JPH0340830B2 - - Google Patents

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JPH0340830B2
JPH0340830B2 JP58077255A JP7725583A JPH0340830B2 JP H0340830 B2 JPH0340830 B2 JP H0340830B2 JP 58077255 A JP58077255 A JP 58077255A JP 7725583 A JP7725583 A JP 7725583A JP H0340830 B2 JPH0340830 B2 JP H0340830B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は２種の生物活性物質を場を分離して固
定した固定化物を用いて、例えば血液に含まれる
薬物あるいは各種疾患に由来する微量成分などを
測定する方法に関するものである。
患者に投与されている薬物、例えばジゴキシ
ン、テオフイリンなどの血中濃度を測定すること
は適正な治療を進めるうえで重要であり、また、
癌など各種の疾患に由来する成分を検診者の血液
から検出することは当該疾患の早期発見を行なう
点で極めて有効である。
そこで、血液のこれらの微量成分を検出する方
法が種々開発されているが、感度、特異性、大量
検体の短時間処理などの点にすぐれる酵素免疫測
定法が賞用されている。しかしながら、従来の酵
素免疫測定法の場合には、未だ感度が充分とはい
えず、また洗浄操作が繁雑であつたり、チユーブ
の移しかえが必要であつたりして正確な濃度を求
めることが容易でなかつた。
そこで本発明者らは、さらに感度を高めかつ繁
雑な操作の少ない分析方法を開発するべく検討を
進めた結果、抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害物
質とを場を分離して固定した固定化物を用いた抗
原及び抗体の簡便な測定法を案出し、その内容を
既に特許出願した（特願昭57−76678号）。本発明
においては、この方法にビオチン−アビジン系の
反応を組込み、その低い結合定数を利用して、よ
り一層の高感度化と簡便化を達成した。
すなわち本発明は、測定対象たる抗原決定基具
有物質１と反応する抗体又はこの抗体と反応する
抗原決定基具有物質２とビオチン酵素又はビオチ
ン酵素阻害物質とを担体に各々の固定相を分離し
た固定した固定化物と、前記抗体と反応する抗原
決定再具有物質２又は前記抗原決定基具有物質２
と反応する抗体と前記ビオチン酵素と反応するビ
オチン酵素阻害物質又は前記ビオチン酵素阻害物
質と反応するビオチン酵素とを結合した結合物
と、測定対象たる抗原決定基具有物質１とを水溶
液中で共存せしめ、その後該固定化物又は水溶液
のビオチン酵素活性又はビオチン酵素阻害物質の
活性を測定することを特徴とする抗原決定基具有
物質の測定方法に関するものである。
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明の方法における測定対象は抗原決定基具
有物質１（以下、リガンド１という。）である。
リガンド１は、例えば、各種内分泌腺に由来する
ホルモン類、免疫グロブリン、アルブミン、フエ
リチン等の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、
バクテリア、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗
原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存するもの
を挙げることができる。リガンド１に含まれる抗
原決定基の数はひとつであつてもよく、二以上で
あつてもよい。このリガンド１にはハプテン及び
２抗体法における第１抗体も含まれる。
また、測定対象たるリガンド１とは本発明法に
おける測定対象であることはいうまでもなく、例
えば２抗体法においては測定の目的物である抗原
と第１抗体との結合物が測定対象たるリガンド１
になる。
次に、本発明の方法に使用される固定化物は、
抗体又は抗原決定基具有物質２（以下、リガンド
２という。）とビオチン酵素又はビオチン酵素阻
害物質とが担体に各々の固定相が分離されて固定
されているものである。
抗体はリガンド１と反応するものでなければな
らず、リガンド２はこの抗体と反応するものでな
ければならない。すなわち、リガンド１とリガン
ド２とは少なくとも一の抗原決定基が共通してい
なければならず、抗体はこの共通の抗原決定基に
対するものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）2、Fab′、Fabのどのフラグメントも含まれ
る。リガンド２の抗原決定基は１以上がリガンド
１と共通であればよく、全てが共通であつてもよ
い。従つて、リガンド２はリガンド１と同一であ
つてもよい。
リガンド１及びリガンド２に共通の抗原決定基
と反応する抗体はリガンド１もしくはリガンド２
又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山
羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの温血動物に
体重１Kgあたり0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、
フツトパツド、大腿筋等にアジユバントとともに
注射して当該動物の体内に形成させる。この抗体
は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体す
なわち免疫グロブリンを採取する公知の方法によ
つて精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングルコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
ビチオン酵素は活性中心にビオチン基をもつて
いるものであつて、プロピオニルCoAカルボキ
シラーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、ピ
ルビン酸カルボキシラーゼ、メチルマロニル
CoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAト
ランスカルボキシラーゼ、メチルクロトニル
CoAカルボキシラーゼ等種々のものが知られて
いるが、そのいずれであつても用いることができ
る。
ビオチン酵素阻害物質の例としては、アビジ
ン、ストレプトアビジン及びこれらの誘導体であ
つてビオチンと結合しうるものを挙げることがで
きる。このような誘導体には、例えば無水酢酸で
アセチル化したものなど一般の化学修飾剤で処理
したものがある。誘導体はビオチンとの結合定数
の小さいもののほうが本発明の方法に好適であ
る。
本発明の固定化物はリガンド２又は抗体とビオ
チン酵素又はビオチン酵素阻害物質とが固定され
ているのであるから、リガンド２とビオチン酵
素、リガンド２とビオチン酵素阻害物質、抗体と
ビオチン酵素、及び抗体とビオチン酵素阻害物質
の４種の組合せがあることになる。
このような固定化物はリガンド２又は抗体の固
定相とビオチン酵素またはビオチン酵素阻害物質
の固定相とが分離されているところに特徴があ
る。この相分離とは、後述するリガンド２又は抗
体とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質との
結合物が一方の相において反応して結合した場合
にもう一方の相と更に反応しない程度に両相が互
いに分離されていることをいう。但し、両相の境
界域において両相と反応する結合物があつてもそ
の比率が固定化物の用途との関係において問題に
ならない程度であればよいことはいうまでもな
い。
具体的には、担体に用いた重合体の場を分けて
リガンド２等をビオチン酵素等を固定したものと
かリガンド２等を固定した重合体とビオチン酵素
等を固定した重合体を貼合せたものなどを例とし
て挙げることができる。また、担体がある程度大
きな粒子、例えば直径３mm以上の粒子であるよう
な場合には全体の面積に対して接触面積が問題に
ならなくなるので、リガンド２等とビオチン酵素
等をこのような大きさの別々の粒子に固定したも
のであつてもよい。他の例としては、一方を管に
固定し、もう一方を粒子に固定したような場合を
挙げることができる。
固定化物の製法としては、重合体の場を分けて
固定したものの場合には、例えば官能基を異にし
たブロツク共重合体とかグラフト共重合体を形成
して官能基の差異を利用してリガンド２等とビオ
チン酵素等を別々に固定すればよい。官能基は、
−NH2、−COOH、−CHO、−OH、−SHなど通常
のものでよい。これらの重合体を構成成分とする
ブロツク共重合体、グラフト共重合体は公知の方
法によつて製造すればよい。一方、固定されるも
のがリガンド２あるいはビオチン酵素阻害物質
で、固定してから共重合体を形成しても活性が失
なわれないような場合には、そうすることによつ
て官能基が異ならなくともよい場合がある。
重合体を貼合わせる場合には予め貼合わせてか
ら固定化してもよく、その逆でもよい。貼合せは
融着であつてもよく接着であつてもよい。
このような担体の外形は特に限定されるもので
はなく、例えば、球形、円盤形、長方形、円管形
などでよい。
リガンド２、抗体、ビオチン酵素、及びビオチ
ン酵素阻害物質の固定化方法は公知の方法に準じ
て行なえばよい。抗体、ビオチン酵素、及びリガ
ンド２、ビオチン酵素阻害物質のうち蛋白質のも
のについては、ジアゾ法、ペプチド結合法、アル
キル化法等の共有結合法、イオン結合法、物理的
吸着法などの酵素等の活性蛋白を担体に固定する
公知の方法に準じて行なえばよく、蛋白質以外の
ものもリガンド２等と担体等の官能基等を考慮し
て固定化方法を適宜選択すればよい。この固定化
されているリガンド２には、例えば担体に共有結
合されているリガンドに第１抗体を抗原抗体反応
させ、これにさらに第２抗体を反応させるような
場合のリガンドと第１抗体との反応物も含む。
このような固定化物における抗体又はリガンド
２とビオチン酵素又はビオチン酵素阻害物質との
比率は測定感度及びこれらの組合せにおいて適当
になるように決定される。
一方、結合物は、該固定化物に固定された抗体
と反応するリガンド２又はリガンド２と反応する
抗体と、該固定化物に固定されたビオチン酵素と
反応するビオチン酵素阻害物質又はビオチン酵素
阻害物質と反応するビオチン酵素とを結合したも
のである。
結合物の組合せはリガンド２とビオチン酵素、
リガンド２とビオチン酵素阻害物質、抗体とビオ
チン酵素、及び抗体とビオチン酵素阻害物質の４
通りあるわけであるが、この結合物は前記固定化
物の両固定相と反応するものでなければならない
から、この組合せは固定化物に応じて自動的に定
まる。また、この結合物は固定化物と反応させる
必要があるところから水溶性が必要であろう。結
合物の製法としては要は結合物が両方の活性を発
揮しうれば足り、例えば結合させる双方がいずれ
も蛋白質である場合には、酵素等の活性蛋白を固
定する架橋法あるいはペプチド結合法などを活用
できる。結合する一方または双方が蛋白質でない
場合にはそれぞれの官能基を考慮して結合方法を
適宜選択すればよい。
結合比はモル比で１：１に限られるものではな
く、測定条件等によつて異なるところから、それ
ぞれの系において適当になるよう決定される。
本発明の測定方法の原理を、リガンド２とビオ
チン酵素を固定した固定化物と、アビジンと抗体
の結合物を用いた場合を例として説明すると、ま
ず、測定されるリガンド１がないときには一般に
リガンド−抗体間の結合力がビオチン酵素−アビ
ジン間の結合力より強いところから、結合物は固
定化リガンド１に結合しビオチン酵素部分には結
合しない。従つて、固定化物のビオチン酵素はア
ビジンの作用を受けず、酵素活性は減少しない。
次に、測定されるリガンド１が存在するときは結
合物の抗体が測定対象リガンド１と固定化リガン
ド２との間で競争反応し、測定対象リガンド１と
結合した結合物はさらにアビジン部分が固定化物
のビオチン酵素と反応してそこに結合する。そし
てこの結合量だけ酵素活性が低下するから予め遊
離のリガンド量と酵素活性の低下量の関係を求め
ておけば、酵素活性の低下量を測定することによ
つて測定対象リガンド量を知ることができる。
測定方法としては、要は水溶液中において固定
化物と結合物と測定対象たるリガンド１の三者を
共存させればよく添加順序は問わない。この共存
は一方の反応中の全時間行なわれている場合に限
らず、一時的であつてもよい。例えば、リガンド
１及びそれとビオチン酵素との結合物を抗体固定
化チユーブで反応させたのちにビオチン酵素阻害
物質固定化ビーズを投入して余剰の結合物をスカ
ベンジするような場合も本発明に含まれる。水溶
液はリガンド−抗体反応及びビオチン酵素−ビオ
チン酵素阻害物質反応が反応しやすいPHにするの
がよくそのためにリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、
トリス緩衝液などの緩衝液を用いるのがよい。PH
はリガンド及び抗体とビオチン酵素およびビオチ
ン酵素阻害物質によつて異なるが通例PH５〜８程
度がよい。温度もリガンド及び抗体とビオチン酵
素及びビオチン酵素阻害物質によつて異なるが通
例は15〜45℃程度である。
反応後は固定化物または水溶液のビオチン酵素
活性を測定する。酵素活性の測定方法は公知の方
法に従つて行なえばよく、例えばプロピオニル
CoAカルボキシラーゼの場合には反応系で生じ
るADPをピルビン酸キナーゼと乳酸デビドロゲ
ナーゼにより共役させ、その際のNADHの減少
として活性を測定できる。
メチルマロニルCoAトランスカルボキシラー
ゼの場合には生成したオキザロ酢酸をリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼの共役によつてリンゴ酢に変え、
その際のNADHの減少量を測定することによつ
て活性値を求めることができる。
また、プロピオニルCoAカルボキシラーゼを
用いた場合には、逆反応によつてATPを生成さ
せて、これをルシフエラーゼ及びルシフエリンの
共存下で反応させると生物発光する。そこで、こ
れをフオトンカウンターで測定することによつて
10-15M以下のATPを定量できる。この方法を用
いればさらに極微量のリガンド１を定量すること
が可能である。
本発明の方法はリガンド１を極めて高感度で測
定できる。例えばビオチンそのものとアビジンそ
のものを用いた場合には10-11グラムのリガンド
１を定量することが可能である。本発明の方法
は、そのほかバウンド（bound）とフリー（flee）
の分離が不要であるなど操作が簡便であり、安価
かつ容易にリガンド１を定量することが可能であ
る。
実施例 １ (1) アビジン−抗体結合物の調製 アビジン５mlを0.1Mリン酸緩衝液PH6.31ml
に溶解し、４−（マレイミドメチル）−１−シク
ロヘキサンカルボン酸 Ｎ−ヒドロキシサクシ
イミドエステル（CHMS）のジオキサン溶液
100μを加え、室温で１時間反応させた。反
応液をセフアデツクスＧ−25（0.1Mリン酸緩衝
液−１ｍＭ EDTAPH6.5）カラムでゲル過
し、蛋白質分画をプールし、CHMS化−アビ
ジンとした。
山羊抗ヒトAFP（アルフアフエトプロテイ
ン）抗体をAFPアフイニテイーカラムにより
精製した特異抗体IgG10mgを0.1Mリン酸緩衝液
−１ｍＭ EDTAPH6.0 1.0mlに溶解し、0.1ml
の0.1M2−メルカプトエチルアミン溶液を加
え、37℃で90分間反応させた。これをセフアデ
ツクスＧ−25によるゲル過を行い、素通り分
画を集めて、これに上記CHMS化−アビジン
を加え、PH6.8に調節し、４℃で24時間反応さ
せた。反応液をPEG−20000による濃縮後、
Sephacryl Ｓ−300によるゲル過によりアビ
ジン−抗AFP IgG結合物約７mgを得た。
(2) 相分離担体の製造 ナイロン製球形ビーズ（直径４mm）を3N
HClで24時間処理してアミノ基を遊離させ、水
洗後0.1Mリン酸緩衝液−５ｍＭ EDTAPH7.5
中でＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物の
ジメチルスルホキシド溶液（10mg／ml）を１／
10容量加え、37℃で３時間反応させた。これに
1Mヒドロキシルアミン溶液PH7.5を容量比１／
10加え、37℃で１時間反応させてから上記緩衝
液で洗浄した。一方、(1)のアビジンと同様の条
件でCHMS化したプロピオニルCoAカルボキ
シラーゼ５mgを0.1Mリン酸緩衝液−１ｍＭ
EDTAPH6.0に溶解し、これを上記ナイロンビ
ーズに加え、次いでPHを7.0として４℃で１晩
反応させた。これを上記緩衝液PH7.5で洗浄後、
１％BSA添加した上記緩衝液中で保存した。
ポリスチレン製球形ビーズ（直径3.2mm）を
水洗後、AFPをO.D280＝01のリン酸緩衝液中
で４℃１晩ひたし、物理吸着させた。リン酸緩
衝液で十分に洗浄後、１％BSAを添加した上
記緩衝液中で保存し、AFP固定化ビーズとし
た。
(3) AFPの測定 試験管にプロピオニルCoAカルボキシラー
ゼ固定化ビーズとAFP固定化ビーズ各１個ず
つ取り、50ｍＭトリス緩衝液−0.14M NaCl−
0.2％BSAPH7.8を800μ加えた。これに、AFP
溶液を800nｇ／mlより4n希釈物各100μずつ
加え、次いで(1)の抗AFP IgG−アビジン結合
物を100μ加えて、室温で１時間放置した。
この各試験管に酵素基質液（0.1M KCl−50
ｍＭ KHCO3−４ｍＭ MgCl2−２ｍＭ還元
型グルタチオン−２ｍＭ ATP−１ｍＭホス
ホエノールピルビン酸−2500U／ピルビシ酸
キナーゼ−3500U／乳酸デヒドロゲナーゼ−
0.15ｍＭ NADH−２ｍＭプロピオニルCoA）
を１mlづつ加え、37℃波長340nｍにおける吸
光度を測定してAFP量とプロピオニルCoAカ
ルボキシラーゼの活性との関係を求めた。
得られた結果を第１図に示す。
血清はあらかじめアビジン固定化ガラスビー
ズと30分間反応させてその上清を用いた。
各種ヒト血清をいずれも10倍希釈しその
100μづつを用いて上記と同様に測定を行な
い、第１図を検量線としてAFPの濃度を測定
した。一方これと並行して従来法であるラジオ
イムノアツセイ（RIA）を用いて同じヒト血清
のAFP濃度を測定した。得られた結果を下表
に示す。
AFP濃度 血清 本発明法 RIA法 Ａ 15.8mg／ml 17.5mg／ml Ｂ 450 432 Ｃ 142 158 Ｄ 6.3 6.9 Ｅ 748 780 Ｆ 210 200 実施例 ２ (1) ピルビン酸カルボキシラーゼ−抗体結合物の
作製 ピルビン酸カルボキシラーゼ５mgを0.1Mリ
ン酸緩衝液PH6.3 １mlにとかし、これにCHMS
のジオキサン溶液100μ（２mg／ml）を加え
室温で90分間反応させた。反応溶液を0.1Mリ
ン酸１ｍＭ EDTA（PH6.5）で平衡化したセフ
アデツクスＧ−25カラムでゲル過し、素通り
分画を集めた。この分画をPEG20000を用いて
１mlまで濃縮し、CHM化ピルビン酸カルボキ
シラーゼを得た。抗ジゴキシンウサギIgG5mg
を0.1Mリン酸５ｍＭ EDTA（PH7.5）緩衝液
にとかし、これに100μの無水アセチルメル
カプトコハク酸溶液（９mg／mlジメチルスルホ
キシド）を加え、37℃で１時間反応させた。さ
らに、1Mヒドロキシアミン液110μを加えて
37℃で30分間反応させ、上記と同様のセフアデ
ツクスＧ−25でゲル過し素通り分画を集め
た。これに、さきに調製したCHM化ピルビン
酸カルボキシラーゼを加え、４℃で一夜放置
後、この反応液をセフアクリルＳ−300でゲル
過した。これにより抗ジゴキシンIgG−ピル
ビン酸カルボキシラーゼの１：１結合分画をプ
ールした。
(2) 相分離固相の作製 ポリスチレンチユーブ（８mm×50cm）にアビ
ジン溶液（100μｇ／ml、20ｍＨ PBSPH7.8）
２mlを加え、４℃で16時間放置した。このチユ
ーブを生理食塩水で４回洗浄した後５％BSA
水溶液を加え、室温にて３時間放置し、アビジ
ン感作チユーブを作製した。
次に、ジゴキシンをNaIO4で酸化してBSA
に結合させた。BSAジゴキシン結合物20mgを
100mlの0.02Mリン酸緩衝液PH8.0に溶かし、こ
れに直径４mmのポリスチレンボール60個を加え
て４℃で16時間放置し、ジゴキシン感作ポリス
チレンビーズを作製した。
(3) ジゴキシンの定量 (2)で作製したアビジン感作チユーブにジゴキ
シン−BSA感作ビーズ１個を加え、20ｍＭト
リス緩衝液−0.14M NaCl−0.2％BSA（PH8.0）
を400μ加えた。これにジゴキシン希釈液
（０〜5nｇ／ml）を100μづつ加え、さらに(1)
で作製したピルビン酸カルボキシラーゼ−抗ジ
ゴキシンIgG結合物100μを加え、30℃で１時
間放置した。
次に、この試験管に酵素基質液（0.1M
KCl、50ｍＭ KHCO3、４ｍＭ MgCl2、２
ｍＭ ATP、２ｍＭ還元型グルタチオン４ｍ
Ｍピルビン酸、0.23ｍＭ NADH、マレート
デハイドトゲナーゼ（3000U／）、PH7.5）を
１ml加え、37℃で波長340nｍにおける吸光度
の減少をレートアツセイし、吸光度変化量（１
分間当り）とジゴキシン量との関係を第２図に
プロツトした。
血清はあらかじめ、アビジン固定化ガラスビ
ーズで30分間反応させ、この上清を用いた。
この血清を1/10希釈したもの100μを用い
て上記と同様に測定した。下表はその結果であ
る。
ジゴキシン量（ｎｇ／ml） 本 法 RIA法 Ａ 1.5 1.3 Ｂ 2.2 2.6 Ｃ 4.1 4.0 Ｄ 0.8 1.1 Ｅ 1.1 1.3 実施例 ３ (1) CHM化抗フエリチンヤギIgGの作製 抗フエリチンヤギIgG5mgを0.1Mリン酸緩衝
液（１ｍＭ EDTA含有PH6.3 １mlに溶かし、
これにCHMSのジオキサン溶液100μ（２
mg／ml）を加えた。室温で90分間反応させたの
ち、0.1Mリン酸緩衝液PH6.5で平衡化したセフ
アデツクスＧ−25でゲル過し、素通り分画を
分取した。
(2) フエリチン−アビジン結合物の作製 フエルチン５mgとアビジソ１mgを0.1M緩衝
液PH6.8 １mlに溶かし、これに１％グルタルア
ルデヒド水溶液100μを加えて30℃で３時間
反応させた。これをセフアクリルＳ−300でゲ
ル過し、フエリチンとアビジンの１：１結合
物の分画を分取して凍結乾燥した。こうして目
的のフエリチン−アビジン結合物３mgを得た。
(3) 相分離固相の作製 担体固相はポリスチレンを基板として公知の
ポリマーブレンド法に従つて作製した。ポリＬ
−システイン及びポリＬ−リジン各10mgをジメ
チルスルホキシド−エーテル混合溶媒に溶解
し、ポリスチレンポリマー基板上に塗布して減
圧下溶媒を除去した。これらの各ポリマーは凝
集エネルギーが異なるためアミノ基層と−SH
基層とのミクロ相分離が形成された。SH基含
有量はジチオピリドン法により、また表面アミ
ノ基はニンヒドリン法により検定したところ、
SH基とアミノ基の比はほぼ１：１であつた。
このポリスチレン基板を0.8cm角に栽断し担体
固相として用いた。この相分離担体をアセチル
CoAカルボキシラーゼ水溶液に浸し、次に１
−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩100mg／10mlになるように
加え、0.1N NaOHによりPHを5.5に維持した。
４℃で16時間放置後、20ｍＭリン酸緩衝化生理
食塩水PH7.0で十分洗浄した。
この担体をさらに0.1Mリン酸−１ｍＭ
EDTAの緩衝液（PH6.5）に浸し、これに(1)で
作製したCHM化抗フエリチンヤギIgGを加え
（２mg／ml）30℃で２時間反応させ、これを20
ｍＭ PBSPH7.0で十分洗浄した。
(4) フエリチンの定量 ガラスチユーブに(3)で作製した相分離担体１
枚を入れ、これに20ｍＭトリス−0.14M NaCl
−0.2％BSA（PH8.0）を400μ加えた。次に、
フエリチン希釈液を50μづつ加え、さらに(2)
で作製したフエリチン−アビジン結合物50μ
を加えた。30℃で１時間加温後、基質液
（0.1M KCl、アセチルCoA：10×10-4M、
0.3M KHCO33ｍＭ ATP、0.23ｍＭ
NADH、２ｍＭ還元型グルタチオン、1.5ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸、2500U／ピルビ
ン酸キナーゼ、3500U／乳酸デヒドロゲナー
ゼ（PH7.8））を１ml加え37℃、波長340nｍにお
ける吸光度の減少をレートアツセイした。第３
図はフエリチンの量と吸光度の変化量をプロツ
トしたものである。
人血清にはあらかじめ、アビジン結合ガラス
ビーズで30分間反応させた上清を用いた。
試 料 本法ｎｇ／ml EIA法ｎｇ／ml Ａ 19 21 Ｂ 169 176 Ｃ 145 146 Ｄ 38 33 Ｅ 395 400 実施例 ４ (1) フエリチン−プロピオニルCoAカルボキシ
ラーゼ結合物 フエリチン５mgとプロピオニルCoAカルボ
キシラーゼ10mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH6.8）
１mlに溶かし、これに１％グルタルアルデヒド
水溶液を100μ加えて30℃で４時間反応させ
た。この反応液を20ｍＭリン酸緩衝（PH7.0）
化セフアロース4Bでゲル過し、１：１結合
分画を分取して目的の結合物を５mg得た。
(2) 実施例３で作製した固相担体を用い、実施例
３と同様の操作で抗フエリチンヤギIgG及びア
ビジン結合相分離担体を得た。
(3) フエリチンの定量 (1)の担体一枚をチユーブにとり、これに50ｍ
Ｍトリス緩衝液−0.14M NaCl−0.2％BSA（PH
7.8）を800μ加えた。これにフエリチン溶液
を1000nｇより4n希釈物各100μづつ加えた。
次いで、(1)のフエリチンプロピオニルCoAカ
ルボキシラーゼ結合物100μを加え、室温で
１時間放置した。
この試験管に酵素基質液（実施例１と同じ）
１mlづつ加え、37℃で34nｍにおける吸光度の
減少をレートアツセイし、プロピオニルCoA
カルボキシラーゼの活性を求めた。第４図はフ
エリチンの量と吸光度の変化量をプロツトした
ものである。
血清はあらかじめアビジン固定化ガラスビー
ズで30分処理した上清を10倍希釈しその100μ
を用いて上記と同様に測定した。得られた結
果を下記に示す。
血清 本発明ｎｇ／ml EIA法ｎｇ／ml Ａ 20.0 20 Ｂ 180 176 Ｃ 150 146 Ｄ 35 33 Ｅ 391 400
【図面の簡単な説明】
第１〜４図はいずれも、各種の抗原決定基具有
物質の濃厚と酵素活性との関係を示すものであ
る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の(A)、(B)、(C)、(D)のいずれかの方法より
    なる抗原決定基具有物質の測定方法 (A) 測定対象たる抗原決定基具有物質１と反応す
    る抗体とビオチン酵素とを担体に各々の固定相
    を分離して固定した固定化物と、前記抗体と反
    応する抗原決定基具物質２と前記ビオチン酵素
    と反応するビオチン酵素阻害物質とを結合した
    結合物と、測定対象たる抗原決定基具有物質１
    とを水溶液中で共存せしめ、その後該固定化物
    又は水溶液のビオチン酵素活性又はビオチン酵
    素阻害物質の活性を測定することを特徴とする
    抗原決定基具有物質の測定方法 (B) 測定対象たる抗原決定基具有物質１と反応す
    る抗体とビオチン酵素阻害物質とを担体に各々
    の固定相を分離して固定した固定化物と、前記
    抗体と反応する抗原決定基具物質２と前記ビオ
    チン酵素阻害物質と反応するビオチン酵素とを
    結合した結合物と、測定対象たる抗原決定基具
    有物質１とを水溶液中で共存せしめ、その後該
    固定化物又は水溶液のビオチン酵素活性又はビ
    オチン酵素阻害物質の活性を測定することを特
    徴とする抗原決定基具有物質の測定方法 (C) 測定対象たる抗原決定基具有物質１と反応す
    る抗体と反応する抗原決定基具有物質２とビオ
    チン酵素とを担体に各々の固定相を分離して固
    定した固定化物と、前記抗原決定基具有物質２
    と反応する抗体と前記ビオチン酵素と反応する
    ビオチン酵素阻害物質とを結合した結合物と、
    測定対象たる抗原決定基具有物質１とを水溶液
    中で共存せしめ、その後該固定化物又は水溶液
    のビオチン酵素活性又はビオチン酵素阻害物質
    の活性を測定することを特徴とする抗原決定基
    具有物質の測定方法 (D) 測定対象たる抗原決定基具有物質１と反応す
    る抗体と反応する抗原決定基具有物質２とビオ
    チン酵素阻害物質とを担体に各々の固定相を分
    離して固定した固定化物と、前記抗原決定基具
    有物質２と反応する抗体と前記ビオチン酵素阻
    害物質と反応するビオチン酵素とを結合した結
    合物と、測定対象たる抗原決定基具有物質１と
    を水溶液中で共存せしめ、その後該固定化物又
    は水溶液のビオチン酵素活性又はビオチン酵素
    阻害物質の活性を測定することを特徴とする抗
    原決定基具有物質の測定方法。
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