JPH034560B2

JPH034560B2 -

Info

Publication number: JPH034560B2
Application number: JP55078436A
Authority: JP
Inventors: Biru Kurisuteian
Original assignee: ORUPEGEN MEDEITSUINISHUUMOREKURAARUBIOROGITSUSHE FUORUSHUNGUSU GmbH
Current assignee: ORUPEGEN MEDEITSUINISHUUMOREKURAARUBIOROGITSUSHE FUORUSHUNGUSU GmbH
Priority date: 1979-06-12
Filing date: 1980-06-12
Publication date: 1991-01-23
Also published as: JPS568355A; DE2923787C2; EP0021169B1; US4351764A; EP0021169A1; DE2923787A1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は場合によりすでに存在するジスルフイ
ド橋１個以上の存在下に更に２個以上のジスルフ
イド橋を合成及び／又は天然ポリペプチド中に選
択的に形成するための方法及び特にインシユリン
誘導体並びにこの方法で得られたインシユリン誘
導体を作用物質として含有する医薬品を製造する
ための方法に関する。最近、大腸菌突然変異体による生物学的なイン
シユリン合成が非常に注目をあびている（D.V.
Goeddel、D.G.Kleid、F.Bolivar、H.L.
Heynecher、D.G.Yansura、R.Crea、T.Hirose、
A.Krazewski、K.Itakura及びA.D.Riggs、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA76参照）。インシユリンを生
成する微生物で人が感染する危険があるために、
この際インシユリンＡ鎖及びＢ鎖を異なつた培地
で分離して合成し、遊離のポリペプチド鎖として
得る。引き続き以前インシユリンの全合成の場合
にそうであつたように、これらを統計的ジスルフ
イド酸化により架橋し、インシユリン分子とする
（R.E.Humbel、H.R.Bosshard、H.Zahnによる、
D.F.Steiner及びN.Freinkel著“Handbook of
Physiology”第１巻、Ｗ−illiams＆Wilkins、バ
ルチモア（1972年）、第111頁以降参照）。しかし
ながら、両方の鎖のこの統計的結合において、イ
ンシユリンは多くの可能な生成物（Ａ鎖のビスジ
スルフイドモノマー３種、Ｂ−鎖のジスルフイド
１種、異性体インシユリン12種、及び個々の鎖及
び両方の鎖から成る多くのオリゴマー及びポリマ
ー）の１種としてのみ得られるので、現在までＡ
鎖とＢ鎖とを統計的ジスルフイド合成により結合
させ10〜20％より高い収率でインシユリンとする
ことはできなかつた。比１：１で天然のＡ鎖及び
Ｂ鎖を用いての再結合実験によつてもわずか約10
％のインシユリン収率が得られるだけである。カンベル（B.Kamber）等はすでに人インシユ
リンの全合成を報告しているが、ここではじめて
三つのジスフイド橋はフラグメント状構成の異な
る工程を目ざし製造された（Helvetica Chimica
Acta、第57巻、Fasc.8（1974年）、第2617〜2621
頁及び同第60巻、Fasc.1（1977年）、第27〜37頁及
びそこに記載してある文献参照）。この場合にも
インシユリンのペプチド鎖Ａ及びＢの鎖間ジスル
フイド橋はこの完全な両方の鎖の結合によりはじ
めて形成されるのではなくて、合成の前工程で形
成されるのである。インシユリン合成の問題点はこのホルモンイン
シユリンを構成するペプチド鎖Ａ及びＢの大きさ
及び複雑性の他に、インシユリンの収率を改良す
るために特に分子に鎖内及び鎖間結合する三つの
ジスルフイド橋を統計的でなく、目的をしぼつて
結合させるべきであるということによつても特徴
づけられる。この際できるかぎり特に生物学的に
生じたインシユリンのＡ鎖及びＢ鎖から出発する
ことができるのが良い。人インシユリンは次の第１式に相応する。前記第１式中の上のアミノ酸連鎖（１〜21）は
Ａ鎖であり、下のアミノ酸連鎖（１〜30）は人イ
ンシユリンのＢ鎖を表わす。本発明の課題は場合により１個以上の存在する
ジスルフイド橋の存在下に天然及び／又は合成ポ
リペプチドに選択的に２個以上のジスルフイド橋
を形成することを可能とする方法を見い出すこと
であり、この際この方法は特にインシユリンの合
成Ａ鎖とインシユリンの合成又は天然Ｂ鎖との組
み合わせにより合成もしくは半合成人インシユリ
ンを製造するために適しているのがよい。一定のアミノ酸−保護基を使用し、これを一定
の方法でジスルフイド橋の同時形成下に再び脱離
するとジスルフイド橋を選択的に形成することが
できることがわかつた。最初にジスルフイド橋に
変換すべき１方又は両方のSH−基をｐ−メトキ
シベンジル保護基で保護し、２番目又はその後に
ジスルフイド橋に変換すべき１方又は両方もしく
はその他のSH−基をアセトアミドメチル保護基
で保護し、次いでｐ−メトキシベンジル保護基を
アニソールの存在下にピリジニウム−ポリヒドロ
ゲンフルオリド（HF／ピリジン）を用いて脱離
させ、引き続き酸性溶液中の沃素で処理すると
き、これにより先ず最初のジスルフイド橋が結合
し、その後アセトアミドメチル保護基が脱離し、
こうして遊離したSH−基が酸化され２番目もし
くはその他のジスルフイド橋を形成するというこ
とが意相外にも判明した。従つて、本発明の課題は場合によりすでに存在
するジスルフイド橋１個以上の存在下に、更に２
個以上のジスルフイド橋を合成及び／又は天然ポ
リペプチド中に選択的に形成することであり、こ
れは最初のジスルフイド橋に変換すべき両方の
SH基の少なくとも１個をｐ−メトキシベンジル
保護基で保護し、かつ第２の、又はそれ以降のジ
スルフイド橋に変換すべき両方又はより多くの
SH基少なくとも１個をアセトアミドメチル保護
基で保護し、次いでｐ−メトキシベンジル保護基
をアニソールの存在下にピリジニウム−ポリヒド
ロゲンフルオリド（HF／ピリジン）を用いて脱
離させ、引き続き酸性溶液中の沃素で処理するこ
とより成る。本発明の有利な実施形式によればこの方法を活
性人インシユリンの製造に使用する。このために
はA⁷−位にアセトアミドメチル保護基そしてA²⁰
−位にｐ−メトキシベンジル保護基を有する合成
インシユリンＡ鎖と当モル量の合成又は天然の還
元性インシユリンＢ鎖とを反応させる。B⁷−位
にアセトアミドメチル保護基及びB¹⁹位にｐ−メ
トキシベンジル保護基を有するインシユリンＢ−
鎖をこの際使用するのが有利である。これはこの
方法でインシユリンの異性体の形成を完全に押さ
えることができるからである。この方法により、すでにＡ鎖中に存在する小さ
な鎖内ジスルフイド環〔A⁶−A¹¹〕のようなすで
に存在するジスルフイド結合を危険にさらすこと
なしに、４個の結合すべきSH基を２個のジスル
フイド結合の形成下に選択的にそれぞれの正しい
反応相手と結合させることが達成された。半合成人インシユリンの製造のための有利な本
発明による方法においては、４個のSH基を有し、
そのうちの結合させて小さな鎖内ジスルフイド環
とすべき２個のSH基はtert−ブチルメルカプト
保護基で保護されており、一方残りの２個のSH
−基すなわちA²⁰位もしくはA⁷位においてはｐ−
メトキシベンジル基もしくはアセトアミドメチル
基を有する完全合成Ａ鎖から出発する。この際、
先ず選択的にtert−ブチルメルカプト基をトリブ
チルホスフアンを用いて窒素雰囲気下に脱離さ
せ、空気での選択的酸化により小さな環の形成下
に鎖内結合させる。この処理方法においてはアセ
トアミドメチル保護基及びｐ−メトキシベンジル
保護基は影響をうけない。本発明方法によれば引
き続きピリジニウム−ポリヒドロゲンフルオリド
（HF／ピリジン）を用いて処理することにより
ｐ−メトキシベンジル保護基が脱離し、この際ア
セトアミドメチル保護基は保持される。引き続き
両方のSH基が保護されていない天然のインシユ
リンＢ鎖の存在下に30％酢酸中の沃素を用いて処
理する。この際、順次に先ず２番目のジスルフイ
ド橋が結合し（A²⁰−B¹⁹）、次いでアセトアミド
メチル保護基が脱離し、この際遊離したSH基が
Ｂ−鎖のもう一個の遊離して残つているSH−基
と共に酸化され第３番目のジスルフイド橋（A⁷
−B⁷）を形成する。この際、意相外にも遊離Ｂ
線の使用量の約30％がＢ鎖の正しいSH基で選択
的に反応することが判明した。しかしながら、ジスルフイド架橋反応をより正
確に制御するためにはB⁷位にアセトアミドメチ
ル保護基そしてB¹⁹位にｐ−メトキシベンジル保
護基を有する天然又は合成インシユリンＢ鎖から
出発することももちろん可能であり、こうしてイ
ンシユリンのＡもしくはＢ鎖の相応するSH基を
相応して保護し、次いで本発明による方法を実施
する場合、記載した反応順にその都度両方の鎖の
それぞれに唯一のSH基が反応に関与するために
存在する。本発明による方法のこの原理によれば唯一の鎖
の中に２個の異なる環をジスルフイド橋を介して
形成することもできるし、もしくは１個以上の鎖
に２個又はそれ以上のジスルフイド橋を形成する
ことももちろん可能である。この場合にも一緒に
反応させるべきSH基を本発明により同様な保護
基を用いて保護する。本発明による方法は特に人インシユリンの合成
に重要である。それぞれ由来により異なるインシ
ユリンにおいて一般にＣ−末端以外のＢ鎖は人イ
ンシユリンのＢ鎖と同じであり、一方Ａ鎖は明ら
かに異なる。Ｂ鎖のＣ末端は容易に交換すること
ができるので、Ａ鎖を合成し、天然からのＢ鎖を
Ｃ末端の変換後使用することは、次いでこれら出
発物質から本発明による方法により人インシユリ
ンを形成するために十分である。しかしながら本発明による方法は例えば次の概
略式及びに示したようなインシユリン類似体
の製造にも好適である。

【式】

【式】前記式〜は本発明方法により得られるイン
シユリン誘導体を概略図で示したものである。こ
うして一般式は天然インシユリンを表わし、一
方一般式及びはジスルフイド環がA⁷−A¹¹位
もしくはA⁶−A⁷位に存在する天然でない鎖内ジ
スルフイド環を有するインシユリン誘導体を表わ
す。式〜は式〜の化合物の逆平行変形体
を表わし、これらではインシユリンＢ鎖が相応す
るインシユリンＡ鎖に逆平行に結合している。鎖内ジスルフイド橋の天然な又は天然でない配
置を有するインシユリンのこれら後者の逆平行変
形体は特に重要である。それというのも一定のPH
条件下に徐々に天然の形の架橋が再構成されるの
で、これは糖尿病治療で所望される生理学的条件
下に非常にゆつくりと活性インシユリンに変換す
る長寿命で不活性で人工的に造つたインシユリン
のデポ形である。第式のインシユリン類以体（〔A⁷−A¹¹、A⁶
−B⁷−シスチン〕−インシユリン）を製造するた
めに出発物質としてA⁶位にアセトアミドメチル
保護基そしてA²⁰位にｐ−メトキシベンジル保護
基を有する合成〔A⁷−A¹¹〕インシユリンＡ鎖を
使用する。前記式（〔A⁶−A⁷、A¹¹−B⁷−シスチン〕−
インシユリン）のインシユリン類以体の製造のた
めに出発物質としてA¹¹位にアセトアミドメチル
保護基そしてA²⁰位にｐ−メトキシベンジル保護
基を有する〔A⁶−A⁷〕−インシユリンＡ鎖を使用
する。前記式（〔A⁶−A¹¹、A⁷−B¹⁹、A²⁰−B⁷−シ
スチン〕−インシユリン）の逆平行インシユリン
類似体の製造のために出発物質としてA⁷位もし
くはA²⁰位にアセトアミドメチル保護基そして
A²⁰位もしくはA⁷位にｐ−メトキシベンジル保護
基を有する天然又は合成の〔A⁶−A¹¹〕−インシ
ユリンＡ鎖を使用し、これを還元型であるか又は
有利にB¹⁹もしくはB⁷位にアセトアミドメチル保
護基及びB⁷もしくはB¹⁹位にｐ−メトキシベンジ
ル保護基を有する天然又は合成インシユリンＢ鎖
と反応させる。前記式（〔A⁷−A¹¹、A⁶−B¹⁹、A²⁰−B⁷−シ
スチン〕−インシユリン）の逆平行インシユリン
類似体を製造するために、A⁶位もしくはA²⁰位に
アセトアミドメチル保護基としてA²⁰位もしくは
A⁶位にｐ−メトキシベンジル保護基を有する合
成〔A⁷−A¹¹〕−インシユリンと、還元型である
か又は有利にB¹⁹位もしくはB⁷位にアセトアミド
メチル保護基及びB⁷位もしくはB¹⁹位にｐ−メト
キシベンジル保護基を有する天然又は合成のイン
シユリンＢ鎖とを反応させる。前記式（〔A⁶−A⁷、A¹¹−B¹⁹，A²⁰−B⁷−シ
スチン〕−インシユリン）の逆平行インシユリン
類似体を製造するために、A¹¹位もしくはA²⁰位
にアセトアミドメチル保護基そしてA²⁰位もしく
はA¹¹位にｐ−メトキシベンジル保護基を有する
合成〔A⁶−A⁷〕インシユリンＡ鎖と還元型であ
るか、又はより有利にはB¹⁹位もしくはB⁷位にア
セトアミドメチル保護基及びB⁷位もしくはB¹⁹位
にｐ−メトキシベンジル保護基を有する天然又は
合成インシユリンＢ鎖とを反応させる。更に、本発明の課題はポリマー担体上のA⁶−
A¹¹位、A⁷−A¹¹位又はA⁶−A⁷位に鎖内ジスルフ
イド環を有する天然又は合成のインシユリンＡ鎖
と還元型であるか又は前記位置にアセトアミドメ
チル保護基もしくはｐ−メトキシベンジル保護基
を有する天然又は合成インシユリンＢ鎖とを平行
又は逆平行でジスルフイド架橋させるということ
からなる。この際、特に長寿命の非生理学的イン
シユリン−デポ型が得られ、これは治療に使用す
るために非常に重要である。本発明方法を実施する場合、有利に30％酢酸水
溶液中の沃素で酸化することによりジスルフイド
橋を形成する。ｐ−メトキシベンジル保護基の脱離は溶剤とし
て試薬ピリジニウム−ポリヒドロゲンフルオリド
（HF／ピリジン）を使用する方法が有利である。ペプチド化学において保護基の脱離のための試
薬としてピリジニウム−ポリヒドロゲンフルオリ
ド（HF／ピリジン）の使用はすでに公知である
（J.C.S.Chem.Comm.（1976年）第451及び452頁参
照）。カオチン結合剤としてアニソールの存在下
にｐ−メトキシベンジル保護基の脱離が特に良好
に行なわれかつこれがなお存在するアセトアミド
メチル保護基に影響を与えず、場合によりすでに
存在するジスルフイド橋にも影響を与えないとい
うことは意想外なことであつた。次に牛インシユリンの合成に関し、より詳細に
説明する。この際、先ずポリマー担体上の選択的
に脱離可能な硫黄保護基を有するインシユリンＡ
鎖の自体公知のフラグメント合成並びにこの合成
Ａ鎖と天然Ｂ鎖とを本発明により段階的かつ酸化
的にジスルフイド架橋形成下に反応させ完全活性
結晶インシユリンとすることに関し詳脱する。こ
の際適用した方法はMCD−ペプチドの合成のた
めに使用した原理を更に発展させたものである．
（C.Birr及びM.Wengert−Mu¨ ller、Angewante
Chemie、第91巻（1979年）、第156頁及び西ドイ
ツ特許公開第2830442号公報）。この際、システインの硫黄保護基はA⁶及びA¹¹
位にtert−ブチルメルカプタン（StBuもしくは
SBu）とのジスルフイド、A⁷位にアセトアミド
メチル保護基（AcmもしくはACM）及びA²⁰位
にｐ−メトキシベンジル保護基（Mbzlもしくは
MBZL）を使用する。次に添付の図に関して本発明を詳細に説明す
る。第１図インシユリンＡ鎖の全合成の概略式第２図インシユリンＡ鎖のフラグメントの合成
概略式第３図インシユリンＡ鎖のフラグメントの合成
概略式第４図小さい鎖内ジスルフイド環の形成下にフラ
グメント及びを結合し、インシユリン
Ａ鎖とし、牛インシユリンＢ−鎖との本発
明による結合第５図本発明により半合成された完全活性牛イン
シユリンの亜鉛錯体の顕微鏡写真第１〜４図中に記載した省略は次の意味を有す
る： DDZもしくはDdz＝α，α−ジメチル−３，５
−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル
基、 OME＝メトキシ基 OBUもしくはOBut＝tert−ブトキシ基、 OBZLもしくはOBzL＝ベンジルオキシ基、 SBUもしくはSBut＝ブチルメルカプト基、 ACMもしくはAcm＝アセトアミドメチル基、 BUもしくはBut＝ブチル基、 MBZLもしくはMbzl＝ｐ−メトキシベンジル
基個々のフラグメント，，及びの製造に
関してはすでにC.Birr（C.ビル）（1978年、ダイツ
イヒ）により報告された。最近公開された方法（C.Birr等著、Int.J.
Peptide Protein Res.第13巻（1979年）、第287〜
295頁）によればフラグメント（１−３）は溶
液状のDdz−アミノ酸から収率84％で形成され
る。フラグメント（４−14）及び（15−21）
（第２及び第３図中に表わされた式を参照）をジ
ビニルベンゾール0.5％で網状化したポリスチロ
ールゲル上に形成する。最初の膜状付加に関して
は収率90％（フラグメント）もしくは93％（フ
ラグメント）が達せられる。フラグメント製造
の全合成法及びポリマー担体へのその縮合を連続
的に記録計を用いて酸不安定で１時間的なＮ−末
端Ddz−保護基の分光学的特性により測光的に観
察する（C.Birrによる、Y.Wolman：
Peptides1974年、Halsted Press、ニユーヨーク
（1975年）第117頁以降）。 Asn及びGlnのかわりに５位、15位及び18位に
Asp（OBzl）もしくはGlu（OBzl）を使用し、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド−縮合試薬による
アミド側面官能基でのニトリル形成を回避する。
フラグメントのＣ末端でAsp（OH）OBu^tはそ
のβ−カルボキシル基で親電子性の２−オキソエ
チルエステル結合を介しポリスチロール担体の芳
香族に結合している。こうして合成の終わりに、
記載したベンジル−エステル結合及び２−オキソ
エチル−エステル結合のアンモノリユーゼによる
ポリマー担体からのフラグメントもしくはの
解離の際同時にすべてのこれからのアミド側面官
能基を導入する（第４図参照）インシユリンＡ鎖のすべての常用の側面官能基
はフラグメントの合成の間tert−ブチル保護基に
より確実に保護される。ジメチルホルムアミド中
の縮合試薬ジシクロヘキシルカルボジイミドの助
けにより15倍過剰量のフラグメントと担体に結
合したフラグメントとを縮合させると担体上の
フラグメント（１−14）が収率86％（−ゲル
ポリマーに対し）で生じる。ポリスチロール担体
へのフラグメントの２−オキソエチルエステル
アンカー結合の塩基性解離（メタノール／ジオキ
サン（1/1、容積／容積）中の0.5N−トリエチル
アミン＋1N水酸化ナトリウム水溶液0.5容積％）、
引き続き解離し、完全に保護されたペプチド酸の
クロマトグラフイー精製により純粋なフラグメン
ト１ｇが得られる。（収率：59％（−ゲルポ
リマーに対し））。脱離条件下でのA⁵位のベンジ
ルエステルの安定な存在は質量スペクトルから証
明された。フラグメントのＣ−末端をアンモニ
アで飽和したジオキサン、次いで液体アンモニ
ア／メタノール混合物4/1（容積／容積）を用い
て加圧下に20℃で担体から脱離させる。クロマト
グラフイー精製後（DEAE A25セフアデツク
ス／メタノール−0.5N酢酸（4/、容積／容積）
及びセフアデツクスLG20／メタノール））、純粋
なフラグメント1.45ｇ（収率＝86％、担体結合
した前工程物質に対し）が得られる。モデル実験
によれば前記条件下にＣ末端はアスパラギン酸−
α−tert−ブチルエステルのβ−アミドが生じス
クシンイミド誘導体は生じない。フラグメント0.5ミリモルとフラグメント
１ミリモルとをジメチルホルムアミド中のカルボ
ジイミド縮合試薬を用いて縮合させ（４日間）、
完全に保護されたフラグメント（１−21）と
し、これをクロマトグラフイー精製するとフラグ
メント1.3ｇが得られる（これはフラグメント
に対し収率78％に相応する）。２，４倍過剰量
のフラグメントと担体上のフラグメントとを
カルボニルジイミダゾールの使用下に同様に縮合
させると収率12％でフラグメントが得られる。
この際フラグメントの過剰の50％を回収するこ
とができる。フラグメント中のA⁵位のベンジルエステル
をメタノール中のアンモニアを用いて加圧下にア
ミドとする。次いで、図４に記載した式によりA⁶位及びA¹¹
位のtert−ブチルジスルフイドを還元にトリブチ
ルホスフアンを用いて解離し、選択的に鎖内ジス
ルフイド環A⁶−A¹¹を空気酸化により収率84％
（完全に保護したフラグメントに対し）で得る。
引き続きトリフルオル酢酸を用いて全tert−ブチ
ルエステル保護基及びtert−ブチルエーテル保護
基を脱離させる。この状態において合成インシユ
リンＡ鎖はA⁷位（Acm）及びA²⁰（Mbzl）にのみ
なお硫黄保護基を有する。ｐ−メトキシベンジル
保護基（Mbzl）をアニソールの存在下にピリジ
ン中の弗化水素で選択的に脱離させる（収率約80
％）。この方法で得られた唯一のシステイニル−メト
カプト官能基（A²⁰）を有するインシユリンＡ鎖
をすぐに30％酢酸にとかし、牛インシユリンから
の還元型で天然のＢ鎖（遊離SH−基２個）当モ
ル量の酢酸酸性溶液と混合し、0.1N沃素溶液で
酸化する。もつぱらA²⁰−B¹⁹位間の抵抗のある
鎖間ジスルフイド架橋の他に、この際第２工程と
してA⁷位に最後になお残つたアセトアミドメチ
ル保護基（Acm）を加沃素分解的に除去し、こ
うして２番目の鎖間ジスルフイド橋（A⁷−B⁷）
をも酸化的に形成する。引き続きすぐに10％の酢酸中でセフアデツクス
（Sephadex）G50上でクロマトグラフイーにかけ
る。この際、電気泳動及び薄層クロマトグラフイ
ーに関し信頼すべき比較材料と一致して移動す
る。純粋な牛インシユリンが収率25％で得られ
る。凍結乾燥した粗材料は脂肪細胞の生物学的リ
ポゲネーゼ試験において活性52％を示し、競合受
容体試験において活性65％を示す。この材料は亜鉛錯体として結晶化し、インシユ
リンに特有な結晶形を示す（第５図）．１％酢酸
中でビオゲル（Biogel）p6でのゲルクロマトグ
ラフイー及びカルボキシメチルセルロースでのイ
オン交換体クロマトグラフイーを繰り返した後、
本発明により得られた半合成牛インシユリンは両
方の前記テスト系において完全な生物学的活性を
示す。本発明による選択的脱離可能な硫黄保護基をイ
ンシユリンＡ鎖にのみ使用する際、１：１の比で
鎖を使用する場合の組合わせの収率は公知の統計
的ジスルフイド架橋に対してすでに100％以上改
良することが判明する。この方法はB⁷位をアセ
トアミドメチル保護基でB¹⁹位をｐ−メトキシベ
ンジル保護基で保護し、次いで本発明方法により
選択的に遊離させるとき、この方法を極めて改良
することができる。次に実施例につき本発明を詳細に説明する。例ペプチド合成の個々の工程をシユバルツ・ビ
オ・リサーチ社（Firma Schwarz Bio Re−
search）の合成自動装置（Syntheseauto−
maten）中で遠心分離反応装置の助けにより行な
う。変換率のコントロールを280nm及び230nmで
のUV−吸収の測定により行ない２系統式記録計
を用いて記録する。ａ）溶液状でのインシユリン１−３フラグメン
ト（フラグメント）の合成ａ）１ ValCMeの合成 C₆H₁₃NO₂（131、173）氷／NaCl−混合物中で−５℃〜−10℃に冷
却したメタノール70ml中に塩化チオニル15.8ml
を加える。次いでバリン23.4ｇを温度が−５℃
を越えないように加える。ゆつくりと40℃に加
温し、この温度で２時間撹拌する。真空中で濃
縮し、５％NaHCO₃中に取り込む。次いで酢
酸エステルで振出し、酢酸エステル相をH₂O
で中性となるまで洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ
る。40℃で真空中で濃縮した後、白色残分を乾
燥器中P₂O₅上乾燥させる。収率：19ｇ：80％薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水；4/1/1）：Rf＝0.46 ａ）２ Ddz−Ile−ValOMe（混合無水物法）
C₂₄H₃₈N₂O₇（466，577）１）アミン成分の調製 CH₂Cl₂50ml中にValOMe2.6ｇ（20ミリモ
ル）を溶解し、−15℃に冷却する。２）カルボキシル成分の調整及び結合 CH₂Cl₂50ml中にDdz−Ile7.3ｇ（20ミリモ
ル）を溶かし、Ｎ−メチルモルホリン2.21ml
（20ミリモル）を加える。引き続き−15℃に冷
却し、クロル蟻酸イソプロピルエステル2.24ml
（20ミリモル）を添加して活性化し（活性化時
間８分）、アミン成分を１回に注ぎ入れる。３）処理反応混合物を氷冷0.1NKHSO₄溶液で５回、
NaCl飽和水で１回及びKHCO₃溶液で５回振出
する。この溶剤をNa₂SO₄で乾燥させ、真空中
で蒸発させる。残つた残分をP₂O₅上で乾燥さ
せる。収率：7.4ｇ（80％）薄層クロマトグラム（ベンゾール／氷酢酸；7/
１）：Rf＝0.39 ａ）３ Ddz−Gly−Ile−ValOMe C₂₆H₄₁N₃O₈（523，630）１）アミン成分の調製 CH₂Cl₂中の５％トリフルオル酢酸100ml中に
Ddz−Ile−ValOMe7.4ｇ（16ミリモル）を溶
かす。（保護基の脱離は15分間）。次いで反応溶
液をＮ−メチルモルホリンで中和し（PH試験紙
でPH７−7.5）、−15℃に冷却する。２）カルボキシル成分の調製と結合 CH₂Cl₂50ml中にDdz−Gly5.6ｇ（20ミリモ
ル）を溶かし、Ｎ−メチルモルホリン2.21ml
（20ミリモル）を加える。引き続き−15℃に冷
却し、クロル蟻酸イソプロピルエステル2.24ml
（20ミリモル）を加えることにより活性化し
（活性化時間８分間）、アミン成分を１回で注ぎ
加える。３）処理反応混合物を氷冷0.1NKHSO₄溶液で５回、
NaCl飽和溶液で１回そしてKHCO₃溶液で５回
振出する。この溶剤をNa₂SO₄で乾燥させ、真
空中で蒸発させる。残つた残分をP₂O₅上で乾
燥させる。収率：7.1ｇ（88％）融点147℃ アミノ酸分析：HCl／プロビオン酸1.5分間160
℃ Gly Val Ile 計算値１１１実測値 1.10 1.00 1.01 質量分析：ｍ／ｅ＝523 ａ）４ Ddz−Gly−Ile−Val C₂₅H₃₉N₃O₈（509，604）ジオキサン20ml中にDdz−Gly−Ile−
ValOMe7.1ｇ（14ミリモル）を溶かし、
1NNaOH2当量を加える。室温で撹拌し、1N
酢酸で中和し、真空中で濃縮し、ゲルクロマト
グラフイーにより精製する（セフアデツクス
LG−20／メタノール）。鹸化を薄層クロマトグラフイーにより追跡す
る：完全な鹸化．薄層クロマトグラム（クロロホルム／メタノー
ル／ピリジン；95/5/3）：Rf＝0.10 旋光度：〔α〕²⁵ _D＝＋1.5゜（Ｃ＝1.4）メタノールｂ）インシユリンＡ鎖フラグメント15−21及び
４−14（もしくは）の自動的固定相合成１）１×２分 CH₂Cl₂中の５％トリフルオ
ル酢酸２）１×15分を用いてDdz^*)−脱離３）６×それぞれ２分 CH₂Cl₂で洗浄４）１×２分 CH₂Cl₂中の５％トリフルオ
ル酢酸５）１×15分を用いてDdz−脱離の繰り返し６）６×それぞれ２分 CH₂Cl₂で洗浄１−６）脱離生成物の濾液及び洗浄液をDdz−
脱離生成物の測光測定のために集める。７）４×それぞれ２分トリエチルアミンとの
反応〔CH₂Cl₂／ジメチルホルム
アミド（1/1）〕１：９８） 12×それぞれ２分 CH₂Cl₂で洗浄９）１×CH₂Cl₂中のDdz−アミノ酸溶液20ml
（あらかじめのDdz−値に対し計
算）の添加 10）１×ジメチルホルムアミド中のジシクロヘ
キシルカルボジイミド溶液20ml
（Ddz−アミノ酸と同当量）の添
加 11）１×ジメチルホルムアミド／CH₂Cl₂（1/1）
20mlの添加 12）１×60分反応時間 13）３×２分 CH₂Cl₂で洗浄 14）５×２分 CH₂Cl₂／メタノールで洗浄 15）４×２分 CH₂Cl₂で洗浄 16）９〜15工程を２回繰り返す 17）１×ピリジン中の0.1M3−ニトロフタール
酸無水物40mlの添加 18）１×ジメチルホルムアミド／CH₂Cl₂（1/1）
20mlの添加 19）１×10分反応時間 20）８×２分 CH₂Cl₂で洗浄 21）５×２分 CH₂Cl₂／メタノール（4/1）で
洗浄 22）４×２分 CH₂Cl₂ 23）５×２分 CH₂Cl₂／メタノールで洗浄
（4/1）24）４×２分 CH₂Cl₂で洗浄＊） Ddz＝α，α−ジメチル−３，５−ジメト
キシ−ベンジルオキシ−カルボニル基前記合成プログラムをインシユリンA15−21
（フラグメント）及びA4−14（フラグメント）
の合成に使用する。それぞれのカルボキシル成分
（Ddz−アミノ酸）をそれぞれの周期においてあ
らかじめのDdz値に対し４倍過剰で使用する。工
程１〜９の溶剤及び洗浄剤としてはAl₂O₃−カラ
ムで精製した塩化メチレンを使用する。合成を
Ddz−AspOBu^t−ポリスチロール（ジビニルベン
ゾール0.5％で網状化）３ｇ及びDdz−Tyr（BU^t）
−ポリスチロール（ジビニルベンゾール0.5％で
網状化）３ｇを用いて遠心分離反応器中で開始す
る。装入： Ddz−AspOBu^t0.526ミリモル／ｇポリマー Ddz−AspOBu^t0.664ミリモル／ｇポリマー Ddz−Tyr（Bu^t）0.900ミリモル／ｇポリマー Ddz−Tyr（Bu^t）0.857ミリモル／ｇポリマープログラム中に容積が記載されていない時はこ
こに合成自動装置により容積60mlを測定する。出発物質に対する反応率はDdz−分解生成物を
測光することにより次のように判明する。反応結果（インシユリン15−21）

【表】第３図参照。両方の合成の平均収率は93％であ
る。反応結果（インシユリン４−14）

【表】第２図、両方の合成の平均収率は90％である。２番目の合成を10サイクルの後中断することな
しに、インシユリンA1−３との反応を行なう。
このトリペプチドをそれぞれ５倍過剰量で３回の
反応に使用する。この反応の合成プログラムを次
のように変える：９）１×Ddz−トリペプチド溶液（CH₂Cl₂）
20mlの添加 10）１×１−ヒドロキシベンゾトリアゾール溶
液（ジメチルホルムアミド中）20mlの添加 11）１×ジメチルホルムアミド／CH₂Cl₂（1/1）
中のジシクロヘキシルカルボジイミド溶液
10mlの添加 12）１×CH₂Cl₂／ジメチルホルムアミド（1/1）
20mlの添加 13）１×反応時間４時間 14）３×２分 CH₂Cl₂で洗浄 15）５×２分 CH₂Cl₂／メタノール（4/1）で
洗浄 16）４×２分 CH₂Cl₂で洗浄 17）９−16工程を２回繰り返すフラグメント縮合の際、それぞれのサイクルに
おいて、トリペプチド15.75ミリモル、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド１当量及び１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール1.5当量を使用する。反応結果（インシユリン１−14、フラグメント
）

〔１〕

C₉₄H₁₄₈N₁₁O₂₄（1816，285）前記脱離及び精製後、フラグメント（４−
14）のメチルエステル及び遊離酸から成る混合物
を鹸化する。フラグメント（４−14）の約1.1ｇをジオキ
サン３ml中に溶かし、1NNaOH2当量を加える。
この溶液のPHをPH−スタート（PH−Stat）で11.5
に保持する。室温で４時間後反応は終了する。次
いで1N酢酸で中和し、真空中で濃縮する。引き
続き、セフアデツクスLH−20／メタノールを介
しゲルクロマトグラフイーにより脱塩を行なう。
最後にP₂O₅上で乾燥させる。収率は担体結合へ
プタペプチドのアミノ酸Ｎ−末端の最後のDdz−
値に対して73％（1.1ｇ）である。薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水；4/1/1）：Rf＝0.83。保護基の質量分析検出切断片 Ddz Acm OBzl ｍ／ｅ 178 72 107 アミノ酸分析：（HCl／プロピオン酸、15分、
160℃） Cys CysSO₃H Ser Glu Ala 計算値３２１１実測値 2.38 1.82 1.64 1.10 Val Leu Tyr 計算値１１１実測値 1.13 1.00^a) 0.95 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−38.2（Ｃ＝0.5）MeOH ｃ）３ Ddz−Gly−Ile−Val−Glu（OBu^t）−Glu
（OBzl）．Cys（SBu^t）−Cys（Acm）−Ala−Ser
（Bu^t）−Val−Cys（SBu^t）−Ser（BU^t）−Leu−
Tyr（Bu^t）。〔２〕 C₁₀₇H₁₇₁N₁₄O₂₇（2085，634）前記一般的な脱離及び精製処理後、フラグメン
ト（１−14）〔２〕をセフアデツクスLH−
60／メタノールを介して分離を行なう。これによ
り分離しないメチルエステルと遊離酸から成る混
合物を再びフラグメント〔１〕と同様にして鹸
化する。担体結合へプタペプチドのＮ−末端アミノ酸の
最後のDdz−値に対し収率59％（1.1ｇ）である。薄層クロマトグラム（クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸；85/15/5）：Rf＝0.63（単一）保護基の質量分析による検出切断片 Ddz Acm OBzl Bu^t ｍ／ｅ 178 72 107 57 アミノ酸分析：6NHCl、28時間、110℃ Cys CysSO₃H Ser Glu Gly 計算値３２２１実測値 2.86 2.08 1.78 1.05 Ala Val Ile Leu 計算値１２１１実測値 1.18 2.04 1.03 1.00^a) Tyr 計算値１実測値 0.86 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−32.3（Ｃ＝0.6、メタノール）このフラグメントは後で溶液での縮合に使用す
る。ｃ）４ Ddz−Glu（OBzl）−Leu−Glu（OBu^t）−
Asp（OBzl）−Try（Bu^t）−Cys（MBzl）−AspOBu^t
〔３〕 C₈₁H₁₀₉B₇O₂₂（1532.803）フラグメント（15−21）〔３〕の脱離と精製
はフラグメント〔１〕と類似の鹸化により実施
する。担体結合へプタペプチドのＮ−末端アミノ酸の
最終Ddz−値に対し収率は51％（0.5ｇ）。薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢／
水；4/1/1）：Rf＝0.80 保護基の質量分析による検出切断片 Ddz OBzl MBzl Bu^t ｍ／ｅ 178 107 121 57 アミノ酸分析：HCl／プロピオン酸、15分、
160℃ Asp Glu Leu Tyr 計算値２２１１実測値 1.67 1.70 1.00^a) 0.87 Cys 計算値１実測値 0.83 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−41.2゜（Ｃ＝２、メタノール
）ｃ）５ポリマー担体へのフラグメント（イン
シユリン15−21）の再結合〔４〕メタノール５ml中にインシユリンA15−21〔３〕
400mg（0.26ミリモル）を溶かす。次いで、
CsOH−溶液38.4mg（0.23ミリモル）（10％過少）
を加える。この溶剤を真空中で蒸留し、残分を
P₂O₅上で乾燥させる。乾燥させたセシウム塩を樹脂エステル化のため
に無水ジメチルホルムアミド中に溶かし、５倍過
剰量で樹脂（1.89ミリモルBr／ｇ樹脂）に加える
（634mg）。配合物を３日間40℃で撹拌する。この
樹脂をガラスフリツトにより濾別し、次の溶剤で
十分に洗浄する：ジメチルホルムアミド、クロロ
ホルム、ジオキサン／メタノール（3/1）、メタノ
ール、ジオキサン及びメタノール。その後、乾燥
器中でP₂O₅上で乾燥させる。樹脂の被膜付加は
窒素の元素分析により、Ddz−保護基脱離の測光
分析及びアミノ酸−分析により決定することがで
きる、アミノ酸定量分析は0.11ミリモル／ｇ樹脂
の付加を示した。ｃ）６フラグメント（15−21）の再回収種々の洗浄液を合併し、回転蒸発器で真空中濃
縮する。残分を酢酸エステル中に取り込み、
0.5N−KHSO₄溶液を用いて振出することにより
遊離酸とする。次いで、有機層をH₂Oで中性と
なるまで洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させる。引き
続き、回転蒸発器中で真空下に濃縮し、P₂O₅上
で乾燥させる。薄層クロマトグラフイーにより純
粋なフラグメント（インシユリン15−21）200
mgが回収される。ｃ）７溶液でのフラグメント（インシユリン
１−14）へのフラグメント−縮合 Ddz−Gly−Ile−Val−Glu（OBu^t）−Glu
（OBzl）−Cys（SBu^t）−Cys（Acm）−Ala−Ser
（Bu^t）−Val−Cys（SBu^t）−Ser（Bu^t）−Leu−Tyr
（Bu^t）〔５〕 C₁₀₇H₁₇₁N₁₄O₂₇（2085.634）フラグメント（インシユリンA1−３）763mg
（1.5ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール270mg（２ミリモル）及びＮ−メチルモルホ
リン0.22ml（２ミリモル）を無水ジメチルホルム
アミド20ml、中に溶かす。この溶液を０℃に冷却
し、ジシクロヘキシルカルボジイミド206mg（1.0
ミリモル）を加える。０℃で１時間撹拌し、次い
でフラグメント（インシユリンA4−14〔１〕）
600mg（0.35ミリモル）（PH7.5にＮ−メチルモル
ホリンで調節）を加える。１夜かけて12時間撹拌
し、次いで真空中で濃縮し、ゲルクロマトグラフ
イー（セフアデツクスLH−20／メタノール）に
より精製する。収量はフラグメント（インシユリンA1−14）
413mgであり、これは変換率52％にあたる。アミノ酸分析：HCl／プロピオン酸、20分、
160℃ Cys CySO₃H Ser Glu Gly 計算値３２２１実測値 1.66 1.64 1.99 1.02 Ala Val Ile Leu 計算値１２１１実測値 1.00^a) 2.21 0.93 1.04 Tyr 計算値１実測値 0.65 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−32.1（Ｃ＝0.1）、メタノー
ル）Ｃ）８ポリマー担体上のフラグメント（イン
シユリン１−21）へのフラグメント縮合振盪フリツト中にインシユリン15−21−フエナ
セチル樹脂〔４〕（付加0.07ミリモル）700mgを入
れ、CH₂Cl₂中の５％トリフルオル酢酸を加える。
半時間振盪し、次いでCH₂Cl₂で十分に洗浄する。
この工程を２回繰り返す。その後この振盪フリツ
トをP₂O₅上で乾燥させる。このペプチドを振盪
フリツト中でトリエチルアミン〔CH₂Cl₂／ジメ
チルホルムアミド（１：２）〕（１：３）を用いて
脱プロトン化し、ジメチルホルムアミド／
CH₂Cl₂及びジメチルホルムアミドで十分洗浄す
る。フラグメント（インシユリン１−14〔５〕）
400mg（0.18ミリモル）とカルボニルジイミダゾ
ール28mg（0.17ミリモル）を無水ジメチルホルム
アミド５ml中に溶かし、前記担体結合フラグメン
ト（15−21）に加える。４日間撹拌し、反応溶
液を濾別し、P₂O₅上で樹脂を乾燥させる。フラ
グメント（インシユリン１−14）を下記のよう
にして回収することができる。フラグメント
（インシユリン１−14）中のアラニンに関してア
ミノ酸定量分析は0.0086ミリモルの付加を示し、
これはインシユリン１−21 30mgである。これは
変換率11.6％に相応する。この反応を繰り返す
が、変換率の上昇は達成できない。フラグメント（インシユリン１−14）の回収種々の洗浄溶液を合し、回転蒸発器中で真空下
に濃縮する。水を添加し、過剰のイミダゾリドを
遊離酸とする。再び濃縮し（回転蒸発器）、乾燥
させる。残分をLH−20でのゲルクロマトグラフ
イーにより精製する。フラグメント（インシユ
リン１−14）210mgが回収される。Ｃ）９ポリマー担体からのインシユリンＡ鎖の
脱離 Ddz−Gly−Ile−Val−Glu（OBu^t）−Glu−Cys
（SBu^t）−Cys（Acm）−Ala−Ser（Bu^t）−Val−
Cys（SBu^t）−Ser（Bu^t）−Leu−Tyr（Bu^t）−Gln−
Leu−Glu（OBu^t）−Asn−Tyr（Bu^t）−Cys
（MBzl）−AsnOBu^t〔７〕ポリマー担体〔６〕をスチールボンベ中メタノ
ール10mlで懸濁化する。湿気の遮遮断下にボンベ
を冷却し、液体アンモニア80mlを加える。こうし
て、β−カルボキシル基はフエナセチル担体への
結合から脱離し、更に18位のアスパラギン酸のβ
−ベンジルエステル基及び５及び15位のグルタミ
ン酸のγ−ベンジルエステル基も脱離し、１工程
で相応するアミドに変換する。このボンベを閉鎖
し、３日間室温で振盪する。脱離反応の後、樹脂を濾別し、メタノールで十
分に洗浄する。6NHCl中で160℃、20分間での樹
脂試料のアミノ酸分析は脱離が完全に終わつてい
ることを示す。脱離溶液を真空中40℃で濃縮し、
メタノールに取り込む。薄層クロマトグラフイー
によるコントロールによれば脱離溶液は目的生成
物インシユリンＡ鎖の他にフラグメント（15−
21）の未反応部分を含有する。更に酢酸エステル
中にも溶けない不溶性残分が残る。この固体残分
でアミノ酸分析を実施する。この分析はこの不溶
性部分がインシユリンＡ鎖から成ることを示す。
しかし、メルカプタン臭が確認できるので、Ｓ−
tert−ブチル保護基が部分的に塩基性条件により
脱離し、固体残分はオリゴマーインシユリンＡ−
鎖から成る（20mg）と思われる。固体残分及びメ
タノール溶液を合し、更に反応に使用する。この
混合物をP₂O₅上で乾燥させる。粗収量（メタノール相）約80ml 不溶性残分約20mg 薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水；4/1/1：Rf＝0.9（フラグメント15−21）、
0.2（インシユリンＡ−鎖）Ｃ）10 鎖内ジスルフイド橋A⁶−A¹¹の形成最後の距離（Ｃ）９）からのペプチド混合物
〔７〕をCys6及びCys20の還元に使用する。還元
をトリブチルホスフアンを用いて実施する。引き
続き、空気酸化によるジスルフイド結合の形成を
行なう。フラクシヨン（インシユリン１−21）
30mg、混合物〔７〕約100mgをプロパノール／水
2.0ml中に溶かし、窒素を通気する。次いでトリ
ブチルホスフアン4μの添加を行なう。反応溶
液を窒素雰囲気下に48時間室温で反応させる。その後、アンモニアでPH８に調節した水１中
に全反応溶液を加える。この溶液を通して空気を
48時間通じる。引き続き、真空中で濃縮し、LH
−20でのゲルクロマトグラフイーにより分離す
る。完全に保護された純粋なインシユリンＡ鎖
〔８〕20mgが得られる。内部環の閉環の収率は66
％である。アミノ酸分析：HCl／プロピオン酸、35分、 160℃ Cys CysSO₃H Asp Ser Glu 計算値４２２４実測値 3.05 1.86 2.12 4.10 Ala Val Ile Leu 計算値１２１２実測値 1.03 2.00^a) 0.87 2.24 Tyr Gly 計算値２１実測値 1.87 0.97 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−4.2゜（Ｃ＝0.1）メタノールｄ）溶液でのインシユリンＡ鎖の合成ｄ）１ポリマー担体からのフラグメント（イ
ンシユリンA15−21）の脱離 Ddz−Gln−Leu−Glu（OBu^t）−Asn−Tyr
（Bu^t）−Cys（MBzl）−AsnOBu^t．

〔９〕 C₆₇H₁₀₀N₁₀O₁₉（1349.560）フエナセチル担体への結合からのβ−カルボキ
シル基も18位のアスパラギン酸のβ−ベンジルエ
ステル基をもアミドに変換する脱離をジオキサ
ン／NH₃を用いて行なう。全脱離を連続的にUV
−測光器により観察し、記録計を用いて記載す
る。２日後に反応の終了を示す。アミノ酸定量分
析は担体からわずか50％のペプチドが脱離してい
ることを示した。次いで、ポリマー担体をスチールボンベ中でメ
タノール10mlを用いて懸濁させる。水分の遮断下
にボンベを−70℃に冷却し、液体アンモニア80ml
を加える。このボンベを閉じ、３日間室温で振盪
する。脱離反応後樹脂を濾別し、メタノールで十
分に洗浄する。6NHCl中で160℃／20分間でのア
ミノ酸分析は脱離が完全に終わつていることを示
す。種々の脱離反応を次のように処理する。引き続き、EDAE−A25イオン交換樹脂でメタ
ノール／0.5N酢酸（1/4）から成る混合物を用い
て分別を実施する。その後、精製をセフアデツク
スLH−20−カラム（2.5×200）cm上で溶離剤と
してメタノール用いてカラムクロマトグラフイー
により行なう。液体アンモニアを用いての脱離に
よる生成物は電気泳動及びDC−プレートにおい
て異なつて移動する２個のスポツトを含有する。
ダンシル化（Dansylierung）により、ペプチド
の１部からDdz−保護基が脱離していることがわ
かつた。ジオキサン／アンモニアを用いての脱離の際の
収量は700mgであり、これは担体結合へプタペプ
チドのＮ−末端アミノ酸の最後のDdz−値に対し
42％である。薄層クロマトグラム（クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸；85/15/5）：Rf＝0.7 薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水；4/1/1）：Rf＝0.9 加圧下での液体アンモニアを用いての脱離の際
収量は0.75ｇ、担体結合へペタペプチドのＮ−末
端アミノ酸の最後のDdz−値に対し44％である。薄層クロマトグラム（クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸；85/15/5）：Rf＝0.7及び0.5 薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水；4/1/1）：Rf＝0.9及び0.8 全収率は担体結合ヘプタペプチドのＮ−末端ア
ミノ酸の最後のDdz−値に対し86％（1.45ｇ）で
ある。アミノ酸分析：HCl／プロピオン酸、15分、 160℃ Asp Glu Leu Tyr Gys 計算値２２１１１実測値 1.91 1.84 1.00^a) 0.76 0.58 ａ）基準アミノ酸 PH1.9、１時間、1000Vでのフエログラム
（Pherogramm）は出発位置と出発線から陽極側
に約２cm離れた所にそれぞれ広いバンドを示し、
これらはニンヒドリンにプラスに反応する。ｄ）２溶液でのインシユリンＡ鎖へのフラグメ
ント縮合 Ddz−Gly−Ile−Val−Glu（OBu^t）−Glu
（OBzl）−Cys（SBu^t）−Cys（Acm）−Ala−Ser
（Bu^t）−Val−Cys（SBu^t）−Ser（Bu^t）−Leu−Tyr
（Bu^t）−Glu−Leu−Glu（OBu^t）−Asn−Tyr
（Bu^t）−Cys（MBzl）−AsnOBu^t．〔10〕無水ジメチルホルムアミド20ml中にＣ）３で記
載したインシユリンA1−14〔２〕1.1ｇ（0.5ミリ
モル）を溶かす。反応溶液を−10℃に冷却し、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド１当量（103mg）
を加える。この混合物を−10℃で10分間撹拌す
る。その後１−ヒドロキシベンゾトリアゾール２
当量（135mg）及びＮ−メチルモルホリン２当量
（0.11ml）を加え、温度を０℃に上げる（約10分
間）。次いで０℃でアミノ成分

〔９〕２当量
（1.16ｇ）処びＮ−メチルモルホリン２当量
（0.11ml）を加え、この混合物を室温に加温し、
４日間撹拌する。その後、反応溶液を真空中で濃縮し、LH−20
上でメタノールを使用しゲルクロマトグラフイー
によりかつシリカゲルＫ−60（調整済カラム）上
でクロロホルム／メタノール傾斜溶液を用いて分
離する。収量は完全に保護されたＡ鎖1.3ｇであり、こ
れはフラグメント（１−14）に対し変換率78％
に相応する。薄層クロマトグラム（ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水；4/1/1）：Rf＝0.2 アミノ酸分析（6NHCl、64時間、110℃）は次
のようである： Cys CysSO₃H Asp Ser Glu 計算値４２２４実測値 4.12 2.21 1.86 3.94 Gly Ala Val Ile 計算値１１２１実測値 1.01 1.02 2.00^a) 0.96 Leu Tyr 計算値２２実測値 2.24 1.86 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−37.3（Ｃ＝0.05）MeOH ｄ）３５位のGlu（OBzl）のGlnへの変換 Ddz−Gly−Ile−Val−Glu（OBu^t）−Gln−Cys
（OBu^t）−Cys（Acm）−Als−Ser（Bu^t）−Val−
Cys（SBU^t）−Ser（Bu^t）−Leu−Tyr（Bu^t）−Glm
−Leu−Glu（OBu^t）−Asn−Tyr（Bu^t）−Cys
（MB^zl）−AsnOBu^t．〔11〕このペプチドをメタノール中に溶かし、スチー
ルボンベ中に充填する。スチールボンベを冷却
し、水分の遮断上に液体アンモニアを加える。こ
のボンベを４日間室温で振盪する。こうしてγ−
ベンジルエステルを同時にアミド形成下に脱離す
る。脱離溶液を真空中40℃で濃縮させ、メタノー
ル中に取り込む。残分として不溶性の部分が残
る。粗収量：約1.1ｇ不溶性残分約0.2ｇ可溶性部分及び固体残分を一緒にして、この先
の反応に使用する。ｄ）４鎖内ジスルフイド橋A⁶−A¹¹の形成ジスルフイド結合の還元をトリブチルホスフア
ンを用いて実施する：ジスルフイド結合は空気酸
化により行なわれる。インシユリンＡ−鎖〔11〕1.3ｇをプロパノー
ル／H₂O（1.2）20ml中に溶かし、この溶液に
N₂を通気する。次いで、トリブチルホスフアン
155.6μを添加する。反応溶液を窒素雰囲気下に
室温で48時間反応させる。その後、全反応溶液を
NH₃でPH８とした水６中に加える。空気をこ
の溶液に48時間通じる。引き続き真空中で濃縮
し、ゲルクロマトグラフイーLH−20で分離す
る。物質〔12〕1.09ｇが得られ、これは収率84％に
相応する。アミノ酸分析（110℃、6NHCl、24時間） Cys CysSO₃H Asp Ser Glu 計算値４２２４実測値 3.22 1.91 2.02 3.93 Gly Ala Val Ile 計算値１１２１実測値 1.05 1.00^a) 1.58 0.67 Leu Tyr 計算値２２実測値 2.11 2.21 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−42.0（Ｃ＝0.1、メタノール）ｄ）５合併したインシユリンＡ−鎖の保護基脱
離完全に保護したインシユリンＡ−鎖〔８〕及び
〔12〕を合併する。保護基脱離のために濃トリフ
ルオル酢酸をペプチドに加え、１時間室温で放置
する。引き続き、反応溶液を真空中で濃縮する。
次いで保護基をはずしたインシユリンＡ−鎖をも
う１度セフアデツクスLH−20／メタノールでの
ゲルクロマトグラフイーにより精製する。最後に
インシユリンＡ−鎖を凍結乾燥させると、純粋な
インシユリンＡ−鎖750mgが得られる。予備酸化：過蟻酸¹⁰⁶、０℃、12時間アミノ酸分析：6N塩酸、110℃、42時間 CysSO₃H Asp Ser Glu 計算値４２２４実測値 3.95 1.89 1.70 3.91 Gly Ala Val Ile 計算値１１２１実測値 1.00^a) 1.08 1.96 0.69 Leu Tyr 計算値２２実測値 2.10 1.67 ａ）基準アミノ酸旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−76.2（Ｃ＝0.5、、メタノー
ル） PH1.9、１時間、1000Vでのフエログラムは出
発線から陽極側に約3.5cm離れて巾広いバンドを
示し、これはCl／−プラスに反応する。ｅ）精製した合成牛インシユリンＡ鎖と天然牛
インシユリンＢ鎖の結合ｅ）１ HF／ピリジンでのMBzl保護基の脱離前記のようにして形成した合成牛インシユリン
Ａ鎖40・８mgをHF／ピリジン２ml中に溶かす。
脱離試薬は同時に溶剤として働らく。陽イオン結
合剤としてはアニソール0.25mlを添加する。室温
で反応時間60分後、20位のCysで還元されたペプ
チドをエーテルで沈殿させる。粘着性のある白色
沈殿が生じるから、これをエーテルで数回十分に
洗浄する。次いで、保護基をはずしたＡ−鎖をすぐに30％
酢酸３ml中に溶かす。その前に、あらかじめ還元したＢ−鎖53.4mgを
30％酢酸２ml中に溶かした。次いで、この準備した溶液を反応溶液に加え、
沃素の色が約４分間安定して残るまで0.1N沃素
溶液で滴定する。過剰の沃素を反応溶液が無色と
なるまでアスコルビン酸で逆滴定を行なう。ｅ）２半合成牛インシユリンの精製反応溶液を
すぐに10％酢酸中でセフアデツクスＧ−50上で
分別する（カラム1.50×60cm）。フラクシヨン
３，４，５及び６を各々凍結乾燥させ信頼すべ
き牛インシユリンと電気泳動で比較する。第
３，４及び５フラクシヨンは電気泳動及び薄層
クロマトグラフイーにおいて純粋な牛インシユ
リンを含有する。粗収量は24.2mg（25％）であ
る。粗生成物を用いて生物学的試験を実施す
る。種々のフラクシヨンを各々新たに１％酢酸中
でビオゲル−ｐ−６−カラム（Biogel−ｐ−
６−Saule）に導入する（カラム２ｍ×0.8cm）。
この二番目の分離の後インシユリンを含有する
フラクシヨンを合し、再び同じカラムを通す。
主フラクシヨンはインシユリン18.2mgを含有す
る（収率20％）。これで、新たに生物学的試験を行なつた。予備酸化：過蟻酸¹⁰⁶、０℃、12時間アミノ酸分析：6NHCl、110℃、42時間 CysSO₃H Asp Thr Ser 計算値６３１３実測値 5.91 3.70 0.86 2.71 Glu Pro Gly Ala
Val 計算値７１４３
５実測値 6.75 0.91 4.03 3.23
5.12 Ile Leu Tyr Phe 計算値１６４３実測値 0.86 6.00^a) 3.73 3.38 His Lys Arg 計算値２１１実測値 1.89 1.11 0.06 ａ）基準アミノ酸第５図には得られた完全活性牛インシユリンの
亜鉛錯体の顕微鏡写真が表わされている。本発明方法により、鎖内及び／又は鎖間ジスル
フイド環を天然又は天然でない配置で含有し、治
療上非常に重要であるインシユリン及びインシユ
リン類似体を所定に製造することができる。こう
して特に小さい鎖内のジスルフイド環の天然又は
天然でない配置を有するインシユリンの逆平行変
形はインシユリンの興味あるデポ形である。それ
というのもこれが生理学的条件下に非常にゆつく
りと活性のインシユリンに変換するからである。
ポリマー担体上構成されかつ結合した天然もしく
は天然でない配置の鎖内及び／又は鎖間ジスルフ
イド環を有するインシユリンは特に長寿命の非生
理学的インシユリン−デポ形である。従つて本発明の課題は本発明方法により得られ
た天然又は天然でない配置の鎖内及び／又は鎖間
ジスルフイド橋を有するインシユリン生成物を場
合により常用の、薬理学的に認容性の結合剤、賦
形剤及び／又は助剤と組み合わせて含有する医薬
調剤である。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明方法を示す略図であり、第１
図はインシユリンＡ鎖の全合成概略式を示す図、
第２図はインシユリンＡ鎖のフラグメントの合
成概略式を示す図、第３図はインシユリンＡ鎖の
フラグメントの合成概略式を示す図、第４図は
小さい鎖内ジスルフイド環の形成下にフラグメン
ト及びを結合し、インシユリンＡ鎖とし、牛
インシユリンＡ鎖とし、牛インシユリンＢ鎖との
本発明による結合を示す図、そして第５図は本発
明により半合成された完全活性牛インシユリンの
顕微鏡による亜鉛鎖体の粒子構造を示す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１場合によりすでに存在するジスルフイド橋１
個以上の存在下に更に２個以上のジスルフイド橋
を合成及び／又は天然ポリペプチド中に選択的に
形成するために、最初のジスルフイド橋に変換す
べき両方のSH基の少なくとも１個をｐ−メトキ
シベンジル保護基で保護し、かつ２番目のジスル
フイド基に変換すべき両方のSH基の少なくとも
１個をアセトアミドメチル保護基で保護し、次い
でｐ−メトキシベンジル保護基をアニソールの存
在下にピリジニウム−ポリヒドロゲンフルオリド
（HF／ピリジン）を用いて脱離させ、引き続き
酸性溶液中の沃素で処理することを特徴とするポ
リペプチド中のジスルフイド橋の選択的形成法。２活性人インシユリンを製造するために、A⁷
位にアセトアミドメチル保護基及びA²⁰位にｐ−
メトキシベンジル保護基を有する合成インシユリ
ンＡ鎖と当モル量の合成又は天然の還元性インシ
ユリンＢ−鎖とを反応させる、特許請求の範囲第
項１記載の方法。３ B⁷位にアセトアミドメチル保護基かつB¹⁹位
にｐ−メトキシベンジル保護基を有するインシユ
リンＢ鎖を使用する、特許請求の範囲第２項記載
の方法。４小さい鎖内ジスルフイド環が窒素雰囲気下に
トリブチルホスフアンを用いてのA⁶及びA¹¹位で
のtert−ブチルメルカプト保護基の還元的脱離及
び空気を用いての選択的酸化により形成された合
成［A⁶−A¹¹］−インシユリンＡ鎖を使用する、
特許請求の範囲第２項又は第３項記載の方法。５天然のインシユリンＢ鎖として場合によりＣ
−末端で変性されている牛インシユリンのＢ鎖を
使用する、特許請求の範囲第２項から第４項まで
のいずれか１項記載の方法。６［A⁷−A¹¹，A⁶−B⁷−シスチン］−インシユ
リンを製造するためにA⁶位にアセトアミドメチ
ル保護基及びA²⁰位にｐ−メトキシベンジル保護
基を有する合成［A⁷−A¹¹］−インシユリンＡ鎖
を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。７［A⁶−A₇，A¹¹−B⁷−シスチン］−インシユ
リンを製造するために、A¹¹位にアセトアミドメ
チル保護基及びA²⁰位にｐ−メトキシベンジル保
護基を有する合成［A⁶−A⁷］−インシユリンＡ鎖
を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。８ジスルフイド橋形成を30％酢酸中の沃素を用
いて酸化することにより行なう、特許請求の範囲
第１項から第７項までのいずれか１項記載の方
法。９ｐ−メトキシベンジル保護基の脱離の際、溶
剤及び試薬としてピリジニウム−ポリヒドロゲン
フルオリド（HF／ピリジン）中で作業する、特
許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１
項記載の方法。１０逆平行［A⁶−A¹¹，A⁷−B¹⁹，A²⁰−B⁷−
シスチン］−インシユリンを製造するために、A⁷
位にアセトアミドメチル保護基及びA²⁰位にｐ−
メトキシベンジル保護基を有する天然又は合成
［A⁶−A¹¹］−インシユリンＡ鎖と還元型又はより
有利にはB¹⁹位にアセトアミドメチル保護基から
B⁷位にｐ−メトキシベンジル保護基を有する天
然又は合成インシユリンＢ鎖とを反応させる、特
許請求の範囲第１項記載の方法。１１逆平行［A⁶−A¹¹，A⁷−B¹⁹，A²⁰−B⁷−
シスチン］−インシユリンを製造するためにA²⁰
位にアセトアミドメチル保護基かつA⁷位にｐ−
メトキシベンジル保護基を有する天然又は合成
［A⁶−A¹¹］−インシユリンＡ−鎖と還元型又はよ
り有利にはB⁷位にアセトアミドメチル保護基か
つB¹⁹位にｐ−メトキシベンジル保護基を有する
天然又は合成インシユリンＢ鎖とを反応させる、
特許請求の範囲第１項記載の方法。１２逆平行［A⁷−A¹¹，A⁶ −B¹⁹，A²⁰−B⁷−
シスチン］−インシユリンを製造するためにA⁶位
にアセトアミドメチル保護基及びA²⁰位にｐ−メ
トキシベンジル保護基を有する合成［A⁷−A¹¹］
−インシユリンＡ鎖を還元型又はより有利にB¹⁹
位にアセトアミドメチル保護基かつB⁷位にｐ−
メトキシベンジル保護基を有する天然又は合成イ
ンシユリンＢ鎖と反応させる、特許請求の範囲第
１項記載の方法。１３逆平行［A⁷−A¹¹，A⁶−B¹⁹，A²⁰−B⁷−
シスチン］−インシユリンを製造するために、
A²⁰位にアセトアミドメチル保護基かつA⁶位にｐ
−メトキシベンジル保護基を有する合成［A⁷−
A¹¹］−インシユリンＡ鎖と還元型であるか又は
より有利にはB⁷位にアセトアミドメチル保護基
かつB¹⁹位にはｐ−メトキシベンジル保護基を有
する天然又は合成インシユリンＢ鎖とを反応させ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。１４逆平行［A⁶−A⁷，A¹¹−B¹⁹，A²⁰−B⁷−
シスチン］−インシユリンを製造するためにA¹¹
位にアセトアミドメチル保護基かつA²⁰位にｐ−
メトキシベンジル保護基を有する合成［A⁶−A⁷］
−インシユリンＡ鎖と還元型であるか又はより有
利にはB¹⁹位にアセトアミドメチル保護基かつB⁷
位にｐ−メトキシベンジル保護基を有する天然又
は合成インシユリンＢ鎖とを反応させる、特許請
求の範囲第１項記載の方法。１５逆平行［A⁶−A⁷，A¹¹−B¹⁹，A²⁰−B⁷−
シスチン］−インシユリンを製造するために、
A²⁰位にアセトアミドメチル保護基かつA¹¹位に
ｐ−メトキシベンジル保護基を有する合成［A⁶
−A⁷］−インシユリンＡ鎖と還元型であるか又は
より有利にはB⁷位にアセトアミドメチル保護基
かつB¹⁹位にｐ−メトキシベンジル保護基を有す
る天然又は合成インシユリンＢ鎖とを反応させ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。１６ポリマー担体上のA⁶−A¹¹位、A⁷−A¹¹位
又はA⁶−A⁷位に鎖内ジスルフイド環を有する天
然又は合成インシユリンＡ−鎖と還元型であるか
又はアセトアミドメチル保護基及びｐ−メトキシ
ベンジル保護基をB¹⁹位及びB⁷位の任意の位置に
有する天然又は合成インシユリンＢ鎖とをジスル
フイド架橋させる、特許請求の範囲第１項から第
１５項までのいずれか１項記載の方法。１７ポリマー担体としてジビニルベンゾールで
網状化したポリスチロールを使用する、特許請求
の範囲第１６項記載の方法。１８ 0.1〜0.8％、有利に0.5％のジビニルベンゾ
ールで網状化されたポリスチロールゲルを使用す
る、特許請求の範囲第１７項記載の方法。