JPH0474360B2

JPH0474360B2 -

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Publication number: JPH0474360B2
Application number: JP61276497A
Authority: JP
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1992-11-26
Also published as: JPS63130600A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は新規な生理活性物質に関するものであ
る。更に詳しくは、ヒト由来のマクロフアージ様
細胞を培養することによつて産生される、細胞分
化誘導作用を有する蛋白性のヒト由来の生理活性
物質（以下、細胞分化誘導物質と略記）に関する
ものである。本発明の化学物質は、細胞分化誘導
作用を有していることから腫瘍細胞、特に白血病
細胞を正常細胞に分化誘導させ、その増殖能を消
失させる作用を有していることから癌の治療に使
用し得るものである。［従来の技術］免疫反応をつかさどつている細胞群の中で、最
近マクロフアージ（以下Mφと略す）が注目され
るようになつてきた。Mφが、どん食作用による
抗原の処理を始めとして、生体の防御機構の中
で、中心的な役割を演じていることが、明らかに
なつてきたからである。また、細胞外からの刺激
に応じて、Mφが、インターロイキン−１、癌壊
死因子、コロニー形成刺激因子など、多種の重要
な生理活性物質を産生することが知られてきた。血液細胞は、造血幹細胞より、増殖分化を繰り
返し、成熟して機能細胞へ到達するのである。こ
の分化成熟の過程で増殖能をもち、腫よう化して
しまつたものが白血病細胞である。このような腫
よう細胞を正常な機能をもつた細胞へと分化を誘
導するのが、分化誘導能をもつた物質であり、こ
れら分化誘導能をもつた物質を用いることによ
り、新しい癌の治療方法を開発できるものとし
て、近年、注目されている。分化誘導能をもつた物質としては、安全性の高
い蛋白性の物質、特にヒト由来の蛋白性の物質が
期待を集め、近年活発に研究がなされている。現
在までに、ヒト末梢血リンパ球をレクチンで刺激
することにより、分化誘導活性が生成されること
が報告されている（ジヤーナルナシヨナルカ
ンサーインステチユート（J.National Cancer
Institute）67巻、1225頁（1981年）、カンサー
リサーチ（Cancer Research）42巻、3928頁
（1982年））。しかしながらこれらの報告において、
ヒト末梢血リンパ球から得られたものは、セフア
デツクスＧ−75（フアルマシア社、スウエーデン）
を用いたゲルろ過分画法によつて分子量25000と
40000の蛋白性物質であることが報告されている
のみであつたが、その後の研究において、公開特
許公報、昭60−28934号に示される分子量45000〜
60000または100000、等電点５〜７の物質であり、
トリプシンに感受性を示し、熱に不安定な物質で
あるとされた。一方、ヒト−Ｔ−リンパ球性白血
病細胞の培養上清中に見いだされた分化誘導活性
は、アクリルアミドゲル電気泳動法によつて、分
子量50000〜60000の蛋白性の物質に由来するもの
とされたが、単離工程中で、その活性の約60〜90
％が失われた（日本組織培養学会要旨、43頁、
（1983年））。［発明が解決しようとする問題点］このように、ヒト末梢血リンパ球およびヒト−
Ｔ−リンパ球性白血病細胞から生成される分化誘
導活性は、その活性をもたらす物質の性質はほと
んどわかつていないか、熱や蛋白質分解酵素に強
い感受性を示す不安定な物質であつた。また、これらの活性は弱く、ビタミンＡ誘導体
などが共存しないと、白血病細胞に充分な分化を
誘導することができなかつた。［問題点を解決するための手段］本発明者らは、上記先行知見を認識し、マクロ
フアージ（Mφ）系の細胞が、より安定性に優れ
た、強い細胞分化誘導作用を有する蛋白性の生理
活性物質を産生するとの作業仮説に基いて、鋭意
検討を続けてきた。その結果、ヒトのMφ前駆細
胞に作用して、単独で、Mφへと分化を誘導しう
る活性を有するヒト由来の蛋白性の細胞分化誘導
物質を見いだし、本発明を完成するに至つた。［発明の内容］すなわち、本発明は下記の特性を有する、白血
病細胞に対して細胞分化誘導作用を有するヒト由
来の蛋白性の生理活性物質を提供するものであ
る。ａ分子量 50000±5000 （ゲル濾過法） 50000±5000 （SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動法）ｂレクチンカラムへの吸着性レンチルレクチ
ンカラム、コンカナバリンＡカラムに吸着するｃ熱安定性 70℃１時間で失格しないｄ還元剤による影響活性が低下するｅ PH安定性 PH２〜10の範囲で安定である。ｆトリプシンおよびプロナーゼＥによる酵素反
応によつて分化誘導活性の低下が認められない本発明において、細胞分化誘導物質とはヒト由
来のMφ又はMφ様細胞が産生する物質であつて、
in vitroで少なくともマウスＭ−１細胞を分化さ
せ、どん食能を誘起する能力を有するものを意味
する。本発明で用いられるMφ様細胞とは、末梢血単
球、組織Mφ，Mφ前駆細胞をin vitroで分化誘導
剤の作用によりMφ様細胞に変化したものなどを
用いることができる。Mφ前駆細胞とは、分化誘
導剤の作用により始めてMφ様細胞に変化する細
胞又は本来Mφの性質の一部を有しているが、分
化誘導剤の作用により更にMφの性質を有するよ
うに変化する細胞を意味する。Mφ前駆細胞は、
白血病患者から分離した初代細胞及び株化細胞な
どから得られるが、株化細胞が大量に得やすく好
ましい。本発明で用いられる株化細胞の例として
は、HL−60細胞（ネイチヤー（Nature）、270
巻、347頁（1977年））THP−１細胞（インター
ナシヨナルジヤーナルカンサー（Int.J.
Cancer）26巻、171頁（1980年））、Mono−１−
207細胞（ウイルヒヨーズアルヒーフアー
パソロジカルアナトミーヒストパソロジー
（Virchows Arch.A Path.Anat.and Histol.）
371巻、15頁（1976年））などが挙げられる。ここ
で用いられる分化誘導剤としては、Mφ様細胞へ
変化し得るMφ前駆細胞をMφ様細胞への変化を
誘導する物質を意味し、例えば、ホルボールエス
テル類、メゼレインのようなジテルペン系化合
物、テレオシジンなどが挙げられる。ホルボール
エステル類では、4β−ヒドロキシ体が好ましく、
中でも、12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−
13−アセテート（以下、TPAと略記する）が特
に好ましい。本発明において用いられるMφ活性化物質とし
ては、ビタミンＡ誘導体（例えば、ビタミンＡ
酸、ビタミンＡアルコール、ビタミンＡアセテー
ト、ビタミンＡパルミテート）、ジメチルスルホ
キシド、酪酸ナトリウム塩、ハイドロコーチゾ
ン、グラム陰性菌由来のリポポリサツカライド
（以下LPSと略す）、リピツドＡ，BCG菌などの
菌体壁、ムラミルジペプチドなどが挙げられ、そ
れぞれ単独、あるいは適宜組み合わせて用いるこ
とにより、Mφを活性化させ、細胞分化誘導物質
の産生を促すことができる。これらMφ活性化物
質の中でも、約１〜5000ng／ml、好ましくは約
100〜3000ng／ml、より好ましくは約500〜
2000ng／mlのビタミンＡ誘導体、中でもビタミ
ンＡ酸の使用が特に好ましい。細胞分化誘導物質産生に充分な時間、ヒト由来
のMφ様細胞を培養した後、培養上清を収集し、
遠心分離により細胞屑を除去すれば、細胞分化誘
導物質を含む溶液が得られる。この細胞分化誘導
物質を含む溶液を生化学的分離操作における常
法、限外ろ過による濃縮、透析脱塩、陰イオン交
換体によるイオン交換クロマトグラフイー、ゲル
ろ過、電気泳動等を適宜組み合わせて精製するこ
とにより、高純度の細胞分化誘導物質を得ること
ができる。細胞分化誘導物質の活性の測定は、in vitroで
マウス骨髄性白血病細胞Ｍ−１細胞に、どん食能
を誘起する効果を測定することにより行なう。本
発明者らが用いている方法は、林の方法（トキシ
コロジーフオーラム、７巻、50頁、（1984年））を
改良したものである。即ち、増殖期にあるＭ−１
細胞５×10⁵cells／ml（培地：イーグルMEM
＋２培量ビタミン・アミノ酸＋10％牛胎児血清）
浮遊液に細胞分化誘導物質溶液（試験液）を混
じ、その１mlを10mlガラス管にとり、横に倒し
て、炭酸ガス培養器中で、37℃で２日間培養液、
遠心処理（1000rpm，10分間）を施し、上澄み液
を捨て、血清を含まない培養液１mlを加えて再び
細胞を懸濁し、2μ／mlの濃度のポリスチレ
ン・ラテツクス粒子（1.004μm：積水化学社製）
を加え攪はんした後、さらに４時間培養する。こ
の細胞をPBS1mlでよく洗浄、遠心し、細胞外の
ラテツクス粒子を除去する。この操作を２回繰り
返したのち、遠心管の底に沈殿した細胞をピペツ
トで吸い上げ、スライドガラス上に１滴落とす。
これに0.5％エオシン液１滴を加え、カバーガラ
スをのせ、顕微鏡で観察する。赤く染色される死
細胞を除き、生細胞のみについて、ラテツクス粒
子をどん食した細胞と非どん食細胞とを計数し、
どん食細胞の比率を求める。試験液を適宜希釈し
て、上記の測定を行ない、どん食細胞の比率が10
％になるのに必要な、細胞分化誘導物質の試料の
希釈率の逆数をもつて、本発明における細胞分化
誘導物質の活性量を１単位（Ｕ）／mlと定義す
る。以下本発明における細胞分化誘導物質の活性
量は、このどん食能測定法によつて測定した単位
で示されている。上記の細胞の培養により産生される、本発明の
細胞分化誘導物質の性質を詳しく述べる。Ａ分子量：50000±5000（ゲルろ過法）ダルベツコリン酸緩衝液（塩化カリウム0.2
ｇ／、塩化ナトリウム８ｇ／、リン酸第１カ
リウム0.2ｇ／、リン酸第２ナトリウム1.15
ｇ／、PH7.4）に0.01％ポリエチレングリコー
ルを添加した溶液にて平衡化したSuperose6＋
Superose12（フアルマシア社（スエーデン）製）
を用いるゲルろ過法により分画し、Ｍ−１細胞で
のどん食能の誘起による細胞分化誘導活性を測定
する。Ｂ分子量：50000±5000（SDS−ポリアクリルア
ミド電気泳動法） Segrestらの方法［メソツドインエンザイ
モロジー（Method in Enzymology）28−Ｂ
巻、54頁（1972年）］に従い、トリス／グリシ
ン／SDS（PH8.3）で、電気泳動を行なつた。標準
分子量キツト（フアルマシア社製）を用いて分子
量検量線を作成し、分画したゲルからの抽出物の
Ｍ−１細胞のどん食能誘起活性評価により分子量
を決定する。以上の結果より、本発明の細胞分化誘導物質は
サブ・ユニツト構造をとつていない物質であるこ
とが分かる。Ｃ等電点：6.5±1.0（等電点電気泳動法）アトー株式会社製の等電点電気泳動装置
（SJ1071EC型）を用い、フアルマライト（フアル
マシア社製、PH４〜８）とグリセロールを含む５
％ポリアクリルアミド平板ゲルを作成する。陽極
側に0.04M DL−グルタミン酸、陰極側に0.2M
Ｌ−ヒスチジンを使用して、700Vで50分間の前
泳動を行なう。続いて試料を付与し、700Vで１
時間、500Vで16時間泳動を行なう。泳動終了後
ゲルを2.5mm巾で切り出し、次いで各ゲル片を
0.15M塩化ナトリウムを含む0.02Mトリスー塩酸
緩衝液（PH8.2）0.2mlで抽出し、各抽出液につい
て、Ｍ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評価
を行なう。Ｄ熱安定性本発明の細胞分化誘導物質を0.01％ポリエチレ
ングリコールを添加したPH7.4リン酸緩衝液にて
３倍に希釈し、所定の時間、所定の温度にて加熱
した後、Ｍ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の
評価を行なう。本発明の細胞分化誘導物質は70
℃、１時間の処理において、その活性を失なず、
熱的に安定な生理活性物質である。Ｅレクチンカラムへの吸着性市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコー
ルミニカラム（バイオラツド社製）に充填し
150mMの塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩
衝液（PH7.5）で充分に洗浄後、本発明の細胞分
化誘導物質試料を添加し、同緩衝液にて洗浄す
る。次いで、各種糖類を含む溶離液で溶出を行な
う。コンカナバリン−Ａ、および、レンチルレク
チンのカラムを用いた場合に、レクチンカラムへ
の吸着が認められ、いずれのカラムにおいても
0.2Mα−メチル−ｄ−マンノシド溶液により、細
胞分化誘導活性が溶出する。Ｆジスルフイド結合の還元剤による影響ジスルフイド結合の還元剤としてジチオスレイ
トール（DTT）、又は、２−メルカプトエタノー
ル（２−ME）を、本発明になる細胞分化誘導物
質の溶液中に加え、37℃で、４時間反応させる。
反応後、Ｍ−１細胞に対するどん食能誘起活性を
測定する。50mMのジチオスレイトールを添加し
た場合に、活性が低下する。Ｇ PH安定性本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液に、
４倍量の各種PHの緩衝液を添加し、24時間、37℃
に加温した後、PHを中性にもどし、Ｍ−１細胞に
対する細胞分化誘導活性を測定する。PH２〜10の
範囲において、活性の低下は認められない。Ｈ蛋白分解酵素安定性本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液（PH
7.4）に蛋白分解酵素トリプシン、または、プロ
ナーゼ−Ｅ（200単位）を添加し、37℃にて、３時
間反応させる。反応後において、Ｍ−１細胞に対
する細胞分化誘導活性の低下は認められない。上
記実験に0.1％SDSを添加したこと以外は、同一
の条件にて、蛋白分解酵素の効果を検討すると、
0.1％SDSの添加時のプロナーゼ−Ｅにより、細
胞分化誘導活性が消失することが認められる。Ｉヒト白血病細胞に対する生理作用牛胎児血清を10％含むRPMI−1640培地にヒト
単球性白血病細胞（THP−１）、ヒト前骨髄性白
血病細胞（HL−60）を37℃、炭酸ガス培養器中
でそれぞれ培養し、増殖期にある細胞をリン酸緩
衝液でよく洗浄する。該細胞を10％牛胎児血清お
よび10nMビタミンＡ酸を添加したRPMI−1640
培地（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞれ２
×10⁵個／ml培地になるように懸濁する。細胞懸
濁液100μと細胞分化誘導物質溶液（試験液）
100μとの混合液を96穴プレートに入れ、37℃、
５％炭酸ガス混合空気の下で、３日間培養する。
0.2％ニトロブルーテトラゾリウム（NBT、シグ
マ社）の溶液（0.2μｇ／mlTPA含有培地）100μ
を加えて、更に45分間培養後、顕微鏡下で観察
する。青く沈着した色素を有する細胞がNBT還
元能陽性細胞として観察される。本発明の細胞分化誘導物質と３日間培養するこ
とにより、THP−１細胞、HL−60細胞にNBT
還元能が誘導されるのみならず、ラテツクス粒子
どん食能、培養容器壁への付着能、酵母菌殺菌
能、酸性ホスフアターゼ活性、β−グルクロニダ
ーゼ活性など、Mφの特徴として、細胞鑑定に常
用される（「マニユアルオブマクロフアージ
メソドロジー（Manual of Macrophage
Methodlogy）、マーセルデツカー社、米国、
1981年」「図解白血球、金芳堂、1982年」）各種指
標の活性の増強が認められる。なお、これまでの説明で明らかなように、本発
明になる新規生理活性物質は、Mφ前駆細胞であ
るヒトおよびマウスの骨髄性白血病細胞に作用し
て、Mφ様細胞へと分化を誘導し、Mφに特有な
各種機能の昂進をもたらし、溶液中での分子量、
すなわちゲルろ過法の分子量が50000±5000であ
り、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での
分子量も50000±5000であること、コンカナバリ
ン−Ａ、レンチルレチン等のレクチンに対して結
合性を有することから、本発明の細胞分化誘導物
質は、サブ・ユニツト構造を有しない糖蛋白質で
あると考えられる。次に本発明の細胞分化誘導物質の製造方法につ
いて詳しく述べる。本発明で使用される細胞の培養には、高等動物
細胞の培養に適した各種合成培地が用いられる。
代表的な培地としては、例えばRPMI−1640培
地、イーグルのMEM培地、ダルベツコ変法の
MEM培地、α−MEM培地、Hamの培地、199
培地、McCoy54培地、Iscoveの培地などを単独
もしくは適宜混合した培地が用いられる。これら
の培地の組成は「細胞組織培養マニユアル、講談
社、1982年」に記載されている。これらの培地に
は、アルブミン、インシユリン、トランスフエリ
ンなどの血清由来の蛋白質、ヒト血清、牛胎児血
清、牛血清、馬血清などの動物血清を単独で、あ
るいは適宜組み合わせて添加してもよい。また、
必要に応じて、微生物による汚染を防止するため
に、例えばペニシリン10〜100単位／ml培地、硫
酸ストレプトマイシン10〜100μｇ／ml培地、硫
酸カナマイシン40〜60μｇ／ml培地などの抗生物
質を添加することができる。培養液のPHの制御
や、炭酸イオン濃度の調節のために、例えば10〜
60mMのヘペス［４−（２−ハドロキシエチル）−
１−ピペラジンエタンスルホン酸］などのPH緩衝
剤を使用してもよい。培養容器の材質は特に限定
しないが、プラスチツク、ガラスあるいは金属製
のものであつて、細胞の増殖が可能であり、細胞
の接着性に優れたものが好ましい。細胞分化誘導物質を産生させるためには、適当
な培地を用いて、ヒト由来のMφ様細胞を、培養
容器面１cm²当たりに約５×10⁴〜５×10⁵個、好ま
しくは、約８×10⁴〜３×10⁵個となるように植え
込む。次いで、Mφ活性化物質を添加する。細胞
及びMφ活性化物質を含む培養容器を約35〜38
℃、好ましくは約37℃、約５〜10％炭酸ガス含有
空気中、湿度約90〜100％の条件の下で、40〜100
時間培養することにより、細胞分化誘導物質が産
生され、培養上清中に放出される。培地のPHは、
培養期間中約6.0〜7.5に維持することが好まし
い。また、Mφ前駆細胞を用いる場合には、動物
血清を含む適当な培地中にて、１〜24時間、Mφ
前駆細胞をMφ様細胞へと変化させうるTPAなど
の分化誘導剤約５〜5000nｇ／ml培地、好ましく
は約50〜1000nｇ／ml培地で処理することによ
り、Mφ様細胞へ変化させた後、分化誘導剤を洗
浄除去し、得られるMφ様細胞を使用し、上記の
ごとく培養することにより、細胞分化誘導物質を
取得する。次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものでな
いことは言うまでもない。なお以下の記載におい
て、「％」は特に記載しない限り容量パーセント
（Ｖ／Ｖ％）を表わす。また特に記載がない限り、
培養は37℃、湿度90〜100％、５％炭酸ガス含有
空気中で行なつた。実施例１ヒト急性単球性白血病細胞THP−１細胞を、
10％の牛胎児血清、50単位／mlのペニシリン及び
50μｇ／mlのストレプトマイシンを含有する
RPMI−1640培地にて、細胞密度６×10⁵個／ml
となるように、細胞浮遊液を調製し、その10mlを
100枚の組織培養用プラスチツク製ペトリデイツ
シユ（直径８cm）に植え込み、分化誘導剤とし
て、12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−
アセテート（TPA）を1μｇ／mlとなるように添
加し、37℃、５％炭酸ガス含有空気中で24時間培
養した。その後、培養液を除去し、TPAを含ま
ずMφ活性化物質としてビタミンＡ酸（RA）を
1μｇ／ml含む血清不含の新鮮RPMI−1640培地
（ペニシリン、ストレプトマイシンを含む）10ml
と置き換え、さらに培養を続けた。72時間後に各
デイツシユの培養上清を収集し、3000rpmで10分
間遠心し細胞屑を除去した後、上清中の細胞分化
誘導物質の活性を測定した。即ち、増殖期にある
Ｍ−１細胞５×10⁵cells／ml（培地：イーグル
MEM＋２培量ビタミン・アミノ酸＋10％牛胎児
血清）浮遊液に得られた培養液を混じ、その１ml
を10mlガラス管にとり横に倒して、炭酸ガス培養
器中で37℃で２日間培養後、遠心処理
（1000rpm，10分間）を施し、上澄み液を捨て血
清を含まない培養液１mlを加えて再び細胞を懸濁
し、2μ／mlの濃度のポリスチレン・ラテツク
ス粒子（1.004μm：積水化学社製）を加え攪はん
した後、さらに４時間培養する。この細胞を
PBS1mlでよく洗浄し、遠心し、細胞外のラテツ
クス粒子を除去する。この操作を２回繰り返した
のち、遠心管の底に沈殿した細胞をピペツトで吸
い上げ、スライドガラス上に１滴落とす。これに
0.5％エオシン液１滴を加え、カバーガラスをの
せ、顕微鏡で観察する。赤く染色される死細胞を
除き、生細胞のみについて、ラテツクス粒子をど
ん食した細胞と非どん食細胞とを計数し、どん食
細胞の比率を求める。培養液を適宜希釈して、上
記の測定を行ない、どん食細胞の比率が10％にな
るのに必要な、培養液の希釈率の逆数をもつて、
１単位（Ｕ）／mlと定義される本発明の細胞分化
誘導物質の活性量は、得られた培養液において、
77単位／mlであつた。得られた培養液のレクチンにたいする吸着性を
検討した。市販の各種レクチン固定化樹脂を市販
セパコールミニカラム（バイオラツド社製）に充
填し150mMの塩化ナトリウムを含む50mMリン
酸緩衝液（PH7.5）で充分に洗浄後、培養液試料
を添加し、同緩衝液にて洗浄し、次いで、各種糖
類を含む溶離液で溶出を行なつた。コンカナバリ
ン−Ａ（Con−Ａ）、および、レンチルレクチンの
カラムを用いた場合に、レクチンカラムへの吸着
が認められ、いずれのカラムにおいても0.2Mα−
メチル−ｄ−マンノシド溶液により、細胞分化誘
導活性が溶出した。 Con−Ａカラムに吸着、溶出した細胞分化誘導
活性について、分子量、等電点の測定を行なつ
た。分子量測定のため、該細胞分化誘導物質の活
性画分を、ダルベツコ、リン酸緩衝液（塩化カリ
ウム0.2ｇ／、塩化ナトリウム８ｇ／、リン
酸第１カリウム0.2ｇ／、リン酸第２ナトリウ
ム1.15ｇ／、PH7.4）に0.01％ポリエチレングリ
コールを添加した溶液にて平衡化したSuperose6
＋Superose12（フアルマシア社製）を用いるゲル
ろ過法により分画し、Ｍ−１細胞でのどん食能の
誘起による細胞分化誘導活性を測定したところ、
分子量50000±5000の画分に細胞分化誘導物質の
活性が認められた。 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
子量測定のため、トリス／グリシン／SDS（PH
8.3）で、電気泳動を行なつた。標準分子量キツ
ト（フアルマシア社製）を用いて分子量検量線を
作成し、分画したゲルからの抽出物のＭ−１細胞
のどん食誘起活性評価により分子量を決定したこ
とろ、分子量50000±5000の画分に細胞分化誘導
物質の活性が認められた。等電点測定のために、等電点電気泳動法を以下
の方法によつて行なつた。即ち、アトー株式会社
製の等電点電気泳動装置（SJ1071EC型）を用い、
フアルマライト（フアルマシア社製、PH４〜８）
とグリセロールを含む５％ポリアクリルアミド平
板ゲルを作成した。陽極側に0.04M DL−グルタ
ミン酸、陰極側に0.2M Ｌ−ヒスチジンを使用し
て、700Vで50分間の前泳動を行なつた。続いて
試料を付与し、700Vで１時間、500Vで16時間泳
動を行なつた。泳動終了後ゲルを2.5mm巾で切り
出し、次いで各ゲル片を0.15M塩化ナトリウムを
含む0.02Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.2）0.2mlで
抽出し、各抽出液について、Ｍ−１細胞を用いた
細胞分化誘導活性の評価を行なつたところ、等電
点はPH：6.5±1.0であつた。次に示す方法によ
り、細胞分化誘導物質の熱安定性を検討した。培
養液に、0.01％ポリエチレングリコールを添加し
たPH7.4リン酸緩衝液にて３倍に希釈し、所定の
時間、所定の温度にて加熱した後、Ｍ−１細胞を
用いた細胞分化誘導活性の評価を行なつた。

【表】ジスルフイド結合の還元剤による影響を検討す
るために、ジチオスレイトール（DTT）、又は、
２−メルカプトエタノール（２−ME）を、培養
液中に加え、37℃で、４時間反応させた。反応
後、Ｍ−１細胞に対するどん食能誘起活性を測定
した。

【表】 PH安定性を次に示す。細胞分化誘導物質を含む
培養液に、４倍量のPH２，４，7.3，９，10の各
種緩衝液を添加し、24時間、37℃に加温した後、
PHを中性にもどし、Ｍ−１細胞に対する細胞分化
誘導活性を測定した。PH２〜10の範囲のいずれに
おいても活性の低下は認められなかつた。つい
で、蛋白分解酵素に対する安定性を検討した。細
胞分化誘導物質を含む培養液に蛋白分解酵素トリ
プシン、または、ブロナーゼ−Ｅ（200単位）を添
加し、37℃にて、３時間反応させた。反応後、Ｍ
−１細胞に対する細胞分化誘導活性を測定した
が、いずれの条件においても、活性の低下は認め
られなかつた。上記実験に0.1％SDSを添加した
こと以外は、同一の条件にて、蛋白分解酵素の効
果を検討したところ、0.1％SDSの添加時のプロ
ナーゼ−Ｅにより、細胞分化誘導活性が完全に消
失した。さらに、ヒト白血病細胞に対する生理作用を確
認すべく、牛胎児血清を10％含むRPMI−1640培
地にヒト単球性白血病細胞（THP−１）、ヒト前
骨髄性白血病細胞（HL−60）を37℃、炭酸ガス
培養器中でそれぞれ培養し、増殖期にある細胞を
リン酸緩衝液でよく洗浄した後、10％牛胎児血清
および10nMビタミンＡ酸を添加したRPMI−
1640培地（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞ
れ２×10⁵個／ml培地になるように懸濁した。細
胞懸濁液100μと培養液100μとの混合液を96
穴プレートに入れ、37℃、５％炭酸ガス混合空気
の下で、３日間培養した。0.2％ニトロブルーテ
トラゾリウム（NBT、シグマ社）の溶液（0.2μ
ｇ／mlTPA含有培地）100μを加えて、更に45
分間培養下後、顕微鏡下で観察した。青く沈着し
た色素を有するNBT還元能陽性細胞が、THP−
１細胞において29％、HL−60細胞において21％
に観察された。実施例２ヒト急性単球性白血病細胞THP−１細胞を、
10％の牛胎児血清、50単位／mlのペニシリン及び
50μｇ／mlのストレプトマイシンを含有する
RPMI−1640培地にて、細胞密度６×10⁵個／ml
となるように、細胞浮遊液を調製し、その10mlを
１枚の組織培養用プラスチツク製ペトリデイツシ
ユに植え込み、TPAを100nｇ／mlとなるように
添加し、37℃、５％炭酸ガス含有空気中で24時間
培養した。その後で、培養液を除去し、TPAを
含まず、下表に示すMφ活性化物質（ビタミンＡ
酸（RA）、LPS、サクシニル化ConA（Ｓ−
ConA））を含む血清不含の新鮮RPMI−1640培地
（ペニシリン、ストレプトマイシンを含む）10ml
と置き換え、さらに培養を続けた。72時間に各デ
イツシユの培養上清を収集し、3000rpmで10分間
遠心した後、上清中の細胞分化誘導物質の活性を
測定した。細胞分化誘導物質の活性が20単位／ml
以上であつた培養上清について、Con−Ａカラム
への吸着処理およびα−メチル−ｄ−マンノシド
溶液による脱着処理により得られる活性画分は、
分子量50000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動
法）で、PH２〜10での処理により失活せずに、70
℃の加熱処理においても、その活性を保持してい
た。

【表】実施例３ヒト急性前骨髄性白血病細胞HL−60細胞を用
い、Mφ用細胞への分化誘導剤として、表−４に
示す、12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13
−アセテート（TPA）、ホルボール−12，13−ジ
デカノエート（PDD）、メゼレイン（MEZ）、
Mφ活性化物質として、1μｇ／mlのビタミンＡ酸
を用いること以外は、実施例２と同様に培養を行
ない、培養上清を得た。培養上清中の細胞分化誘導物質の活性を測定
し、その活性が認められる培養上清について以下
の検討を行なつた。Con−Ａカラムへの吸着およ
びα−メチル−ｄ−マンノイド溶液による脱着処
理により得られる活性画分は、その分子量は約
50000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法）で
あり、70℃での加熱処理においても、その活性を
失わなかつた。

【表】実施例４ヘパリン1000単位を添加した健常人末梢血20ml
を２倍に希釈し、Ficoll Hipaque液（フアルマ
シア社）に上層し、800rpmにて、30分間、比重
遠心を行ない、中間層より、単核球を採取した。
該単核球を４℃に冷却した10％牛胎児血清含有
RPMI−1640培地で一晩前処理した組織培養用ペ
トリデイツシユ（直径８cm）10枚に植えつけた。該デイツシユを、37℃、５％炭酸ガス含有空気
中で３時間培養した。無血清RPMI−1640培地に
て、洗浄し、非付着性細胞を除去した。デイツシ
ユ１枚当たり平均５×10⁶個（１×10⁵個／cm²）
の細胞が得られた。得られた細胞の、90％以上が
単球であつた。該デイツシユを、最終濃度として、ビタミンＡ
酸1μｇ／ml、LPS1μｇ／mlを添加した無血清
RPMI−1640培地（ビタミン・アミノ酸強化）15
mlにて置換し、37℃、５％炭酸ガス含有空気中
で、３日間培養した。３日後、培養液を回収し、3000rpmにて遠心処
理して、細胞屑を除く。得られた培養液を、マウ
スＭ−１細胞のどん食能誘起活性を測定したとこ
ろ、44単位／mlであつた。以上詳細に説明した、本発明の細胞分化誘導物
質を医薬品製造の常套手段、例えば加熱処理、ろ
過滅菌、凍結乾燥、分注等の処理を適宜施して製
剤化することにより、従来にない新しい医薬品を
得ることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の特性を有する、白血病細胞に対して細
胞分化誘導作用を有するヒト由来の蛋白性の生理
活性物質。ａ分子量 50000±5000 （ゲル濾過法） 50000±5000 （SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動法）ｂレクチンカラムへの吸着性レンチルレクチ
ンカラム、コンカナバリンＡカラムに吸着す
る。ｃ熱安定性 70℃１時間で失活しない。ｄ還元剤による影響活性が低下する。ｅ PH安定性 PH２〜10の範囲で安定である。ｆトリプシンおよびプロナーゼＥによる酵素反
応によつて分化誘導活性の低下が認められな
い。