JPH0348797B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な生理活性物質の製造方法に関す
るものである。更に詳しくは、ヒト由来の白血病
細胞を培養することによつて産生される、細胞分
化誘導作用を有する蛋白性のヒト由来生理活性物
質（以下、細胞分化誘導物質と略記）の製造方法
に関するものである。 〔従来の技術〕 免疫反応をつかさどつている細胞群の中で、最
近マクロフアージ（以下Μφと略す）が注目され
るようになつたきた。Μφが、どん食作用による
抗原の処理を始めとして、生体の防御機構の中
で、中心的な役割を演じていることが、明らかに
なつてきたからである。また、細胞外からの刺激
に応じて、Μφが、インターロイキン−１、癌壊
死因子、コロニー形成刺激因子など、多種の重要
な生理活性物質を産生することが知られてきた。 血液細胞は、造血幹細胞より、増殖分化を繰り
返し、成熟して機能細胞へ到達するのである。こ
の分化成熟の過程で増殖能をもち、腫よう化して
しまつたものが白血病細胞である。このような腫
よう細胞を正常な機能をもつた細胞へと分化を誘
導するのが、分化誘導能をもつた物質であり、こ
れら分化誘導能をもつた物質を用いることによ
り、新しい癌の治療方法を開発できるものとし
て、近年、注目されている。 分化誘導能をもつた物質としては、安全性の高
い蛋白性の物質、特にヒト由来の蛋白性の物質が
期待を集め、近年活発に研究がなされている。現
在までに、ヒト末梢血リンパ球をレクチンで刺激
することにより、分化誘導活性が生成されること
が報告されている（ジヤーナル ナシヨナル カ
ンサー インステチユート（J.National Cancer
lnstitute）67巻、1225頁（1981年）、カンサーリ
サーチ（Cancer Research）42巻、3928頁（1982
年））。しかしながらこれらの報告において、ヒト
末梢血リンパ球から得られたものは、セフアデツ
クスＧ−75（フアルマシア社、スウエーデン）を
用いたゲルろ過分画法によつて分子量25000と
40000の蛋白性物質であることが報告されている
のみであつたが、その後の研究において、公開特
許公報、昭60−28934号に示される分子量45000〜
60000または100000、等電点５〜７の物質であり、
トリプシンに感受性を示し、熱に不安定な物質で
あるとされた。一方、ヒト−Ｔ−リンパ球性白血
病細胞の培養上清中に見いだされた分化誘導活性
は、アクリルアミドゲル電気泳動法によつて、分
子量50000〜60000の蛋白性の物質に由来するもの
とされたが、単離工程中で、その活性の約60〜90
％が失われた（日本組織培養学会要旨、43頁、
（1983年））。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このように、ヒト末梢血リンパ球およびヒト−
Ｔ−リンパ球性白血病細胞から生成される分化誘
導活性は、その活性をもたらす物質の性質はほと
んどわかつていないか、熱や蛋白質分解酵素に強
い感受性を示す不安定な物質であると共に、これ
らの物質の活性は弱く、ビタミンＡ誘導体などが
共存しないと、白血病細胞に充分な分化を誘導す
ることができなかつた。 また、ヒト末梢血リンパ球はヒトの血液から採
取される血球を分画して調整されるため、大量に
取得することは困難であり、工業的生産は容易で
はなかつた。またヒト−Ｔ−リンパ性白血病細胞
は、ヒトのＴ細胞白血病ウイルスに維持感染する
ことによつて、増殖性を獲得したものであり、大
量の細胞培養は安全性の点で問題が多かつた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記先行知見を認識し、マクロ
フアージ（Μφ）系の細胞が、より安定性に優れ
た、強い細胞分化誘導作用を有する蛋白性の生理
活性物質を産生するとの作業仮説に基いて、鋭意
検討を続け、ヒトのΜφ前駆細胞に作用して、単
独で、Μφへと分化を誘導しうる活性を有するヒ
ト由来の蛋白性の細胞分化誘導物質を見いだし、
発明を完成し、特許出願を行なつた。しかしなが
ら、先願ではΜφ前駆細胞である白血病細胞を使
用する場合においても、Μφ前駆細胞を分化誘導
能を有する物質（以下、分化誘導剤と略す）Μφ
様細胞へ変化させた後、分化誘導剤を洗浄、除去
するために、大変手間取り、大量の細胞を処理す
ることがむずかしかつた。そこで、細胞分化誘導
物質を大量かつ容易に取得するための手段につい
て、検討をかさね、Μφ様細胞に分化しうるヒト
白血病細胞を用い、分化誘導能を有する物質およ
びΜφ活性化物質の存在下に培養することによ
り、安全に大量の細胞を取り扱うことができ、か
つ細胞分化誘導物質を大量に取得できることを見
いだし本発明を完成した。 〔発明の内容〕 すなわち、本発明はマクロフアージ様細胞に分
化しうるヒト白血病細胞を、分化誘導能を有する
物質およびマクロフアージ活性化物質の存在下に
接着培養することを特徴とする白血病細胞に対し
て細胞分化誘導活性を有するヒト由来生理活性物
質の生産方法に関し、生産される生理活性物質は
下記の特性を有する。 ａ 分子量 50000±5000（ゲル濾過法） 50000±5000（SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動法） ｂ レクチンカラムへの吸着性 レンチルレクチ
ンカラム、コンカナバリンＡカラムに吸着する ｃ 熱安定性 70℃１時間で失活しない ｄ 還元剤による影響 活性が低下する ｅ PH安定性 PH２〜10の範囲で安定である 本発明において、細胞分化誘導物質とはヒト由
来のΜφ様細胞が産生する物質であつてin vitro
で少なくともマウスΜ−１細胞を分化させ、どん
食能を誘起する能力を有するものを意味する。 本発明の方法によれば、培養規模を調節するこ
とにより任意の量の細胞分化誘導物質を、随時、
製造することができる。 本発明で用いられるΜφ様細胞に分化しうるヒ
ト白血病細胞とは、Μφ前駆細胞に相当し、分化
誘導剤の作用により始めてΜφ様細胞に変化する
細胞又は本来Μφの性質の一部を有しているが、
分化誘導剤の作用により更にΜφの性質を有する
ように変化する細胞を意味する。Μφ前駆細胞と
しては、白血病患者から分離した初代細胞及び株
化細胞などから得られるが、株化細胞が大量に得
やすく好ましい。本発明で用いられる、白血病細
胞の株化細胞の例としては、HL−60細胞（ネイ
チヤー（Nature）、270巻、347頁（1977年））、
THP−１細胞（インターナシヨナル ジヤーナ
ルカンサー（Int.J.Cancer）26巻、171頁（1980
年））、Mono−１−207細胞（ウイルヒヨーズ
アルヒーフ アー パソロジカル アナトミー
ヒストパソロジー（Virchows Arch.A Path.
Anat.and Histol.371巻、15頁（1976年））などが
挙げられる。ここで用いられる分化誘導剤として
はΜφ様細胞へ変化し得る白血病細胞のΜφ様細
胞への変化を誘導する物質を意味し、例えば、ホ
ルボールエステル類、メゼレインのようなジテル
ペン系化合物、テレオシジンなどが挙げられる。
ホルボールエステル類では、4β−ヒドロキシ体
が好ましく、中でも12−０−テトラデカノイルホ
ルボール−13−アセテート（以下、TPAと略記
する）が特に好ましい。 本発明において用いられるΜφ活性化物質とし
ては、ビタミンＡ誘導体（例えば、ビタミンＡ
酸、ビタミンＡアルコール、ビタミンＡアセテー
ト、ビタミンＡパルミテート）、ジメチルスルホ
キシド、酪酸ナトリウム塩、ハイドロコーチゾ
ン、グラム陰性菌由来のリポポリサツカライド
（以下LPSと略す）、リピツドＡ、BCG菌などの
菌体壁、ムラミルジペプチドなどが挙げられ、そ
れぞれ単独、あるいは適宜組み合わせて用いるこ
とにより、Μφを活性化させ、細胞分化誘導物質
の産生を促すことができる。これらΜφ活性化物
質の中でも、約１〜5000ng／ml、好ましくは約
100〜3000ng／ml、より好ましくは約500〜
2000ng／mlのビタミンＡ誘導体、中でもビタミ
ンＡ酸の使用が特に好ましい。 細胞分化誘導物質産生に充分な時間、ヒト由来
の白血病細胞を培養した後、培養上清を収集し、
遠心分離により細胞屑を除去すれば、細胞分化誘
導物質を含む溶液が得られる。この細胞分化誘導
物質を含む溶液を生化学的分離操作における常
法、限外ろ過による濃縮、透析脱塩、陰イオン交
換体によるイオン交換クロマトグラフイー、ゲル
ろ過、電気泳動等を適宜組み合わせて精製するこ
とにより、高純度の細胞分化誘導物質を得ること
ができる。 細胞分化誘導物質の活性の測定は、in vitroで
マウス骨髄性白血病細胞Μ−１細胞に、どん食能
を誘起する効果を測定することにより行なつた。
本発明者らが用いている方法は、林の方法（トキ
シコロジーフオーラム、７巻、50頁（1984年））
を改良したものである。即ち、増殖期にあるΜ−
１細胞５×10⁵cells／ml（培地：イーグルMEM＋
２培量ビタミン・アミノ酸＋10％牛胎児血清）浮
遊液に細胞分化誘導物質溶液（試験液）を混じ、
その1mlを10mlガラス管にとり、横に倒して、炭
酸ガス培養器中で、37℃で２日間培養後、遠心処
理（1000rpm.10分間）を施し、上澄み液を捨て、
血清を含まない培養液1mlを加えて再び細胞を懸
濁し、2μl／mlの濃度のポリスチレン・ラテツク
ス粒子（1.004μｍ：積水化学社製）を加え撹はん
した後、さらに４時間培養する。この細胞を
PBS1mlでよく洗浄、遠心し、細胞外のラテツク
ス粒子を除去する。この操作を２回繰り返したの
ち、遠心管の底に沈澱した細胞をピペツトで吸い
上げ、スライドガラス上に１滴落とす。これに
0.5％エオシン液１滴を加え、カバーガラスをの
せ、顕微鏡で観察する。赤く染色される死細胞を
除き、生細胞のみについて、ラテツクス粒子をど
ん食した細胞と非どん食細胞とを計数し、どん食
細胞の比率を求める。試験液を適宜希釈して、上
記の測定を行ない、どん食細胞の比率が10％にな
るのに必要な、細胞分化誘導物質の試料の希釈率
の逆数をもつて、本発明における細胞分化誘導物
質の活性量を１単位（Ｕ）／mlと定義する。以
下本発明における細胞分化誘導物質の活性量は、
このどん食能測定法によつて測定した単位で示さ
れている。 上記の細胞の培養により産生される、本発明の
細胞分化誘導物質の性質を詳しく述べる。 Ａ 分子量：50000±5000（ゲルろ過法） ダルベツコリン酸緩衝液（塩化カリウム0.2g／
ｌ、塩化ナトリウム8g／ｌ、リン酸第１カリウ
ム0.2g／ｌ、リン酸第２ナトリウム1.15g／ｌ、
pH7.4）に0.01％ポリエチレングリコールを添加
した溶液にて平衡化したSuperose6＋Superose12
（フアルマシア社（スウエーデン）製）を用いる
ゲルろ過法により分画し、Μ−１細胞でのどん食
能の誘起による細胞分化誘導活性を測定する。 Ｂ 分子量：50000±5000（SDS−ポリアクリルア
ミド電気泳動法） Segrestらの方法〔メソツド イン エンザイ
モロジー（Method in Enzymology）28−Ｂ巻、
54頁（1972年）〕に従い、トリス／グリシン／
SDS（PH8.3）で、電気泳動を行なつた。標準分子
量キツト（フアルマシア社製）を用いて分子量検
量線を作成し、分画したゲルからの抽出物のΜ−
１細胞のどん食能誘起活性評価により分子量を決
定する。 以上の結果より、本発明の細胞分化誘導物質は
サブ・ユニツト構造をとつていない物質であるこ
とが分かる。 Ｃ 等電点：6.5±1.0（等電点電気泳動法） アトー株式会社製の等電点電気泳動装置
（SJ1071EC型）を用い、フアルマライト（フアル
マシア社製、PH４〜８）とグリセロールを含む５
％ポリアクリルアミド平板ゲルを作成する。陽極
側に0.04M DL−グルタミン酸、陰極側に0.2M
Ｌ−ヒスチジンを使用して、700Vで50分間の前
泳動を行なう。続いて試料を付与し、700Vで１
時間、500Vで16時間泳動を行なう。泳動終了後
ゲルを2.5mm巾で切り出し、次いで各ゲル片を
0.15M塩化ナトリウムを含む0.02Mトリス−塩酸
緩衝液（PH8.2）0.2mlで抽出し、各抽出液につい
て、Μ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評価
を行なう。 Ｄ 熱安定性 本発明の細胞分化誘導物質を0.01％ポリエチレ
ングリコールを添加したPH7.4リン酸緩衝液にて
３倍に希釈し、所定の時間、所定の温度にて加熱
した後、Μ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の
評価を行なう。本発明の細胞分化誘導物質は、70
℃、１時間の熱処理において、その活性を失わな
い、熱的に安定な生理活性物質である。 Ｅ レクチンカラムへの吸着性 市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコー
ルミニカラム（バイオラツド社製）に充填し
150mMの塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩
衝液（PH7.5）で充分に洗浄後、本発明の細胞分
化誘導物質試料を添加し、同緩衝液にて洗浄し、
次いで、各種糖類を含む溶離液で溶出を行なう。 コンカナバリン−Ａ、および、レンチルレクチ
ンのカラムを用いた場合に、レクチンカラムへの
吸着が認められ、いずれのカラムにおいても
0.2Mα−メチル−ｄ−マンノシド溶液により、細
胞分化誘導活性が溶出する。 Ｆ ジスルフイド結合の還元剤による影響 ジスルフイド結合の還元剤としてジチオスレイ
トール（DTT）、又は、２−メルカプトエタノー
ル（２−ME）を、本発明になる細胞分化誘導物
質の溶液中に加え、37℃で、４時間反応させる。
反応後、Μ−１細胞に対するどん食能誘起活性を
測定する。50mMのジチオスレイトールを添加し
た場合に、その活性の低下が認められる。 Ｇ PH安定性 本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液に、
４倍量の各種PHの緩衝液を添加し、24時間、37℃
に加温した後、PHを中性にもどし、Μ−１細胞に
対する細胞分化誘導活性を測定する。PH２〜10の
範囲において、活性の低下は認められない。 Ｈ 蛋白分解酵素安定性 本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液（PH
7.4）に蛋白分解酵素トリプシン、または、プロ
ナーゼ−Ｅ（200単位）を添加し、37℃にて、３時
間反応させる。反応後において、Μ−１細胞に対
する細胞分化誘導活性の低下は認められない。上
記実験に0.1％SDSを添加したこと以外は、同一
の条件にて蛋白分解酵素の効果を検討したとこ
ろ、0.1SDS添加時のプロナーゼ−Ｅにより、細
胞分化誘導活性が消失することが認められる。 Ｉ ヒト白血病細胞に対する生理作用 牛胎児血清を10％含むRPMI−1640培地にヒト
単球性白血病細胞（THP−１）、ヒト前骨髄性白
血病細胞（HL−60）を37℃、炭酸ガス培養器中
でそれぞれ培養し、増殖期にある細胞をリン酸緩
衝液でよく洗浄した後５％牛胎児血清および
10nMビタミンＡ酸を添加したRPMI−1640培地
（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞれ２×10⁵
個／ml培地になるように懸濁する。細胞懸濁液
100μlと細胞分化誘導物質溶液（試験液）100μlと
の混合液を96穴プレートに入れ、37℃、５％炭酸
ガス混合空気の下で、３日間培養する。0.2％ニ
トロブル−テトラゾリウム（NBT、シグマ社）
の溶液（0.2μg／mlTPA含有培地に溶かした溶
液）100μlを加えて、さらに45分間培養後、顕微
鏡下で観察する。青く沈着した色素を有する細胞
がNBT還元能陽性細胞として観察される。 本発明の細胞分化誘導物質と３日間培養するこ
とにより、THP−１細胞、HL−60細胞にNBT
還元能が誘導されるのみならず、ラテツクス粒子
どん食能、培養容器壁への付着能、酵母菌殺菌
能、酸性ホスフアターゼ活性、β−グルクロニダ
ーゼ活性など、Μφの特徴として、細胞鑑定に常
用される（「マニユアル オブ マクロフアージ
メソドロジー（Manual of Macrophage
Methodology）、マーセル デツカー社、米国、
1981年」「図解白血球、金芳堂、1982年」）各種指
標の活性の増強が認められる。 なお、これまでの説明で明らかなように、本発
明になる新規生理活性物質は、Μφ前駆細胞であ
るヒトおよびマウスの骨髄性白血病細胞に作用し
て、Μφ様細胞へと分化を誘導し、Μφに特有な
各種機能の昂進をもたらし、溶液中での分子量、
すなわちゲルろ過時の分子量が50000±5000であ
り、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での
分子量も50000±5000であること、コンカナバリ
ン−Ａ、レンチルレチン等のレクチンに対して結
合性を有することから、本発明の細胞分化誘導物
質は、サブ・ユニツト構造を有しない糖蛋白質で
あると考えられる。 次に本発明の細胞分化誘導物質の製造方法につ
いて詳しく述べる。 本発明で使用される細胞の培養には、高等動物
細胞の培養に適した各種合成培地が用いられる。
代表的な培地としては、例えばRPMI−1640培
地、イーグルのMEM培地、ダルベツコ変法の
MEM培地、α−MEM培地、Hamの培地、199
培地、McCoy5A培地、Ｉ scoveの培地などを
単独もしくは適宜混合した培地が用いられる。こ
れらの培地の組成は「細胞組識培養マニユアル、
講談社、1982年」に記載されている。これらの培
地には、アルブミン、インシユリン、トランスフ
エリンなどの血清由来の蛋白質、ヒト血清、牛胎
児血清、牛血清、馬血清などの動物血清を単独
で、あるいは適宜組み合わせて添加してもよい。
また必要に応じて、微生物による汚染を防止する
ために、例えばペニシリン10〜100単位／ml培
地、硫酸ストレプトマイシン10〜100μg／ml培
地、硫酸カナマイシン40〜60μg／ml培地などの
抗生物質を添加することができる。培養液のPHの
制御や、炭酸イオン濃度の調節のために、例えば
10〜60mMのヘペス〔４−（２−ハドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〕などの
PH緩衝剤を使用してもよい。培養容器の材質は特
に限定しないが、プラスチツク、ガラスあるいは
金属製のものであつて、細胞の増殖が可能であ
り、細胞の接着性に優れたものがよい。 細胞分化誘導物質を産生させるためには、適当
な培地を用いて、ヒト白血病細胞を、培地1ml当
たりに約１×10⁵〜４×10⁶個、好ましくは、約４
×10⁵〜２×10⁶個となるように懸濁し、培養容器
へ植え込む。次いで、分化誘導能を有する物質
（分化誘導剤）およびΜφ活性化物質を添加する。
細胞、分化誘導剤及びΜφ活性化物質を含む培養
容器を約35〜38℃、好ましくは約37℃、約５〜10
％炭酸ガス含有空気中、湿度約90〜100％の条件
の下で、40〜100時間接着培養することにより、
細胞分化誘導物質が産生され、培養上清中に放出
される。培地のPHは、培養期間中約6.0〜7.5に維
持することが好ましい。 次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものでな
いことは言うまでもない。なお以下の記載におい
て、「％」は特に記載しない限り容量パーセント
（Ｖ／Ｖ％）を表わす。また特に記載がない限り、
培養は37℃、湿度90〜100％、５％炭酸ガス含有
空気中で行なつた。 実施例 １ ヒト急性単球性白血病細胞THP−１細胞を、、
50単位／mlのペニシリンおよび50μg／mlのスト
レプトマイシンを含有し、血清を含まないRPMI
−1640培地にて、細胞密度６×10⁵個／mlとなる
ように、細胞浮遊液を調製し、その10mlを100枚
の組識培養用プラスチツク製ペトリデイツシユに
植え込み、分化誘導剤として、12−０−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート（TPA）、
Μφ活性化物質としてビタミンＡ酸（RA）をそ
れぞれ1μg／mlとなるように添加し、37℃、５％
炭酸ガス含有空気中で72時間培養した。72時間後
に各デイツシユの培養上清を収集し、3000rpmで
10分間遠心し、細胞屑を除去した後、上清中の細
胞分化誘導物質の活性を測定した。即ち、増殖期
にあるΜ−１細胞５×10⁵cells／ml（培地：イー
グルMEM＋２培量ビタミン・アミノ酸＋10％牛
胎児血清）浮遊液に得られた培養液を混じ、その
1mlを10mlガラス管にとり、横に倒して、炭酸ガ
ス培養器中で、37℃で２日間培養後、遠心処理
（1000rpm、10分間）を施し、上澄み液を捨て、
血清を含まない培養液1mlを加えて再び細胞を懸
濁し、2μl／mlの濃度のポリスチレン・ラテツク
ス粒子（1.004μm：積水化学社製）を加え撹はん
した後、さらに４時間培養する。この細胞を
PBS1mlでよく洗浄、遠心し、細胞外のラテツク
ス粒子を除去する。この操作を２回繰り返したの
ち、遠心管の底に沈澱した細胞をピペツトで吸い
上げ、スライドガラス上に１滴落とす。これに
0.5％エオシン液１滴を加え、カバーガラスをの
せ、顕微鏡で観察する。赤く染色される死細胞を
除き、生細胞のみについて、ラテツクス粒子をど
ん食した細胞と非どん食細胞とを計数し、どん食
細胞の比率を求める。培養液を適宜希釈して、上
記の測定を行ない、どん食細胞の比率が10％にな
るのに必要な、培養液の希釈率の逆数をもつて、
１単位（Ｕ）／mlと定義される本発明の細胞分
化誘導物質の活性量は、得られた培養液におい
て、138単位／mlであつた。 得られた培養液のレクチンにたいする吸着性を
検討した。市販の各種レクチン固定化樹脂を市販
セパコールミニカラム（バイオラツド社製）に充
填し150mMの塩化ナトリウムを含む50mMリン
酸緩衝液（PH7.5）で充分に洗浄後、培養液試料
を添加し、同緩衝液にて洗浄し、次いで、各種糖
類を含む溶離液で溶出を行なつた。コンカナバリ
ン−Ａ（Con−Ａ）、および、レンチルレクチンの
カラムを用いた場合に、レクチンカラムへの吸着
が認められ、いずれのカラムにおいても0.2Mα−
メチル−ｄ−マンノシド溶液により、細胞分化誘
導活性が溶出した。 Con−Ａカラムに吸着、溶出した細胞分化誘導
活性について、分子量、等電点の測定を行なつ
た。分子量測定のため、該細胞分化誘導物質の活
性画分を、ダルベツコ リン酸緩衝液（塩化カリ
ウム0.2g／ｌ、塩化ナトリウム8g／ｌ、リン酸第
１カリウム0.2g／ｌ、リン酸第２ナトリウム
1.15g／ｌ、PH7.4）に0.01％ポリエチレングリコ
ールを添加した溶液にて平衡化したSuperose6＋
Superose12（フアルマシア社製）を用いるゲルろ
過法により分画し、Μ−１細胞でのどん食能の誘
起による細胞分化誘導活性を測定したところ、分
子量50000±5000の画分に細胞分化誘導物質の活
性が認められた。 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
子量測定のため、トリス／グリシン／SDS（PH
8.3）で、電気泳動を行なつた。標準分子量キツ
ト（フアルマシア社製）を用いて分子量検量線を
作成し、分画したゲルからの抽出物のΜ−１細胞
のどん食能誘起活性評価により分子量を決定した
ところ、分子量50000±5000の画分に細胞分化誘
導物質の活性が認められた。 等電点測定のために、等電点電気泳動法を以下
の方法によつて行なつた。即ち、アトー株式会社
製の等電点電気泳動装置（SJ1071EC型）を用い、
フアルマライト（フアルマシア社製、PH４〜８）
とグリセロールを含む５％ポリアクリルアミド平
板ゲルを作成した。陽極側に0.04M DL−グルタ
ミン酸、陰極側に0.2M Ｌ−ヒスチジンを使用し
て、700Vで50分間の前泳動を行なつた。続いて
試料を付与し、700Vで１時間、500Vで16時間泳
動を行なつた。泳動終了後ゲルを2.5mm巾で切り
出し、次いで各ゲル片を0.15M塩化ナトリウムを
含む0.02Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.2）0.2mlで
抽出し、各抽出液について、Μ−１細胞を用いた
細胞分化誘導活性の評価を行なつたところ、等電
点はPH：6.5±1.0であつた。 次に示す方法により、細胞分化誘導物質の熱安
定性を検討した。培養液に、0.01％ポリエチレン
グリコールを添加したPH7.4リン酸緩衝液にて３
倍に希釈し、所定の時間、所定の温度にて加熱し
た後、Μ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評
価を行なつた。

【表】 ジスルフイド結合の還元剤による影響を検討す
るために、ジチオスレイトール（DTT）、又は、
２−メルカプトエタノール（２−ME）を、培養
液中に加え、37℃で、４時間反応させた。反応
後、Μ−１細胞に対するどん食誘起活性を測定し
た。

【表】 PH安定性を次に示す。細胞分化誘導物質を含む
培養液に、４倍量のPH２，４，7.3，９，10の各
種緩衝液を添加し、24時間、37℃に加温した後、
PHを中性にもどし、Μ−１細胞に対する細胞分化
誘導活性を測定した。PH２〜10の範囲のいずれに
おいても活性の低下は認められなかつた。つい
で、蛋白分解酵素に対する安定性を検討した。細
胞分化誘導物質を含む培養液に蛋白分解酵素トリ
プシン、または、プロナーゼ−Ｅ（200単位）を添
加し、37℃にて、３時間反応させた。反応後、Μ
−１細胞に対する細胞分化誘導活性を測定した
が、いずれの条件においても、活性の低下は認め
られなかつた。上記実験に0.1％SDSを添加した
こと以外は、同一の条件にて、蛋白分解酵素の効
果を検討したところ、0.1％SDSの添加時のプロ
ナーゼ−Ｅにより、細胞分化誘導活性が完全に消
失した。 さらに、ヒト白血病細胞に対する生理作用を確
認すべく、牛胎児血清を10％含むRPMI−1640培
地にヒト単球性白血病細胞（THP−１）、ヒト前
骨髄性白血病細胞（HL−60）を37℃、炭酸ガス
培養器中でそれぞれ培養し、増殖期にある細胞を
リン酸緩衝液でよく洗浄した後、10％牛胎児血清
および10nMビタミンＡ酸を添加したRPMI−
1640培地（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞ
れ２×10⁵個／ml培地になるように懸濁した。細
胞懸濁液100μlと培養液100μlとの混合液を96穴プ
レートに入れ、37℃、５％炭酸ガス混合空気の下
で、３日間培養した。0.2％ニトロブル−テトラ
ゾリウム（NBT、シグマ社）の溶液（0.2μg／
mlTPA含有培地）100μlを加えて、更に45分間培
養下後、顕微鏡下で観察した。青く沈着した色素
を有するNBT還元能陽性細胞が、THP−１細胞
において33％、HL−60細胞において27％に観察
された。 実施例 ２ ヒト急性単球性白血病細胞THP−１細胞を用
いて、実施例１と同様にして細胞濃度６×10⁵
個／mlの細胞浮遊液を調製し、その10mlを10枚
の組織培養用プラスチツク製ペトリデイツシユに
植え込み、分化誘導剤として、12−０−テトラデ
カノイルホルボール−13−アセテート（TPA）、
ホルボール−12，13−ジデカノエート（PDD）、
メゼレイン（MEZ）およびΜφ活性化物質として
RA、LPSなどを添加し、37℃、５％炭酸ガス含
有空気中で72時間培養した。72時間後に各デイツ
シユの培養上清を収集し、3000rpmで10分間遠心
し、細胞屑を除去した上清中の細胞分化誘導物質
の活性を測定した。それぞれの培養上清につい
て、Con−Ａカラムへの吸着処理およびα−メチ
ル−ｄ−マンノシド溶液による脱着処理によつて
得られる活性画分は、分子量約50000（SDS−ポリ
アクリルアミド電気泳動法）で、PH２〜10での処
理にて失活せずに、70℃の加熱処理においても、
その活性を保持していた。

【表】 実施例 ３ ヒト急性単球性白血病細胞THP−１細胞を用
いて、細胞濃度を変えたこと以外は、実施例１と
同様にして細胞浮遊液を調製し、その10mlを10
枚の組織培養用プラスチツク製ペトリデイツシユ
に植え込み、TPAを100ng／ml、RAを1μg／ml
となるように添加し、37℃、５％炭酸ガス含有空
気中で72時間培養した。72時間後に各デイツシユ
の培養上清を収集し、3000rpmで10分間遠心し、
細胞屑を除去した上清中の細胞分化誘導物質の活
性を測定した。それぞれの培養上清について、
Con−Ａカラムへの吸着処理およびα−メチル−
ｄ−マンノシド溶液による脱着処理によつて得ら
れる活性画分は、分子量約50000（SDS−ポリアク
リルアミド電気泳動法）で、PH２〜10での処理に
て失活せずに、70℃の加熱処理においても、その
活性を失わなかつた。

【表】 実施例 ４ ヒト急性前骨髄性白血病細胞HL−60細胞を用
いること以外は、実施例２と同様に培養を行な
い、培養上清を得た。培養上清中の細胞分化誘導
物質の活性を測定したところ、119単位／mlの活
性が認められた。Con−Ａカラムへの吸着処理お
よびα−メチル−ｄ−マンノシド溶液による脱着
処理にて得られる活性画分は、その分子量約
50000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）で
あり、70℃の加熱処理においても、その活性を保
持していた。 以上詳細に説明した、本発明の細胞分化誘導物
質を医薬品製造の常套手段、例えば加熱処理、ろ
過滅菌、凍結乾燥、分注等の処理を適宜施して製
剤化することにより、従来にない新しい医薬品を
得ることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ マクロフアージ様細胞に分化しうるヒト白血
   病細胞を、分化誘導能を有する物質およびマクロ
   フアージ活性化物質の存在下に接着培養すること
   を特徴とする、下記の特性を有し、白血病細胞に
   対して細胞分化誘導活性を有するヒト由来生理活
   性物質の生産方法 ａ 分子量 50000±5000（ゲル濾過法） 50000±5000（SDS−ポリアクリルアミド電気
   泳動法） ｂ レクチンカラムへの吸着性 レンチルレクチ
   ンカラム、コンカナバリンＡカラムに吸着する ｃ 熱安定性 70℃１時間で失活しない ｄ 還元剤による影響 活性が低下する ｅ PH安定性 PH２〜10の範囲で安定である