に有利であり、この組成
は対照又は標準用材料の所望の利用目的により調
節される。種々の異なる測定のための標準として
使用することのできる、全般的に使用可能な対照
血清の製造のためには、すべての主な酵素、基質
及び代謝産物を蛋白質溶液に添加する。脂質は好
適な脂質フラクシヨンの添加により増加する。 対照又は標準血清を液状で長時間貯蔵すべき
時、血清を菌による汚染に対して十分に保存する
のが特に有利である。このためには、有利に貯蔵
のための瓶中に充填する前に該溶液を無菌又は少
なくとも僅少菌数に濾過するが、この際、孔径≦
0.2μｍの濾過膜を使用する。次いで、血清に保存
剤を添加する。特に、ナトリウムアジドを使用す
るのが有利である。抗生物質、例えばクロラムフ
エニコール、ゲンタマイシン及び／又はペニシリ
ンは血清の保存に好適である。 本発明のもう１つの課題は、クレアチンキナー
ゼをそのジスルフイド又はチオスルホネートとの
反応生成物の形で、かつ水溶性多糖類に結合させ
て含有するクレアチンキナーゼ測定用対照又は標
準血清である。 対照もしくは標準血清が活性50〜1000U／ml
（25℃）のクレアチンキナーゼを含有しているの
が有利である。150〜600U／mlの活性を有するク
レアチンキナーゼを使用するのが特に有利であ
る。 本発明において安定化したクレアチンキナーゼ
は、酵素クレアチンキナーゼがジスルフイド又は
チオスルホネートとの反応生成物の形で、かつ水
溶性多糖類に結合して存在することを特徴とす
る。この本発明によるクレアチンキナーゼは特に
クレアチンキナーゼの測定のための対照及び標準
血清を製造するために好適である。 安定化した可溶性クレアチンキナーゼ誘導体を
有する本発明により製造した対照もしくは標準血
清は４〜８℃で少なくとも１年は安定である。本
発明による該血清は液状で冷蔵庫温度において
も、凍結乾燥した形においても貯蔵することがで
きる。凍結乾燥した対照もしくは標準血清は水又
は好適な希釈剤での再構成の後も長時間安定であ
る。 実施例 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。 本発明において得られたクレアチンキナーゼ誘
導体を熱負荷実験により判定した。このためには
対照又は標準液体試料を十分に閉じ、35℃で貯蔵
する。35℃で１、２、３及び６週間貯蔵した後、
活性を測定し、負荷の開始時でのクレアチンキナ
ーゼ活性と比較する。35℃で貯蔵した試料の検出
が３週間後、なお少なくとも90％を示すならば、
対照及び標準血清の酵素活性は冷蔵庫での貯蔵に
関して少なくとも１年間は安定であることを示
す。 例 １ (A) 安定クレアチンキナーゼ誘導体の製法 家兎筋肉−クレアチンキナーゼ164mgを１
あたりシスチン２ｍmolを含有する炭酸塩緩衝
液（10ｍＭ、PH8.0）20mlに溶かし、室温で１
時間放置する。炭酸塩緩衝液（10ｍＭ、PH8.0）
に対して透析を行なう。 デキストランT40 ６ｇを水40ml中に溶かし、
氷浴中で±０℃に冷却する。低温冷却したジメ
チルホルムアミド10ml中に２，４，６−トリク
ロル−１，３，５−トリアジン600mgを溶かし、
配合物に添加する。PH値を0.5N NaOHを添加
することにより5.0に調節し、保持する。反応
の終了後、すなわちPH変化がおこらなくなつた
時、活性化デキストランをその都度容積２倍過
剰量の低温冷却アセトンで沈殿させることによ
り精製する。アセトン沈殿をその都度氷水で溶
かす。 クレアチンキナーゼ溶液（１mlあたり蛋白質
約8.6mg）部分量をトリクロルトリアジン活性
化デキストラン溶液（17.2mg／ml）同容積と混
合する。該溶液を24時間室温で放置する。その
後、グリシン緩衝液（1M、PH8.0）10容量％を
添加し、該溶液を新たに１夜放置する。 比較のために、SH基が保護されていない、
新たに製造した家兎筋肉−クレアチンキナーゼ
溶液を、前記のように直接活性化デキストラン
T40に結合する。ここでも蛋白質対デキストラ
ンの比は１：２である。 再活性化可能なクレアチンキナーゼ活性の収
量は次のようである：シスチンとの反応による
SH−保護後92％及びシスチンによるSH−保護
及びデキストランT40への固定の後64％。 (B) 対照及び標準血清の製造 対照血清のためのマトリツクスは６％牛血清
アルブミン溶液である。全般的な対照もしくは
標準血清の製造のためにはすべての主要な酵素
（例えば、α−アミラーゼ、AP、GOT、
GPT、γ−GT、LDH、HBDH、リパーゼ）、
基質（脂質又は脂質フラクシヨン）、代謝物質
（例えば、アルブミン、クレアチニン、グルコ
ース、尿素、尿酸、コレステリン、燐脂質、ト
リグリセリド）及び電解質（例えば、Na、Ｋ、
Ca、Li、Fe、Mg、Cl、燐酸塩）を該蛋白質溶
液に添加する。脂質を好適な脂質フラクシヨン
を添加することにより増量する。対照又は標準
血清のPH値を約7.0に調節する。 菌による汚染のない液状で対照又は標準血清
を長期間保存するためには、対照血清マトリツ
クスを孔径0.2μのフイルター膜で濾過して菌を
僅かにし、１あたりナトリウムアジド250mg
及び１あたりゲンタマイシン100mgを添加し
て保存する。 該対照血清マトリツクスにそれぞれ次のものを
添加する； (a) 家兎筋肉クレアチンキナーゼ、天然 (b) 家兎筋肉クレアチンキナーゼ、SH基をシス
チンで保護、 (c) トリクロルトリアジン活性デキストランT40
に共有結している、SH基を保護していない家
兎筋肉クレアチンキナーゼ、 (d) SH基をシスチンで保護し、トリクロルトリ
アジン活性化デキストランT40に共有結合して
いる家兎筋肉クレアチンキナーゼ。 すべての血清に関して、クレアチンキナーゼ活
性を約500U／に調節する。これら４つの対照
もしくは標準血清に関して、熱負荷の安定性実験
を行なう。個々の溶液を小さい瓶中に５mlまで充
填し、十分に密閉し、35℃で液状で貯蔵する。ク
レアチンキナーゼ活性を毎週、５〜６週間の間測
定し、負荷の最初のクレアチンキナーゼ活性と比
較する。 クレアチンキナーゼ活性を臨床化学に関するド
イツ協会（die deutsche Gesellschaft fu¨r
klinische Chemie）の推奨する最適標準法
（Clin.Chem.第22巻、1976年、第650〜662頁）に
より25℃で測定する。 ４つの対照血清の負荷試験の結果を第１図中に
まとめる。前記４つのクレアチンキナーゼプレパ
レートの負荷後の活性度（％）を、負荷後の活性
度を負荷前の出発活性度で割り、100をかけたも
の（％）として表わす。 例 ２〜６ 例１に記載されているように実施する。シスチ
ンのかわりに次のジスルフイドを例１におけると
同様に、同じ濃度（２ｍmol／）で使用する。 シスタミン シスチンメチルエステル ホモシスチン ペニシラミンジスルフイド及び ビス−（２−ピリジル−Ｎ−オキシド）ジスルフ
イド。 個々のSH−保護クレアチンキナーゼ（CK）−
プレパレートをトリクロルトリアジン（TCT）−
デキストランT40に個定し、対照もしくは標準液
中に装入した後、３週間負荷後の安定性をSH−
保護成分としてのシスチンに比較して測定する。
結果は次の表及び第２図から明らかである。第２
図は例中に記載したCK−対照もしくは標準血清
の負荷試験における安定性を示す。
チンキナーゼを使用したクレアチンキナーゼ対照
及び標準血清の製法及び該血清に関する。 従来技術 クレアチンキナーゼの測定は臨床化学分析にお
いて重要である。この種の分析の対照及びクレア
チンキナーゼ活性の測定用自動分析装置の較正の
ために、既知クレアチンキナーゼ活性含量を有す
る対照及び標準血清（Kontroll−und
Eichseren）を提供することは必要である。この
ことは対照もしくは標準血清中の成分が所定の時
間の間安定であり、かつこの時間の間クレアチン
キナーゼ活性があまり変化しないということが前
提である。更に、対照もしくは標準血清中に含有
されるクレアチンキナーゼは患者材料中に含有さ
れるクレアチンキナーゼと同じ挙動を示すという
ことも重要である。 対照もしくは標準血清は通常人血清、動物血清
又は牛血清アルブミンを基礎として構成される。
良好な測定性及び精確性及び最適な装置較正を得
るために、クレアチンキナーゼ含量を外来クレア
チンキナーゼ活性の添加により高めなければなら
ない。 この外来クレアチンキナーゼ活性は対照血清中
で不安定であるということはすでに公知である。
従つて、対照血清中でのクレアチンキナーゼ活性
を安定化するための実験は多くなされている。酵
素固有の不安定性のために、酵素を含有する対照
及び標準血清を貯蔵安定性改良のために凍結乾燥
させることは通常行なわれる。使用のためには凍
結乾燥対照及び標準血清を再構成する。一般に、
この再構成し、凍結乾燥物質から得られた溶液は
比較的短かい安定性を有し、この安定性はそれぞ
れのパラメーターにより約24時間〜約５日間であ
る。冷蔵庫温度での貯蔵は多くの場合前提であ
る。一般に行なわれるように、自動分析装置で同
時、もしくは短時間の間隔で多くのパラメーター
に関して対照もしくは較正を行なう場合、更に多
くの制限がある。この場合にはこの対照もしくは
標準血清を使用することのできる時間は最も短か
い安定性を有するパラメーターにより決定され
る。 冷蔵庫貯蔵、すなわち温度２〜８℃において、
液体媒体中での長期安定性は少なくとも１年であ
るのがよい。しかしながら今日まで、この問題は
解決されず、従つて溶液の形で存在し、ただちに
使用可能であり、かつ充填物を開封した後も長時
間、すなわち数週間冷蔵庫中での貯蔵において安
定である対照もしくは標準血清に対する要求があ
る。 従つて、再構成した対照もしくは標準血清の使
用可能期間を延長するための実験及び対照もしく
は標準血清パラメーターの安定性を、凍結乾燥が
もはや必要でなくなるまで改良するための実験が
多くなされている。 こうして、特にチオール化合物の添加によりク
レアチンキナーゼを酸化から、こうして活性損失
から守ることが実験されている。チオール化合物
の添加の欠点は、チオール化合物は還元剤とし
て、例えばH2O2の測定のための程色反応に影響
を与えることにより分析法を妨げるのでこのチオ
ール化合物を含有する血清中で多くのパラメータ
ーを同時に測定することができないということで
ある。 ヨーロツパ特許公開第0045122号公報は、対照
もしくは標準血清中のクレアチンキナーゼ安定性
の改良のために、好適な変性試薬、例えばジスル
フイドによる酵素の反応性SH−基の可逆的な変
性が次式により可逆的に変性することを記載して
いる。 酵素サブユニツト−SH＋Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ （酵素サブユニツト）−Ｓ−Ｓ−Ｒ＋Ｒ−SH このようにして酵素の反応性SH−基は酸化及
び他の血清阻害物質から保護される。 更なる可能性は西ドイツ国特許公開第2856988
号公報に記載されており、該方法においては凍結
乾燥対照又は標準血清をエチレングリコール又は
同族体約20〜40％の水溶液で再構成する。エチレ
ングリコールは対照及び標準血清マトリツクスの
凝固点を、該生成物を−20℃で液体で貯蔵するこ
とができるようになるまで低下させる。この形
で、酵素及び他のパラメーターは生成物中で数ケ
月以上安定である。低温冷蔵庫から取り出した
後、該生成物を加温するとすぐに使用できる。エ
チレングリコールは優れた殺菌剤であるので、対
照及び標準血清は冷蔵庫貯蔵において数週間安定
である。この方法で構成された生成物はデシジヨ
ン・コントロール（Decision Control）という市
販名で売られている。しかしながらこの方法は重
大な欠点を有する。高含量のエチレングリコール
により、生成物は患者血清と同様に挙動しない。
エチレングリコールの高い粘度は対照及び標準血
清のピペツト採取における挙動を変えるので、分
析誤差が生じることがある。更に、種々の分析的
検出法はエチレングリコールの添加により妨害さ
れる。この生成物はなおいくつかの欠点を有する
ので、対照又は標準血清として一般的に使用する
ことができない。 その他の提案としては“アドバンシズ・イン・
ビオケミカル・エンジニアリング（Advances in
Biochemical Engineering）”、スプリンガー出版
（Springer−Verlag）、第12巻、1979年、第83〜
90頁に記載されており、酵素を炭水化物に結合さ
せることにより安定化する。しかしながら、この
安定化は不十分である。 更に、ヨーロツパ特許公開第0049475号公報か
ら安定化のために、酵素を、官能基単位として無
水物を有するポリマーに共有結合させることが公
知である。この方法の欠点は、安定化反応の後、
酵素のはじめの活性のわずか約５〜10％のみが保
持されるということである。 発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は安定化したクレアチンキナーゼ
を使用したクレアチンキナーゼ測定用対照及び標
準血清の製法及び該血清に関する。ここで使用す
るクレアチンキナーゼは冷蔵庫の温度で少なくと
も１年間活性の損失なしに貯蔵することができ、
かつ充填容器を開封する際にも安定化のために凍
結乾燥することなしに長時間安定性であるのがよ
い。更に、安定化されたクレアチンキナーゼは液
体の形で存在し、ただちに使用可能であるのがよ
い。更に、安定化の際に活性がほぼ低下しないよ
うにクレアチンキナーゼが安定化されるのがよ
い。 問題点を解決するための手段 この目的のためにはまず安定化クレアチンキナ
ーゼを製造する。この際クレアチンキナーゼを任
意の順序で、 (a) ジスルフイド又はチオスルホネートのモル過
剰量と反応させ、かつ (b) 担体として水溶性多糖類のモル過剰量と反応
させることを特徴とするジスルフイド変性によ
るクレアチンキナーゼの安定化法を行う。 対照及び標準血清中のクレアチンキナーゼを２
安定価工程、すなわちジスルフイド交換による
SH基の保護及び水溶性多糖類への固定による酵
素安定化により、対照もしくは標準血清中の酵素
を液体の形で４〜８℃で重大な活性低下なしに長
期間貯蔵可能となるように安定化することができ
るということが見い出された。溶液の形のクレア
チンキナーゼを添加物なしに安定化することがで
きるという点にこの方法の大きな利点がある。こ
うして、公知法の欠点は克服された。 前記クレアチンキナーゼの安定化法は次にあげ
た、任意の順序で適用すべき工程からなる： (a) 人又は動物組織から単離したクレアチンキナ
ーゼをジスルフイド又はチオスルフオネートの
過剰量と反応させる。この際遊離したクレアチ
ンキナーゼのSH基はジスルフイドもしくはチ
オスルホネートと混合ジスルフイドの形成下に
反応する。この保護基は該当する対照又は標準
血清を使用する時、公知薬剤を添加することに
より再び容易に切断され、酵素の活性は再び示
される。 (b) クレアチンキナーゼを水溶性多糖類の過剰量
と反応させる、有利に多糖類を公知法で活性化
する。この活性化多糖類にクレアチンキナーゼ
は共有結合する。 両方の工程(a)及び(b)の順序は任意である。しか
しながら、はじめにSH基をジスルフイド又はチ
オスルホネートと反応させることにより保護し、
引き続きこのように得られたクレアチンキナーゼ
ジスルフイドを活性化多糖類と反応させることが
有利である。 この方法に関しては種々の動物種のクレアチン
キナーゼプレパレートを使用することができる。
こうしてクレアチンキナーゼは家兎筋肉、豚筋
肉、豚心臓、オランウータン−骨格筋肉、ニワト
リ筋肉、牛心臓又は他のものから得られた。この
方法において家兎筋肉又はニワトリ筋肉からの又
は豚心臓又は牛心臓からのクレアチンキナーゼが
有利である。 前記方法の工程(a)を実施する際、クレアチンキ
ナーゼとジスルフイド又はチオスルホネートと反
応させる。ジスルフイドとしては有利にシスチ
ン、ホモシスチン、又はシスチン誘導体、ペニシ
リナミンジスルフイド及び／又はビス−（２−ピ
リジル−Ｎ−オキシド）−ジスルフイドを使用す
る。シスチン誘導体としては有利にシスチンメチ
ルエステル及びシスタミンを使用する。ジスルフ
イド成分を酵素対ジスルフイド１：５〜１：20の
モル比（SH基に関して）で使用する。 同様に、チオスルホネートとの反応も好適であ
る。この際、チオスルホネートとしてはメタンチ
オスルホン酸−Ｓ−メチルエステルを使用する。
チオスルホネートを酵素対チオスルホネート１：
0.5〜１：５のモル比（SH基に関して）で使用す
る。 クレアチンキナーゼとジスルフイド又はチオス
ルホネートとの反応においては酵素は有利に0.01
〜１ｍmol／溶液の濃度で存在する。特に有利
であるのは0.05〜0.5ｍmol／の酵素濃度であ
る。 該方法の工程(b)においては、クレアチンキナー
ゼもしくはクレアチンキナーゼジスルフイドを水
溶性多糖類に共有結合させる。 有利な多糖類はデキストランである。しかしな
がら、非常に良好な結果は他の水溶性多糖類、例
えば特に溶解性デンプンでも達せられる。例えば
エピハロゲンヒドリンとの反応により得られた単
及び二糖類の高分子ポリマー（例えばFicoll）
も非常に好適であるとされている。 最も有利な実施形においては、クレアチンキナ
ーゼもしくはクレアチンキナーゼジスルフイドは
分子量4000〜500000の水溶性デキストランに共有
結合される。 クレアチンキナーゼと担体との反応において担
体として使用した多糖類は水中に溶けて存在す
る。水溶性中の担体の濃度は有利に１〜10％の範
囲である。 多糖類を自体公知法で活性化する。活性化は有
利に多糖類とトリクロルトリアジン、ブロムシア
ン又は１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジ
ニウム−テトラフルオロボレートとの反応により
行なわれる。活性剤対多糖類の比は両方の成分の
重量に関して１：５〜１：10の範囲が有利であ
る。次いで、この活性化多糖類をクレアチンキナ
ーゼと反応させる。この際、酵素対多糖類の比
を、重量に関して１：10〜１：30の範囲で使用す
るのが有利である。 前記両方の工程を実施することにより得られた
クレアチンキナーゼ誘導体はこの形で溶液中全く
安定化添加物なしに長期間、すなわち少なくとも
１年間、４〜８℃で、すなわち冷蔵庫中で保存す
ることができ、この際酵素の活性はほとんど変化
しない。 SH基がジスルフイド交換により保護されてい
る、溶解多糖類に結合したクレアチンキナーゼの
安定性を更に改良するために、特に有利な実施形
においては、酵素を含有する溶液を充填し、引き
続き不活性保護ガスで覆う。不活性保護ガスとし
ては窒素が有利に使用される。一定の炭酸塩／炭
酸水素塩−目標値が所望である場合、保護ガスと
して窒素及びCO2からの混合物を使用するのが有
利である。 このように安定化したクレアチンキナーゼ誘導
体は対照又は標準血清の製造に使用される。クレ
アチンキナーゼ活性の測定のためには、酵素の
SH基保護のために導入したジスルフイド橋を再
び切断しなければならない。このことは自体公知
法でチオール化合物の添加により行なわれる。ク
レアチンキナーゼ活性の公知測定法においては一
般にチオール化合物が添加され、このチオール化
合物は試料中に酸化されているか又は抑制された
形で存在するクレアチンキナーゼ酵素の再活性化
に働らく。試薬中に含有されるチオール化合物
は、本発明において得られた安定なクレアチンキ
ナーゼ誘導体をテスト実施のための所定の時間内
に活性誘導体に完全に変換するために十分であ
る。この際チオール化合物としては有利にＮ−ア
セチルシステインを使用する。 クレアチンキナーゼ測定のための対照又は標準
血清の製造において、好適なマトリツクスが選択
される。通常、人血清、動物血清又は純粋な蛋白
溶液をベースとする対照及び標準用血清を常法で
構成する。このマトリツクスに本発明において製
造した、安定化クレアチンキナーゼ誘導体を使用
目的に好適な活性で添加する。更に、対照血清の
製造のために常用の添加物、例えば保存剤及び／
又は抗生物質を添加する。対照又は標準血清はこ
の形で４〜８℃で貯蔵することができる。対照又
は標準血清を凍結乾燥させ、次いで使用するため
に水で再構成することもできる。 対照又は標準血清の製造用マトリツクスとして
人血清又は動物血清を使用する場合、血清中に内
因的に含有される酵素活性を好適な処置により不
活性化することは有利である。この際、血清中の
残留活性を、後に対照又は標準血清中に所望な活
性の３％以下となるように低下させることが特に
有利である。 対照又は標準血清の製造のためには純粋な蛋白
質溶液を使用するのが特に有利であり、この組成
は対照又は標準用材料の所望の利用目的により調
節される。種々の異なる測定のための標準として
使用することのできる、全般的に使用可能な対照
血清の製造のためには、すべての主な酵素、基質
及び代謝産物を蛋白質溶液に添加する。脂質は好
適な脂質フラクシヨンの添加により増加する。 対照又は標準血清を液状で長時間貯蔵すべき
時、血清を菌による汚染に対して十分に保存する
のが特に有利である。このためには、有利に貯蔵
のための瓶中に充填する前に該溶液を無菌又は少
なくとも僅少菌数に濾過するが、この際、孔径≦
0.2μｍの濾過膜を使用する。次いで、血清に保存
剤を添加する。特に、ナトリウムアジドを使用す
るのが有利である。抗生物質、例えばクロラムフ
エニコール、ゲンタマイシン及び／又はペニシリ
ンは血清の保存に好適である。 本発明のもう１つの課題は、クレアチンキナー
ゼをそのジスルフイド又はチオスルホネートとの
反応生成物の形で、かつ水溶性多糖類に結合させ
て含有するクレアチンキナーゼ測定用対照又は標
準血清である。 対照もしくは標準血清が活性50〜1000U／ml
（25℃）のクレアチンキナーゼを含有しているの
が有利である。150〜600U／mlの活性を有するク
レアチンキナーゼを使用するのが特に有利であ
る。 本発明において安定化したクレアチンキナーゼ
は、酵素クレアチンキナーゼがジスルフイド又は
チオスルホネートとの反応生成物の形で、かつ水
溶性多糖類に結合して存在することを特徴とす
る。この本発明によるクレアチンキナーゼは特に
クレアチンキナーゼの測定のための対照及び標準
血清を製造するために好適である。 安定化した可溶性クレアチンキナーゼ誘導体を
有する本発明により製造した対照もしくは標準血
清は４〜８℃で少なくとも１年は安定である。本
発明による該血清は液状で冷蔵庫温度において
も、凍結乾燥した形においても貯蔵することがで
きる。凍結乾燥した対照もしくは標準血清は水又
は好適な希釈剤での再構成の後も長時間安定であ
る。 実施例 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。 本発明において得られたクレアチンキナーゼ誘
導体を熱負荷実験により判定した。このためには
対照又は標準液体試料を十分に閉じ、35℃で貯蔵
する。35℃で１、２、３及び６週間貯蔵した後、
活性を測定し、負荷の開始時でのクレアチンキナ
ーゼ活性と比較する。35℃で貯蔵した試料の検出
が３週間後、なお少なくとも90％を示すならば、
対照及び標準血清の酵素活性は冷蔵庫での貯蔵に
関して少なくとも１年間は安定であることを示
す。 例 １ (A) 安定クレアチンキナーゼ誘導体の製法 家兎筋肉−クレアチンキナーゼ164mgを１
あたりシスチン２ｍmolを含有する炭酸塩緩衝
液（10ｍＭ、PH8.0）20mlに溶かし、室温で１
時間放置する。炭酸塩緩衝液（10ｍＭ、PH8.0）
に対して透析を行なう。 デキストランT40 ６ｇを水40ml中に溶かし、
氷浴中で±０℃に冷却する。低温冷却したジメ
チルホルムアミド10ml中に２，４，６−トリク
ロル−１，３，５−トリアジン600mgを溶かし、
配合物に添加する。PH値を0.5N NaOHを添加
することにより5.0に調節し、保持する。反応
の終了後、すなわちPH変化がおこらなくなつた
時、活性化デキストランをその都度容積２倍過
剰量の低温冷却アセトンで沈殿させることによ
り精製する。アセトン沈殿をその都度氷水で溶
かす。 クレアチンキナーゼ溶液（１mlあたり蛋白質
約8.6mg）部分量をトリクロルトリアジン活性
化デキストラン溶液（17.2mg／ml）同容積と混
合する。該溶液を24時間室温で放置する。その
後、グリシン緩衝液（1M、PH8.0）10容量％を
添加し、該溶液を新たに１夜放置する。 比較のために、SH基が保護されていない、
新たに製造した家兎筋肉−クレアチンキナーゼ
溶液を、前記のように直接活性化デキストラン
T40に結合する。ここでも蛋白質対デキストラ
ンの比は１：２である。 再活性化可能なクレアチンキナーゼ活性の収
量は次のようである：シスチンとの反応による
SH−保護後92％及びシスチンによるSH−保護
及びデキストランT40への固定の後64％。 (B) 対照及び標準血清の製造 対照血清のためのマトリツクスは６％牛血清
アルブミン溶液である。全般的な対照もしくは
標準血清の製造のためにはすべての主要な酵素
（例えば、α−アミラーゼ、AP、GOT、
GPT、γ−GT、LDH、HBDH、リパーゼ）、
基質（脂質又は脂質フラクシヨン）、代謝物質
（例えば、アルブミン、クレアチニン、グルコ
ース、尿素、尿酸、コレステリン、燐脂質、ト
リグリセリド）及び電解質（例えば、Na、Ｋ、
Ca、Li、Fe、Mg、Cl、燐酸塩）を該蛋白質溶
液に添加する。脂質を好適な脂質フラクシヨン
を添加することにより増量する。対照又は標準
血清のPH値を約7.0に調節する。 菌による汚染のない液状で対照又は標準血清
を長期間保存するためには、対照血清マトリツ
クスを孔径0.2μのフイルター膜で濾過して菌を
僅かにし、１あたりナトリウムアジド250mg
及び１あたりゲンタマイシン100mgを添加し
て保存する。 該対照血清マトリツクスにそれぞれ次のものを
添加する； (a) 家兎筋肉クレアチンキナーゼ、天然 (b) 家兎筋肉クレアチンキナーゼ、SH基をシス
チンで保護、 (c) トリクロルトリアジン活性デキストランT40
に共有結している、SH基を保護していない家
兎筋肉クレアチンキナーゼ、 (d) SH基をシスチンで保護し、トリクロルトリ
アジン活性化デキストランT40に共有結合して
いる家兎筋肉クレアチンキナーゼ。 すべての血清に関して、クレアチンキナーゼ活
性を約500U／に調節する。これら４つの対照
もしくは標準血清に関して、熱負荷の安定性実験
を行なう。個々の溶液を小さい瓶中に５mlまで充
填し、十分に密閉し、35℃で液状で貯蔵する。ク
レアチンキナーゼ活性を毎週、５〜６週間の間測
定し、負荷の最初のクレアチンキナーゼ活性と比
較する。 クレアチンキナーゼ活性を臨床化学に関するド
イツ協会（die deutsche Gesellschaft fu¨r
klinische Chemie）の推奨する最適標準法
（Clin.Chem.第22巻、1976年、第650〜662頁）に
より25℃で測定する。 ４つの対照血清の負荷試験の結果を第１図中に
まとめる。前記４つのクレアチンキナーゼプレパ
レートの負荷後の活性度（％）を、負荷後の活性
度を負荷前の出発活性度で割り、100をかけたも
の（％）として表わす。 例 ２〜６ 例１に記載されているように実施する。シスチ
ンのかわりに次のジスルフイドを例１におけると
同様に、同じ濃度（２ｍmol／）で使用する。 シスタミン シスチンメチルエステル ホモシスチン ペニシラミンジスルフイド及び ビス−（２−ピリジル−Ｎ−オキシド）ジスルフ
イド。 個々のSH−保護クレアチンキナーゼ（CK）−
プレパレートをトリクロルトリアジン（TCT）−
デキストランT40に個定し、対照もしくは標準液
中に装入した後、３週間負荷後の安定性をSH−
保護成分としてのシスチンに比較して測定する。
結果は次の表及び第２図から明らかである。第２
図は例中に記載したCK−対照もしくは標準血清
の負荷試験における安定性を示す。
【表】
例 ７
安定化CKの製造、しかしこの際SH保護を例１
〜６に記載したようにジスルフイド交換によるの
ではなく、チオスルホネートとの反応により行な
う。 家兎筋肉−CK17mgをグリシン緩衝液（10ｍＭ、
PH7.8）２ml中に溶かし、メタンチオスルホン酸
−Ｓ−メチルエステル溶液（グリシン緩衝液10ｍ
Ｍ中20ｍＭ、PH7.8）50μと０℃で30分間反応さ
せる。 セフアデツクスG25−カラムの精製を行ない、
炭酸塩緩衝液PH8.0、10ｍＭに対して透析し、得
られたCK−誘導体を例１と同様にしてTCT−活
性化デキストランT40に固定する。 ３週間の負荷後、例１〜６により製造した対
照／標準血清中のCK−活性は58％である。 例 ８〜11 種々の動物種のCK−プレパレートを使用する。
SH−保護、デキストランへの固定及び対照又は
標準血清の製造を例１により実施する。 液体対照血清を35℃で３週間貯蔵した後の開始
時活性度の検出は、使用したCK−プレパレート
において次のようである：
〜６に記載したようにジスルフイド交換によるの
ではなく、チオスルホネートとの反応により行な
う。 家兎筋肉−CK17mgをグリシン緩衝液（10ｍＭ、
PH7.8）２ml中に溶かし、メタンチオスルホン酸
−Ｓ−メチルエステル溶液（グリシン緩衝液10ｍ
Ｍ中20ｍＭ、PH7.8）50μと０℃で30分間反応さ
せる。 セフアデツクスG25−カラムの精製を行ない、
炭酸塩緩衝液PH8.0、10ｍＭに対して透析し、得
られたCK−誘導体を例１と同様にしてTCT−活
性化デキストランT40に固定する。 ３週間の負荷後、例１〜６により製造した対
照／標準血清中のCK−活性は58％である。 例 ８〜11 種々の動物種のCK−プレパレートを使用する。
SH−保護、デキストランへの固定及び対照又は
標準血清の製造を例１により実施する。 液体対照血清を35℃で３週間貯蔵した後の開始
時活性度の検出は、使用したCK−プレパレート
において次のようである：
【表】
例 12
天然もしくはSH保護された家兎筋肉−CKを使
用する。 SH−保護は例１に示したように、シスチンと
の反応により行なわれる。 酵素の固定はBrCN−活性化デキストランT40
で行なうが、この際主にマーシヤル（Marshall）
により記載された標準法（活性化及び固定化）を
使用する（American Chemical Society
Symposium Series第123巻（1980年）、第125〜
140頁）。BrCN対デキストランの比は１：３であ
る。蛋白質対デキストランの比は１：６である。 再活性化可能なクレアチンキナーゼ活性の収率
は次のようである：SH保護酵素に関して（シス
チンとの反応後）92％、SH−保護され、かつデ
キストランに固定された酵素に関して62％及び天
然で、デキストランに固定された酵素64％。 例１と同様にして、対照血清マトリツクスにそ
れぞれ次のものを約500U／添加する： (a) 家兎筋肉−CK、天然 (b) シスチンによりSH−保護された家兎筋肉−
CK (c) SH保護はされていないが、BrCN活性化デ
キストランT40に固定された家兎筋肉−CK (d) シスチンによりSH−保護され、かつBrCN
活性化デキストランT40に固定された家兎筋肉
−CK 第２図は負荷試験の結果を示す。 例 13 天然及びSH−保護家兎筋肉−CKを使用する。
SH−保護を例１によりシスチンとの反応により
行なう。 酵素の固定はJ.J.マーシヤル（Marshall）
（American Chemical Society Symposium
Series第123巻、1980年、第125〜140頁）により
デキストランT40で行なう。このデキストラン
T40はJ.コーン（Kohn）及びM.ウイルチエツク
（Wilchek）（Appl.Biochem.Biotech.）、第９巻、
1984年、第285〜305頁によりCDAP−BF4で活性
化されたものである。 例１と同様にして対照血清マトリツクスにそれ
ぞれ次のものを約500U／添加する： (a) 家兎筋肉−CK、天然、 (b) シスチンによりSH−保護された家兎筋肉、 (c) SH−保護はされていないが、CDAP−活性
化デキストランT40に固定された家兎筋肉−
CK、 (d) CDAP−活性化デキストランT40に固定され
たSH−保護家兎筋肉−CK。 対照血清瓶の１部を付加的に窒素（保護ガス雰
囲気）で覆う。 第３及び第３ａ図は、他の例と同様に対照血清
を35℃で液体で貯蔵する際の負荷実験の結果を示
す。第３ａ図はCK−安定化への個々の処置の相
乗作用を示す。 例 14 例13に記載したように実施する。SH保護家兎
筋肉−CK（シスチンによるSH−保護）を使用し、
蛋白質対デキストランの比を１：３〜１：20で変
化させる。 蛋白質対デキストラン比に依存するSH保護さ
れ、デキストランT40に固定された酵素プレパレ
ートの活性収率を次の表中にまとめる。
用する。 SH−保護は例１に示したように、シスチンと
の反応により行なわれる。 酵素の固定はBrCN−活性化デキストランT40
で行なうが、この際主にマーシヤル（Marshall）
により記載された標準法（活性化及び固定化）を
使用する（American Chemical Society
Symposium Series第123巻（1980年）、第125〜
140頁）。BrCN対デキストランの比は１：３であ
る。蛋白質対デキストランの比は１：６である。 再活性化可能なクレアチンキナーゼ活性の収率
は次のようである：SH保護酵素に関して（シス
チンとの反応後）92％、SH−保護され、かつデ
キストランに固定された酵素に関して62％及び天
然で、デキストランに固定された酵素64％。 例１と同様にして、対照血清マトリツクスにそ
れぞれ次のものを約500U／添加する： (a) 家兎筋肉−CK、天然 (b) シスチンによりSH−保護された家兎筋肉−
CK (c) SH保護はされていないが、BrCN活性化デ
キストランT40に固定された家兎筋肉−CK (d) シスチンによりSH−保護され、かつBrCN
活性化デキストランT40に固定された家兎筋肉
−CK 第２図は負荷試験の結果を示す。 例 13 天然及びSH−保護家兎筋肉−CKを使用する。
SH−保護を例１によりシスチンとの反応により
行なう。 酵素の固定はJ.J.マーシヤル（Marshall）
（American Chemical Society Symposium
Series第123巻、1980年、第125〜140頁）により
デキストランT40で行なう。このデキストラン
T40はJ.コーン（Kohn）及びM.ウイルチエツク
（Wilchek）（Appl.Biochem.Biotech.）、第９巻、
1984年、第285〜305頁によりCDAP−BF4で活性
化されたものである。 例１と同様にして対照血清マトリツクスにそれ
ぞれ次のものを約500U／添加する： (a) 家兎筋肉−CK、天然、 (b) シスチンによりSH−保護された家兎筋肉、 (c) SH−保護はされていないが、CDAP−活性
化デキストランT40に固定された家兎筋肉−
CK、 (d) CDAP−活性化デキストランT40に固定され
たSH−保護家兎筋肉−CK。 対照血清瓶の１部を付加的に窒素（保護ガス雰
囲気）で覆う。 第３及び第３ａ図は、他の例と同様に対照血清
を35℃で液体で貯蔵する際の負荷実験の結果を示
す。第３ａ図はCK−安定化への個々の処置の相
乗作用を示す。 例 14 例13に記載したように実施する。SH保護家兎
筋肉−CK（シスチンによるSH−保護）を使用し、
蛋白質対デキストランの比を１：３〜１：20で変
化させる。 蛋白質対デキストラン比に依存するSH保護さ
れ、デキストランT40に固定された酵素プレパレ
ートの活性収率を次の表中にまとめる。
【表】
第４図は負荷実験の結果を示す。対照血清プレ
パレートを空気雰囲気下に35℃で液体で貯蔵す
る。 例 15及び16 種々の動物種のCK−プレパレートを使用する。
SH−保護及びデキストランの固定は例13により
実施する。 空気雰囲気下に35℃で液体の対照血清を３週間
貯蔵した後、開始時活性の検出は個々の酵素に関
して約70％である。
パレートを空気雰囲気下に35℃で液体で貯蔵す
る。 例 15及び16 種々の動物種のCK−プレパレートを使用する。
SH−保護及びデキストランの固定は例13により
実施する。 空気雰囲気下に35℃で液体の対照血清を３週間
貯蔵した後、開始時活性の検出は個々の酵素に関
して約70％である。
【表】
例 17
固定していない、天然家兎筋肉−CK、SH−保
護を有する家兎筋肉−CK（シスチンで変換）及び
TCT、BrCN及びCDAPにより水溶性デキスト
ランT40に固定された、天然家兎筋肉−CK、SH
−保護を有する家兎筋肉−CKをそれぞれ新鮮人
血清100mlに溶かす。CK−活性を300〜600U／
に調節する。 安定なCK−誘導体の製造は例１、12、13もし
くは14により行なわれる。蛋白質：デキストラン
の比は１：10もしくは１：20を使用する。 必要であれば、すべての主要な酵素、基質及び
代謝産物を同様に添加し、“全般的”対照もしく
は標準血清が得られる。 対照血清のPH値は2NHClで約6.0に調節する。 得られた溶液を透明に濾過し、瓶中に４mlの量
で充填し、かつ凍結乾燥する。凍結乾燥試料を冷
蔵庫温度で貯蔵する。 試料の１部を35℃で３週間保持する。安定性を
試験するために、温度負荷及び温度非負荷試料中
のCK−活性を水４mlで再構成した後で測定する。 対照／標準血清のPH値は、水でプレパレートを
再構成した後約7.0である。負荷試料中のCK活性
（％）の検出を非負荷試料と比較し第１表に記載
した。 試料の１部を水で再構成した後、これに保存の
ためにナトリウムアジド250mg／及びゲンタマ
イシン100mg／を添加し、３週間４℃で貯蔵す
る。種々の試料中のCK−活性を毎週測定し、貯
蔵試料中のCK−活性の検出（％）を開始時の値
に比較して第１表に示す。
護を有する家兎筋肉−CK（シスチンで変換）及び
TCT、BrCN及びCDAPにより水溶性デキスト
ランT40に固定された、天然家兎筋肉−CK、SH
−保護を有する家兎筋肉−CKをそれぞれ新鮮人
血清100mlに溶かす。CK−活性を300〜600U／
に調節する。 安定なCK−誘導体の製造は例１、12、13もし
くは14により行なわれる。蛋白質：デキストラン
の比は１：10もしくは１：20を使用する。 必要であれば、すべての主要な酵素、基質及び
代謝産物を同様に添加し、“全般的”対照もしく
は標準血清が得られる。 対照血清のPH値は2NHClで約6.0に調節する。 得られた溶液を透明に濾過し、瓶中に４mlの量
で充填し、かつ凍結乾燥する。凍結乾燥試料を冷
蔵庫温度で貯蔵する。 試料の１部を35℃で３週間保持する。安定性を
試験するために、温度負荷及び温度非負荷試料中
のCK−活性を水４mlで再構成した後で測定する。 対照／標準血清のPH値は、水でプレパレートを
再構成した後約7.0である。負荷試料中のCK活性
（％）の検出を非負荷試料と比較し第１表に記載
した。 試料の１部を水で再構成した後、これに保存の
ためにナトリウムアジド250mg／及びゲンタマ
イシン100mg／を添加し、３週間４℃で貯蔵す
る。種々の試料中のCK−活性を毎週測定し、貯
蔵試料中のCK−活性の検出（％）を開始時の値
に比較して第１表に示す。
添付図面は本発明による実施例の結果を示すグ
ラフ図である。第１図は実施例１に記載したCK
−対照もしくは標準血清プレパレートの負荷試験
における安定性を示し、縦軸に活性度、横軸に35
℃における貯蔵期間（週）を示す。第２図は実施
例２に記載したCK−対照もしくは標準血清プレ
パレートの負荷試験における安定性を示し、第１
図同様縦軸に活性度、横軸に35℃における貯蔵期
間（週）を示す。第３図は実施例13に記載された
CK−対照もしくは標準血清プレパレートの負荷
試験における安定性を示し、窒素被覆による影響
を示している。第３ａ図はCK−安定化のための
個々の処置の相乗作用を示す。Woは週間の略語
である。第４図は例14に記載したCK−対照もし
くは標準血清プレパレートの安定性を示し、安定
化CK−誘導体の製造の際に蛋白質対デキストラ
ンの比を変化させる（１：３、１：６、１：10及
び１：20）。
ラフ図である。第１図は実施例１に記載したCK
−対照もしくは標準血清プレパレートの負荷試験
における安定性を示し、縦軸に活性度、横軸に35
℃における貯蔵期間（週）を示す。第２図は実施
例２に記載したCK−対照もしくは標準血清プレ
パレートの負荷試験における安定性を示し、第１
図同様縦軸に活性度、横軸に35℃における貯蔵期
間（週）を示す。第３図は実施例13に記載された
CK−対照もしくは標準血清プレパレートの負荷
試験における安定性を示し、窒素被覆による影響
を示している。第３ａ図はCK−安定化のための
個々の処置の相乗作用を示す。Woは週間の略語
である。第４図は例14に記載したCK−対照もし
くは標準血清プレパレートの安定性を示し、安定
化CK−誘導体の製造の際に蛋白質対デキストラ
ンの比を変化させる（１：３、１：６、１：10及
び１：20）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ジスルフイド又はチオスルホネートとの反応
及び水溶性多糖類との反応により得られたクレア
チンキナーゼ誘導体を好適なマトリツクスに添加
し、かつ該溶液を場合により好適な保存剤及び／
又は殺菌剤の添加により安定化することを特徴と
するクレアチンキナーゼを測定するための対照及
び標準血清の製法。 ２ クレアチンキナーゼをジスルフイド又はチオ
スルホネートとの反応生成物の形で、かつ水溶性
多糖類に結合させて含有するクレアチンキナーゼ
測定用対照又は標準血清。 ３ クレアチンキナーゼの活性が50〜1000U／
である特許請求の範囲第２項記載の対照又は標準
血清。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3540076.5 | 1985-11-12 | ||
| DE19853540076 DE3540076A1 (de) | 1985-11-12 | 1985-11-12 | Verfahren zur stabilisierung von creatinkinase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62118887A JPS62118887A (ja) | 1987-05-30 |
| JPH0335920B2 true JPH0335920B2 (ja) | 1991-05-29 |
Family
ID=6285753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61267907A Granted JPS62118887A (ja) | 1985-11-12 | 1986-11-12 | クレアチンキナーゼ用対照及び標準血清の製法及び該血清 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4931392A (ja) |
| EP (1) | EP0222380B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62118887A (ja) |
| AT (1) | ATE87030T1 (ja) |
| DE (2) | DE3540076A1 (ja) |
| ES (1) | ES2054609T3 (ja) |
| GR (1) | GR3007427T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DE4011084A1 (de) * | 1990-04-05 | 1991-10-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Saccharid-modifizierte, wasserloesliche proteine |
| US5217890A (en) * | 1991-08-20 | 1993-06-08 | Eastman Kodak Company | Stabilized composition containing creatine kinase and protein having blocked sulfhydryl groups |
| US5298406A (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Formulation for stabilizing enzymatic activity and immunoreactivity of creatine kinase and creatine kinase isoenzymes |
| US5405769A (en) * | 1993-04-08 | 1995-04-11 | National Research Council Of Canada | Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase |
| WO1995008348A1 (en) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs |
| US5849301A (en) * | 1993-09-22 | 1998-12-15 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Producing immunogenic constructs using soluable carbohydrates activated via organic cyanylating reagents |
| US6309646B1 (en) | 1996-05-09 | 2001-10-30 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Protein-polysaccharide conjugate vaccines and other immunological reagents prepared using homobifunctional and heterobifunctional vinylsulfones, and processes for preparing the conjugates |
| DE19627075A1 (de) * | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Modifizierte Lactatdehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
| ES2297889T3 (es) | 1997-07-14 | 2008-05-01 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas. |
| US5981249A (en) * | 1998-02-05 | 1999-11-09 | Spectral Diagnostics, Inc. | Single-chain polypeptides comprising creatine kinase M and creatine kinase B |
| CA2359345A1 (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| DE60118621T2 (de) * | 2000-10-27 | 2007-05-03 | The Johns Hopkins University | Verfahren zur bestimmung der nitrosylierung von proteinen |
| CA2433479A1 (en) * | 2002-07-22 | 2004-01-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugate of a tissue non-specific alkaline phosphatase and dextran, process for its production and use thereof |
| EP1405907A3 (en) * | 2002-07-22 | 2004-10-13 | Roche Diagnostics GmbH | Conjugate of a tissue non-specific alkaline phosphatase and dextran, process for its production and use thereof |
| WO2014182666A1 (en) * | 2013-05-06 | 2014-11-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Stabilization of labile analytes in reference materials |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3876501A (en) * | 1973-05-17 | 1975-04-08 | Baxter Laboratories Inc | Binding enzymes to activated water-soluble carbohydrates |
| US4339533A (en) * | 1980-07-30 | 1982-07-13 | Technicon Instruments Corporation | Stabilization of creatine kinase (CK) and its application as a reference standard |
| US4652524A (en) * | 1980-10-02 | 1987-03-24 | Ivan E. Modrovich | Soluble stabilized enzymes |
-
1985
- 1985-11-12 DE DE19853540076 patent/DE3540076A1/de not_active Ceased
-
1986
- 1986-11-12 DE DE8686115699T patent/DE3688041D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-12 EP EP86115699A patent/EP0222380B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-12 ES ES86115699T patent/ES2054609T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-12 AT AT86115699T patent/ATE87030T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-12 JP JP61267907A patent/JPS62118887A/ja active Granted
-
1989
- 1989-05-15 US US07/355,039 patent/US4931392A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-03-23 GR GR920403233T patent/GR3007427T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3540076A1 (de) | 1987-05-14 |
| JPS62118887A (ja) | 1987-05-30 |
| ATE87030T1 (de) | 1993-04-15 |
| DE3688041D1 (de) | 1993-04-22 |
| EP0222380A3 (en) | 1989-01-04 |
| EP0222380B1 (de) | 1993-03-17 |
| GR3007427T3 (ja) | 1993-07-30 |
| ES2054609T3 (es) | 1994-08-16 |
| EP0222380A2 (de) | 1987-05-20 |
| US4931392A (en) | 1990-06-05 |
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