JPH0349555B2 - - Google Patents
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- JPH0349555B2 JPH0349555B2 JP9244182A JP9244182A JPH0349555B2 JP H0349555 B2 JPH0349555 B2 JP H0349555B2 JP 9244182 A JP9244182 A JP 9244182A JP 9244182 A JP9244182 A JP 9244182A JP H0349555 B2 JPH0349555 B2 JP H0349555B2
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- Japan
- Prior art keywords
- cystine
- cysteine
- atc
- ferm
- medium
- Prior art date
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
この発明は、Ｌ−含硫アミノ酸、詳しくはＬ−
システインおよびＬ−シスチンの製造法に関す
る。 従来、Ｌ−システインおよびＬ−シスチンは、
毛髪等のＬ−システインやＬ−シスチンの含量の
高い天然物を鉱酸で加水分解し、生じたアミノ酸
混液よりＬ−シスチンとして単離取得し、Ｌ−シ
ステインはこのようにして得られたＬ−シスチン
を還元して製造されていた。 これに対し、本出願人においては既に、２−ア
ミノ−チアゾリン−４−カルボン酸（以下、
ATCと記す。）を原料とし、微生物の作用を利用
してＬ−システイン又はＬ−シスチンを製造する
方法（特開昭51−136619号公報参照）を開発し
た。 この方法に於いては、ATCを含硫アミノ酸に
変換する能力を有する微生物が酵素源として使用
され、この酵素は誘導酵素であるため、酵素誘導
剤として原料のATCが必要とされている。しか
しながらATCは高価であり、原料の１部を酵素
誘導剤として使用することは経済的ではなく、こ
の方法を工業的に実施し、含硫アミノ酸を安価に
製造するためには、ATCに代る安価な酵素誘導
剤が望まれていた。そこで、本発明者等は安価な
酵素誘導剤を開発することを目的として種々研究
を重ねた結果、ATCに代る誘導剤として、DL−
ATCの化学合成中間体である安価なＳ−（β−カ
ルボキシ−β−クロルエチル）−イソチオウレア
（以下、SCCIと記す。）が使用できることを発見
し本発明を完成するに至つた。即ち、本発明は
ATCを含硫アミノ酸に変換する能力を有する微
生物をSCCIを含む培地で培養し、培養した微生
物をATCに作用させて含硫アミノ酸に変換せし
めることを特徴とする含硫アミノ酸の製造方法に
係るものである。 本発明において使用する微生物は、自然界に存
在する野生株、公的な微生物保存機関に保存され
ている菌株或いはそれらより人工的に変異誘導し
た微生物群より、ATCからのシスチン又は（及
び）システイン生産能の有無を調べることによつ
て分離採取されるものであり、たとえば、アクロ
モバクター、アルカリゲネス、バチルス、ブレビ
バクテリウム、エンテロバクター、エルビニア、
エツシエリヒア、フラボバクテリウム、ミクロコ
ツカス、ミコプラナ、シユードモナス、サルシナ
あるいはセラチアの各属に属する微生物である。
より具体的に例示するならば次の如き菌株があげ
られる： サルチナ・ルテアAJ−1217（Sarcina lutea）
ATCC272、アクロモバクター・デルマルバアAJ
−1983（Achremebaeter delmarvae）FERM−
P3483、アルカリゲネス・デニトロフインカスAJ
−2553（Alcaligenes denitrificans）
ATCC15173、パチルス・ブレビスAJ−1282
（Bacillus brevis）ATCC8185、ブレビバクテリ
ウム・フラバムAJ−1516（Brevibaeterium
flavum）ATCC13826、エンテロバクター・アエ
ロゲネスAJ−2643（Enterobacter aerogenes
IAM1019）FERM−P2764、エルビニア・カロト
ボラAJ−2753（Erwinia carotovora CCM873）
FERM−P2766、シユードモナス・チアゾリノフ
イラムAJ−3854（Pseudomonas
thiazolinophilum）FERM−P2810、シユードモ
ナス・デスモリチカAJ2368（P.desmolyitca）
FERM−P2816、エツシエリヒア・コリAJ−
2592（Escherichia coli IAM1132）FERM−
P2763、ミクロコツカス・ソドンシスAJ−1753
（Micrococcus sodonensis）ATCC11800、ミコ
プラナ・ジモルフアAJ−2809（Mycoplana
dimorpha）ATCC4249、セラチア・マツセツセ
ンスAJ−2698（Serratia marcescens IAM1206）
FERM−P2765、フラボバクテリウム・アシドフ
イクムAJ−2494（Flavobacterium acidoficum）
ATCC8366、プソイドモナス・オバリスAJ−
2236（Pseudomenas ovalis IAM1454）FERM−
P2762 原料であるATCは、合成法にて供給されるも
ので、一般にラセミ体である。しかし本発明の方
法によれば、Ｄ−体、Ｌ−体ともにＬ−体のシス
チンまたはシステインに変換される。 前述の如き微生物を培養するための培地は
SCCIを0.01〜３％含有する栄養培地が使用され
る。SCCIはATCの化学合成中間体であり、ATC
に比べて安価である。栄養培地としては炭素源、
窒素源、無機イオン類、更に要すれば有機微量栄
養素を適宜含有する培地である。たとえば、炭素
源としてグルコース、シユクロース、キシロー
ス、糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸、エタノー
ル、グリセロール、メタノール等のアルコール類
などの、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウムなど、有機栄養源として酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーン・ステイープリカー
など無機イオンとして、マグネシウム、鉄、マン
ガン、カリウム、ナトリウム、リン酸などのイオ
ンが適宜用いられる。 培養は常法によればよく、たとえば培地のPHは
６〜９とし、接種後、20〜40℃で１〜３日好気的
に培養する。 このようにして培養した微生物を基質のATC
に作用せしめてATCを含硫アミノ酸を生成せし
める。 上記培養した微生物とは培養して得られる培養
液、分離菌体、洗滌生菌体、凍結乾燥菌体、アセ
トン乾燥菌体、物理的、化学的もしくは生化学的
に破壊された菌体、抽出液、粗精製物、精製物、
精製蛋白標晶、または菌体もしくは精製処理物の
固定化物などをいい、ATCに作用させる際の基
質濃度は、バツチ式、連続式によつても異なる
が、バツチ式では一般に水性媒質中0.1〜30％、
好ましくは0.5〜10％程度で連続式では、これよ
りやや濃度を低下させた方が好ましい。 反応は、普通、水性媒質中で15〜60℃、好まし
くは30℃〜50℃附近で、PH＝６〜10、好ましくは
7.0〜9.5附近で行なわれる。反応時間は、静置、
撹拌、流下等の手段あるいは酵素標品の形態、力
価によつて異なつてくるので一様ではないが、バ
ツチ法では通常10分〜72時間程度である。 反応が進行すると、反応液中にＬ−システイン
とＬ−シスチンが共存するのであるが、通常Ｌ−
システインは空気中の酸素により酸化されてＬ−
シスチンに変化し易く、時間がたつにつれてＬ−
シスチンの量が増大する。しかしながら、反応条
件等の変更によつてＬ−システインとＬ−シスチ
ンの濃度比を変えることも可能である。 一般には、通気酸化により大部分をＬ−シスチ
ンとし、その難溶性を利用して晶析する方法によ
りＬ−シスチンを得ることができた。また、Ｌ−
システインにする場合は電気還元による通常の方
法で処理して、Ｌ−システインとして採取するこ
とができる。なお、反応液にヒドロキシルアミン
やセミカルバジドを添加することによつてＬ−シ
ステイン及び／またはＬ−シスチンの収率を向上
することができる。 Ｌ−シスチンとＬ−システインの定量は、液体
クロマトグラフイーと微生物定量法によつた。後
者は乳酸菌ロイコノストツク・チトロボラム
ATCC8081を用いる方法であるが、本菌はＬ−シ
スチンとＬ−システインの双方によつて何等の生
育を与えられるので両アミン酸の和を定量するこ
とになり、通常Ｌ−シスチンとして表示される。
なお、本菌はＤ体のシスチン、システインでは生
育できない。 実施例 １ 第１表に示す組成の培地を調整し、500ml容フ
ラスコに50ml宛分注し120℃で10分間加熱・減菌
した。
システインおよびＬ−シスチンの製造法に関す
る。 従来、Ｌ−システインおよびＬ−シスチンは、
毛髪等のＬ−システインやＬ−シスチンの含量の
高い天然物を鉱酸で加水分解し、生じたアミノ酸
混液よりＬ−シスチンとして単離取得し、Ｌ−シ
ステインはこのようにして得られたＬ−シスチン
を還元して製造されていた。 これに対し、本出願人においては既に、２−ア
ミノ−チアゾリン−４−カルボン酸（以下、
ATCと記す。）を原料とし、微生物の作用を利用
してＬ−システイン又はＬ−シスチンを製造する
方法（特開昭51−136619号公報参照）を開発し
た。 この方法に於いては、ATCを含硫アミノ酸に
変換する能力を有する微生物が酵素源として使用
され、この酵素は誘導酵素であるため、酵素誘導
剤として原料のATCが必要とされている。しか
しながらATCは高価であり、原料の１部を酵素
誘導剤として使用することは経済的ではなく、こ
の方法を工業的に実施し、含硫アミノ酸を安価に
製造するためには、ATCに代る安価な酵素誘導
剤が望まれていた。そこで、本発明者等は安価な
酵素誘導剤を開発することを目的として種々研究
を重ねた結果、ATCに代る誘導剤として、DL−
ATCの化学合成中間体である安価なＳ−（β−カ
ルボキシ−β−クロルエチル）−イソチオウレア
（以下、SCCIと記す。）が使用できることを発見
し本発明を完成するに至つた。即ち、本発明は
ATCを含硫アミノ酸に変換する能力を有する微
生物をSCCIを含む培地で培養し、培養した微生
物をATCに作用させて含硫アミノ酸に変換せし
めることを特徴とする含硫アミノ酸の製造方法に
係るものである。 本発明において使用する微生物は、自然界に存
在する野生株、公的な微生物保存機関に保存され
ている菌株或いはそれらより人工的に変異誘導し
た微生物群より、ATCからのシスチン又は（及
び）システイン生産能の有無を調べることによつ
て分離採取されるものであり、たとえば、アクロ
モバクター、アルカリゲネス、バチルス、ブレビ
バクテリウム、エンテロバクター、エルビニア、
エツシエリヒア、フラボバクテリウム、ミクロコ
ツカス、ミコプラナ、シユードモナス、サルシナ
あるいはセラチアの各属に属する微生物である。
より具体的に例示するならば次の如き菌株があげ
られる： サルチナ・ルテアAJ−1217（Sarcina lutea）
ATCC272、アクロモバクター・デルマルバアAJ
−1983（Achremebaeter delmarvae）FERM−
P3483、アルカリゲネス・デニトロフインカスAJ
−2553（Alcaligenes denitrificans）
ATCC15173、パチルス・ブレビスAJ−1282
（Bacillus brevis）ATCC8185、ブレビバクテリ
ウム・フラバムAJ−1516（Brevibaeterium
flavum）ATCC13826、エンテロバクター・アエ
ロゲネスAJ−2643（Enterobacter aerogenes
IAM1019）FERM−P2764、エルビニア・カロト
ボラAJ−2753（Erwinia carotovora CCM873）
FERM−P2766、シユードモナス・チアゾリノフ
イラムAJ−3854（Pseudomonas
thiazolinophilum）FERM−P2810、シユードモ
ナス・デスモリチカAJ2368（P.desmolyitca）
FERM−P2816、エツシエリヒア・コリAJ−
2592（Escherichia coli IAM1132）FERM−
P2763、ミクロコツカス・ソドンシスAJ−1753
（Micrococcus sodonensis）ATCC11800、ミコ
プラナ・ジモルフアAJ−2809（Mycoplana
dimorpha）ATCC4249、セラチア・マツセツセ
ンスAJ−2698（Serratia marcescens IAM1206）
FERM−P2765、フラボバクテリウム・アシドフ
イクムAJ−2494（Flavobacterium acidoficum）
ATCC8366、プソイドモナス・オバリスAJ−
2236（Pseudomenas ovalis IAM1454）FERM−
P2762 原料であるATCは、合成法にて供給されるも
ので、一般にラセミ体である。しかし本発明の方
法によれば、Ｄ−体、Ｌ−体ともにＬ−体のシス
チンまたはシステインに変換される。 前述の如き微生物を培養するための培地は
SCCIを0.01〜３％含有する栄養培地が使用され
る。SCCIはATCの化学合成中間体であり、ATC
に比べて安価である。栄養培地としては炭素源、
窒素源、無機イオン類、更に要すれば有機微量栄
養素を適宜含有する培地である。たとえば、炭素
源としてグルコース、シユクロース、キシロー
ス、糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸、エタノー
ル、グリセロール、メタノール等のアルコール類
などの、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウムなど、有機栄養源として酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーン・ステイープリカー
など無機イオンとして、マグネシウム、鉄、マン
ガン、カリウム、ナトリウム、リン酸などのイオ
ンが適宜用いられる。 培養は常法によればよく、たとえば培地のPHは
６〜９とし、接種後、20〜40℃で１〜３日好気的
に培養する。 このようにして培養した微生物を基質のATC
に作用せしめてATCを含硫アミノ酸を生成せし
める。 上記培養した微生物とは培養して得られる培養
液、分離菌体、洗滌生菌体、凍結乾燥菌体、アセ
トン乾燥菌体、物理的、化学的もしくは生化学的
に破壊された菌体、抽出液、粗精製物、精製物、
精製蛋白標晶、または菌体もしくは精製処理物の
固定化物などをいい、ATCに作用させる際の基
質濃度は、バツチ式、連続式によつても異なる
が、バツチ式では一般に水性媒質中0.1〜30％、
好ましくは0.5〜10％程度で連続式では、これよ
りやや濃度を低下させた方が好ましい。 反応は、普通、水性媒質中で15〜60℃、好まし
くは30℃〜50℃附近で、PH＝６〜10、好ましくは
7.0〜9.5附近で行なわれる。反応時間は、静置、
撹拌、流下等の手段あるいは酵素標品の形態、力
価によつて異なつてくるので一様ではないが、バ
ツチ法では通常10分〜72時間程度である。 反応が進行すると、反応液中にＬ−システイン
とＬ−シスチンが共存するのであるが、通常Ｌ−
システインは空気中の酸素により酸化されてＬ−
シスチンに変化し易く、時間がたつにつれてＬ−
シスチンの量が増大する。しかしながら、反応条
件等の変更によつてＬ−システインとＬ−シスチ
ンの濃度比を変えることも可能である。 一般には、通気酸化により大部分をＬ−シスチ
ンとし、その難溶性を利用して晶析する方法によ
りＬ−シスチンを得ることができた。また、Ｌ−
システインにする場合は電気還元による通常の方
法で処理して、Ｌ−システインとして採取するこ
とができる。なお、反応液にヒドロキシルアミン
やセミカルバジドを添加することによつてＬ−シ
ステイン及び／またはＬ−シスチンの収率を向上
することができる。 Ｌ−シスチンとＬ−システインの定量は、液体
クロマトグラフイーと微生物定量法によつた。後
者は乳酸菌ロイコノストツク・チトロボラム
ATCC8081を用いる方法であるが、本菌はＬ−シ
スチンとＬ−システインの双方によつて何等の生
育を与えられるので両アミン酸の和を定量するこ
とになり、通常Ｌ−シスチンとして表示される。
なお、本菌はＤ体のシスチン、システインでは生
育できない。 実施例 １ 第１表に示す組成の培地を調整し、500ml容フ
ラスコに50ml宛分注し120℃で10分間加熱・減菌
した。
【表】
この培地にシユードモナス・デスモリチカ
FERM−P2816を接種し、30℃にて24時間振盪培
養を行つた。 各培養液5.0mlに1.0ｇ／dlのDL−ATC及び1.0
ｇ／dlのKH2PO4を含む5.0ml（PH8.0）を添加し、
30℃で５時間反応せしめた。 反応液中に生成したシステイン、シスチンの量
を高速液体クロマトグラフイーに定量した。その
結果を第２表に示す。
FERM−P2816を接種し、30℃にて24時間振盪培
養を行つた。 各培養液5.0mlに1.0ｇ／dlのDL−ATC及び1.0
ｇ／dlのKH2PO4を含む5.0ml（PH8.0）を添加し、
30℃で５時間反応せしめた。 反応液中に生成したシステイン、シスチンの量
を高速液体クロマトグラフイーに定量した。その
結果を第２表に示す。
【表】
上記SCCI0.1ｇ／dl添加して得られた培養液50
mlを遠心分離して菌体を集め、水で洗浄した後、
この菌体をDL−ATC・3H2O 3.0ｇ及びKH2PO4
1.0ｇを含むPH8.0の水溶液100mlに添加し、30℃
で15時間ゆるやかに撹拌しながら反応した。 反応終了後、反応液を激しく撹拌してシステイ
ンをシスチンに変換して結晶を析出せしめた。次
いで濃塩酸を添加して結晶を溶解後、遠心分離し
て不溶性物質を除去した。得られた上清に苛性ソ
ーダ溶液を加え、中和して結晶を析出せしめた。
再結を再度行つて白色の結晶1.7ｇを得た。 この結晶はNMRスペクトル、Ｘ線回析、およ
び液体クロマトグラフイーに於てオーセンテイク
なＬ−シスチンと完全に一致し、Ｌ−シスチンと
同定された。 実施例 ２ 第１表に示す組成の培地（SCCI：0.1ｇ／dl）
を使用して第３表に示す試験菌を実施例１と同様
の方法で培養した。培養液5.0mlを、5.0mlのDL−
ATC水溶液（DLATC2.0ｇ／dl、KH2PO4 1.0
ｇ／dl、PH8.0）と混合し、30℃にて５時間反応
せしめた。反応液中のシステイン及びシスチンを
高速液体クロマトグラフイーにて定量した。その
結果を第３表に示す。
mlを遠心分離して菌体を集め、水で洗浄した後、
この菌体をDL−ATC・3H2O 3.0ｇ及びKH2PO4
1.0ｇを含むPH8.0の水溶液100mlに添加し、30℃
で15時間ゆるやかに撹拌しながら反応した。 反応終了後、反応液を激しく撹拌してシステイ
ンをシスチンに変換して結晶を析出せしめた。次
いで濃塩酸を添加して結晶を溶解後、遠心分離し
て不溶性物質を除去した。得られた上清に苛性ソ
ーダ溶液を加え、中和して結晶を析出せしめた。
再結を再度行つて白色の結晶1.7ｇを得た。 この結晶はNMRスペクトル、Ｘ線回析、およ
び液体クロマトグラフイーに於てオーセンテイク
なＬ−シスチンと完全に一致し、Ｌ−シスチンと
同定された。 実施例 ２ 第１表に示す組成の培地（SCCI：0.1ｇ／dl）
を使用して第３表に示す試験菌を実施例１と同様
の方法で培養した。培養液5.0mlを、5.0mlのDL−
ATC水溶液（DLATC2.0ｇ／dl、KH2PO4 1.0
ｇ／dl、PH8.0）と混合し、30℃にて５時間反応
せしめた。反応液中のシステイン及びシスチンを
高速液体クロマトグラフイーにて定量した。その
結果を第３表に示す。
Claims (1)
- １ ２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸を
Ｌ−システイン又はＬ−シスチンに変換する能力
を有する微生物をＳ−（β−カルボキシ−β−ク
ロルエチル）−イソチオウレアを含む培地で培養
し、培養した微生物を２−アミノ−チアゾリン−
４−カルボン酸に作用させてＬ−システイン又は
Ｌ−シスチンを生成せしめることを特徴とするＬ
−含硫アミノ酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9244182A JPS58209988A (ja) | 1982-05-31 | 1982-05-31 | Ｌ−含硫アミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9244182A JPS58209988A (ja) | 1982-05-31 | 1982-05-31 | Ｌ−含硫アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58209988A JPS58209988A (ja) | 1983-12-07 |
| JPH0349555B2 true JPH0349555B2 (ja) | 1991-07-29 |
Family
ID=14054499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9244182A Granted JPS58209988A (ja) | 1982-05-31 | 1982-05-31 | Ｌ−含硫アミノ酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58209988A (ja) |
-
1982
- 1982-05-31 JP JP9244182A patent/JPS58209988A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58209988A (ja) | 1983-12-07 |
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