JPH0347253B2 - - Google Patents

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1983-07-01

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1991-07-18

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Description

請求の範囲１ヘモフイルス・インフルエンザｂからの多糖
類に対するＴ−細胞依存性抗体応答を生じさせる
ことができ、ゲル・パーミエイシヨン・クロマト
グラフイーによるデキストラン・スタンダードに
準拠した分子の大きさが140000ダルトン以上、
4500000以下、リボース／蛋白比が0.25と1.00の
間であり、実質的にハロゲン化シアンを含まない
溶液中、４〜８個の炭素のジカルボン酸およびヒ
ドラジドで誘導体化されたジフテリアまたは破傷
風トキソイドと、ほぼ等モル量のリボース、リビ
トールおよびリン酸塩からなり、予め、多糖類の
60％以上が、ゲル・パーミエイシヨン・クロマト
グラフイーによるデキストラン・スタンダードに
準拠した分子の大きさが200000および2000000ダ
ルトンの間に調整されるまで加熱して大きさを調
整されているハロゲン化シアン活性化莢膜ヘモフ
イリス・インフルエンザｂ多糖類と混合すること
により調製された、多糖類がジフテリアまたは破
傷風トキソイドと共有結合してなる水溶性、耐熱
性の抱合体。２該ジカルボン酸がアジピン酸である前記第１
項の抱合体。３該トキソイドがジフテリア・トキソイドであ
る前記第１項の抱合体。４該トキソイドが破傷風トキソイドである前記
第１項の抱合体。５該ハロゲン化物が臭化物である前記第１項の
抱合体。６ (a) ほぼ等モル量のリボース、リビトールお
よびリン酸塩からなるヘモフイルス・インフル
エンザｂの莢膜多糖類を、ゲル・パーミエイシ
ヨン・クロマトグラフイーによるデキストラ
ン・スタンダードに準拠して、20％未満が
200000ダルトン未満の分子の大きさ、20％未満
が2000000ダルトンを越える分子の大きさにな
るまで加熱し、 (b) 得られた大きさを調整した多糖類を臭化シア
ンで活性化し、 (c) 未反応の臭化シアンを実質的に全て除去し、
ついで (d) 該活性化生成物を４〜８個の炭素のジカルボ
ン酸ヒドラジド誘導体化外毒素トキソイドと反
応させること、からなるヘモフイルス・インフルエンザｂからの
多糖類に対するＴ−細胞依存性抗体応答を生じさ
せることができ、分子の大きさがゲル・パーミエ
イシヨン・クロマトグラフイーによるデキストラ
ン・スタンダードに準拠して140000〜4500000ダ
ルトンの間であり、リボース／蛋白比が0.25〜
1.00の間である、多糖類がジフテリアまたは破傷
風トキソイドと共有結合してなる水溶性、耐熱性
の抱合体の製法。７該ジカルボン酸がアジピン酸である前記第６
項の製法。８該トキソイドがジフテリア・トキソイドであ
る前記第６項の製法。９該トキソイドが破傷風トキソイドである前記
第６項の製法。発明の概要本発明は、多糖類−ジフテリア・トキソイド抱
合体（conjugate）（PRP−Ｄ）ワクチンおよび
多糖類−破傷風トキソイド抱合体（PRP−Ｔ）
ワクチンで例示される新規なヘモフイルス・イン
フルエンザ（Haemophilus influenzae）ｂ多糖
類−外毒素トキソイド、その製造用の多糖類ハプ
テンおよびそれらの製法に関する。本発明は、加
熱処理によつて分子の大きさを主として200000お
よび2000000ダルトンの間に調整し、ほぼ等モル
量のリボース、リビトールおよびリン酸塩からな
り、ついで、活性化剤、典型的には臭化シアンで
活性化した純粋なヘモフイルス・インフルエンザ
ｂ多糖類を提供する。本明細書で述べる分子の大
きさはゲル・パーミエイシヨン・クロマトグラフ
イーによるデキストラン・スタンダードに準拠し
ている。該活性化された多糖類を外毒素トキソイ
ド、好ましくはジフテリア・トキソイドと均密に
混合して抱合を行なう。好ましくは、該外毒素ト
キソイドはスペーサーとして４〜８個の炭素の橋
を用いて、例えば、ジフテリア・トキソイド（Ｄ
−AH）のアジピン酸ヒドラジド誘導体のように
誘導体化される。使用できる別の誘導体化外毒素
トキソイドには破傷風トキソイド（Ｔ−AH）が
包含される。該外毒素トキソイドは複数のAH単
位と結合している。この方法を用いることにより、ヘモフイルス・
インフルエンザｂからの多糖類に対するＴ−細胞
依存性応答をもたらす抱合体ワクチンが得られ
る。かかる抱合体は幼児および若年の子供における
ヘモフイルス感染症の予防に使用するのにことに
有益である。本発明はまた、ジフテリアや破傷風のような病
気に対する免疫付与のために有用な抱合体ワクチ
ンを利用できるようにする。ヒトにおけるかかる
抱合体の効力は通常のジフテリアおよび破傷風ト
キソイド調製物のものより大きい。過剰の活性化
剤の注意深い調節および除去により、該方法はス
ペーサーを介して複数の外毒素トキソイド分子が
単一の多糖類分子に結合してなる、実質的に架橋
もしくは重合誘導体を含まない多糖類抱合体を与
える。その式は一般的にPRP−Xnと表わすこと
ができ、ここに、Ｘはトキソイド部分、ｎは20以
下の整数、典型的な平均は７〜８である。（本明
細書においては、整数ｎを用いることなく、ジフ
テリア・トキソイド抱合体をPRP−Ｄと、破傷
風抱合体をPRP−Ｔと称する。）

【図面の簡単な説明】

第１図はヘモフイルス・インフルエンザｂ莢膜
多糖類の抗原性、すなわち、抗−PRP応答を示
す。この棒グラフは実施例Ｖの実験計画によるデ
ータである。発明の開示安定な液素性免疫の発生は少なくとも２つの
別々のリンパ細胞セツトによる異物の認識を必要
とする。これらのセツトは抗体形成細胞の前駆体
であるＢ−リンパ細胞およびＢ−細胞の機能を調
節するＴ−リンパ細胞である。数種の多糖類を含
め、いくつかの抗原はＢ−細胞を直接刺激して抗
体を生じさせることができるが（Ｔ−非依存性抗
原）、大部分の抗原（Ｔ−依存性）はＴ−リンパ
細胞により、Ｂ−細胞に与えられなければならな
い。本発明のワクチンの場合、ワクチンの外毒素
トキソイド部分がＴ−細胞系により認識される。
該蛋白はそれ自体の抗原性決定子と、共有結合し
たPRPハプテンの両方を有しているので、決定
子の両方のセツトがＴ−細胞によりＢ−細胞に与
えられなければならない。この担体−ハプテン抱
合体調製物の投与の結果はPRPがＴ−依存性免
疫原として与えられることとなる。PRPのＴ−
依存性授与が、もつとも危険の大きい目標集団で
ある幼児に保護免疫を誘導する。したがつて、本
発明の抱合体ワクチンは小さな幼児において特に
価値あるものである。かかる抱合体の女性への投
与は、ワクチン抗原に対する高い割合のIgG抗体
を誘導し、これは妊娠の間に胎盤関門を通り、か
くして、幼児に誕生から保護を与える。Ｔ−非依存性抗原はＢ−細胞を誘導して最終的
に抗体分泌細胞（形質球）に分化させ、一方、Ｔ
−依存性応答は相当に、より複雑である。Ｔ−依
存性刺激を受けた後、Ｂ−細胞群は抗体形成のみ
ならず、増殖および熟成をも開始する。その結
果、PRPに対する抗体生成Ｂ−細胞数の増加と、
PRPに対する第２回目の暴露に応答できるＢ−
細胞数の増加をもたらせる。くり返し免疫付与は
さらにPRP特異性Ｂ−細胞数の増加、したがつ
て、高い抗体力価、増強応答をもたらせる。要約
すると、Ｔ−非依存性応答は感応性Ｂ−細胞の数
によつて制限されるが、Ｔ−依存性応答は抗原感
応性細胞の合計数の増加をもたらす。本発明のPRP−外毒素トキソイド・ワクチン
は実験動物においてＴ−依存性免疫原として機能
することが証明されている。PRP−Ｄの標準的
投与で連続的に免疫付与された一群のウサギは全
て増強応答を示した。加えて、該抱合体に用いた
担体蛋白、例えば、PRP−Ｄ用のジフテリア・
トキソイドでの一次免疫付与は、PRP−外毒素
トキソイド抱合体のPRP成分に対する最初の応
答を増大させることが示された。同様なPRP応
答の増大は、抱合体に用いた以外の外毒素トキソ
イドで初回免疫刺激を受けた動物では見られなか
つた。本発明のワクチンはPRP−外毒素トキソイ
ド・ハプテン−担体抱合体である。かかるワクチ
ンにおいては、該抗原性、かつ、弱い免疫原性の
ハプテン分子（PRP）がジフテリア(D)または破
傷風トキソイド（Ｔ）のような高い免疫原性担体
分子に対する新規な抗原特異性を与える。該調製物における担体として用いる精製ジフテ
リア・トキソイド(D)は、水溶性カルボジイミド縮
合法を用いて、アジピン酸ジヒドラジド（ADH）
のような４〜８個の炭素のスペーサー分子の結合
により修飾（誘導体化）された商業的外毒素トキ
ソイドである。該修飾外毒素トキソイド、典型的
にはアジピン酸ヒドラジド誘導体Ｘ−AHは、つ
いで、未反応のADHから分離される。これは可
溶性物質で、実質的に架橋されておらず、このこ
とはゲルクロマトグラフイーおよびポリアクリル
アミドゲル電気泳動によつて測定されるような分
子の大きさに実質的な増加がないことによつて証
明される。ヘモフイルス・インフルエンザｂの莢膜外糖類
は、認可された多糖類ワクチンに用いられている
ような商業的な源から調製され、コンノート・ラ
ボラトリース（Connaught Laboratories）から
入手できる。しかし、該多糖類は通常、カルシウ
ム塩として精製されているが、カルシウムイオン
の使用はさける。なぜなら、それらは抱合操作に
おける炭酸塩緩衝剤の使用を妨害するからであ
る。ついで、該ハプテンに所望の寸法が得られる
まで加熱することにより、該多糖類の分子の大き
さを調整する。典型的には、該液体多糖類の100
℃における15分間の加熱が、分子の20％未満が
200000ダルトンより小さい分子の大きさで、20％
未満が2000000ダルトンより大きい分子の大きさ
であることを保証するために充分である。この大
きさ規制操作は適正なPRP−ＤまたはPRP−Ｔ
抱合体を得るために重要である。かくして得られた、大きさを規制した多糖類
を、ハロゲン化シアンまたは水素化ホウ素ナトリ
ウムのような該多糖類上に親電子基を生じさせる
活性化剤で活性化する。用いる典型的な活性化剤
は臭化シアンである。未反応の活性化剤は徹底的
に除去する。なぜなら、実質的な残留があると、
それが以後の反応混合物中で該蛋白の架橋を生じ
るからである。生じた架橋生成物は多糖類をトラ
ツプし、ワクチンの収率を低下させ、本発明で得
られる抱合体と化学的性質および溶解度の異な
る、分子の大きさのより大きい抱合体および本発
明のワクチンの所望の比率を欠くワクチンを生じ
させる。ついで、活性化したPRPおよびＸ−AHを合
し、冷所で反応させる。該誘導体化した外毒素ト
キソイド上のヒドラジド基のいくつかがPRP上
の活性化部位と反応し、共有結合を形成する。生
成物は４〜８個の炭素の橋を介して誘導体化外毒
素トキソイドに共有結合したPRPである。この
反応生成物を、ゲル・パーミエイシヨン・クロマ
トグラフイーでいずれもの未反応蛋白および分子
の大きさの小さい混入物を除去して精製する。主
要フラクシヨンの典型的な分子の大きさはデキス
トラン・スタンダードに準拠して675000ダルトン
である。相対的な分子の大きさについての典型的
な範囲は140000ダルトン〜4500000ダルトンであ
る。チメロサールのような保存剤を、チメロサール
の場合、１：10000の最終濃度で加える。バルク
濃縮物を0.2ミクロンのメンブラン・フイルター
を通して過し、冷所で保存する。該PRP−外毒素トキソイド抱合体生成物は耐
熱性で水溶性である。架橋のないことは、ゲル・
パーミエイシヨン・クロマトグラフイーにより、
また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測
定されるごとく、分子の大きさに出発多糖類のそ
れからの実質的な増加がないことにより証明され
る。熱安定性が長い製品寿命および、たとえ望ま
しくない環境中でも安定な製品を保証する。該反応は２工程として図式的に表わすことがで
きる。 (1) PRP＋CNBr→PRP^* (2) PRP^*＋nX →PRP（−Ｘ）_o もし、該ハロゲン化シアンの除去が効率的に行
なわれなければ、活性化PRPと外毒素トキソイ
ドの抱合でPRP（−Ｘ）_oが形成するほかに、Ｘ−
Ｘまたは重複して結合した誘導体の形成、例え
ば、のような望ましくない反応が起る。皮下または筋注についてのPRP−外毒素トキ
ソイド抱合体ワクチンの典型的なヒトへの投与量
はリボース10μgもしくは該抱合体生成物のほぼ
40μg相当を含有する0.5mlからなる。アンプル溶
液は、保存剤としてチメロサールを用い、該バル
ク濃縮物をリン酸塩緩衝食塩溶液で稀釈すること
により調製される。該生成物はヒトにおいて、該PRPおよび外毒
素トキソイド成分の両方に対する抗体形成を誘導
する。本発明をさらに詳細に説明するためにつぎの実
施例を提供する。これらは本発明をその精神また
は範囲において限定するものと理解されるべきも
のではない。実施例１ PRPの調製Ａ生物ヘモフイルス・インフルエンザｂの莢膜ポリリ
ボシル・リビトール・リン酸塩（PRP）をその
イーガン（Eagan）株から調製した。培養菌をく
り返し移植し、凍結乾燥種菌を調製した。この凍
結乾燥種菌から、さらに１回移植を行ない湿潤作
業用種菌を調製した（−60℃で保存）。該湿潤作
業用種菌から菌体の醗酵器ロツトを調製した。培養純度をつぎの基準によつて判定する。１陰性グラム染色特性２ NAD（ジホスホピリジン・ヌクレチオド）お
よびヘミン（フエリヘムのウシ型結晶塩）含
有寒天上で増殖、３ NADまたはヘミン不含寒天上で増殖せず、
および４特異抗血清（ｂ型ヘモフイルス・インフルエ
ンザｂ、ヘイランド・ラボラトリース
（Hyland Laboratories））により凝集。Ｂ培養および培地細菌を継代培養するため、すなわち、醗酵器の
接種に先立つて、BHI寒天（１当り、37ｇ
BHI（Difco）、15ｇバクト寒天（Difco）、0.6mlの
１％NAD（Sigma−Grade）および６mlの0.2％
ヘミン（Sigma−Bovine Type1））を用いた。
寒天表面から洗い出した菌体（20時間）を用いて
ヘモフイルス・インフルエンザｂ（Hib）液体培
地（１づつ）に接種する。これらの培養物を振
とうしながら、該細菌がその増殖サイクルの対数
期に達するまでインキユベートする。この時点
で、培養物２を用いて醗酵器中の液体Hib培地
40に接種し、８％UCON（Union Carbide潤滑
剤）300mlを加える。16〜18時間後、醗酵器培養
物は収集できるようになる。 Hib液体培地1000ml当りの組成は、酵母エキス透析物 5.0ｇカサミノ酸（Difco） 22.5ｇ二塩基性リン酸ナトリウム 14.4ｇデキストロース 5.59ｇヘミン 20ｇ水酸化アンモニウム（30％） 0.1534ml NAD １％ 0.6ml である。醗酵器の収集時、充当するグラム染色および培
養法（前記A1〜４参照）により培養純度を測定
する。培養物にカタブロン（臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウム）を最終濃度0.1％まで加
える。30分後、この時点で細菌はすでに不活化さ
れ、固形相を遠心分離により集める。該湿潤ペー
ストをさらに加工するまで−70℃で保存する。Ｃ多糖類の精製つぎの方法を用い、PRPの抽出およびそれに
続く精製を行なう。１洗浄剤からの解離ペーストの湿潤重量１ｇにつき、0.4M
NaCl10mlを加える。この懸濁液を市販のブレン
ダー中で30秒間混合する。混合液を冷所（４℃）
で17000×ｇにて15分間遠心分離する。上澄液を
集め、エタノールを濃度25％まで加える。つい
で、この物質を、17000×ｇ（４℃）で２時間遠心
分離し、上澄液をたくわえる。上澄液の４倍の容
量のエタノールを加え、この物質を一夜４℃に保
持する。２核酸の除去該物質を2800×ｇ（４℃）で５分間遠心分離す
る。沈澱を集め、ペースト抽出に最初に用いた容
量の1/4でトリス−MgSO₄緩衝液に再懸濁する。
蒸留水１当りの該トリス緩衝液の組成はつぎの
とおりである。トリス−ヒドロキシメチルアミノ−メタン
（Sigma）６ｇ MgSO₄・7H₂O 246mg チメロサール（Elanco） 50mg PHを濃塩酸で7.0±0.2に調整する。最初の湿潤ペースト100ｇ当り、デオキシリボ
ヌクレアーゼ 1.5mg（SigmaD−0876）および
リボヌクレアーゼ−A0.75mg（Sigma−Type １
−AS，Ｒ−5503）を加える。この物質を透析バ
ツグに入れ、対トリスMgSO₄緩衝液18で、37
℃で18時間インキユベートする。３蛋白の除去蛋白成分を除去するため、等容量のフエノール
−酢酸塩溶液（フエノール454ｇと合した10％
（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウム135ml）の添加により、
該物質をさらに加工する。ついで、この物質を30
分間（４℃）振とうし、17000×ｇで15分間遠心
分離し、水性相を集める。さらに２回フエノール
抽出を行ない、最後の水性相を蒸留水に対して透
析する。この段階の物質がバルク液体莢膜多糖類
（PRP）を構成し、さらに加工（以下のＤ参照）
するまで−20℃に保存する。４多糖類の品質の評価バルクPRPの品質は分取した液体試料の分析
に基いて判定される。エタノール（４容）、つい
で、CaCl₂（最終濃度0.02M）を加え、PRPを沈澱
させる。PRPを遠心分離により沈澱させ、真空
下、デシケータで乾燥させる。熱重量分析
（TGA）を用いて水分含量を測定する。その後の
分析は乾燥重量基準で算出する。許容される基準には、 (a) リボースの分析（オルシノール法）：30％以
上、 (b) 蛋白の分析（ローリー法）：１％より小、 (c) 核酸の分析（U.V.吸収）：１％より小、およ
び (d) 特異免疫血清による沈降（反対免疫電気泳動
法）が包含される。加えて、分子の大きさを適当なゲル・パーミエ
イシヨン・クロマトグラフイーで測定する。該多
糖類をリムラス（Limulus）溶解質テストおよび
ウサギ発熱原性テストにより内毒素について監視
する。典型的なロツトはつぎの特性を有する。 (a) 蛋白含量0.5％ (b) 核酸含量0.35％ (c) 残余ウシ抗原：ラジオイムノアツセイにより
測定した場合、精製PRPの該多糖類調製に用
いたウシRNAアーゼおよびDNAアーゼによる
汚染なし。 (d) 内毒素含量はリムラス・アメーバ様細胞−溶
解質分析（LAL）により測定した：200ng／mg
PRP (e) CL−4Bセフアロース上のKd：0.30。0.30の
値はデキストリン・スタンダードに準拠して概
略分子量1125000に対応する。Ｄ多糖類（PRP）試薬の調製該多糖類はこのように液体として精製される
が、精製操作においてカルシウムは使用しない。
（従来の多糖類の精製はカルシウム塩を生じるが、
カルシウムは以下の抱合の間に用いる炭酸塩緩衝
剤と結合でき、沈澱を生じる。該多糖類の大きさを、必要とする大きさの変化
の程度に見合つた時間、100℃で加熱することに
より調整する。該多糖類の大きさは、空隙容量で
20％未満がCL−4Bセフアロース・カラムから溶
出し、20％未満が0.5より大きいKdで溶出するよ
うに調整する。主要フラクシヨンは200000〜
2000000ダルトンの分子の大きさを有する。実施例 PRPの活性化Ａこの多糖類を、マグネチツク・スターラを備
えた反応容器中、氷浴上で４℃に冷却する。蒸
留水中、25mg／ml（20〜30mg／mlの範囲）の濃
度のPRPの最初の容量を記録する。ついで、
塩化ナトリウムを0.85％の濃度まで加える。Ｂ得られた該多糖類の塩化ナトリウムの溶液の
PHを、1N水酸化ナトリウムの添加により10.5
〜11.0に上昇させる。（より低いPHでは臭化シ
アンとの反応が少なく、より高いPHでは該多糖
類が分解するので、この範囲を選択する。Ｃ乾燥臭化シアンをPH10.5〜11.0の0.005N重炭
酸ナトリウム緩衝液に溶解し、直ちに（調製
後、10分以内）、0.4mg／mgPRPの割合で反応容
器に加える。Ｄ混合液のPHを、水酸化ナトリウムの添加によ
りPH10.5〜11.0に調整し、６分間維持する。Ｅついで、1N HClでPHを6.0に下げる。（酸性
PHは臭化シアンによつて該多糖類上に生じさせ
た活性化部位を安定化させる。さらにPHの低下
はPRPの加水分解をもたらせる。）Ｇ等容量の、PH6.0の予め４℃に冷却した食塩
水を加える。Ｈ該臭化シアン−多糖類混合物を濃縮装置に移
し、工程Ａで記録した最初の容量まで濃縮す
る。Ｉ工程ＧおよびＨを合計10回くり返す。かくし
て該多糖類濃度を25mg／mlに保持しながら、未
消費の臭化シアンの約99.9％を除去する。も
し、臭化シアンが除去されなければ、それは以
下で使用するジフテリア外毒素トキソイドと反
応する。実施例Ｄ−AH担体の調製Ａ蒸留水中、商業的なジフテリア外毒素トキソ
イド(D)を、陽圧で撹拌した濃縮器中、10000ダ
ルトン以上の分子を保持する膜上で20〜40mg／
ml、典型的には、35mg／mlに濃縮する。Ｂアジピン酸ジヒドラジド（ADH）８mg／mg
蛋白および１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド（EDAC）／mg
蛋白の乾燥混合物を効率的なスターラおよびPH
の監視、制御の可能なPH探針を備えた反応容器
に入れる。Ｃついで、ジフテリア外毒素トキソイドを反応
容器に加え、反応体の割合をつぎのようにす
る。ジフテリア外毒素トキソイド＝35mg蛋白／ml ADH＝8.0mg／mg蛋白 EDAC＝0.75mg／mg蛋白（ADHおよびEDACの順次添加の上、酢酸
塩緩衝剤の使用は持続性の柔毛状沈澱をもたら
す。反応体はそれら自体で充分な緩衝能を有し
ている。）Ｄ PHを直ちに4.7に調整し、4.7±0.2に少なくと
も２時間維持する。１化学反応の過程はPH調節器のレコーダによ
り追跡できる。要すれば、該反応は、PHが少
なくとも15分間安定するまで、２時間以上続
けることができる（すなわち、PH調節のため
のHCl添加なしに15分間）。２消費したHClの量を工程チエツクとして記
録する。３反応容器中の温度変化も監視する。Ｅ反応生成物を４℃にて、２回交換の最少100
容量の食塩水に対して、交換ごとに８時間透析
する。Ｆついで、工程Ｅと同様な最少容量、時間およ
び温度で２回交換のリン酸塩緩衝食塩水に対し
て透析する。Ｇ生成物（Ｄ−AH）を陽圧装置および10000
分子量膜で25mg／ml蛋白に濃縮する。Ｈこの濃縮物を滅菌過（0.2μ）し、４℃に保
存する。かかるＤ−AH担体の典型的ロツトの試料の分
析は38.3μgADH／mgDTの比率を示した。その試
料のクロマトグラフイーはCL−4Bセフアロース
上のKd値0.75を示した。これは蛋白スタンダー
ドに準拠して概略分子量139000に相当する。実施例共有多糖類−ジフテリア・トキソイド
抱合体（PRP−Ｄ）の形成Ａ濃度25mg／mlの実施例のジフテリア・トキ
ソイド・アジピン酸ヒドラジド担体（Ｄ−
AH）を、重炭酸ナトリウムで濃度0.5Mまで処
理し、PHを8.5に調整する。（著しく低い塩濃度
は、活性化多糖類を含有する最終反応混合液中
でゲル形成を起させる。）Ｂ密封することのできる反応容器中に、実施例
で得た洗浄PRP溶液の等量を入れる。PHは
8.4〜8.6で安定でなければならない。（もし、
CNBrが除去されていなければ、PHは急速に低
下し、多量の沈澱が形成する。この反応はたと
え、多糖類が存在しなくても起る。結合による
反応体の物理的外観には著しい変化があつては
ならない。）Ｃ反応混合物を４℃で15〜18時間混転させる。Ｄ該抱合体を、リン酸塩緩衝食塩水中で平衡さ
せたセフアクリル−300上でゲル・パーミエイ
シヨン・クロマトグラフイーによつて精製し、
未反応蛋白および分子の大きさ140000ダルトン
未満の物質を除去する。（もし、出発多糖類が
少なすぎると、この方法で遊離蛋白から該抱合
体を分離することはできない。）Ｅ精製した抱合体試料を、本実施例の以下の部
分に記載する化学分析用に分取する。Ｆ該精製抱合体に濃度１：10000までチメロサ
ールを加え、生成物を分析まで４℃に保存す
る。Ｇ該生成物を0.2μ滅菌過する。（もし、該多
糖類が実施例１(D)に記載したような大きさに規
制されていないと、すなわち、それが大きすぎ
ると、得られた抱合体は過できない。）分析実施例のバルク濃縮物について行なつたテス
トはつぎの結果を与えた。ａリボース含量：156.5μg／ml （実施例におけるPRP値の計算について、
実験で求めたリボース濃度に基く名目上の多糖
類濃度を算出するために変換係数２を用いる。）ｂ蛋白含量：330μg／ml ｃリボース／蛋白比：0.47（限界0.25〜1.0）ｄセフアロースCL−2B上でのクロマトグラフ
分析は、単一ピークとして抱合体分子の均質な
分布を示すクロマトグラフの特色を示した。ｅ Kd（多糖類）：セフアロースCL−4Bを用いて
0.36、CL−2Bを用いて0.77 PRPについての各フラクシヨンのリボース
分析で測定した。CL−4B上での0.36の値はデ
キストラン・スタンダードに準拠して概略分子
の大きさ674000に相当する。ｆ Kd（蛋白）：CL−4Bを用いて0.34、CL−2B
を用いて0.71 蛋白についての各フラクシヨンのローリー分
析によつて測定した。CL−4B上、ジフテリア
外毒素トキソイドのKd値の0.75から0.34への変
化は蛋白の多糖類との抱合がクロマトグラフイ
ー的にいずれもの原料からも異なつた物質を形
成することを示す。ｇ遊離蛋白：５％未満遊離蛋白はPRPに結合しなかつた誘導体化
ジフテリア担体蛋白を意味する。これは、ジフ
テリア外毒素トキソイド試料の位置に溶出する
蛋白の量を全溶出蛋白に対比させることによつ
て測定されるｈ内毒素含量：1μg／ml 内毒素はリムラス・アメーバ様細胞−溶解質
分析（LAL）によつて定量化した。該内毒素
含量はPRP−Ｄのヒト投与量10μgリボース当
り、64ngに相当する。ｉ発熱原性：バルク濃縮物は、0.15μgリボース／ml／Kgウ
サギ体重の体重等価（ヒト）投与量を用いる非
発熱原性についての米国基準に適合する。ｊポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PAGE）：純度および多糖類と蛋白の間の共有結合を支
持する証拠を得るためにPAGE分析を行なつ
た。遊離担体は柱状ゲル中の丁度半分、ほぼカ
タラーゼ（分子量60000）の位置にバンドを形
成するが、該PRP−Ｄ抱合体はゲルに入るこ
とができなかつた（分子量330000のチログロブ
リンの位置の前）。PRP−Ｄは原点のところで
単一のバンドを示した。ｋ臭化シミン： PRP−Ｄ抱合体調製前、第１工程で臭化シ
アン（CNBr）を用いるが、それはその後、生
成物から排除される。製法のいくつかの工程が
CNBr含量の減少に寄与している。しかし、ゲ
ル・パーミエイシヨン・クロマトグラフイーに
よるワクチンの最終的精製が分子量100000以下
のいずれの汚染物をも除去する。この精製が残
つた痕跡の遊離CNBrまたはその分解生成物に
よる汚染を排除する。１熱安定性： PRP−Ｄ抱合体ワクチンの耐熱性について
の検討を行なつた。該バルク物質を40倍に濃縮
し、３mlの試料３つを採取した。第１の試料を
４℃の水浴で16時間保持し、第３の試料を100
℃の水浴中で30分間加熱する。行なつたテスト
は蛋白およびリボース含量、セフアロースCL
−4Bによるゲル・パーミエイシヨン・クロマ
トグラフイーおよびSDS−多糖類ゲル電気泳動
（PAGE）についてであつた。その結果は、前記のテスト(a)および(b)における
結果を比較して、リボースまたは蛋白含量につい
て試料間に何ら著しい変化がないことを示した。
クロマトグラフ分析は、条件がより厳しくなるに
つれて、抱合体物質の分子の大きさが少し減少す
ることを示した。しかし、254nmでの吸収測定に
よるこれらの試料の分別分析では、該物質は多糖
類ピークに一致するただ１つのピークを維持し、
遊離蛋白ピークは全く現れず、この結果は前記の
(d)および(g)の結果に匹敵する。これは、蛋白と多
糖類の間の結合は切断されないが、分子の大きさ
の減少が鎖状多糖類の中の結合の切断によるもの
であつたことを示している。これはさらに、これ
らの試料のPAGE分析を前記(j)に記載した結果と
比較することにより、たとえ洗浄剤（ドデシル硫
酸ナトリウム）の存在下でも、いずれもの試料に
おいて遊離蛋白が検知できなかつたことを示して
いる。このことは、誘導体蛋白−多糖類共有結合
および高温処理を通じてのその安定性を強く肯定
している。実施例 PRP−Ｄ免疫原性テストこの実験は、担体依存性、担体特異性、増強効
果およびｇクラスの変化によつて証明されるよ
うなＴ−細胞依存性を示すために設計された。こ
の実験は２つの部分：１）一連の２回の注射によ
る初回免疫刺激、２）一連の２回の注射による攻
撃、で行なつた。材料：１ PRP−Ｄバルク濃縮物、実施例２破傷風トキソイド（Ｔ）３ジフテリア・トキソイド(D) ４ヘモフイルス・インフルエンザｂ莢膜多糖類
（PRP）５ PRP／Ｄ、20μgPRP（10μgリボース）および
20μgD混合物６ PRP／Ｄ−AH、20μgPRP（10μgリボース）
および20μgD−AH混合物方法：全ての免疫付与はアジユバントなしに１mlの容
量で皮下投与した。PRPを含有する全ての投与
は１ml投与当り、リボース10μgに調整した。非
抱合外毒素トキソイド投与は１ml投与当り20μg
蛋白に調整した。免疫付与には14日間隙で巡廻す
る計画を用いた。各免疫付与10日後採血した。全
調整物は0.01％チメロサールを含有するリン酸塩
緩衝食塩水中で稀釈した。各投与分を４つの投与
バイアルとして調製し、−20℃で貯蔵した。各群
においては３匹のウサギに免疫付与した。血清学：以下に示すように、抗−PRP、抗−Ｄ−AH、
抗−Ｄおよび抗−Ｔについて、血清を固相ラジオ
イムノアツセイ（SPRIA）で分析した。抗体レ
ベルは１ml当りのIgGおよびIgMのマイクログラ
ム数として定量化した。実験計画：

【表】計画：ウサギを前採血し、各群、14日ごとに免疫付与
した。各免疫付与10日後に後採血した。最初の２
回の注射は一次免疫原で行ない、一方、第３およ
び第４の注射は二次免疫原で行なつた。抗−PRP応答を第１図に示す。ウサギの６実
験群（１群当り３匹）におけるヘモフイルス・イ
ンフルエンザｂ莢膜多糖類に対するIgG抗体の平
均レベルをグラフ的に表わしてある。前記の実験
計画に従つて、各群をこの図上に表示してある。
全てのウサギについて、前採血レベルは1μg／ml
未満であり、明確化のため、この図には示してい
ない。塗りつぶしていない棒は一次免疫原による一連
の２回の注射後のIgGのレベルを表わしている。
塗りつぶした棒は二次または攻撃免疫原による第
３および第４の注射後のIgGレベルを示す。 IgG応答はPRP−Ｄ抱合体ワクチンによる免疫
付与後にのみ観察された。ジフテリア・トキソイ
ドで初回免疫刺激した群３のウサギはPRP−Ｄ
に対する応答を促進したが、破傷風トキソイドの
初回免疫刺激（群２）は効果がなかつた。破傷風トキソイド実施例Ｔ−AH担体の調製および共有結合
の形成多糖類−破傷風トキソイド抱合体（PRP−Ｔ）実施例の操作において、ジフテリア・トキソ
イドの代りに商業的破傷風トキソイドを用いてそ
のアジピン酸ヒドラジド誘導体を製造する。Ｔ−AH担体の典型的ロツトの試料の分析は
53.9μg／ADH／mgＴの比を示した。この試料の
クロマトグラフイーはCL−4BセフアロースのKd
値0.66を示した。これは蛋白スタンダードに準拠
して概略分子量227000に対応する。本発明に記載したＤ−AHについての操作と
同様な操作を用いて多糖類と、破傷風トキソイド
のアジピン酸ヒドラジド誘導体との抱合体を形成
させる。 PRP−Ｔの典型的なロツトの分析は１ml当り
多糖類142.6μｇおよび蛋白260μgを示した。抱合
体は可溶性で、0.2μフイルターで過できるもの
であつた。CL−4B上でクロマトグラフイーに付
した場合、該蛋白成分はKd0.30、該多糖類成分
はKd0.37を示した。

【表】

JP58502510A 1982-07-06 1983-07-01 ヘモフイルス・インフルエンザｂ多糖類外毒素トキソイド抱合体ワクチン Granted JPS59501360A (ja)

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