JPS6178385A - 安定なペルオキシダ−ゼ組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は安定なペルオキシダーゼ組成物に関するもので
あり、特に酵素免疫測定に使用するｍｓ酵素、ペルオキ
シダーゼの製造および貯蔵に関するものである。

（従来の技？４１１） 遊離のペルオキシダーゼあるいは他の成分（例えば、免
疫活性物質）と結合しているペルオキシダーゼを長時間
安定化させるためには１陳結乾燥といった手段を用いて
安定化が行なわれるが、特公昭５８−５６６１３号公報
記載のように８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸
の有効量を添加するか、特開昭５８−２３’７８６号公
報記載のように４−アミノ−アンチピリンの有効量を添
加する安定化法が記載されている〇 （発明が解決しようとする問題点） しかし、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸や４
−アミノアンチピリンといった物質を用いないと遊離の
ペルオキシダーゼあるいは他の成分（例えば免疫活性物
質）と結合しているペルオキシダーゼを長時間安定化さ
せることは（イ）餘で特に低濃度の水溶液状態において
きわめて不安室であり、測置に必要な酵素活性を維持す
ることは酵素免疫測定法において重要な意義を有する。

本発明者等は上記８−アニリノ−１−ナフタレンスルホ
ン酸や４−アミノアンチピリンによらない。ペルオキシ
ダーゼの安定化法を開発すべく鋭意研究した結果本発明
に到達した。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、ペルオキシダーゼ、血清あるいは血ダーゼ組
成物である。

本発明に用いるハロゲン化アルキルフェノールの分子式
は、次に示すような構造を有し７ている。

（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒは炭素原子数１〜１０の
アルキル基、ｍ　＝　１〜４　、　ｎ　＝１−４を示す
。）ハロゲン化アルキルフェノールとしては、例えば４
−クロロ−ｍ−クレゾール、番−クロロー０−クレゾー
ル、２．６−ジアミツー４−クロロフェノール、４−ブ
ロム−ｍ−クレゾール、２−エチル−４−クロロフェノ
ールなどが挙げられる。

ハロゲン化アルキルフェノールの添加量としては全組成
物に対して約１〜５重鰍対容量（Ｗ／１％、好ましくは
１〜３へ重量対合Ｍ（Ｗ／１％である。又、溶解度を越
える量を添加しても水性で 媒質中に沈殿として発生してくるの１使用できない。

血清としては、家兎血清、人血清、馬血清、牛胎児血清
、牛血清等多種挙げられ、又血清蛋白質として牛血清ア
ルブミン、家兎血清アルブミン等これも多数挙げられる
。血清又は血清蛋白質の添加量は、血清として全組成物
に対して５〜Ｉ５ｏ宕量％で血清蛋白質の乾燥微粉末な
ら全組成物に対としては、水又は駿漬液などが挙げられ
る。

本発明の組成物におけるハロゲン化アルキルフェノール
のペルオキシダーゼへの安定化作用は不明であるが、血
清蛋白質と〕・ロゲン化アルキルフェノールがペルオキ
シダーゼに作用し、その特殊状態のものであってもよい
。又遊離状態のものと結合状態のものとの混合物であっ
てもよい０免疫活性物質としては、ハプテン、多価抗原
、プロスタグランジン、ステロイドホルモン、例えばプ
ロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、エ
ストリオールなど、及び抗生物質、例えばペニシリンな
どが用いられる。多価抗原としてはホルモン、例えば成
長ホルモンなどタンパク質、例えばアルブミン、グロブ
リン、α−フェトプロティンなど及び種々の細菌、ウィ
ルス、例えば連鎖球菌、肝炎ウィルス、風疹ウィルスな
どが用いられる。抗体としては、従来既知の方法で、ヤ
ギ、ウサギなどの哺乳動物に上記ハブテン又は抗原を免
疫することによって得られた抗体（例えば、抗インスリ
ン抗体、抗α−フェトプロティンなど）が用いられる。

又、ハイブリドーマ法によって作成された抗体も同様に
使用できる。

また、免疫活性物質とペルオキシダーゼ結合物の結合形
態としては、共有結合があげられ、種々の公知の方法、
例えばグルタルアルデヒドを架橋剤として免疫活性物質
のアミ７基とペルオキシダーゼのアミ７基を共有結合す
る方法（Ａｖｒａｍｅａｓ、　ｓ、＋工ｍｍｕｎｏｏｈ
ｅｍ１ｓｔｒｙ、　ｐ：４３−５２．　（１９６９）　
）及びペルオキシダーゼに含まれる糖鎖を過沃素酸で酸
化切断し、アルデヒド基を導入後免疫活性物質のアミノ
基とシップ塩基を作製し結合させる方法（Ｎａｋａｎｅ
　＃　ＰＩＫ−Ｈ＆　Ｋａｗａｏｉ　ｌ　Ａ−＋　Ｊ−
Ｈｌ　Ｂ　ｔ　ｏｏｈｅｍ＊０７ｔＯＯＭｍ、４１１０
８４−１０９１．　（１９７４）などを用いて共有結合
を作ることができる。

遊離のペルオキシダーゼあるいは共有結合し７ているペ
ルオキシダーゼの酵素活性は、過酸化水素と適当な発色
剤、例えば０−アミノフェノール、４−アミノアンチピ
リンとフェノール、Ｏ−フェニレンジアミンなどを用い
比色法によりその酵素活性を定量することが可能である
。

また本発明の組成物は、緩衝作用を有する任意成分を添
加しても良いし、生理食塩水濃度の塩化ナトリウムを添
加しても良い。緩衝剤としてはリン酸緩衝液、トリス緩
衝液などが用いられ、水性溶液の田が６〜８を示すもの
が好ましい。水性組成物を調製する場合、各物質の添加
順序はとくに限定されない。

またペニシリンＧ１アンピシリン、クロラムフェニコー
ル、テトラサイクリン、アンホテリシンＢなどの抗生物
質を添加して用いることも可能である。

本発明による安定化されたペルオキシダーゼ組成物を用
いた有利な検査薬としては、免疫診断用試薬、特に酵素
免疫測定法があげられる。又、酵素免疫測定法以外の診
断薬として、例えばグルコースを定量するためのグルコ
ースオキシダーゼ法の試薬としても使用可能である。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例に限定されるものではない。

実施例り 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡−株式会社製、グ
レード１−０）を家兜面Ｙ１”７１０容Ｍ％と４−クロ
ロメタクレゾール０．０２重Ｍ対＠ｉｈｔ（ｗ／ｖ）％
を含む０．０１ＭＩＪンｒ故緩衝生理食塩水（以下０．
０１Ｍ　ＰＢＳと略する）μｍ６．Ｏに溶解Ｅ７た。対
照として４−クロロメタクレゾールを含まないものを用
意し、以下の酵素安定性試験に供した。又、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの８度は各々１．０μｇ／ｌであった
。各溶液は０．２２μｍの滅ｋｌ過器で治過し、５−の
殺菌ビンにとり、４℃と４０℃で貯蔵した。０，７日、
１４日の酵素安定性を調べた。安定性は４０℃貯蔵の酵
素活性の４℃貯蔵で示す活性に対するパーセントで示し
た。

酵素活性測置は過酸化水素０．０２重髄対容社（Ｗ／Ｖ
　）％および０−フエニレンジアミンニ塩酸塩（以下Ｏ
ＰＰと略す。）を３ｑ／−含む口１６．Ｏのシトレート
・ホスフェート０．１Ｍ緩衝液０．５−に上記溶液を５
０μ！加え、室ｆｋＡｓｏ分反応させＩＮ（ｉｉｌ１２
．０−を加え反応を停止させた後１４９２　ｒｌｗａの
吸光度を測定することにより求めた。

その結果を第１表に示す。

実施例２ 過ヨウ素酸塩酸化法（Ｎａｋａｎｅ、　Ｐ、に−ｇ　＆
　ＫａＷ＆０１−　Ａ、＋Ｊ、　Ｈｌｓｔｏｏｈｅｍ、
　Ｏｙｔｏｏｈｅｍ、　２２．１０８４−１０９１．　
（１９’７４））により家兎イムノグロブリンＧ（以下
Ｗ兎工ｇａと略す）と結合させて西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを七ファデックスＧ−２００によるゲル−過で遊
離のペルオキシダーゼを除去した結合ペルオキシダーゼ
とゲル−過をかけず遊離のペルオキシダーゼと結合した
ペルオキシダーゼとが共存する場合の各々について、４
−クロロ−ｍ−クレゾール、０．０２５重ｌ対容置（Ｗ
／Ｖ）％及び家兎血清ｌ容量％１牛血清アルブミン１重
量対容量（Ｗ／Ｖ）％クロコ ラムフエニ躯−ル０．１亀量対容ｋｔ（Ｗ／Ｖ）％を含
む０．０２Ｍリンリン酸緩衝液塩水番こ加えた場合と対
照例として、４−クロロ−ｍ−クレゾールだｉ−１を除
いたものについて実施例１に記載の操作法で溶液中のペ
ルオキシダーゼの安定性を調べた。その結果を第２表に
示す。

（発明の効果） 本発明により、ペルオキシダーゼを低ｍ度で長期にわた
り安定化することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペルオキシダーゼ、血清あるいは血清蛋白質を含
   む媒質およびハロゲン化アルキルフェノールを含むこと
   を特徴とする安定なペルオキシダーゼ組成物。
2. （２）ペルオキシダーゼが遊離状態のペルオキシダーゼ
   および／あるいは結合状態のペルオキシダーゼであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の安定なペル
   オキシダーゼ組成物。
3. （３）結合状態のペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ
   と免疫活性物質との結合体であることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項記載の安定なペルオキシダーゼ組成物
   。