JPH1075779A - ビリルビンオキシダーゼの安定化 - Google Patents
ビリルビンオキシダーゼの安定化Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ビリルビンオキシダーゼを液状で長期間安定
化すること。 【解決手段】 ｐＨ７．０〜１２．０の間に緩衝能をも
たせたビリルビンオキシダーゼ含有液に下記一般式
(１)、(２)または(３)で示される含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の一種または二種以上を添加すること
を特徴とする。 【化１】 【効果】 液状でのビリルビンオキシダーゼの安定性が
飛躍的に向上し、ビリルビンオキシダーゼ試薬を用いる
測定操作が簡便に行える。
化すること。 【解決手段】 ｐＨ７．０〜１２．０の間に緩衝能をも
たせたビリルビンオキシダーゼ含有液に下記一般式
(１)、(２)または(３)で示される含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の一種または二種以上を添加すること
を特徴とする。 【化１】 【効果】 液状でのビリルビンオキシダーゼの安定性が
飛躍的に向上し、ビリルビンオキシダーゼ試薬を用いる
測定操作が簡便に行える。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ビリルビンオキシ
ダーゼの安定化方法、さらに詳しくは、ビリルビンオキ
シダーゼを液状で保存する場合において、ビリルビンオ
キシダーゼの酵素活性を長期間安定に保持することので
きる安定化方法および該方法を適用したビリルビンオキ
シダーゼ試薬に関する。
ダーゼの安定化方法、さらに詳しくは、ビリルビンオキ
シダーゼを液状で保存する場合において、ビリルビンオ
キシダーゼの酵素活性を長期間安定に保持することので
きる安定化方法および該方法を適用したビリルビンオキ
シダーゼ試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビン
をビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素であ
り、臨床検査上、生体中のビリルビンの光学的測定法お
よび測定試薬に用いられる。ビリルビンオキシダーゼを
用いてビリルビンを測定する試薬(本明細書において
は、ビリルビンオキシダーゼ試薬と称する）としては総
ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン測定用試薬
とが挙げられ、ビリルビンオキシダーゼはその凍結乾燥
品のごとき粉末を緩衝液に溶解ないしは分散し、水性液
状にして使用される。総ビリルビン測定用試薬には、ｐ
Ｈ６.０〜９.０の範囲の緩衝液、例えば、Ｎ−(２−ア
セトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(略称ＡＣ
ＥＳ）緩衝液などのグッド緩衝液、またはリン酸緩衝液
が用いられ、反応促進のために、コール酸ナトリウム、
ラウリル硫酸ナトリウム(略称ＳＤＳ）などの直接化剤
を該緩衝液に添加するのが好ましい。
をビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素であ
り、臨床検査上、生体中のビリルビンの光学的測定法お
よび測定試薬に用いられる。ビリルビンオキシダーゼを
用いてビリルビンを測定する試薬(本明細書において
は、ビリルビンオキシダーゼ試薬と称する）としては総
ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン測定用試薬
とが挙げられ、ビリルビンオキシダーゼはその凍結乾燥
品のごとき粉末を緩衝液に溶解ないしは分散し、水性液
状にして使用される。総ビリルビン測定用試薬には、ｐ
Ｈ６.０〜９.０の範囲の緩衝液、例えば、Ｎ−(２−ア
セトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(略称ＡＣ
ＥＳ）緩衝液などのグッド緩衝液、またはリン酸緩衝液
が用いられ、反応促進のために、コール酸ナトリウム、
ラウリル硫酸ナトリウム(略称ＳＤＳ）などの直接化剤
を該緩衝液に添加するのが好ましい。
【０００３】直接ビリルビン測定用試薬には、ｐＨ３.
０〜４.５の範囲の緩衝液、例えば、乳酸−乳酸ナトリ
ウム緩衝液、クエン酸緩衝液などが用いられる。ビリル
ビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属由
来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachydermatsum
odae）の産生するビリルビンオキシダーゼ等多くのもの
が知られており、その使用量は所望の酵素活性を示す範
囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４〜１
０単位／ml、好ましくは、総ビリルビン測定用には０.
０８〜４単位／ml、直接ビリルビン測定用には、０.４
〜８単位／mlの範囲で用いられる。ところが、ビリルビ
ンオキシダーゼは、液状で非常に不安定で、低温におい
てもpH９.２〜９.７の０.１Ｍリン酸緩衝液中で９６時
間安定であるに過ぎず［アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、第
４６巻第８号、２０３１〜２０３４頁、１９８２年］、
また、常温(２５℃）において本酵素の安定ｐＨで保存
する場合であっても、１４日間後には、１０.５％の残
存活性しか示さない。
０〜４.５の範囲の緩衝液、例えば、乳酸−乳酸ナトリ
ウム緩衝液、クエン酸緩衝液などが用いられる。ビリル
ビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属由
来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachydermatsum
odae）の産生するビリルビンオキシダーゼ等多くのもの
が知られており、その使用量は所望の酵素活性を示す範
囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４〜１
０単位／ml、好ましくは、総ビリルビン測定用には０.
０８〜４単位／ml、直接ビリルビン測定用には、０.４
〜８単位／mlの範囲で用いられる。ところが、ビリルビ
ンオキシダーゼは、液状で非常に不安定で、低温におい
てもpH９.２〜９.７の０.１Ｍリン酸緩衝液中で９６時
間安定であるに過ぎず［アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、第
４６巻第８号、２０３１〜２０３４頁、１９８２年］、
また、常温(２５℃）において本酵素の安定ｐＨで保存
する場合であっても、１４日間後には、１０.５％の残
存活性しか示さない。
【０００４】一般に、ビリルビンオキシダーゼ試薬は凍
結乾燥品のごとき粉末で市販されているが、この場合、
用時、必要量を液状に調製しなければならず、手間がか
かるほか、一旦調製すると短期間のうちに使用しなけれ
ばならない。一方、ビリルビンオキシダーゼ試薬が液状
で入手できれば、ビリルビンの測定操作を簡便に行うこ
とができるが、そのためにはビリルビンオキシダーゼが
液状で長期間安定であることが必要である。従来、ビリ
ルビンオキシダーゼを液状で安定化する方法として、ｐ
Ｈ８以上、好ましくはｐＨ８〜１０のアルカリ性緩衝液
で、例えばジエチルバルビツール酸ナトリウム・塩酸緩
衝液、トリスヒドロキシアミノメタン・塩酸緩衝液な
ど、または、これらの緩衝液に乳糖アラニン、グリシ
ン、牛アルブミン、シクロデキストリン等の安定化剤、
窒化ソーダ等を適宣添加配合した溶液で保存する方法
(特開昭60-151561）、ｐＨ７〜９付近のリン酸緩衝液、
トリス・塩酸塩緩衝液、ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ
緩衝液で保存する方法(特開昭61-209587）、そしてｐＨ
５〜１０.５の０.１Ｍリン酸緩衝液で保存する方法(特
公昭62-33880）等が知られている。しかし、これらの方
法を用いてもビリルビンオキシダーゼの活性を長期間保
持することは困難である。
結乾燥品のごとき粉末で市販されているが、この場合、
用時、必要量を液状に調製しなければならず、手間がか
かるほか、一旦調製すると短期間のうちに使用しなけれ
ばならない。一方、ビリルビンオキシダーゼ試薬が液状
で入手できれば、ビリルビンの測定操作を簡便に行うこ
とができるが、そのためにはビリルビンオキシダーゼが
液状で長期間安定であることが必要である。従来、ビリ
ルビンオキシダーゼを液状で安定化する方法として、ｐ
Ｈ８以上、好ましくはｐＨ８〜１０のアルカリ性緩衝液
で、例えばジエチルバルビツール酸ナトリウム・塩酸緩
衝液、トリスヒドロキシアミノメタン・塩酸緩衝液な
ど、または、これらの緩衝液に乳糖アラニン、グリシ
ン、牛アルブミン、シクロデキストリン等の安定化剤、
窒化ソーダ等を適宣添加配合した溶液で保存する方法
(特開昭60-151561）、ｐＨ７〜９付近のリン酸緩衝液、
トリス・塩酸塩緩衝液、ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ
緩衝液で保存する方法(特開昭61-209587）、そしてｐＨ
５〜１０.５の０.１Ｍリン酸緩衝液で保存する方法(特
公昭62-33880）等が知られている。しかし、これらの方
法を用いてもビリルビンオキシダーゼの活性を長期間保
持することは困難である。
【０００５】また、ビリルビンオキシダーゼの活性を安
定化する他の方法として、アスパラギン酸および／又は
トリプトファンを添加する方法(特開平６−２８４８８
６）があり、これらの安定化剤の中で、トリプトファン
に安定化効果があるが、ビリルビンオキシダーゼ含有試
液にトリプトファンを添加した場合、保存中に徐々に茶
色に着色してしまい、吸光度変化を測定するビリルビン
測定用試薬には不向きである。最近、ビリルビンオキシ
ダーゼの活性を長期間安定に保持する方法として、ハロ
ゲン化物によるビリルビンオキシダーゼの安定化方法
(特開平７−２０３９６２）および、Ｎ，Ｎ−ビス(２−
ヒドロキシエチル）グリシン等の緩衝剤と酒石酸ナトリ
ウムカリウム等のカルボン酸類によるビリルビンオキシ
ダーゼの安定化方法(特開平８−６６１９６）等が公開
された。これらの安定化方法を用いれば、冷蔵(７℃）
で一年間保存後でも約５０％の残存活性を保持すること
ができるが、さらなる長期安定化が望まれていた。
定化する他の方法として、アスパラギン酸および／又は
トリプトファンを添加する方法(特開平６−２８４８８
６）があり、これらの安定化剤の中で、トリプトファン
に安定化効果があるが、ビリルビンオキシダーゼ含有試
液にトリプトファンを添加した場合、保存中に徐々に茶
色に着色してしまい、吸光度変化を測定するビリルビン
測定用試薬には不向きである。最近、ビリルビンオキシ
ダーゼの活性を長期間安定に保持する方法として、ハロ
ゲン化物によるビリルビンオキシダーゼの安定化方法
(特開平７−２０３９６２）および、Ｎ，Ｎ−ビス(２−
ヒドロキシエチル）グリシン等の緩衝剤と酒石酸ナトリ
ウムカリウム等のカルボン酸類によるビリルビンオキシ
ダーゼの安定化方法(特開平８−６６１９６）等が公開
された。これらの安定化方法を用いれば、冷蔵(７℃）
で一年間保存後でも約５０％の残存活性を保持すること
ができるが、さらなる長期安定化が望まれていた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】かかる事情に鑑み、
本発明は、不安定なビリルビンオキシダーゼを水性液状
で長期間安定に保存する方法、および、該方法を適用し
た安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供することを
目的とする。
本発明は、不安定なビリルビンオキシダーゼを水性液状
で長期間安定に保存する方法、および、該方法を適用し
た安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供することを
目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、意外にも、一般式(１):
を重ねた結果、意外にも、一般式(１):
【化４】 ［式中、Ｒ1とＲ2は共に水素原子であるか、または一緒
になって、低級アルキル基で置換されていてもよいベン
ゼン環を形成する。Ｒ3は水素原子または低級アルキル
基である］； 一般式(２)
になって、低級アルキル基で置換されていてもよいベン
ゼン環を形成する。Ｒ3は水素原子または低級アルキル
基である］； 一般式(２)
【化５】 ［式中、Ｒ4およびＲ5のいずれか一方は水素原子または
低級アルキル基であり、他方はそれが結合する窒素原子
と隣接する５位の炭素原子との間で二重結合を形成す
る］；または一般式(３)：
低級アルキル基であり、他方はそれが結合する窒素原子
と隣接する５位の炭素原子との間で二重結合を形成す
る］；または一般式(３)：
【化６】 ： ［式中、Ｒ6は水素原子または低級アルキル基である］
で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一
種または二種以上を液状のビリルビンオキシダーゼ試薬
に添加することにより、ビリルビンオキシダーゼの安定
性が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一
種または二種以上を液状のビリルビンオキシダーゼ試薬
に添加することにより、ビリルビンオキシダーゼの安定
性が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、ビリルビンオキシダー
ゼ含有液に前記一般式(１)、(２)または(３)で示される
含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二
種以上を配合することを特徴とするビリルビンオキシダ
ーゼの安定化方法、およびそのように調製される安定な
ビリルビンオキシダーゼ試薬を提供するものである。本
発明の好ましい態様においては、ビリルビンオキシダー
ゼ含有液に緩衝剤を添加し、ｐＨ７．０〜１２．０の間
に緩衝能をもたせ、これに前記一般式(１)、(２)または
(３)で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体
の一種または二種以上を配合することを特徴とするビリ
ルビンオキシダーゼの安定化方法、およびそのように調
製される安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供する
ものである。本発明で用いられる含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の具体例としては、２−メルカプト−
１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４
−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプ
ト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、お
よび、２−メルカプトベンズイミダゾール等が挙げら
れ、好ましくは２−メルカプト−１−メチルイミダゾー
ルおよび３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールで
ある。
ゼ含有液に前記一般式(１)、(２)または(３)で示される
含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二
種以上を配合することを特徴とするビリルビンオキシダ
ーゼの安定化方法、およびそのように調製される安定な
ビリルビンオキシダーゼ試薬を提供するものである。本
発明の好ましい態様においては、ビリルビンオキシダー
ゼ含有液に緩衝剤を添加し、ｐＨ７．０〜１２．０の間
に緩衝能をもたせ、これに前記一般式(１)、(２)または
(３)で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体
の一種または二種以上を配合することを特徴とするビリ
ルビンオキシダーゼの安定化方法、およびそのように調
製される安定なビリルビンオキシダーゼ試薬を提供する
ものである。本発明で用いられる含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の具体例としては、２−メルカプト−
１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４
−トリアゾール、６−メルカプトプリン、３−メルカプ
ト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、お
よび、２−メルカプトベンズイミダゾール等が挙げら
れ、好ましくは２−メルカプト−１−メチルイミダゾー
ルおよび３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールで
ある。
【０００９】含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の
添加量は、十分な安定化効果が得られる量であれば特に
限定するものではなく、一般に用時のビリルビンオキシ
ダーゼ水性液中の最終濃度が５ｍＭ以上であれば所望の
安定化効果が得られ、通常、最終濃度として５ｍＭ〜７
５０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに
好ましくは１５ｍＭ〜２５０ｍＭである。また、これら
含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体は必要に応じて
そのアルカリ金属塩や塩酸塩などの形態で用いてもよ
い。本発明で用いられる上記の緩衝剤は、ビリルビンオ
キシダーゼの安定なｐＨ域(ｐＨ７．０〜１２．０）に
おいて緩衝能を有するものに限られない。またこれらは
単独で、または２種以上を組み合わせて用いることがで
きる。好ましい緩衝剤は、２−モルホリノエタンスルホ
ン酸一水和物(略号ＭＥＳ）、ビス(２−ヒドロキシエチ
ル）イミノトリス(ヒドロキシメチル）メタン(略号Ｂｉ
ｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−(２−アセトアミド）イミノ二酢
酸(略号ＡＤＡ）、ピペラジン−１，４−ビス(２−エタ
ンスルホン酸）(略号ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−(２−アセトア
ミド）−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＡＣＥ
Ｓ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホ
ン酸(略号ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシ
エチル）−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＢＥ
Ｓ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸(略号ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸(略号ＴＥＳ）、２−［４−(２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］エタンスルホン
酸(略号ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス(２−
ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）二水和物(ＰＩ
ＰＳＯ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(略
号ＤＩＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス(ヒドロ
キシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
(略号ＴＡＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−［４−(２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］プロパンスルホ
ン酸一水和物(略号ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−(２−ヒ
ドロキシエチル）−１−ピペラジン］プロパンスルホン
酸(略号ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス(ヒドロキシメチル）
メチル］グリシン(略号Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビ
ス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(略号Ｂｉｃｉｎ
ｅ）、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸(略号ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロ
ヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＣＨＥ
Ｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミ
ノプロパンスルホン酸(略号ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロ
ヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(略号ＣＡＰ
Ｓ）、２−(エチルアミノ）エタノール(略号ＥＡＥ）、
ジエタノールアミン(略号ＤＥＡ）、トリス(ヒドロキシ
メチル）アミノメタン(略号Ｔｒｉｓ）、トリス(ヒドロ
キシメチル）アミノメタンマレイン酸塩(略号Ｔｒｉｓ
−マレイン酸）、グリシンアミド、グリシルグリシン、
グリシン、ホウ酸緩衝剤[ホウ酸(Ｈ3ＢＯ4)および四ホ
ウ酸ナトリウム(Ｎａ2Ｂ4Ｏ7)]、または、リン酸緩衝剤
[リン酸水素二ナトリム(Ｎａ2ＨＰＯ4)およびリン酸二
水素ナトリム(ＮａＨ2ＰＯ4)]であり、さらに好ましく
は、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂ
ｉｃｉｎｅ)、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸(ＴＡＰＳ)、Ｎ−シクロ
ヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(ＣＨＥＳ)、Ｎ
−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパ
ンスルホン酸(ＣＡＰＳＯ)、Ｎ−シクロヘキシル−３−
アミノプロパンスルホン酸(ＣＡＰＳ)、２−(エチルア
ミノ）エタノール(ＥＡＥ)、ジエタノールアミン(ＤＥ
Ａ)、または、ホウ酸緩衝剤であり、特に好ましくは
Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃ
ｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤である。緩衝剤の添加量
は、十分に安定化効果が得られる量であれば特に限定す
るものではなく、一般に用時のビリルビンオキシダーゼ
含有液中の最終濃度が１０ｍＭ以上であれば、所望の安
定化効果が得られ、通常、最終濃度として１０ｍＭ〜１
Ｍ、好ましくは、１０ｍＭ〜１００ｍＭとする。
添加量は、十分な安定化効果が得られる量であれば特に
限定するものではなく、一般に用時のビリルビンオキシ
ダーゼ水性液中の最終濃度が５ｍＭ以上であれば所望の
安定化効果が得られ、通常、最終濃度として５ｍＭ〜７
５０ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに
好ましくは１５ｍＭ〜２５０ｍＭである。また、これら
含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体は必要に応じて
そのアルカリ金属塩や塩酸塩などの形態で用いてもよ
い。本発明で用いられる上記の緩衝剤は、ビリルビンオ
キシダーゼの安定なｐＨ域(ｐＨ７．０〜１２．０）に
おいて緩衝能を有するものに限られない。またこれらは
単独で、または２種以上を組み合わせて用いることがで
きる。好ましい緩衝剤は、２−モルホリノエタンスルホ
ン酸一水和物(略号ＭＥＳ）、ビス(２−ヒドロキシエチ
ル）イミノトリス(ヒドロキシメチル）メタン(略号Ｂｉ
ｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−(２−アセトアミド）イミノ二酢
酸(略号ＡＤＡ）、ピペラジン−１，４−ビス(２−エタ
ンスルホン酸）(略号ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−(２−アセトア
ミド）−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＡＣＥ
Ｓ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホ
ン酸(略号ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシ
エチル）−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＢＥ
Ｓ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸(略号ＭＯＰ
Ｓ）、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸(略号ＴＥＳ）、２−［４−(２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］エタンスルホン
酸(略号ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス(２−
ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）二水和物(ＰＩ
ＰＳＯ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチ
ル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(略
号ＤＩＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス(ヒドロ
キシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
(略号ＴＡＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−［４−(２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］プロパンスルホ
ン酸一水和物(略号ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−(２−ヒ
ドロキシエチル）−１−ピペラジン］プロパンスルホン
酸(略号ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス(ヒドロキシメチル）
メチル］グリシン(略号Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビ
ス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(略号Ｂｉｃｉｎ
ｅ）、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸(略号ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロ
ヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(略号ＣＨＥ
Ｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミ
ノプロパンスルホン酸(略号ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロ
ヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(略号ＣＡＰ
Ｓ）、２−(エチルアミノ）エタノール(略号ＥＡＥ）、
ジエタノールアミン(略号ＤＥＡ）、トリス(ヒドロキシ
メチル）アミノメタン(略号Ｔｒｉｓ）、トリス(ヒドロ
キシメチル）アミノメタンマレイン酸塩(略号Ｔｒｉｓ
−マレイン酸）、グリシンアミド、グリシルグリシン、
グリシン、ホウ酸緩衝剤[ホウ酸(Ｈ3ＢＯ4)および四ホ
ウ酸ナトリウム(Ｎａ2Ｂ4Ｏ7)]、または、リン酸緩衝剤
[リン酸水素二ナトリム(Ｎａ2ＨＰＯ4)およびリン酸二
水素ナトリム(ＮａＨ2ＰＯ4)]であり、さらに好ましく
は、Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂ
ｉｃｉｎｅ)、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル）メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸(ＴＡＰＳ)、Ｎ−シクロ
ヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(ＣＨＥＳ)、Ｎ
−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパ
ンスルホン酸(ＣＡＰＳＯ)、Ｎ−シクロヘキシル−３−
アミノプロパンスルホン酸(ＣＡＰＳ)、２−(エチルア
ミノ）エタノール(ＥＡＥ)、ジエタノールアミン(ＤＥ
Ａ)、または、ホウ酸緩衝剤であり、特に好ましくは
Ｎ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃ
ｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤である。緩衝剤の添加量
は、十分に安定化効果が得られる量であれば特に限定す
るものではなく、一般に用時のビリルビンオキシダーゼ
含有液中の最終濃度が１０ｍＭ以上であれば、所望の安
定化効果が得られ、通常、最終濃度として１０ｍＭ〜１
Ｍ、好ましくは、１０ｍＭ〜１００ｍＭとする。
【００１０】これら含窒素複素環化合物のメルカプト誘
導体の一種または二種以上と緩衝剤の一種または二種以
上との組み合わせのうち、好ましい組み合わせは、２−
メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト
−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、
３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリ
アゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾール
から選ばれる一種または二種以上とＮ,Ｎ−ビス(２−ヒ
ドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉｎｅ)、Ｎ−シクロ
ヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホ
ン酸(ＣＡＰＳＯ)、２−(エチルアミノ）エタノール(Ｅ
ＡＥ)、ジエタノールアミン(ＤＥＡ)、およびホウ酸緩
衝剤から選ばれる一種または二種以上の組み合わせであ
り、さらに好ましくは、２−メルカプト−１−メチルイ
ミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾー
ル、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチ
ル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メ
ルカプトベンズイミダゾールから選ばれる一種または二
種以上とＮ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン
(Ｂｉｃｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種ま
たは二種の組み合わせで、最も好ましい組み合わせは２
−メルカプト−１−メチルイミダゾールと３−メルカプ
ト−１，２，４−トリアゾールから選ばれる一種または
二種とＮ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン
(Ｂｉｃｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種ま
たは二種の組み合わせである。
導体の一種または二種以上と緩衝剤の一種または二種以
上との組み合わせのうち、好ましい組み合わせは、２−
メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト
−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプリン、
３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリ
アゾール、および、２−メルカプトベンズイミダゾール
から選ばれる一種または二種以上とＮ,Ｎ−ビス(２−ヒ
ドロキシエチル）グリシン(Ｂｉｃｉｎｅ)、Ｎ−シクロ
ヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホ
ン酸(ＣＡＰＳＯ)、２−(エチルアミノ）エタノール(Ｅ
ＡＥ)、ジエタノールアミン(ＤＥＡ)、およびホウ酸緩
衝剤から選ばれる一種または二種以上の組み合わせであ
り、さらに好ましくは、２−メルカプト−１−メチルイ
ミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾー
ル、６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチ
ル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メ
ルカプトベンズイミダゾールから選ばれる一種または二
種以上とＮ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン
(Ｂｉｃｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種ま
たは二種の組み合わせで、最も好ましい組み合わせは２
−メルカプト−１−メチルイミダゾールと３−メルカプ
ト−１，２，４−トリアゾールから選ばれる一種または
二種とＮ，Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル）グリシン
(Ｂｉｃｉｎｅ)およびホウ酸緩衝剤から選ばれる一種ま
たは二種の組み合わせである。
【００１１】これらの含窒素複素環化合物のメルカプト
誘導体と緩衝剤との組み合わせによるビリルビンオキシ
ダーゼの安定化効果は、さらにカルボン酸類の一種また
は二種以上を組み合わせた場合において著しく安定性が
向上する。これら含窒素複素環化合物のメルカプト誘導
体と緩衝剤に組み合わせるカルボン酸としては、酒石
酸、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸水素カ
リウム、酒石酸ナトリウムカリウム、クエン酸ナトリウ
ムが好ましく、酒石酸ナトリウムカリウムが特に好まし
い。ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいず
れも用いられ、例えば、ミロセシウム(Myrothecium)属
菌、例えばミロセシウム・ベルカリア(Myrotheciumverr
ucaria)由来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachy
dermatsumodae）の産生するビリルビンオキシダーゼ、
ペニシリウム・ジャンシネラム(Penicilliumjanthinell
um)由来ビリルビンオキシダーゼ、バチルス・リヒェニ
フォルミス(Bacillus licheniformis)由来ビリルビンオ
キシダーゼ、アガリカス・ビスポラス(Agaricus bispor
us)菌茸由来ビリルビンオキシダーゼ等が挙げられる。
ビリルビンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示
す範囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４
〜１０単位／ml、好ましくは、総ビリルビン測定用には
０.０８〜４単位／ml、直接ビリルビン測定用には、０.
４〜８単位／mlの範囲で用いられる。
誘導体と緩衝剤との組み合わせによるビリルビンオキシ
ダーゼの安定化効果は、さらにカルボン酸類の一種また
は二種以上を組み合わせた場合において著しく安定性が
向上する。これら含窒素複素環化合物のメルカプト誘導
体と緩衝剤に組み合わせるカルボン酸としては、酒石
酸、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸水素カ
リウム、酒石酸ナトリウムカリウム、クエン酸ナトリウ
ムが好ましく、酒石酸ナトリウムカリウムが特に好まし
い。ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいず
れも用いられ、例えば、ミロセシウム(Myrothecium)属
菌、例えばミロセシウム・ベルカリア(Myrotheciumverr
ucaria)由来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachy
dermatsumodae）の産生するビリルビンオキシダーゼ、
ペニシリウム・ジャンシネラム(Penicilliumjanthinell
um)由来ビリルビンオキシダーゼ、バチルス・リヒェニ
フォルミス(Bacillus licheniformis)由来ビリルビンオ
キシダーゼ、アガリカス・ビスポラス(Agaricus bispor
us)菌茸由来ビリルビンオキシダーゼ等が挙げられる。
ビリルビンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示
す範囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４
〜１０単位／ml、好ましくは、総ビリルビン測定用には
０.０８〜４単位／ml、直接ビリルビン測定用には、０.
４〜８単位／mlの範囲で用いられる。
【００１２】本発明によるビリルビンオキシダーゼの安
定化には、上記のように調製される緩衝剤と、含窒素複
素環化合物のメルカプト誘導体の１種または２種以上を
配合したビリルビンオキシダーゼ含有液のｐＨ値を、通
常、ｐＨ７．０〜１２．０、好ましくはｐＨ８．０〜１
１．０、さらに好ましくはｐＨ９．０〜１１．０とす
る。上記ビリルビンオキシダーゼ試薬には、必要によ
り、通常の緩衝剤や防腐剤等の他の成分を添加してもよ
い。また、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体を用
いてビリルビンオキシダーゼを安定化する際に、ジチオ
スレイトール、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−シ
ステイン、メチオニン、メルカプトエタノール等のメル
カプト基を有する化合物やヒスチジン等の還元剤を一緒
に添加しておけば、ビリルビンオキシダーゼの安定化効
果はさらに良くなる。
定化には、上記のように調製される緩衝剤と、含窒素複
素環化合物のメルカプト誘導体の１種または２種以上を
配合したビリルビンオキシダーゼ含有液のｐＨ値を、通
常、ｐＨ７．０〜１２．０、好ましくはｐＨ８．０〜１
１．０、さらに好ましくはｐＨ９．０〜１１．０とす
る。上記ビリルビンオキシダーゼ試薬には、必要によ
り、通常の緩衝剤や防腐剤等の他の成分を添加してもよ
い。また、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体を用
いてビリルビンオキシダーゼを安定化する際に、ジチオ
スレイトール、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−シ
ステイン、メチオニン、メルカプトエタノール等のメル
カプト基を有する化合物やヒスチジン等の還元剤を一緒
に添加しておけば、ビリルビンオキシダーゼの安定化効
果はさらに良くなる。
【００１３】本発明により、ビリルビンオキシダーゼを
安定化するには、ビリルビンオキシダーゼ含有液に、前
記緩衝剤の一種または二種以上と含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の一種または二種以上との組み合わせ
で添加することにより達成され、また、この組み合わせ
にカルボン酸類の一種または二種以上を添加することに
より、さらに安定性が良くなる。実際上は、緩衝剤を常
法に従って、通常のｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、乳
酸、酢酸などの無機酸または有機酸、あるいは水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、など
の無機塩基または有機塩基を用いて適当なｐＨ領域を有
する緩衝液を調製し、これにビリルビンオキシダーゼを
分散または溶解させ、その前後に含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の一種または二種以上を添加する方法
により行われる。
安定化するには、ビリルビンオキシダーゼ含有液に、前
記緩衝剤の一種または二種以上と含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の一種または二種以上との組み合わせ
で添加することにより達成され、また、この組み合わせ
にカルボン酸類の一種または二種以上を添加することに
より、さらに安定性が良くなる。実際上は、緩衝剤を常
法に従って、通常のｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫酸、乳
酸、酢酸などの無機酸または有機酸、あるいは水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、など
の無機塩基または有機塩基を用いて適当なｐＨ領域を有
する緩衝液を調製し、これにビリルビンオキシダーゼを
分散または溶解させ、その前後に含窒素複素環化合物の
メルカプト誘導体の一種または二種以上を添加する方法
により行われる。
【００１４】本発明のビリルビンオキシダーゼ試薬は、
液状でも、または、粉末などの固形状であってもよい。
液状の試薬の調製は、上述したように、ｐＨ７．０〜１
２．０の間に緩衝能をもったビリルビンオキシダーゼ含
有液に５ｍＭ以上の含窒素複素環化合物のメルカプト誘
導体の一種または二種以上を配合することにより行われ
る。固形状の試薬の調製は、上記の緩衝剤の一種または
二種以上と含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一
種または二種以上を配合したビリルビンオキシダーゼ含
有液を凍結乾燥してもよく、また、粉末状のビリルビン
オキシダーゼに、前記緩衝剤の一種または二種以上と含
窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種
以上とを、それぞれ、液状にした際の濃度が１０ｍＭ以
上および５ｍＭ以上となるように配合することにより行
われる。
液状でも、または、粉末などの固形状であってもよい。
液状の試薬の調製は、上述したように、ｐＨ７．０〜１
２．０の間に緩衝能をもったビリルビンオキシダーゼ含
有液に５ｍＭ以上の含窒素複素環化合物のメルカプト誘
導体の一種または二種以上を配合することにより行われ
る。固形状の試薬の調製は、上記の緩衝剤の一種または
二種以上と含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一
種または二種以上を配合したビリルビンオキシダーゼ含
有液を凍結乾燥してもよく、また、粉末状のビリルビン
オキシダーゼに、前記緩衝剤の一種または二種以上と含
窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種
以上とを、それぞれ、液状にした際の濃度が１０ｍＭ以
上および５ｍＭ以上となるように配合することにより行
われる。
【００１５】本発明のビリルビンオキシダーゼ試薬はキ
ットの形態にすることもでき、例えば、粉末状のビリル
ビンオキシダーゼと、含窒素複素環化合物のメルカプト
誘導体の一種または二種以上と緩衝剤との固形状混合物
とそれを溶解するための緩衝液との組み合わせ、あるい
は粉末状ビリルビンオキシダーゼと緩衝剤との固形状混
合物または凍結乾燥品とそれを溶解するための含窒素複
素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を
含有する緩衝液との組み合わせ等があり、それらは用時
混合して用いられる。本発明の方法および試薬は、ビリ
ルビンオキシダーゼを液状で極めて安定に保存でき、ビ
リルビンオキシダーゼを用いる測定法、例えば、総ビリ
ルビン測定、直接ビリルビン測定に有効に使用できる。
ットの形態にすることもでき、例えば、粉末状のビリル
ビンオキシダーゼと、含窒素複素環化合物のメルカプト
誘導体の一種または二種以上と緩衝剤との固形状混合物
とそれを溶解するための緩衝液との組み合わせ、あるい
は粉末状ビリルビンオキシダーゼと緩衝剤との固形状混
合物または凍結乾燥品とそれを溶解するための含窒素複
素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を
含有する緩衝液との組み合わせ等があり、それらは用時
混合して用いられる。本発明の方法および試薬は、ビリ
ルビンオキシダーゼを液状で極めて安定に保存でき、ビ
リルビンオキシダーゼを用いる測定法、例えば、総ビリ
ルビン測定、直接ビリルビン測定に有効に使用できる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。実施例におけるビリルビンオキシダーゼの残存活
性は、つぎのようにして測定した。 活性測定用試薬 試料 ：ビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム属由来） 第１試液：５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７.２ １％ コール酸ナトリウム 第２試液：ビリルビンの管理血清 ５ｍｇ／ｄｌ [市販の管理血清(ネスコール(日本商事(株)製))に、ビリル ビン(ＩＣＮ社製)を５ｍｇ／ｄｌとなるように添加したもの]活性測定法 ０.０２単位／ｍｌ以下となるように調製したビリルビ
ンオキシダーゼ溶液２μｌに第１試液２７０μｌを添加
し、３７℃で５分間インキュベートした後、第２試液９
０μｌを加えて３分後から５分後までの４５０ｎｍにお
ける吸光度変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化の
量で活性を示した。酵素１単位(Ｕ）は、本条件下、１
分間に１μｍｏｌｅのアルブミン結合ビリルビンを酸化
するのに必要な酵素量と定義される。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。実施例におけるビリルビンオキシダーゼの残存活
性は、つぎのようにして測定した。 活性測定用試薬 試料 ：ビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム属由来） 第１試液：５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７.２ １％ コール酸ナトリウム 第２試液：ビリルビンの管理血清 ５ｍｇ／ｄｌ [市販の管理血清(ネスコール(日本商事(株)製))に、ビリル ビン(ＩＣＮ社製)を５ｍｇ／ｄｌとなるように添加したもの]活性測定法 ０.０２単位／ｍｌ以下となるように調製したビリルビ
ンオキシダーゼ溶液２μｌに第１試液２７０μｌを添加
し、３７℃で５分間インキュベートした後、第２試液９
０μｌを加えて３分後から５分後までの４５０ｎｍにお
ける吸光度変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化の
量で活性を示した。酵素１単位(Ｕ）は、本条件下、１
分間に１μｍｏｌｅのアルブミン結合ビリルビンを酸化
するのに必要な酵素量と定義される。
【００１７】実施例１ ２−メルカプト−１−メチルイミダゾールによるビリル
ビンオキシダーゼの長期安定化効果 基本処方として、２５ｍＭビシン緩衝液に酒石酸ナトリ
ウムカリウム２５ｍＭを添加した処方に、ビリルビンオ
キシダーゼ４Ｕ／ｍｌを添加し、ｐＨ１０.０に調整した
処方を用いた。この基本処方に２−メルカプト−１−メ
チルイミダゾール(以下ＭＭＩと称す）２５ｍＭを含有
するように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）を７℃で保
存し、８ヶ月後と１１ヶ月後の残存活性を上記測定方法
により測定し基本処方と比較した。その結果を表１に示
す。
ビンオキシダーゼの長期安定化効果 基本処方として、２５ｍＭビシン緩衝液に酒石酸ナトリ
ウムカリウム２５ｍＭを添加した処方に、ビリルビンオ
キシダーゼ４Ｕ／ｍｌを添加し、ｐＨ１０.０に調整した
処方を用いた。この基本処方に２−メルカプト−１−メ
チルイミダゾール(以下ＭＭＩと称す）２５ｍＭを含有
するように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）を７℃で保
存し、８ヶ月後と１１ヶ月後の残存活性を上記測定方法
により測定し基本処方と比較した。その結果を表１に示
す。
【表１】 表１より、従来技術をもちいた基本処方では７℃１１ヶ
月保存後で４２．３％の残存活性しか残すことができな
いが、２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加
した場合、７℃保存１１ヶ月後でも８４．８％の残存活
性を保っていることがわかる。
月保存後で４２．３％の残存活性しか残すことができな
いが、２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加
した場合、７℃保存１１ヶ月後でも８４．８％の残存活
性を保っていることがわかる。
【００１８】実施例２ 各種含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体によるビリ
ルビンオキシダーゼの安定化効果 １００ｍＭホウ酸緩衝液にビリルビンオキシダーゼ２Ｕ
／ｍｌ、および下記表２に示す物質２５ｍＭを含有する
ように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）を苛酷な条件(３
０℃）で保存し、６日後の残存活性を上記測定方法によ
り測定し基本処方と比較した。その結果を表２に示す。
ルビンオキシダーゼの安定化効果 １００ｍＭホウ酸緩衝液にビリルビンオキシダーゼ２Ｕ
／ｍｌ、および下記表２に示す物質２５ｍＭを含有する
ように調製した酵素液(ｐＨ１０．０）を苛酷な条件(３
０℃）で保存し、６日後の残存活性を上記測定方法によ
り測定し基本処方と比較した。その結果を表２に示す。
【表２】 表２に示すごとく、２−メルカプト−１−メチルイミダ
ゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、
６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−
４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカ
プトベンズイミダゾールで安定化の効果が大きいことが
認められた。特に２−メルカプト−１−メチルイミダゾ
ールの効果が顕著であった。
ゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、
６−メルカプトプリン、３−メルカプト−４−メチル−
４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、および、２−メルカ
プトベンズイミダゾールで安定化の効果が大きいことが
認められた。特に２−メルカプト−１−メチルイミダゾ
ールの効果が顕著であった。
【００１９】実施例３ ２−メルカプト−１−メチルイミダゾールの添加濃度と
安定化効果との関係 １００ｍＭホウ酸緩衝液にビリルビンオキシダーゼ２Ｕ
／ｍｌを含有するように調製した酵素液(ｐＨ１０．
０）に種々の濃度の２−メルカプト−１−メチルイミダ
ゾールを添加し３０℃で保存し、５日後の残存活性を上
記測定方法により測定し比較した。その結果を表３に示
す。
安定化効果との関係 １００ｍＭホウ酸緩衝液にビリルビンオキシダーゼ２Ｕ
／ｍｌを含有するように調製した酵素液(ｐＨ１０．
０）に種々の濃度の２−メルカプト−１−メチルイミダ
ゾールを添加し３０℃で保存し、５日後の残存活性を上
記測定方法により測定し比較した。その結果を表３に示
す。
【表３】 表３より、２−メルカプト−１−メチルイミダゾールは
５ｍＭ〜７５０ｍＭの間で安定化効果を示すことがわか
った。また７５０ｍＭ以上添加すると安定化効果は弱く
なることがわかった。
５ｍＭ〜７５０ｍＭの間で安定化効果を示すことがわか
った。また７５０ｍＭ以上添加すると安定化効果は弱く
なることがわかった。
【００２０】実施例４ ２−メルカプト−１−メチルイミダゾール添加処方と無
添加処方との比較 ２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加した処
方と２−メルカプト−１−メチルイミダゾール無添加の
処方とを総ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン
測定用試薬に適用した調製時の試薬で相関関係を調べ
た。総ビリルビン測定用試薬に適用した場合の結果を図
１に、また、直接ビリルビン測定用試薬に適用した場合
の結果を図２に示す。総ビリルビン測定用試薬および直
接ビリルビン測定用試薬としてはＶＬ Ｔ−ＢＩＬおよ
びＶＬ Ｄ−ＢＩＬ(日本商事(株）製）を用いた。図１
および図２より、２−メルカプト−１−メチルイミダゾ
ールを添加した処方でも、無添加のものと変わらない性
能を示し、これら安定化剤の添加によってもビリルビン
測定性能が影響されないことがわかった。
添加処方との比較 ２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加した処
方と２−メルカプト−１−メチルイミダゾール無添加の
処方とを総ビリルビン測定用試薬および直接ビリルビン
測定用試薬に適用した調製時の試薬で相関関係を調べ
た。総ビリルビン測定用試薬に適用した場合の結果を図
１に、また、直接ビリルビン測定用試薬に適用した場合
の結果を図２に示す。総ビリルビン測定用試薬および直
接ビリルビン測定用試薬としてはＶＬ Ｔ−ＢＩＬおよ
びＶＬ Ｄ−ＢＩＬ(日本商事(株）製）を用いた。図１
および図２より、２−メルカプト−１−メチルイミダゾ
ールを添加した処方でも、無添加のものと変わらない性
能を示し、これら安定化剤の添加によってもビリルビン
測定性能が影響されないことがわかった。
【００２１】実施例５ ７℃で１年間保存した試薬と調製時の試薬との比較 ２−メルカプト−１−メチルイミダゾールを添加し、７
℃で１年間保存した試薬を用いて、調製時の試薬との相
関関係を調べた。その結果を図３に示す。図３より、７
℃で１年間経過しても調製時と変わらない性能を示すこ
とがわかった。
℃で１年間保存した試薬を用いて、調製時の試薬との相
関関係を調べた。その結果を図３に示す。図３より、７
℃で１年間経過しても調製時と変わらない性能を示すこ
とがわかった。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、ｐＨ７．０〜１２．０
の間に緩衝能をもたせたビリルビンオキシダーゼ含有液
に前記一般式(１)、(２)または(３)で示される含窒素複
素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を
添加するという非常に簡単で、経済的な方法により、ビ
リルビンオキシダーゼを液状で長期間安定化させること
ができ、ビリルビンの測定毎に新たにビリルビンオキシ
ダーゼ試薬を調製する必要がなく、一度調製したビリル
ビンオキシダーゼ試薬を長期間に亙って使用することが
でき、あるいはまた、入手されるビリルビンオキシダー
ゼ試薬溶液をそのまま測定に使用できるため所望の総ビ
リルビンおよび直接ビリルビンの測定がきわめて簡便に
かつ容易に行うことができる。
の間に緩衝能をもたせたビリルビンオキシダーゼ含有液
に前記一般式(１)、(２)または(３)で示される含窒素複
素環化合物のメルカプト誘導体の一種または二種以上を
添加するという非常に簡単で、経済的な方法により、ビ
リルビンオキシダーゼを液状で長期間安定化させること
ができ、ビリルビンの測定毎に新たにビリルビンオキシ
ダーゼ試薬を調製する必要がなく、一度調製したビリル
ビンオキシダーゼ試薬を長期間に亙って使用することが
でき、あるいはまた、入手されるビリルビンオキシダー
ゼ試薬溶液をそのまま測定に使用できるため所望の総ビ
リルビンおよび直接ビリルビンの測定がきわめて簡便に
かつ容易に行うことができる。
【図１】 総ビリルビン測定用試薬に適用した場合のＭ
ＭＩ添加処方と無添加処方との相関関係を示すグラフで
ある。
ＭＩ添加処方と無添加処方との相関関係を示すグラフで
ある。
【図２】 直接ビリルビン測定用試薬に適用した場合の
ＭＭＩ添加処方と無添加処方との相関関係を示すグラフ
である。
ＭＭＩ添加処方と無添加処方との相関関係を示すグラフ
である。
【図３】 総ビリルビン測定用試薬に適用した場合のＭ
ＭＩ添加処方における、調製時と７℃１年保存後との相
関関係を示すグラフである。
ＭＩ添加処方における、調製時と７℃１年保存後との相
関関係を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 ビリルビンオキシダーゼ含有液に、一般
式(１): 【化１】 ［式中、Ｒ1とＲ2は共に水素原子であるか、または一緒
になって、低級アルキル基で置換されていてもよいベン
ゼン環を形成する。Ｒ3は水素原子または低級アルキル
基である］； 一般式(２) 【化２】 ［式中、Ｒ4およびＲ5のいずれか一方は水素原子または
低級アルキル基であり、他方はそれが結合する窒素原子
と隣接する５位の炭素原子との間で二重結合を形成す
る］；または一般式(３)： 【化３】 ： ［式中、Ｒ6は水素原子または低級アルキル基である］
で示される含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の一
種または二種以上を配合することを特徴とするビリルビ
ンオキシダーゼの安定化方法。 - 【請求項２】 含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体
が２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メル
カプト−１，２，４−トリアゾール、６−メルカプトプ
リン、３−メルカプト−４−メチル−４Ｈ−１，２，４
−トリアゾール、および、２−メルカプトベンズイミダ
ゾールである請求項１記載のビリルビンオキシダーゼの
安定化方法。 - 【請求項３】 ビリルビンオキシダーゼ含有液に緩衝剤
を添加し、ｐＨ７.０から１２.０の間の緩衝能下に保存
することを特徴とする請求項１および２記載のビリルビ
ンオキシダーゼの安定化方法。 - 【請求項４】 緩衝剤としてＮ，Ｎ−ビス(２−ヒドロ
キシエチル）グリシン、２−(エチルアミノ）エタノー
ル、ジエタノールアミン、または、ホウ酸緩衝剤を用い
ることを特徴とする請求項３記載のビリルビンオキシダ
ーゼの安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23643596A JP3863231B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | ビリルビンオキシダーゼの安定化 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23643596A JP3863231B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | ビリルビンオキシダーゼの安定化 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075779A true JPH1075779A (ja) | 1998-03-24 |
| JP3863231B2 JP3863231B2 (ja) | 2006-12-27 |
Family
ID=17000719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23643596A Expired - Fee Related JP3863231B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | ビリルビンオキシダーゼの安定化 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3863231B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1018972C2 (nl) | 2001-09-18 | 2003-03-19 | Antonie Herman De Leeuw | Inrichting voor het aan huis bezorgen van grotere poststukken of pakketten. |
| WO2013190506A1 (en) * | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Miruna Petcu | Polymer and method of use |
| WO2014098153A1 (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | トヨタ自動車株式会社 | 固定化酵素を備えるバイオリアクター、固定化酵素の活性向上方法及びバイオ燃料電池 |
| WO2019168200A1 (ja) * | 2018-03-02 | 2019-09-06 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 酵素反応生成物の検出方法 |
| US11008603B2 (en) | 2016-09-05 | 2021-05-18 | Japan Science And Technology Agency | Method and kit for detecting pathogenic microorganism |
-
1996
- 1996-09-06 JP JP23643596A patent/JP3863231B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1018972C2 (nl) | 2001-09-18 | 2003-03-19 | Antonie Herman De Leeuw | Inrichting voor het aan huis bezorgen van grotere poststukken of pakketten. |
| WO2013190506A1 (en) * | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Miruna Petcu | Polymer and method of use |
| WO2014098153A1 (ja) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | トヨタ自動車株式会社 | 固定化酵素を備えるバイオリアクター、固定化酵素の活性向上方法及びバイオ燃料電池 |
| JPWO2014098153A1 (ja) * | 2012-12-19 | 2017-01-12 | トヨタ自動車株式会社 | 固定化酵素を備えるバイオリアクター、固定化酵素の活性向上方法及びバイオ燃料電池 |
| US10490837B2 (en) | 2012-12-19 | 2019-11-26 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Bioreactor comprising immobilized enzyme, method for improving activity of immobilized enzyme, and biofuel cell |
| US11008603B2 (en) | 2016-09-05 | 2021-05-18 | Japan Science And Technology Agency | Method and kit for detecting pathogenic microorganism |
| WO2019168200A1 (ja) * | 2018-03-02 | 2019-09-06 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 酵素反応生成物の検出方法 |
| JPWO2019168200A1 (ja) * | 2018-03-02 | 2021-02-12 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 酵素反応生成物の検出方法 |
| US12173348B2 (en) | 2018-03-02 | 2024-12-24 | Japan Science And Technology Agency | Method for detecting enzymatic reaction product |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3863231B2 (ja) | 2006-12-27 |
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