JPH0335B2 - - Google Patents
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- JPH0335B2 JPH0335B2 JP58217176A JP21717683A JPH0335B2 JP H0335 B2 JPH0335 B2 JP H0335B2 JP 58217176 A JP58217176 A JP 58217176A JP 21717683 A JP21717683 A JP 21717683A JP H0335 B2 JPH0335 B2 JP H0335B2
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Description
本発明は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸リ
ダクターゼ（２，５−diketo−Ｄ−gluconic
acidreductase、以後25DKG−Raseと略す）に関
する。 すなわち本酵素は、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸（以後25DKGと略す）を還元型ニコチン
アミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸（以
後NADPHと略す）存在下に還元し、ビタミン
Ｃの前駆物質である２−ケト−Ｌ−グロン酸（２
−keto−Ｌ−gulonic acid、以後2KLGと略す）
を生成する作用を有す。 本発明者らは、多くの2KLG生産菌株の
25DKGを還元する酵素を研究してきたところ、
コリネバクテリウム（Corynebacterium）に属す
る2KLG生産菌株より得た25DKG−Raseが
NADPH存在下に (i) 25DKGを2KLGに還元しかつ、 (ii) ５−ケト−Ｄ−フラクトース（以後5KFと略
す）をＬ−ソルボーズ（Ｌ−sorbose）に還元
する 性質を有することを見い出した。また、この今ま
で知られていない作用を有する（この両作用を併
せ有する）新規酵素を単離精製することに成功
し、本発明を完成した。 すなわち本発明の目的は、次の物理化学的性質
を有する25DKG−Raseを提供することにある。 (イ) 酵素作用： NADPHを補酵素として、 (i) 25DKG又はその塩を2KLG又はそのその
塩に還元する。 (ii) 5KFをＬソルボーズに還元する。 (ロ) 基質特異性： 25DKGおよび5KFに対し特異性を示す。（但
し、この２基質に共通の、５位のケト基の保有、
という特徴を共にする５−ケト−Ｄ−グルコン酸
を還元せず、また末端アルコール基に隣接するケ
ト基を有するＤ−フラクトースやＬ−ソルボーズ
などのケトースや、２位がケト基である2KLGや
２−ケト−Ｄグルコン酸に対しても還元作用を示
さない） (ハ) 至適PH：PH６〜７ (ニ) PH安定性：PH５〜７ (ホ) 分子量：29000±2000 (ヘ) 等電点：PH4.4±0.3 本酵素は、コリネバクテリウム属に属する
2KLG生産菌株の菌体を破砕し、その破砕液より
得られる菌体内酵素である。酵素源としては、コ
リネバクテリウム属に属する2KLG生産菌株であ
るコリネバクテリウム・スピーシーズNo.20A−77
（Corynebacterium sP.No.20A−77，
ATCC31090、FFRM−P2770）およびこの菌体
より造成した変異株（たとえば５−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸代謝欠損変異株、FERM−BP108）が
挙げられるが、コリネバクテリウム・スピーシー
ズNo.13（ATCC31089）やコリネバクテリウム・ス
ピーシーズNo.K106（ATCC31088）およびこれら
の菌株から造成される変異株も同様に酵素源とし
て用いられる。（20A−77株、T13株およびK106
株の菌学的性状は、特公昭56−15877号公報に、
またFERM−BP108株の親株20A−77株からの誘
導変異法は特開昭58−162296号公報に詳述されて
いる。） これらの2KLG生産菌株に本発明の25DKG−
Raseを生産させるための生育培地に特別な制限
はない。たとえば１〜３％のＤ−グルコースや蔗
糖等の糖やグルコン酸、グリセリン等の有機酸を
炭素源として用い、0.5〜５％のポリペプトンや
コーン・ステイープ・リカーを窒素源として加
え、リン酸塩、マグネシウム塩その他生育に必要
なビタミン類や微量の金属塩を加えた倍地を用い
る。この培地に前記の2KLG生産菌を植菌し、25
〜35℃で15〜30時間培養し生育させる。 生育後の培養液から菌体内酵素を抽出するため
の方法としては、たとえば次のようなものが挙げ
られる。すなわち、先づ培養液より遠心分離等の
方法で菌体を集め、水又は生理食塩水、あるいは
適当なPHを有する緩衝液で洗菌する。洗菌された
菌体を適当なPHを有する緩衝液に懸濁し、超音
波、フレンチプレスあるいは酵素（リゾチーム）
等の処理により菌体を破砕して菌体内酵素を含む
菌体の破砕液とする。この破砕液から、遠心分離
等により未破砕菌体や破砕菌体残渣を取り除き、
上澄液（粗酵素液）を得る。この粗酵素液に硫酸
アンモニウムを加えて塩析する。（30〜70％飽和
画分）。 この塩析物を酵素が失活しない適当な緩衝液に
溶解し、透析処理を施し硫酸アンモニウムをのぞ
いた後、この酵素液をイオン交換クロマトグラフ
イー、アフイニテイークロマトグラフイー等の精
製処理を行うことにより単一に精製された
25DKG−Raseを得る。 この精製された25DKG−Raseの物理化学的な
性状を詳述すれば次のとおりである。 (1) 作用： 25DKG＋NADPH＋H+→2KLG＋
NADP+5KF＋NADPH＋H+→Ｌ−ソルボーズ
＋NADP+上記反応における水素供与体として
は、NADPHが用いられる。NADH（還元型ニコ
チンアミド・ジヌクレオチド）を水素供与体とし
て用いた場合、その反応速度は、NADPHを用
いた場合の反応速度の250分の１以下である。 (2) 基質特異性： 25DKGおよび5KFに特異性を示す。 この２基質と類似（５位にケト基を有する）の
５−ケト−Ｄ−グルコン酸は還元されず、末端ア
ルコールに隣接するケト基を有するＤ−フラクト
ースやＬ−ソルボース等などのケトースや２位が
ケト基である2KLGや２−ケト−Ｄ−グルコン酸
に対しても還元作用を示さない。 NADPあるいは、NAD存在下に2KLGあるい
はＬ−ソルボーズを加えても25DKGあるいは
5KFの生成は、全くあるいはほとんど認められな
い。 (3) 至適PH：PH６〜７ (4) PH安定性：PH５〜７ （PH４〜５は0.1Mジメチルグルタル酸緩衝液、
PH６〜７は、0.1Mグツド（PIPES）緩衝液、PH
８〜９は、0.1Mトリス・塩酸緩衝液中にて、28
℃、30分処理し残存活性を測定）。PH５〜７では
70％以上残存活性が認められたがPH４以下、８以
上では30％以下の残存活性しか認められなかつ
た。 (5) 酵素活性の測定法 0.1mM NADPHおよび3.3mMのCa−25DKG
を含む0.1Mトリス緩衝液（PH７）に酵素液を加
え30℃で反応させ、NADPEの酸化を340nmの吸
光値の減少から測定する。酵素活性の1unitは、
１分間にNADPH1μmoleを酸化させる酵素活性
と定義する。 (6) 作用温度の範囲：25〜45℃ (7) PH、温度による失活の条件： PH４以下およびPH８以上で、28℃、２時間放置
すると96％以上失活する。 (8) 阻害、活性化および安定化： 蓚酸塩により阻害され、グリセロアルデヒドに
よりわずかに阻害される。Mn++およびMg++を
加えても顕著には活性化されない。高濃度のグリ
セリン（30〜50％）やシユークロース（1M）に
より安定化される。 (9) 分子量：29000±2000 （SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法およ
びゲル過去による測定） (10) 等電点：PH4.4±0.3 （等電点電気泳動法により測定） (11) 酵素のKm値：2.2±1.5mM（基質25DKG、
0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）、温度30℃） 本発明の25DKG−Raseは上記酵素作用を発揮
する用途に使用可能である。すなわち、補酵素
NADPHの存在下に25DKGまたは５−ケト−フ
ラクトースと作用させることにより、2KLGまた
はＬ−ソルボーズを、それぞれ製造することがで
きる。25DKGの場合を例にとると、反応は通常
25〜45℃、PH６〜７、で行う。反応に際しての基
質25DKGのモル濃度は、水素供与体である
NADPHのモル濃度とほぼ等しく、酵素反応の
常識によつて定められるが、20〜200mM程度が
適当とされる。また酵素濃度は0.5〜5.0unit／ml
程度が適当である。また反応に際して、酵素を適
当な担体に固定化して用いることもできる。これ
らの固定化は、酵素に関して知られている一般的
方法が使用可能である。たとえば、官能基を有す
る樹脂の膜、粒などに直接あるいは二官能基を有
する橋状体たとえばグルタルアルデヒドなどを介
して結合させる。 前記酵素反応の時間はとくに制限する必要がな
いが、30℃における反応の場合60〜120分間で基
質中の25DKGの90％以上が2KLGに還元されう
る。以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 実施例 １ (1) 菌の培養 (i) 種培地： Ｄ−グルコース 1.0％ イースト・エキストラクト（Difco） 0.5％ バクト・ペプトン（Difco） 0.5％ NaNO3 0.1％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ PH7.0 上記組成の培地60mlを500ml容のフラスコに入
れ120℃、15分間蒸気滅菌した。 (ii) 生育用培地： Ｄ−グルコース 2.0％ コーン・ステイープ・リカー 3.0％ イースト・エキストラクト 0.1％ NaNO3 0.3％ KH2PO4 0.06％ PH7.2 上記組成の培地20を30容ジヤー・フアーメ
ンターに入れ、消泡剤（ポリプロピレングリコー
ルＰ−2000）50ppmを加えて、120℃、20分間滅
菌した。 (iii) 培養方法 コリネバクテリウム・スピーシーズNo.20A−77
の変異株（FERM−BP108）を10本の種培地に
１白金耳ずつ植菌し、28℃、18時間、ロータリー
振盪機（振幅71mm、270rpm）で培養した。10本
の種培養液を生育用培地に植菌し、通気量
0.5vvm、撹拌400rpm、28℃にて22時間培養し
た。（OD＝19） (2) 酵素の抽出 (1)で得た培養液から、遠心分離（シヤープレス
遠心機、10000G、10分）によつて菌を集め、
0.1Mトリス緩衝液（以後トリス緩衝液はTBと略
す。又特記しないかぎりPHは7.0である）で洗菌
した。この洗菌体をOD＝150になるように
0.1MTBに懸濁し超音波（160watt×７分／80ml）
にて菌を破砕した。菌の破砕液から遠心分離
（15000G、30分）により未破砕の菌体および菌体
残渣をとりのぞき約１の上澄液を得た。（蛋白
質＝10.3mg／ml、25DKG−Rase＝0.63unit／ml）。 (3) 酵素の精製（以下の操作はすべて４℃以下で
行つた） (i) 硫酸アンモニウム（硫安）分画 上記(2)で得た上澄液に30％飽和になるように硫
安を加え塩析物を遠心分離（10000G、10分）に
より取りのぞき、上澄液にさらに70％飽和になる
ように硫安を加えた。約１時間氷冷した後遠心分
離（10000G、10分）にて析出した蛋白質を集め
た。この蛋白質を200mlの0.1MTBに溶解し
0.02MTBに対し１夜透析した。 (ii) イオン交換クロマトグラフイー 上記(i)で得た透析液（250ml、蛋白質13.6mg／
ml）をDEAE−セフアロースCL−6B（フアーマ
シアフアインケミカルズ製）カラムに充填し下記
の条件でクロマトグラフイーを行つた。 カラム：1.6×30cm、平衡化液：0.02MTB、溶
出液＝0.02MTB（200ml）−0.15MNaCl／
0.02MTB（300ml）−0.25MNaCl／0.02MTB（200
ml）。 溶出液を５mlずつのフラクシヨンにとり分け、
各フラクシヨンの酵素活性を後記(5)−(ii)で記載す
る方法でCa−25DKG及び5KFを基質として測定
した。この結果、0.25M NaCl／0.02MTBで溶
出された約80mlの溶出液に、両基質に対する酵素
活性が認められた。この溶出液に70％飽和になる
ように硫安を加え蛋白質を塩析し、塩析物を30ml
の0.1MTBに溶解し、0.02MTBに対し４℃、１
夜透析した。 (iii) アフイニテイ・クロマトグラフイー 上記(3)−(ii)で得られた透析液を、0.02MTBで
あらかじめ平衡化されたアミコン・マトリツクス
ゲルレツドＡ（アミコン フアーイースト リミ
テツド製）カラムに充填し、次の条件でクロマト
グラフイーを行つた。カラム：1.6×19cm、洗浄
液：0.4M NaCl／0.02MTB（400ml）、溶出液：
0.5M NaCl／0.02MTB（450ml）−0.7M NaCl／
0.02MTB（150ml）−1M NaCl／0.02MTB（300
ml）。 (3)−(ii)同様、溶出された各フラクシヨン（各５
ml）の酵素活性を測定した結果0.7M−1M
NaCl／0.02MTBで溶出された18フラクシヨンに
25DKGおよび5KFの両基質に対する酵素活性を
認めた。 約90mlの溶出液に0.02MTB225mlを加えNaCl
濃度を低下させ、再度アミコン マトリツクスゲ
ル レツドＡ カラム（1.9×13cm）に充填し
0.2M NaCl／0.02MTB120mlで洗浄したのち
0.5mM NADPHと0.2M NaClを含む
0.02MTB150mlで溶出した。各５mlずつ溶出液を
取り分け各フラクシヨンの酵素活性を上記同様に
測定した。この結果0.5mM NADPHおよび0.2M
NaClを含む0.02MTBでの70ml溶出区分を中心に
高い酵素活性を有するフラクシヨン（約35ml）が
得られた。 (iv) 酵素の濃度とNADPHの除去 上記(iii)で得られた溶出液に30％飽和になるよう
に硫安を加え、あらかじめ30％飽和硫安を含む
0.02MTBで平衡化してあるフエニルセフアロー
スCL−4B（フアーマシア・フアインケミカルズ
製）のカラム（0.9×３cm）に充填した。このカ
ラムを30％飽和硫安を含む0.02MTBで洗浄し
340nmの吸光値を測定して完全にNADPHを洗い
除いたのち、0.02MTBで酵素を溶出し１mlずつ
分画した。このフラクシヨンの酵素活性を測定し
たところ、４フラクシヨンに高い酵素活性が認め
られた。この４本のフラクシヨンの液を集め精製
酵素液とし、以後の測定に用いた。この溶液は、
54units／mlの25DKG−Rase活性を示し、かつ
0.58mg／mlの蛋白質を含むものであつた。 (4) 精製酵素液の純度 上記(3)で得た精製酵素液の２〜5μをSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分離ゲル：10
％アクリルアミド、泳動条件：40mA、1Hr、室
温）により分析したところ、29000±2000の分子
量に相当する位置に単一なバンドとして泳動し
た。 さらにゲル過（セフアデツクスＧ−100）に
より分析したところ分子量29000±2000に相当す
る溶出区分に酵素活性が認められた。 この酵素液5μ等を等電点電気泳動 （ゲル：ポリアクリルアミド；泳動条件(イ)：PH
インターバル25〜５；陽電極液＝0.1MH2SO4、
陰電極液0.1M NaOH、6W、2700VH、泳動条
件(ロ)；PHインターバル4.0〜6.5、陽電極液＝
0.04MDL−グルタミン酸、陰電極液0.2M
NaOH、25W、2600VH；温度18〜20℃） で測定したところPH4.4±0.2の位置に単一なバン
ドとして泳動した。以上の事実よりこの精製酵素
液は、25DKG−Raseのみを含む酵素液であるこ
とを確認した。 (5) 酵素の物理化学的性質の測定 (i) 酵素反応 25μmolesの基質（Ca−25DKG又は5KF）およ
び15μmolesのNADPHを含む0.1Mトリス緩衝液
（PH７）3.0mlに(3)で得られた精製酵素液10μlを加
え、30℃で60分反応させた。反応後、反応液をペ
ーパークロマトグラフイー（展開剤：フエノー
ル：ギ酸：水＝75：４：25、発色剤＝アニリン−
水素−フタル酸溶液）およびガスクロマトグラフ
イー（カラム：SE−52、キヤリアーガス：ヘリ
ウム、サンプル：トリメチルシリル化誘導体）で
分析した。両クロマトグラフイーによる分析の結
果より25DKGからは2KLGのみが生成し、5KF
からはＬ−ソルボースのみが生成した。第１表に
ガスクロマトグラフイーで生成物を定量分析した
結果を示す。
ダクターゼ（２，５−diketo−Ｄ−gluconic
acidreductase、以後25DKG−Raseと略す）に関
する。 すなわち本酵素は、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸（以後25DKGと略す）を還元型ニコチン
アミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸（以
後NADPHと略す）存在下に還元し、ビタミン
Ｃの前駆物質である２−ケト−Ｌ−グロン酸（２
−keto−Ｌ−gulonic acid、以後2KLGと略す）
を生成する作用を有す。 本発明者らは、多くの2KLG生産菌株の
25DKGを還元する酵素を研究してきたところ、
コリネバクテリウム（Corynebacterium）に属す
る2KLG生産菌株より得た25DKG−Raseが
NADPH存在下に (i) 25DKGを2KLGに還元しかつ、 (ii) ５−ケト−Ｄ−フラクトース（以後5KFと略
す）をＬ−ソルボーズ（Ｌ−sorbose）に還元
する 性質を有することを見い出した。また、この今ま
で知られていない作用を有する（この両作用を併
せ有する）新規酵素を単離精製することに成功
し、本発明を完成した。 すなわち本発明の目的は、次の物理化学的性質
を有する25DKG−Raseを提供することにある。 (イ) 酵素作用： NADPHを補酵素として、 (i) 25DKG又はその塩を2KLG又はそのその
塩に還元する。 (ii) 5KFをＬソルボーズに還元する。 (ロ) 基質特異性： 25DKGおよび5KFに対し特異性を示す。（但
し、この２基質に共通の、５位のケト基の保有、
という特徴を共にする５−ケト−Ｄ−グルコン酸
を還元せず、また末端アルコール基に隣接するケ
ト基を有するＤ−フラクトースやＬ−ソルボーズ
などのケトースや、２位がケト基である2KLGや
２−ケト−Ｄグルコン酸に対しても還元作用を示
さない） (ハ) 至適PH：PH６〜７ (ニ) PH安定性：PH５〜７ (ホ) 分子量：29000±2000 (ヘ) 等電点：PH4.4±0.3 本酵素は、コリネバクテリウム属に属する
2KLG生産菌株の菌体を破砕し、その破砕液より
得られる菌体内酵素である。酵素源としては、コ
リネバクテリウム属に属する2KLG生産菌株であ
るコリネバクテリウム・スピーシーズNo.20A−77
（Corynebacterium sP.No.20A−77，
ATCC31090、FFRM−P2770）およびこの菌体
より造成した変異株（たとえば５−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸代謝欠損変異株、FERM−BP108）が
挙げられるが、コリネバクテリウム・スピーシー
ズNo.13（ATCC31089）やコリネバクテリウム・ス
ピーシーズNo.K106（ATCC31088）およびこれら
の菌株から造成される変異株も同様に酵素源とし
て用いられる。（20A−77株、T13株およびK106
株の菌学的性状は、特公昭56−15877号公報に、
またFERM−BP108株の親株20A−77株からの誘
導変異法は特開昭58−162296号公報に詳述されて
いる。） これらの2KLG生産菌株に本発明の25DKG−
Raseを生産させるための生育培地に特別な制限
はない。たとえば１〜３％のＤ−グルコースや蔗
糖等の糖やグルコン酸、グリセリン等の有機酸を
炭素源として用い、0.5〜５％のポリペプトンや
コーン・ステイープ・リカーを窒素源として加
え、リン酸塩、マグネシウム塩その他生育に必要
なビタミン類や微量の金属塩を加えた倍地を用い
る。この培地に前記の2KLG生産菌を植菌し、25
〜35℃で15〜30時間培養し生育させる。 生育後の培養液から菌体内酵素を抽出するため
の方法としては、たとえば次のようなものが挙げ
られる。すなわち、先づ培養液より遠心分離等の
方法で菌体を集め、水又は生理食塩水、あるいは
適当なPHを有する緩衝液で洗菌する。洗菌された
菌体を適当なPHを有する緩衝液に懸濁し、超音
波、フレンチプレスあるいは酵素（リゾチーム）
等の処理により菌体を破砕して菌体内酵素を含む
菌体の破砕液とする。この破砕液から、遠心分離
等により未破砕菌体や破砕菌体残渣を取り除き、
上澄液（粗酵素液）を得る。この粗酵素液に硫酸
アンモニウムを加えて塩析する。（30〜70％飽和
画分）。 この塩析物を酵素が失活しない適当な緩衝液に
溶解し、透析処理を施し硫酸アンモニウムをのぞ
いた後、この酵素液をイオン交換クロマトグラフ
イー、アフイニテイークロマトグラフイー等の精
製処理を行うことにより単一に精製された
25DKG−Raseを得る。 この精製された25DKG−Raseの物理化学的な
性状を詳述すれば次のとおりである。 (1) 作用： 25DKG＋NADPH＋H+→2KLG＋
NADP+5KF＋NADPH＋H+→Ｌ−ソルボーズ
＋NADP+上記反応における水素供与体として
は、NADPHが用いられる。NADH（還元型ニコ
チンアミド・ジヌクレオチド）を水素供与体とし
て用いた場合、その反応速度は、NADPHを用
いた場合の反応速度の250分の１以下である。 (2) 基質特異性： 25DKGおよび5KFに特異性を示す。 この２基質と類似（５位にケト基を有する）の
５−ケト−Ｄ−グルコン酸は還元されず、末端ア
ルコールに隣接するケト基を有するＤ−フラクト
ースやＬ−ソルボース等などのケトースや２位が
ケト基である2KLGや２−ケト−Ｄ−グルコン酸
に対しても還元作用を示さない。 NADPあるいは、NAD存在下に2KLGあるい
はＬ−ソルボーズを加えても25DKGあるいは
5KFの生成は、全くあるいはほとんど認められな
い。 (3) 至適PH：PH６〜７ (4) PH安定性：PH５〜７ （PH４〜５は0.1Mジメチルグルタル酸緩衝液、
PH６〜７は、0.1Mグツド（PIPES）緩衝液、PH
８〜９は、0.1Mトリス・塩酸緩衝液中にて、28
℃、30分処理し残存活性を測定）。PH５〜７では
70％以上残存活性が認められたがPH４以下、８以
上では30％以下の残存活性しか認められなかつ
た。 (5) 酵素活性の測定法 0.1mM NADPHおよび3.3mMのCa−25DKG
を含む0.1Mトリス緩衝液（PH７）に酵素液を加
え30℃で反応させ、NADPEの酸化を340nmの吸
光値の減少から測定する。酵素活性の1unitは、
１分間にNADPH1μmoleを酸化させる酵素活性
と定義する。 (6) 作用温度の範囲：25〜45℃ (7) PH、温度による失活の条件： PH４以下およびPH８以上で、28℃、２時間放置
すると96％以上失活する。 (8) 阻害、活性化および安定化： 蓚酸塩により阻害され、グリセロアルデヒドに
よりわずかに阻害される。Mn++およびMg++を
加えても顕著には活性化されない。高濃度のグリ
セリン（30〜50％）やシユークロース（1M）に
より安定化される。 (9) 分子量：29000±2000 （SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法およ
びゲル過去による測定） (10) 等電点：PH4.4±0.3 （等電点電気泳動法により測定） (11) 酵素のKm値：2.2±1.5mM（基質25DKG、
0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）、温度30℃） 本発明の25DKG−Raseは上記酵素作用を発揮
する用途に使用可能である。すなわち、補酵素
NADPHの存在下に25DKGまたは５−ケト−フ
ラクトースと作用させることにより、2KLGまた
はＬ−ソルボーズを、それぞれ製造することがで
きる。25DKGの場合を例にとると、反応は通常
25〜45℃、PH６〜７、で行う。反応に際しての基
質25DKGのモル濃度は、水素供与体である
NADPHのモル濃度とほぼ等しく、酵素反応の
常識によつて定められるが、20〜200mM程度が
適当とされる。また酵素濃度は0.5〜5.0unit／ml
程度が適当である。また反応に際して、酵素を適
当な担体に固定化して用いることもできる。これ
らの固定化は、酵素に関して知られている一般的
方法が使用可能である。たとえば、官能基を有す
る樹脂の膜、粒などに直接あるいは二官能基を有
する橋状体たとえばグルタルアルデヒドなどを介
して結合させる。 前記酵素反応の時間はとくに制限する必要がな
いが、30℃における反応の場合60〜120分間で基
質中の25DKGの90％以上が2KLGに還元されう
る。以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 実施例 １ (1) 菌の培養 (i) 種培地： Ｄ−グルコース 1.0％ イースト・エキストラクト（Difco） 0.5％ バクト・ペプトン（Difco） 0.5％ NaNO3 0.1％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ PH7.0 上記組成の培地60mlを500ml容のフラスコに入
れ120℃、15分間蒸気滅菌した。 (ii) 生育用培地： Ｄ−グルコース 2.0％ コーン・ステイープ・リカー 3.0％ イースト・エキストラクト 0.1％ NaNO3 0.3％ KH2PO4 0.06％ PH7.2 上記組成の培地20を30容ジヤー・フアーメ
ンターに入れ、消泡剤（ポリプロピレングリコー
ルＰ−2000）50ppmを加えて、120℃、20分間滅
菌した。 (iii) 培養方法 コリネバクテリウム・スピーシーズNo.20A−77
の変異株（FERM−BP108）を10本の種培地に
１白金耳ずつ植菌し、28℃、18時間、ロータリー
振盪機（振幅71mm、270rpm）で培養した。10本
の種培養液を生育用培地に植菌し、通気量
0.5vvm、撹拌400rpm、28℃にて22時間培養し
た。（OD＝19） (2) 酵素の抽出 (1)で得た培養液から、遠心分離（シヤープレス
遠心機、10000G、10分）によつて菌を集め、
0.1Mトリス緩衝液（以後トリス緩衝液はTBと略
す。又特記しないかぎりPHは7.0である）で洗菌
した。この洗菌体をOD＝150になるように
0.1MTBに懸濁し超音波（160watt×７分／80ml）
にて菌を破砕した。菌の破砕液から遠心分離
（15000G、30分）により未破砕の菌体および菌体
残渣をとりのぞき約１の上澄液を得た。（蛋白
質＝10.3mg／ml、25DKG−Rase＝0.63unit／ml）。 (3) 酵素の精製（以下の操作はすべて４℃以下で
行つた） (i) 硫酸アンモニウム（硫安）分画 上記(2)で得た上澄液に30％飽和になるように硫
安を加え塩析物を遠心分離（10000G、10分）に
より取りのぞき、上澄液にさらに70％飽和になる
ように硫安を加えた。約１時間氷冷した後遠心分
離（10000G、10分）にて析出した蛋白質を集め
た。この蛋白質を200mlの0.1MTBに溶解し
0.02MTBに対し１夜透析した。 (ii) イオン交換クロマトグラフイー 上記(i)で得た透析液（250ml、蛋白質13.6mg／
ml）をDEAE−セフアロースCL−6B（フアーマ
シアフアインケミカルズ製）カラムに充填し下記
の条件でクロマトグラフイーを行つた。 カラム：1.6×30cm、平衡化液：0.02MTB、溶
出液＝0.02MTB（200ml）−0.15MNaCl／
0.02MTB（300ml）−0.25MNaCl／0.02MTB（200
ml）。 溶出液を５mlずつのフラクシヨンにとり分け、
各フラクシヨンの酵素活性を後記(5)−(ii)で記載す
る方法でCa−25DKG及び5KFを基質として測定
した。この結果、0.25M NaCl／0.02MTBで溶
出された約80mlの溶出液に、両基質に対する酵素
活性が認められた。この溶出液に70％飽和になる
ように硫安を加え蛋白質を塩析し、塩析物を30ml
の0.1MTBに溶解し、0.02MTBに対し４℃、１
夜透析した。 (iii) アフイニテイ・クロマトグラフイー 上記(3)−(ii)で得られた透析液を、0.02MTBで
あらかじめ平衡化されたアミコン・マトリツクス
ゲルレツドＡ（アミコン フアーイースト リミ
テツド製）カラムに充填し、次の条件でクロマト
グラフイーを行つた。カラム：1.6×19cm、洗浄
液：0.4M NaCl／0.02MTB（400ml）、溶出液：
0.5M NaCl／0.02MTB（450ml）−0.7M NaCl／
0.02MTB（150ml）−1M NaCl／0.02MTB（300
ml）。 (3)−(ii)同様、溶出された各フラクシヨン（各５
ml）の酵素活性を測定した結果0.7M−1M
NaCl／0.02MTBで溶出された18フラクシヨンに
25DKGおよび5KFの両基質に対する酵素活性を
認めた。 約90mlの溶出液に0.02MTB225mlを加えNaCl
濃度を低下させ、再度アミコン マトリツクスゲ
ル レツドＡ カラム（1.9×13cm）に充填し
0.2M NaCl／0.02MTB120mlで洗浄したのち
0.5mM NADPHと0.2M NaClを含む
0.02MTB150mlで溶出した。各５mlずつ溶出液を
取り分け各フラクシヨンの酵素活性を上記同様に
測定した。この結果0.5mM NADPHおよび0.2M
NaClを含む0.02MTBでの70ml溶出区分を中心に
高い酵素活性を有するフラクシヨン（約35ml）が
得られた。 (iv) 酵素の濃度とNADPHの除去 上記(iii)で得られた溶出液に30％飽和になるよう
に硫安を加え、あらかじめ30％飽和硫安を含む
0.02MTBで平衡化してあるフエニルセフアロー
スCL−4B（フアーマシア・フアインケミカルズ
製）のカラム（0.9×３cm）に充填した。このカ
ラムを30％飽和硫安を含む0.02MTBで洗浄し
340nmの吸光値を測定して完全にNADPHを洗い
除いたのち、0.02MTBで酵素を溶出し１mlずつ
分画した。このフラクシヨンの酵素活性を測定し
たところ、４フラクシヨンに高い酵素活性が認め
られた。この４本のフラクシヨンの液を集め精製
酵素液とし、以後の測定に用いた。この溶液は、
54units／mlの25DKG−Rase活性を示し、かつ
0.58mg／mlの蛋白質を含むものであつた。 (4) 精製酵素液の純度 上記(3)で得た精製酵素液の２〜5μをSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分離ゲル：10
％アクリルアミド、泳動条件：40mA、1Hr、室
温）により分析したところ、29000±2000の分子
量に相当する位置に単一なバンドとして泳動し
た。 さらにゲル過（セフアデツクスＧ−100）に
より分析したところ分子量29000±2000に相当す
る溶出区分に酵素活性が認められた。 この酵素液5μ等を等電点電気泳動 （ゲル：ポリアクリルアミド；泳動条件(イ)：PH
インターバル25〜５；陽電極液＝0.1MH2SO4、
陰電極液0.1M NaOH、6W、2700VH、泳動条
件(ロ)；PHインターバル4.0〜6.5、陽電極液＝
0.04MDL−グルタミン酸、陰電極液0.2M
NaOH、25W、2600VH；温度18〜20℃） で測定したところPH4.4±0.2の位置に単一なバン
ドとして泳動した。以上の事実よりこの精製酵素
液は、25DKG−Raseのみを含む酵素液であるこ
とを確認した。 (5) 酵素の物理化学的性質の測定 (i) 酵素反応 25μmolesの基質（Ca−25DKG又は5KF）およ
び15μmolesのNADPHを含む0.1Mトリス緩衝液
（PH７）3.0mlに(3)で得られた精製酵素液10μlを加
え、30℃で60分反応させた。反応後、反応液をペ
ーパークロマトグラフイー（展開剤：フエノー
ル：ギ酸：水＝75：４：25、発色剤＝アニリン−
水素−フタル酸溶液）およびガスクロマトグラフ
イー（カラム：SE−52、キヤリアーガス：ヘリ
ウム、サンプル：トリメチルシリル化誘導体）で
分析した。両クロマトグラフイーによる分析の結
果より25DKGからは2KLGのみが生成し、5KF
からはＬ−ソルボースのみが生成した。第１表に
ガスクロマトグラフイーで生成物を定量分析した
結果を示す。
【表】
(ii) 基質特異性
0.3μmole NADPHを含む0.1Mトリス緩衝液
（PH７）2.9mlを１cmの光路差を有する石英キユベ
ツトに入れ、(3)で得られた酵素液を、１〜5μ
加え30℃に保温し、0.1Mの各基質溶液を0.1ml加
えた。340nmの吸光値の減少を経時的に測定し、
１分当りの吸光値の減少量より各基質に対する反
応性を測定した。その結果を第２表に示す。
（PH７）2.9mlを１cmの光路差を有する石英キユベ
ツトに入れ、(3)で得られた酵素液を、１〜5μ
加え30℃に保温し、0.1Mの各基質溶液を0.1ml加
えた。340nmの吸光値の減少を経時的に測定し、
１分当りの吸光値の減少量より各基質に対する反
応性を測定した。その結果を第２表に示す。
【表】
上記より明らかなように本発明の酵素は、
25DKG、5KFには高い活性を示すが、５−ケト
−Ｄ−グルコン酸、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ソル
ボーズ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、2KLGに対
しては還元活性を示さないことが確認された。 (iii) 補酵素（水素供与体）について (5)−(ii)の反応系のNADPHをNADHにかけて
基質Ca−25DKGおよび5KFに対する25DKG.
Raseの酵素活性を測定した。 その結果を第３表に示した。
25DKG、5KFには高い活性を示すが、５−ケト
−Ｄ−グルコン酸、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ソル
ボーズ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸、2KLGに対
しては還元活性を示さないことが確認された。 (iii) 補酵素（水素供与体）について (5)−(ii)の反応系のNADPHをNADHにかけて
基質Ca−25DKGおよび5KFに対する25DKG.
Raseの酵素活性を測定した。 その結果を第３表に示した。
【表】
上表に示すようにCa−25DKGに対して
NADPHを水素供与体としたとき、精製酵素液
１ml当り54unitの活性を示したがNADHを用い
ると0.2unit以下の活性しか示さなかつた。同様
に5KFを基質とした場合、NADPHを水素供与
体としたとき94unitであつた活性は、NADHを
用いると0.2unit以下の活性しか示さなかつた。 (iv) 至適PH 25−DKG−Raseの反応速度とPHの関係を知る
ため(5)−(ii)で示した反応系の緩衝液を次の緩衝液
にかけて酵素活性を測定した。 PH4.0〜5.0：0.1M3.3−ジメチルグルタル酸緩
衝液、PH6.0〜7.0は0.1Mグツド緩衝液（PIPES：
ピペラジン−Ｎ，N′−ビス−（２−エタンスルホ
ン酸））、PH7.0〜9.0は0.1Mトリス緩衝液。 Ca−25DKGおよび5KFを基質としたときの
各々のPHでの酵素活性の測定結果を次の第４表に
示す。
NADPHを水素供与体としたとき、精製酵素液
１ml当り54unitの活性を示したがNADHを用い
ると0.2unit以下の活性しか示さなかつた。同様
に5KFを基質とした場合、NADPHを水素供与
体としたとき94unitであつた活性は、NADHを
用いると0.2unit以下の活性しか示さなかつた。 (iv) 至適PH 25−DKG−Raseの反応速度とPHの関係を知る
ため(5)−(ii)で示した反応系の緩衝液を次の緩衝液
にかけて酵素活性を測定した。 PH4.0〜5.0：0.1M3.3−ジメチルグルタル酸緩
衝液、PH6.0〜7.0は0.1Mグツド緩衝液（PIPES：
ピペラジン−Ｎ，N′−ビス−（２−エタンスルホ
ン酸））、PH7.0〜9.0は0.1Mトリス緩衝液。 Ca−25DKGおよび5KFを基質としたときの
各々のPHでの酵素活性の測定結果を次の第４表に
示す。
【表】
上表で明らかなようにこの酵素はPH６〜７で最
も酵素活性が高かつた。 (v) 作用温度 Ca−25DKGを基質とする(5)−(ii)の反応系の温
度を15〜50℃までかえて反応速度を測定した。そ
の結果を次の第５表に示す。
も酵素活性が高かつた。 (v) 作用温度 Ca−25DKGを基質とする(5)−(ii)の反応系の温
度を15〜50℃までかえて反応速度を測定した。そ
の結果を次の第５表に示す。
【表】
【表】
量
上表で明らかなように、本発明酵素は40℃まで
は温度の上昇とともに、その酵素活性が増加する
が、45℃以上では温度の上昇とともに酵素活性が
低下するものであることが確認された。 (vi) Km値の測定 (5)−(ii)に記載した方法におけるCa−25DKGの
溶液の濃度を0.01M〜0.25Mまでかえ各々の還元
反応速度を測定し、25DKGに対するKm値を求
めた。その結果Km値は1.8±1.0mMであつた。 実施例 ２ (1) 菌の培養 (i) 生育用培地 Ｄ−グルコース 1.0％ コーン・ステイープ・リカー 1.0％ イースト・エキストラクト（Difco） 0.2％ ポリペプトン（Difco） 0.5％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ PH7.0。培地12を20容ジヤー・フアーメンタ
ーに入れ、120℃、20分滅菌した。 (ii) 培養 実施例１−(1)に記載した種培地、培養方法で、
コリネバクテリウム・スピーシーズNo.K106
（ATCC31088、以後K106と略す）およびコリネ
バクテリウム・スピーシーズNo.T13
（ATCC31089、以後T13と略す）を各々２本ずつ
培養した。この種培養液を各々(i)の培地に植菌
し、通気量0.5vvm、撹拌速度400rpm、28℃で18
時間培養した。この時の菌量はそれぞれ次の如く
であつた。菌株No.K106：OD＝11.8、No.T13：OD
＝12・２。 (2) 酵素の抽出 菌株K106およびT13の培養液より実施例１−
(2)に記載した方法で再洗菌し、0.02MTBで
OD150の菌体懸濁液を調整した。この懸濁液を
フレンチプレス（700Kg／cm2）にかけ、菌体を破
砕した。破砕液は、実施例１−(2)に記載したよう
に、遠心分離（15000G、30分）により未破砕菌
体および菌体残渣をとりのぞいた。その結果次の
酵素活性を有する抽出液を得た。 菌株 抽出液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 400ml 10mg／ml 2.1 units／ml T13 400ml 12mg／ml 2.0 units／ml (3) 酵素の精製 (i) 硫酸アンモニウムによる塩析 実施例１−(3)で記載した方法により、30％〜70
硫安飽和塩析区分の蛋白質を集め0.02MTBで溶
解後、0.02MTBに対し４℃で１夜透析した。 その結果次の酵素活性を有する酵素液を得た。 菌株 酵素液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 74ml （測定せず） 7.0 units／ml T13 88ml 11.1mg／ml 4.8units／ml (ii) イオン交換クロマトグラフイー 実施例１−(3)−(ii)の方法を用いた。その結果次
の酵素活性を有する溶出液を得た。 菌株 酵素液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 49ml 0.60mg／ml 2.4units／ml T13 52ml 0.94mg／ml 4.1units／ml (iii) アフイニテイクロマトグラフイー (ii)で得た溶出液に30％飽和になるように硫安を
加え、先ず実施例１−(3)−(iv)に記載したフエニル
セフアロースカラムクロマトグラフイーにより酵
素の濃縮と脱塩を前もつて行つた。濃縮された酵
素液を、実施例１−(3)−(iii)に記載したアミコン・
マトリツクスゲルレツドＡカラムによるアフイニ
テイークロマトグラフイーを２回行うことにより
精製した。その結果、両菌株の25DKG−Rase
は、１回目のクロマトグラフイーでは、0.7〜1M
のNaCl濃度でのフラクシヨンに、２回目のクロ
マトグラフイーでは0.5mM MADPHフラクシヨ
ンに溶出された。溶出液は、実施例１−(3)−(iv)で
記載した方法で脱塩、NADPHの除去および酵
素の濃縮を行つた。その結果下記の如くの精製酵
素液が得られた。 菌株 酵素液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 約１ml 0.25mg／ml 23.8 units／ml T13 約２ml 0.17mg／ml 15.1 units／ml 上記の酵素液（２〜10μ）を、実施例１−(4)
に記載したSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
および等電点電気泳動法により分析した結果、い
ずれも単一なバンドとして泳動した。この精製酵
素液を用いて以下の酵素の性質を測定した。 (4) 酵素の物理化学的性質 酵素の物理化学的性質の測定は、実施例１−(4)
〜(5)に記載した方法を用いて行つた。 (i) 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り分析したところ、K106およびT13より得た
25DKG−Raseの分子量は共に29000±2000であ
つた。 (ii) 等電点 等電点電気泳動法により測定した結果K106の
酵素は、PH4.4±0.2、T13の酵素は、PH4.5±0.2で
あつた。 (iii) 基質特異性 両酵素ともCa−25DKGからは、Ca−2KLGの
みが、又5KFからはＬ−ソルボーズのみが生成し
た。５−ケト−Ｄ−グルコン酸、Ｄ−フラクトー
ス、Ｌ−ソルボーズ、2KLG、２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸からは何も生成しなかつた。 (iv) 酵素活性 K106の酵素はCa−25DKGに対し、23・
8units／ml（95units／mgProtein）5KFに対し
38.3units／ml（152units／mgProtein）であつた。
一方T13の酵素はCa−25DKGに対し15.1units／
ml（89units／mgProtin）、5KFに対し39units／ml
（229units／mgProtin）であつた。 (v) 両酵素ともNADHを補酵素としてCa−
25DKGに対する酵素活性を測定した結果いずれ
も0.1units／ml以下の活性であつた。 (vi) 至適PH K106およびT13から得た25DKG−Raseの酵素
活性（基質Ca−25DKG、反応温度30℃）をPH４
〜９の各PHで測定した。その結果を次の表に示
す。
上表で明らかなように、本発明酵素は40℃まで
は温度の上昇とともに、その酵素活性が増加する
が、45℃以上では温度の上昇とともに酵素活性が
低下するものであることが確認された。 (vi) Km値の測定 (5)−(ii)に記載した方法におけるCa−25DKGの
溶液の濃度を0.01M〜0.25Mまでかえ各々の還元
反応速度を測定し、25DKGに対するKm値を求
めた。その結果Km値は1.8±1.0mMであつた。 実施例 ２ (1) 菌の培養 (i) 生育用培地 Ｄ−グルコース 1.0％ コーン・ステイープ・リカー 1.0％ イースト・エキストラクト（Difco） 0.2％ ポリペプトン（Difco） 0.5％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ PH7.0。培地12を20容ジヤー・フアーメンタ
ーに入れ、120℃、20分滅菌した。 (ii) 培養 実施例１−(1)に記載した種培地、培養方法で、
コリネバクテリウム・スピーシーズNo.K106
（ATCC31088、以後K106と略す）およびコリネ
バクテリウム・スピーシーズNo.T13
（ATCC31089、以後T13と略す）を各々２本ずつ
培養した。この種培養液を各々(i)の培地に植菌
し、通気量0.5vvm、撹拌速度400rpm、28℃で18
時間培養した。この時の菌量はそれぞれ次の如く
であつた。菌株No.K106：OD＝11.8、No.T13：OD
＝12・２。 (2) 酵素の抽出 菌株K106およびT13の培養液より実施例１−
(2)に記載した方法で再洗菌し、0.02MTBで
OD150の菌体懸濁液を調整した。この懸濁液を
フレンチプレス（700Kg／cm2）にかけ、菌体を破
砕した。破砕液は、実施例１−(2)に記載したよう
に、遠心分離（15000G、30分）により未破砕菌
体および菌体残渣をとりのぞいた。その結果次の
酵素活性を有する抽出液を得た。 菌株 抽出液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 400ml 10mg／ml 2.1 units／ml T13 400ml 12mg／ml 2.0 units／ml (3) 酵素の精製 (i) 硫酸アンモニウムによる塩析 実施例１−(3)で記載した方法により、30％〜70
硫安飽和塩析区分の蛋白質を集め0.02MTBで溶
解後、0.02MTBに対し４℃で１夜透析した。 その結果次の酵素活性を有する酵素液を得た。 菌株 酵素液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 74ml （測定せず） 7.0 units／ml T13 88ml 11.1mg／ml 4.8units／ml (ii) イオン交換クロマトグラフイー 実施例１−(3)−(ii)の方法を用いた。その結果次
の酵素活性を有する溶出液を得た。 菌株 酵素液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 49ml 0.60mg／ml 2.4units／ml T13 52ml 0.94mg／ml 4.1units／ml (iii) アフイニテイクロマトグラフイー (ii)で得た溶出液に30％飽和になるように硫安を
加え、先ず実施例１−(3)−(iv)に記載したフエニル
セフアロースカラムクロマトグラフイーにより酵
素の濃縮と脱塩を前もつて行つた。濃縮された酵
素液を、実施例１−(3)−(iii)に記載したアミコン・
マトリツクスゲルレツドＡカラムによるアフイニ
テイークロマトグラフイーを２回行うことにより
精製した。その結果、両菌株の25DKG−Rase
は、１回目のクロマトグラフイーでは、0.7〜1M
のNaCl濃度でのフラクシヨンに、２回目のクロ
マトグラフイーでは0.5mM MADPHフラクシヨ
ンに溶出された。溶出液は、実施例１−(3)−(iv)で
記載した方法で脱塩、NADPHの除去および酵
素の濃縮を行つた。その結果下記の如くの精製酵
素液が得られた。 菌株 酵素液量 蛋白質
25DKG−Rase活性 K106 約１ml 0.25mg／ml 23.8 units／ml T13 約２ml 0.17mg／ml 15.1 units／ml 上記の酵素液（２〜10μ）を、実施例１−(4)
に記載したSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
および等電点電気泳動法により分析した結果、い
ずれも単一なバンドとして泳動した。この精製酵
素液を用いて以下の酵素の性質を測定した。 (4) 酵素の物理化学的性質 酵素の物理化学的性質の測定は、実施例１−(4)
〜(5)に記載した方法を用いて行つた。 (i) 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り分析したところ、K106およびT13より得た
25DKG−Raseの分子量は共に29000±2000であ
つた。 (ii) 等電点 等電点電気泳動法により測定した結果K106の
酵素は、PH4.4±0.2、T13の酵素は、PH4.5±0.2で
あつた。 (iii) 基質特異性 両酵素ともCa−25DKGからは、Ca−2KLGの
みが、又5KFからはＬ−ソルボーズのみが生成し
た。５−ケト−Ｄ−グルコン酸、Ｄ−フラクトー
ス、Ｌ−ソルボーズ、2KLG、２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸からは何も生成しなかつた。 (iv) 酵素活性 K106の酵素はCa−25DKGに対し、23・
8units／ml（95units／mgProtein）5KFに対し
38.3units／ml（152units／mgProtein）であつた。
一方T13の酵素はCa−25DKGに対し15.1units／
ml（89units／mgProtin）、5KFに対し39units／ml
（229units／mgProtin）であつた。 (v) 両酵素ともNADHを補酵素としてCa−
25DKGに対する酵素活性を測定した結果いずれ
も0.1units／ml以下の活性であつた。 (vi) 至適PH K106およびT13から得た25DKG−Raseの酵素
活性（基質Ca−25DKG、反応温度30℃）をPH４
〜９の各PHで測定した。その結果を次の表に示
す。
【表】
の活性
上表から明らかなように両菌株から得られた
25DKG−Raseの至適PHは、いずれもPH６〜７で
あつた。 (vii) 作用温度 K106およびT13から得た25DKG−Raseの酵素
活性（PH7.0、基質Ca−25DKG）を種々の温度で
測定した。その結果を次の第７表に示す。
上表から明らかなように両菌株から得られた
25DKG−Raseの至適PHは、いずれもPH６〜７で
あつた。 (vii) 作用温度 K106およびT13から得た25DKG−Raseの酵素
活性（PH7.0、基質Ca−25DKG）を種々の温度で
測定した。その結果を次の第７表に示す。
【表】
【表】
＊ 前６表の定義に準じる。
上表から明らかなように両菌株から得られた
25DKG−Raseは、いずれも40℃まで温度の上昇
とともに活性は増加するが45℃以上では、温度の
上昇とともに活性は、低下することが確認され
た。 (viii) Km値 K106およびT13の精製酵素液を用いて測定し
た両酵素の25DKGに対するKm値は、各々1.7±
1.0mM、2.6±1.0mMであつた。
上表から明らかなように両菌株から得られた
25DKG−Raseは、いずれも40℃まで温度の上昇
とともに活性は増加するが45℃以上では、温度の
上昇とともに活性は、低下することが確認され
た。 (viii) Km値 K106およびT13の精製酵素液を用いて測定し
た両酵素の25DKGに対するKm値は、各々1.7±
1.0mM、2.6±1.0mMであつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の物理化学的性質を有する２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸リダクターゼ (イ) 酵素作用： NADPHを補酵素として (i) ２，５ジケト−Ｄ−グルコン酸またはその
塩を２−ケト−Ｌ−グロン酸またはその塩に
還元する。 (ii) ５−ケト−Ｄ−フラクトースをＬ−ソルボ
ーズに還元する。 (ロ) 基質特異性： ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸および５−ケ
ト−Ｄ−フラクトースに対し特異性を示す。 (ハ) 至適PH：PH６〜７ (ニ) PH安定性：PH５〜７ (ホ) 分子量：2900±2000 (ヘ) 等電点：PH4.4±0.3
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58217176A JPS60118186A (ja) | 1983-11-17 | 1983-11-17 | ２・５−ジケト−ｄ−グルコン酸リダクタ−ゼ |
| CA000466243A CA1226836A (en) | 1983-11-17 | 1984-10-24 | 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase |
| US06/665,965 US4748122A (en) | 1983-11-17 | 1984-10-29 | 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase |
| ES537480A ES537480A0 (es) | 1983-11-17 | 1984-11-07 | Procedimiento para la fabricacion de la reductasa del acido 2, 5-diceto-d-gluconico |
| IE2913/84A IE57594B1 (en) | 1983-11-17 | 1984-11-13 | 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase |
| GB08428615A GB2151233B (en) | 1983-11-17 | 1984-11-13 | 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase |
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| DE8484113750T DE3485321D1 (de) | 1983-11-17 | 1984-11-14 | 2,5-diketo-d-glukonsaeure-reduktase. |
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| KR1019840007209A KR880001944B1 (ko) | 1983-11-17 | 1984-11-16 | 2,5-디케토-d-글루콘산 리덕타제의 제조방법 |
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| AU35612/84A AU569925B2 (en) | 1983-11-17 | 1984-11-16 | 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58217176A JPS60118186A (ja) | 1983-11-17 | 1983-11-17 | ２・５−ジケト−ｄ−グルコン酸リダクタ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60118186A JPS60118186A (ja) | 1985-06-25 |
| JPH0335B2 true JPH0335B2 (ja) | 1991-01-07 |
Family
ID=16700049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58217176A Granted JPS60118186A (ja) | 1983-11-17 | 1983-11-17 | ２・５−ジケト−ｄ−グルコン酸リダクタ−ゼ |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
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| AU (1) | AU569925B2 (ja) |
| CA (1) | CA1226836A (ja) |
| DE (1) | DE3485321D1 (ja) |
| DK (1) | DK545484A (ja) |
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| GB (1) | GB2151233B (ja) |
| HU (1) | HU192892B (ja) |
| IE (1) | IE57594B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5004690A (en) * | 1983-06-28 | 1991-04-02 | Genetech, Inc. | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
| US4755467A (en) * | 1985-06-03 | 1988-07-05 | Unisearch Limited | Method for the production of sorbitol and gluconate |
| GB8519536D0 (en) * | 1985-08-02 | 1985-09-11 | Biogen Nv | Vitamin c precursor |
| DE3686041T2 (de) * | 1985-08-02 | 1993-01-28 | Biogen Inc | Herstellung eines vitamin-c-vorlaeufers mittels genetisch modifizierter organismen. |
| US5032514A (en) * | 1988-08-08 | 1991-07-16 | Genentech, Inc. | Metabolic pathway engineering to increase production of ascorbic acid intermediates |
| US5376544A (en) * | 1992-09-08 | 1994-12-27 | Rutgers The State University Of New Jersey | Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid |
| US5795761A (en) * | 1996-01-11 | 1998-08-18 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Mutants of 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) reductase A |
| US7256027B1 (en) | 1999-06-15 | 2007-08-14 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid |
| US6979717B2 (en) * | 2001-08-13 | 2005-12-27 | Moore Eugene R | Anionic process design for rapid polymerization of polystyrene without gel formation and product produced there from |
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| JPS5135487A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
| JPS5135486A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
| JPS5135485A (en) * | 1974-09-20 | 1976-03-25 | Shionogi Seiyaku Kk | 22 keto ll guronsan no seizohoho |
| US4245049A (en) * | 1980-01-21 | 1981-01-13 | Pfizer Inc. | Preparation of 2-keto-L-gulonic acid |
| JPS58162298A (ja) * | 1982-03-05 | 1983-09-26 | Shionogi & Co Ltd | ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 |
| US4543331A (en) * | 1982-03-05 | 1985-09-24 | Shionogi & Co., Ltd. | Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid |
| EP0132308B1 (en) * | 1983-06-28 | 1991-03-06 | Genentech, Inc. | Biosynthetic 2,5-diketogluconic acid reductase, processes, recombinant cells and expression vectors for its production, and its use in preparing 2-keto-l-gulonic acid |
-
1983
- 1983-11-17 JP JP58217176A patent/JPS60118186A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-24 CA CA000466243A patent/CA1226836A/en not_active Expired
- 1984-10-29 US US06/665,965 patent/US4748122A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-07 ES ES537480A patent/ES537480A0/es active Granted
- 1984-11-13 GB GB08428615A patent/GB2151233B/en not_active Expired
- 1984-11-13 IE IE2913/84A patent/IE57594B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-11-14 EP EP84113750A patent/EP0142169B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-14 DE DE8484113750T patent/DE3485321D1/de not_active Expired - Fee Related
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- 1984-11-16 KR KR1019840007209A patent/KR880001944B1/ko not_active Expired
- 1984-11-16 DK DK545484A patent/DK545484A/da not_active Application Discontinuation
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