JPH0337913B2 - - Google Patents
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- JPH0337913B2 JPH0337913B2 JP5918181A JP5918181A JPH0337913B2 JP H0337913 B2 JPH0337913 B2 JP H0337913B2 JP 5918181 A JP5918181 A JP 5918181A JP 5918181 A JP5918181 A JP 5918181A JP H0337913 B2 JPH0337913 B2 JP H0337913B2
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、著量の酵素を生産し、かつ、生育速
度も良好な麹菌を得る方法に関するものである。 一般に麹菌は醤油醸造にとつてきわめて重要な
役割をはたしており、使用麹菌株の改良も様々に
行なわれているものである。 従来、麹菌の改質方法としては紫外線照射等の
変異処理が一般に採用されている。しかし、紫外
線照射等の変異処理による変異株の分離は、きわ
めて偶然性が高く、スクリーニングに膨大な労力
を要するなど効率がきわめて悪い。また、たまた
ま酵素生産性にすぐれた変異株が得られても、直
ちに復帰突然変異を起したり、生育速度が著じる
しく遅くなつていたりして、実用性に欠けるもの
であつた。更に、一般的変異処理による変異株
は、２回、３回と重ねて変異処理を行うと、劣つ
た生育速度が更に劣化し、実用化にはほど遠いも
のとなるのである。 本発明者は、酵素生産性が高く、かつ生育速度
が早く、しかも確実に効率よく分離することので
きる麹菌の育種方法を求めて研究したところ、２
倍体造成手段を中間にして変異処理をすれば、こ
れら目的に合致する変異株を確実に得られること
を知つた。 本発明は、この知見より完成されたもので、変
異によつて得られた著量酵素生産性麹菌株を少く
とも一方の親株として２倍体を造成し、得られた
２倍体株を更に変異せしめ、より高度な著量酵素
生産性麹菌株を得ることを特徴とする麹菌の育種
方法である。 本発明においては、生産性を高める酵素とし
て、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、
酸性プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、グルタミナー
ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びペクチントラン
スエリミナーゼが目標となるが、これら酵素はす
べて全部のものが一せいに各力価を上昇させるこ
とはきわめて困難であり、少くとも１種もしくは
２〜６種のものの力価を同時に高めるのが普通で
ある。 本発明においては、まず、普通に市販されてい
る種麹菌から酵素生産性と生育の良好な菌株を分
離し、これに紫外線照射等の変異処理を行い、酵
素生産性のよりすぐれた菌株を分離する。ここで
はアルカリプロテアーゼを目標にした場合、1.2
〜３倍量の生産性が向上しているが、これは一般
的である。しかし、この変異株は普通生育速度が
おとり、しかも復帰突然変異を起しやすいもので
ある。 本発明においては、ここに得られる変異株を少
くとも一方の親株として２倍体が造成される。も
う一方の親株としては、同株の変異株でもよい
し、原株でも、同種の異株でもよいが、生育速度
の良好のものを選択するのが好ましい。 ２倍体を造成する際、両親株に特に栄養要求
性、変色調性等の標識を付する必要はないのであ
るが、標識を付していないと、後のヘテロカリオ
ン、２倍体の分離操作が困難となるので好ましく
ない。酵素生産性の良好な変異株に標識を付すの
は主として次の操作による。 １ 栄養要求性の付与 栄養要求性を付与しようとする株を30℃７〜
10日間培養して得た胞子の懸濁液にUV照射を
行う。（生残率10-2−10-3）プレイト当りのコ
ロニーが50程度になる様に希釈して、胞子の照
射懸濁液を完全培地（米麹汁 糖度10）に塗布
する。この完全培地にはコロニーが大きくなら
ない様にデオキシコール酸ナトリウム等を適量
加えておく。30℃で２−３日培養して生育して
きた麹菌コロニーに胞子が着生した後、このプ
レイトをマスタープレイトとして、最少培地
（ツアペツク培地）と完全培地に常法に従いレ
プリカを行う。 完全培地に成育し、最少培地に成育しない菌
が栄養要求株である。オキサノグラフ法により
要求物質を決定することができる。 変異剤としてNTG（ニトロソグアニジン）処
理でも有効に栄養要求株を得ることができる。 ２ 変色調性の付与 栄養要求株（胞子の色は緑）を１と同様の
UV処理を行うと、10-2−10-3の頻度で胞子の
色が、白、黄、茶等のカラーミユータントを得
ることができる。 このダブルミユータント（栄養要求性、胞子
の色）の２つの性質が充分に安定であることを
確認して次の段階に進む。 このようにして処理した一方の親株を用意
し、一方、もう一方とは異なるカラーミユータ
ントを親株として用意する。 これら両株は、吻合（anastomosis）を行な
わせ、吻合体を増殖させて、ヘテロカリオンを
得、次いで、これを増殖させて、ヘテロカオリ
ンから２倍体を自然に分離することができる。
そのとき、両親株に退色（白、黄、茶に）した
ものを用いていれば、緑色のものが２倍体（も
う一方の親株との合体で緑色となるため）であ
るので直ちに分離することが可能となる。 吻合、ヘテロカオリンの生成、２倍体の生成
を具体的に述べれば、２種のダブルミユータン
ト（栄養要求性、胞子の変色）の胞子を吻合用
培地（糖度1.0 米麹汁培地PH5.5）に混合接種
を行い、23℃で７日間培養する。うすく増殖し
た部分より胞子をツアペツク培地に抜き出して
30℃で３日間培養するとヘテロカリオンが増殖
して来る。 ヘテロカリオンの増殖によつて２倍体は10-5
〜10-7の頻度で自然に生成し分離することがで
きる。ここにおいては緑色のコロニーのみが２
倍体であるから、白、黄、混合のヘテロオリカ
ンとは容易に区別される。２倍体の生成頻度を
あげるため生残率を５％以下にする程度に紫外
線照射すれば、10-2程度の頻度で２倍体を得る
こともできる。 ここに得られる２倍体には、更に紫外線照射等
の変異処理が行なわれ、目的とする酵素力価の高
い菌株を選択分離して、酵素力価及び生育度がと
もに高く、すぐれた麹菌を得ることができる。こ
のようにして得られた、プロテアーゼ生成がすぐ
れ、しかも生育度の高い一菌株は微工研にアスペ
ルギルス・ソーヤSD、FERM Ｐ No.5956として
寄託されている。 次に、上述の方法を用いて実験を行つた。
度も良好な麹菌を得る方法に関するものである。 一般に麹菌は醤油醸造にとつてきわめて重要な
役割をはたしており、使用麹菌株の改良も様々に
行なわれているものである。 従来、麹菌の改質方法としては紫外線照射等の
変異処理が一般に採用されている。しかし、紫外
線照射等の変異処理による変異株の分離は、きわ
めて偶然性が高く、スクリーニングに膨大な労力
を要するなど効率がきわめて悪い。また、たまた
ま酵素生産性にすぐれた変異株が得られても、直
ちに復帰突然変異を起したり、生育速度が著じる
しく遅くなつていたりして、実用性に欠けるもの
であつた。更に、一般的変異処理による変異株
は、２回、３回と重ねて変異処理を行うと、劣つ
た生育速度が更に劣化し、実用化にはほど遠いも
のとなるのである。 本発明者は、酵素生産性が高く、かつ生育速度
が早く、しかも確実に効率よく分離することので
きる麹菌の育種方法を求めて研究したところ、２
倍体造成手段を中間にして変異処理をすれば、こ
れら目的に合致する変異株を確実に得られること
を知つた。 本発明は、この知見より完成されたもので、変
異によつて得られた著量酵素生産性麹菌株を少く
とも一方の親株として２倍体を造成し、得られた
２倍体株を更に変異せしめ、より高度な著量酵素
生産性麹菌株を得ることを特徴とする麹菌の育種
方法である。 本発明においては、生産性を高める酵素とし
て、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、
酸性プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、グルタミナー
ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びペクチントラン
スエリミナーゼが目標となるが、これら酵素はす
べて全部のものが一せいに各力価を上昇させるこ
とはきわめて困難であり、少くとも１種もしくは
２〜６種のものの力価を同時に高めるのが普通で
ある。 本発明においては、まず、普通に市販されてい
る種麹菌から酵素生産性と生育の良好な菌株を分
離し、これに紫外線照射等の変異処理を行い、酵
素生産性のよりすぐれた菌株を分離する。ここで
はアルカリプロテアーゼを目標にした場合、1.2
〜３倍量の生産性が向上しているが、これは一般
的である。しかし、この変異株は普通生育速度が
おとり、しかも復帰突然変異を起しやすいもので
ある。 本発明においては、ここに得られる変異株を少
くとも一方の親株として２倍体が造成される。も
う一方の親株としては、同株の変異株でもよい
し、原株でも、同種の異株でもよいが、生育速度
の良好のものを選択するのが好ましい。 ２倍体を造成する際、両親株に特に栄養要求
性、変色調性等の標識を付する必要はないのであ
るが、標識を付していないと、後のヘテロカリオ
ン、２倍体の分離操作が困難となるので好ましく
ない。酵素生産性の良好な変異株に標識を付すの
は主として次の操作による。 １ 栄養要求性の付与 栄養要求性を付与しようとする株を30℃７〜
10日間培養して得た胞子の懸濁液にUV照射を
行う。（生残率10-2−10-3）プレイト当りのコ
ロニーが50程度になる様に希釈して、胞子の照
射懸濁液を完全培地（米麹汁 糖度10）に塗布
する。この完全培地にはコロニーが大きくなら
ない様にデオキシコール酸ナトリウム等を適量
加えておく。30℃で２−３日培養して生育して
きた麹菌コロニーに胞子が着生した後、このプ
レイトをマスタープレイトとして、最少培地
（ツアペツク培地）と完全培地に常法に従いレ
プリカを行う。 完全培地に成育し、最少培地に成育しない菌
が栄養要求株である。オキサノグラフ法により
要求物質を決定することができる。 変異剤としてNTG（ニトロソグアニジン）処
理でも有効に栄養要求株を得ることができる。 ２ 変色調性の付与 栄養要求株（胞子の色は緑）を１と同様の
UV処理を行うと、10-2−10-3の頻度で胞子の
色が、白、黄、茶等のカラーミユータントを得
ることができる。 このダブルミユータント（栄養要求性、胞子
の色）の２つの性質が充分に安定であることを
確認して次の段階に進む。 このようにして処理した一方の親株を用意
し、一方、もう一方とは異なるカラーミユータ
ントを親株として用意する。 これら両株は、吻合（anastomosis）を行な
わせ、吻合体を増殖させて、ヘテロカリオンを
得、次いで、これを増殖させて、ヘテロカオリ
ンから２倍体を自然に分離することができる。
そのとき、両親株に退色（白、黄、茶に）した
ものを用いていれば、緑色のものが２倍体（も
う一方の親株との合体で緑色となるため）であ
るので直ちに分離することが可能となる。 吻合、ヘテロカオリンの生成、２倍体の生成
を具体的に述べれば、２種のダブルミユータン
ト（栄養要求性、胞子の変色）の胞子を吻合用
培地（糖度1.0 米麹汁培地PH5.5）に混合接種
を行い、23℃で７日間培養する。うすく増殖し
た部分より胞子をツアペツク培地に抜き出して
30℃で３日間培養するとヘテロカリオンが増殖
して来る。 ヘテロカリオンの増殖によつて２倍体は10-5
〜10-7の頻度で自然に生成し分離することがで
きる。ここにおいては緑色のコロニーのみが２
倍体であるから、白、黄、混合のヘテロオリカ
ンとは容易に区別される。２倍体の生成頻度を
あげるため生残率を５％以下にする程度に紫外
線照射すれば、10-2程度の頻度で２倍体を得る
こともできる。 ここに得られる２倍体には、更に紫外線照射等
の変異処理が行なわれ、目的とする酵素力価の高
い菌株を選択分離して、酵素力価及び生育度がと
もに高く、すぐれた麹菌を得ることができる。こ
のようにして得られた、プロテアーゼ生成がすぐ
れ、しかも生育度の高い一菌株は微工研にアスペ
ルギルス・ソーヤSD、FERM Ｐ No.5956として
寄託されている。 次に、上述の方法を用いて実験を行つた。
【表】
生育度：常法により調整した米麹汁（糖度10）寒
天プレイト上に、30℃100時間培養した時の巨
大コロニー直径（mm）による。 アルカリプロテアーゼ活性ｕ／ｇ〓麹：150ml
三角フラスコに小麦〓５ｇをとり、水道水４ml
を加え、よく練つた後、30分間オートクレイブ
で蒸煮殺菌を行つた。この培地に１白金耳量の
胞子を接種し、30℃３日間培養して〓麹をつく
つた。10倍量の水を加え、５℃１晩酵素を抽出
した。アンソン−萩原法に準じてプロテアーゼ
活性を測定した。ｕ／ｇ〓麹で表した。 Ｈ株、Ｍ株から２倍体の造成： 以上述べた方法により、Ｈ株同士、Ｈ株とＭ
株、Ｍ株同士の３つの組合せで２倍体を造成し
た。それらをHH株、HM株、MM株と呼ぶこと
にする。 これらの菌の生育度とアルカリプロテアーゼ活
性ｕ／ｇ〓麹は第１図の通りである。HH株と
MM株はそれらの親株と大差ない性質であり、
HM株は両親の中間を示した。 更に、HH株、HM株、MM株より数株ずつ選
びUV照射を行い、著量アルカリプロテアーゼ生
産菌の分離を試みた。尚一次スクリーニングとし
て、カゼイン培地に於るプロテアーゼ生産量と相
関するヘロ比〔カゼイン溶解円／コロニー直径、
H.SEKINE、S.NASUNO ＆ N.IGUCHI；
Agr.Biol.Chem.、33、1477（1969）〕が親株以上
の菌を選択した。 この結果、HM株、MM株からは著量アルカリ
プロテアーゼ生産菌を分離することができたが、
HH株からは分離することができなかつた。（第
２図）特にHM株に由来する著量アルカリプロテ
アーゼ生産菌は生育もＭ株とほとんど大差なく、
スケールアツプをした場合でも充分に能力を発揮
することができた。 上記変異の生残率は10-3以下が望ましく、通常
の変異の場合の10-2（以下）程度の生残率ではほ
とんど著量アルカリプロテアーゼ生産菌をとるこ
とができなかつた。また亜硝酸等の化学変異剤で
もUVと同様にとることができた。 Ｍ株（半数体）を親株として、同様に変異及び
スクリーニングを行つた場合も著量アルカリプロ
テアーゼ生産菌をとることができた。 しかし、その効率は２倍体（HM株、MM株
（第２図）〕と比較して、極めて悪いものであつ
た。（第３図） また、アルカリプロテアーゼ生産量が充分に高
い菌は全て成育がかなり劣つており、スケールア
ツプをした場合、Ｍ株と大差ないか、むしろ低目
の値しか示すことができなかつた（第１図参照）。
天プレイト上に、30℃100時間培養した時の巨
大コロニー直径（mm）による。 アルカリプロテアーゼ活性ｕ／ｇ〓麹：150ml
三角フラスコに小麦〓５ｇをとり、水道水４ml
を加え、よく練つた後、30分間オートクレイブ
で蒸煮殺菌を行つた。この培地に１白金耳量の
胞子を接種し、30℃３日間培養して〓麹をつく
つた。10倍量の水を加え、５℃１晩酵素を抽出
した。アンソン−萩原法に準じてプロテアーゼ
活性を測定した。ｕ／ｇ〓麹で表した。 Ｈ株、Ｍ株から２倍体の造成： 以上述べた方法により、Ｈ株同士、Ｈ株とＭ
株、Ｍ株同士の３つの組合せで２倍体を造成し
た。それらをHH株、HM株、MM株と呼ぶこと
にする。 これらの菌の生育度とアルカリプロテアーゼ活
性ｕ／ｇ〓麹は第１図の通りである。HH株と
MM株はそれらの親株と大差ない性質であり、
HM株は両親の中間を示した。 更に、HH株、HM株、MM株より数株ずつ選
びUV照射を行い、著量アルカリプロテアーゼ生
産菌の分離を試みた。尚一次スクリーニングとし
て、カゼイン培地に於るプロテアーゼ生産量と相
関するヘロ比〔カゼイン溶解円／コロニー直径、
H.SEKINE、S.NASUNO ＆ N.IGUCHI；
Agr.Biol.Chem.、33、1477（1969）〕が親株以上
の菌を選択した。 この結果、HM株、MM株からは著量アルカリ
プロテアーゼ生産菌を分離することができたが、
HH株からは分離することができなかつた。（第
２図）特にHM株に由来する著量アルカリプロテ
アーゼ生産菌は生育もＭ株とほとんど大差なく、
スケールアツプをした場合でも充分に能力を発揮
することができた。 上記変異の生残率は10-3以下が望ましく、通常
の変異の場合の10-2（以下）程度の生残率ではほ
とんど著量アルカリプロテアーゼ生産菌をとるこ
とができなかつた。また亜硝酸等の化学変異剤で
もUVと同様にとることができた。 Ｍ株（半数体）を親株として、同様に変異及び
スクリーニングを行つた場合も著量アルカリプロ
テアーゼ生産菌をとることができた。 しかし、その効率は２倍体（HM株、MM株
（第２図）〕と比較して、極めて悪いものであつ
た。（第３図） また、アルカリプロテアーゼ生産量が充分に高
い菌は全て成育がかなり劣つており、スケールア
ツプをした場合、Ｍ株と大差ないか、むしろ低目
の値しか示すことができなかつた（第１図参照）。
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 変異によつて得られた著量酵素生産性麹菌株
を少くとも一方の親株として２倍体を造成し、得
られた２倍体株を更に変異せしめ、より高度な著
量酵素生産性麹菌株を得ることを特徴とする麹菌
の育種方法。 ２ 麹菌において、酵素生産性が高められる酵素
が、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、
酸性プロテアーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、グルタミナー
ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びペクチントラン
スエリミナーゼから選択された一つ以上である特
許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5918181A JPS57174087A (en) | 1981-04-21 | 1981-04-21 | Breeding method of koji mold |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5918181A JPS57174087A (en) | 1981-04-21 | 1981-04-21 | Breeding method of koji mold |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57174087A JPS57174087A (en) | 1982-10-26 |
| JPH0337913B2 true JPH0337913B2 (ja) | 1991-06-07 |
Family
ID=13105972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5918181A Granted JPS57174087A (en) | 1981-04-21 | 1981-04-21 | Breeding method of koji mold |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57174087A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60188057A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Kikkoman Corp | 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法 |
| JPH0829084B2 (ja) * | 1986-12-15 | 1996-03-27 | わかもと製薬株式会社 | 魚類蛋白質分解用酵素の製造法 |
| JP4469014B1 (ja) * | 2009-04-17 | 2010-05-26 | キッコーマン株式会社 | 大規模ゲノム重複を保持する麹菌 |
-
1981
- 1981-04-21 JP JP5918181A patent/JPS57174087A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57174087A (en) | 1982-10-26 |
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