JPS63129993A - ヒト由来生理活性物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規な生理活性物質の製造方法に間するもので
ある。更に詳しくは、ヒト由来の白血病＊ｍを培養する
ことによって産生される、細胞分化誘導作用を有する蛋
白性のヒト由来生理活性物質（以下、細胞分化誘導物質
と略記）の製造方法に関するものである。

［従来の技術］ 免疫反応をつかさどっている細胞群の中で、最近マクロ
ファージ（以下Ｍφと略す）が注目されるようになって
きた。Ｍφが、どん食作用による抗原の処理を始めとし
て、生体の防御機構の中で、・Ｉ返し、成熟して機能細
胞へ到達するのである。こ）・ °、の分化成熟の過程で増殖能をもち、腫よう化してし
まったものが白血病細胞である。このような腫よう細胞
を正常な機能をもった細胞へと分化を誘導するのが、分
化誘導能をもった物質であり、これら分化誘導能をもっ
た物質を用いることにより、新しい癌の治療方法を開発
できるものとして、近年、注目されている。

分化誘導能をもった物質としては、安全性の高い蛋白性
の物質、特にヒト由来の蛋白性の物質が１ＩＩＮ待を集
め、近年活発に研究がなされている。現在までに、ヒト
末梢血リンパ球をレクチンで刺激することにより、分化
誘導活性が生成されることが報告されている（ジャーナ
ル　ナショナル　カンサー　インステチュート（，１，
Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）
　６７巻、１２２５頁（１９８１年）、カンサーリサー
チ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　４２巻、　３
！３２８頁（１９８２年））。しかしながらこれらの報
告において、ヒ４ｏ、ｏｏｏの蛋白性物質であることが
報告されているのみであったが、その後の研究において
、公開特許公報、昭６０　２８９３４号に示される分子
量４５．０００〜６０　、０００または１００，０００
　、等電点５〜７の物質てあり、トリプシンに感受性を
示し、熱に不安定な物質であるとされた。一方、ヒ）−
Ｔ−リンパ球性白血病細胞の培養上清中に見いだされた
分化誘導活性は、アクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て、分子！５０．０００〜６０，０００の蛋白性の物質
に由来するものとされたが、単離工程中で、その活性の
約６０〜９０％が失われた（日本ＭＪ織培百学会要旨、
４３頁、（１９８３年））。

［発明が解決しようとする問題点］ このように、ヒト末梢血リンパ球およびヒト−丁−リン
パ球性白血病細胞から生成される分化誘導活性は、その
活性をもたらす物質の性質はほとんどわかっていないか
、熱や蛋白質分解酵素に強い感受性を示す不安定な物質
であると共に、これらの物質の活性は弱く、ビタミンＡ
誘導体などが共存しないと、白血病細胞に充分な分化を
誘導することができなかった。

また、ヒト末梢血リンパ球はヒトの血液から採取される
血球を分画して調製されるため、大量に取得することは
困難であり、工業的生産は容易ではなかった。またヒト
−ニーリンパ性白血病細胞は、ヒトのＴ細胞白血病ウィ
ルスに維持感染することによって、増殖性を獲得したも
のであり、大量の細胞培養は安全性の点て問題が多かっ
た。

［問題点を解決するための手段］ 木発明者らは、」二記先行知見を認識し、マクロファー
ジ（Ｎ・１φ）系の細胞が、より安定性に優れた、強い
細胞分化誘導作用を有する蛋白性の生理活性物質を産生
ずるとの作業仮説に基いて、鋭意検討を続け、ヒトのＮ
１φ前駆細胞に作用して、単独で、Ｍφへと分化を誘導
しろる活性を有するヒト由来の蛋白性の細胞分化誘導物
質を見いだし、発明を完成し、特許出願を行なった。し
かしながら、先願てはＭφ前駆細胞である白血病細胞を
使用する場合においても、Ｍφ前駆細胞を分化誘導能を
有する物質（以下、分化誘導剤と略す）Ｍφ様細胞へ変
化させた後、分化誘導剤を洗浄、除去するために、大変
手間取り、大量の細胞を処理することがむずかしかった
。そこで、細胞分化誘導物質を天竜かつ容易に取得する
ための手段について、検討をかさね、Ｍφ様細胞に分化
しうるヒト白血病細胞を用い、分化誘導能を有する物質
およびＭφ活性化物質の存在下に培養することにより、
安全に大量の細胞を取り扱うことができ、かつ細胞分化
誘導物質を大量に取得できることを見いだし本発明を完
成した。

［発明の内容］ すなわち、本発明はマクロファージ様細胞に分化しろる
ヒト白血病細胞を分化誘導能を有する物質およびマクロ
ファージ活性化物質の存在下に培養することによる、下
記の特性を有し、ａ）分子ｊ！ｌ　　５０．０００±５
，０００（ゲルろ過性）５０．０００±５．０００　（
Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動法） ｂ）等電点　６．５±１．０（等電点電気泳動法）Ｃ）
熱安定性　７０’Ｃにて失活しない白血病細胞に対して
細胞分化誘導活性を有するヒト由来生理活性物質の生産
方法に関する。

本発明において、細胞分化誘導物質とはヒ！・由来のＭ
φ様細胞が産生ずる物質であってｉｎ　ｖｉｔｒ。

で少なくともマウスＭ−１ｍ胞を分化させ、どん本発明
で用いられるＭφ様細胞に分化しうるヒト白血病細胞と
は、Ｍφ前駆細胞に相当し、分化誘導剤の作用により始
めてＭφ様細胞に変化する細胞又は本来Ｍφの性質の一
部を有しているが、分化誘導剤の作用により更にＭφの
性質を有するように変化する細胞を意味する。Ｍφ前駆
細胞としては、白血病患者から分離した初代細胞及び株
化細胞などから得られるが、株化細胞が大量に得やすく
好ましい。本発明で用いられる、白血病細胞の株（ヒ細
胞の例としては、ＨＬ−６０細胞（ネイチャー　　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、２７０巻、３４７頁（１９７７年））、
Ｔ　ＨＰ−１胞（インターナショナル　ジャーナルカン
サー（Ｉｎｔ、　、１．　Ｃａｎｃｅｒ）　２６巻、１
７！頁（１９８０年）　）　、Ｍｏｎｏ−１−２０７＊
胞（ウィルヒョーズ　アルヒーフ　ァー　バソロジカル
　アナトミー　ヒスドパソロジー（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　
Ａｒｃｈ、　Ａ　　Ｐａｔｈ、　Ａｎａｔ。

ａｎｒｌ　　Ｉｌｉ個、ｏｌ、　３７１巻、１５頁（１
９７６年））などが挙げられる。ここで用いられる分化
誘導剤としてはＮ１φ様細胞へ変化し得る白血病細胞の
Ｍφ様細胞への変化を誘導する物質を意味し、例えば、
ホ好ましく、中でも、１２−０−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（以下、ＴＰＡと略記する）
が特に好ましい。

本発明において用いられるＭφ活性化物７１としては、
ビタミンＡ誘導体（例えば、ビタミンＡ酸、ビタミンＡ
アルコール、ビタミンＡアセテート、ビタミンＡパルミ
テート）、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム塩、
ハイドロコーチシン、ダラム陰性菌由来のりボボリサッ
力ライト（以下ＬＰＳと略す）、リビッドＡ、ＢＣＧＷ
なとの菌体壁、ムラミルジペプチドなどが挙げられ、そ
れぞれ単独、あるいは適宜組み合わせて用いることによ
り、Ｍφを活性化させ、細胞分化誘導物質の産生を促す
ことができる。これらＭφ活性化物質の中でも、約１〜
５０００ｎｇ／ｍｌ　、好ましくは約１００〜３０００
ｎｇ／ｍｌ　、より好ましくは約５００〜２０００ｎｇ
／ｍ　ＩのビタミンＡ誘導体、中でもビタミンＡ酸の使
用が特に好ましい。

細胞分化誘導物質産生に充分な時間、ヒト由来の白面病
細胞を培養した後、培養上清を収集し、遠心分離により
細胞層を除去すれば、細胞分化誘導物質動等を適宜組み
合わせて精製することにより、高純度の細胞分化誘導物
質を得ることができろ。

細胞分化誘導物質の活性の測定は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで
マウス骨髄性白血病細胞Ｍ−１細胞に、どん食能を誘起
する効果を測定することにより行なった。本発明者らが
用いている方法は、林の方法（トキシコロジーフォーラ
ム、７巻、５０頁、（１９８４年））を改良したもので
ある。即ち、増Ｍ門にあるＮ１−１細胞５ＸＩＯ５ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌ　（培地：イーグルＭＥＭ＋２培量ビタミ
ン・アミノ酸＋１０％牛脂児血清）浮遊液に細胞分化誘
導物質溶液（試験液）を混し、その１ｍｌを１０ｍｌガ
ラス管にとり、横に倒して、炭酸ガス培養器中で、３７
℃で２日間培養後、遠心処理（＋０００　ｒｐｍ、　１
０分間）を施し、上澄ミ液ヲ捨て、血清を含まない培養
液１ｍｌを加えて再び細胞を懸濁し、２μｍ／ｍ１の濃
度のポリスチレン・ラテックス粒子（１，００４μｍ：
積水化学社製）を加λ攪はんした後、さらに４時間培養
する。この細、スをのせ、顕微鏡で観察する。赤く染色
されろ死、！ｓ鞄を除き、生細胞のみについて、ラテッ
クス粒１子をとん食した細胞と非どん食細胞とを計数し
、どん食細胞の比率を求めろ。試験液を適宜希釈して、
上記の測定を行ない、どん食細胞の比率が１０％になる
のに必要な、細胞分化誘導物質の試料の希釈尤の逆数を
もって、本発明における細胞分化誘導物質の活性量を　
１単侍（Ｕ）／ｉｔ　と定義する。

以下本発明における細胞分化誘導物質の活性量は、この
とん食能測定法によって測定した単位で示されている。

上記の弧胞の培養により産生きれる、本発明の細胞分化
誘導物質の性質を詳しく述べる。

Ａ）分子量　：　５０．０００±５．０００（ゲルろ違
法）ダルヘラコリン酸緩衡液（塩化カリウム０．２ｇ／
ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／１．リン酸第１カリウム０．
２ｙ、／１．リン酸第２ナトリウム１．１５ｇ／１．　
ｐ　Ｈ７，４）に０．０１χポリエチレングリコールを
添加した溶液にて平衡化した５ｕｐｅｒｏｓｅ　６　＋
　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　（ファル５ｅ２ｒｅｓｔら
の方法［メソッド　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ）　２８−８巻、５
４頁（１９７２年）コに従い、トリス／グリシン／５Ｄ
ｓ（ｐＨ８，３）で、電気泳動を行なった。標Ｌｔ分子
量キット（ファルマシア社製）を用いて分子量検量線を
作成し、分画したゲルからの抽出物のＭ−１細胞のとん
食能誘起活性評価により分子量を決定する。

以上の結果より、本発明の細胞分化誘導物質はサブ・ユ
ニット構造をとっていない物質であることが分かる。

Ｃ）等電点：６．５±１．０（等電点電気泳動法）アト
−株式会社製の等電点電気泳動装置（ＳＪ１０７ＩＥｃ
型）を用い、ファルマライト（ファルマシア社製、ｐＨ
４〜８）とグリセロールを含む５％ポリアクリルアミド
平板ゲルを作成する。陽極側に０．０４　Ｍ　　ＤＬ−
グルタミン酸、陰極側に０．２Ｍ　Ｌ−ヒスチジンを使
用して、７００ｖで５０分間の前泳動を行なう。続いて
試料を付与し、７００ｖで１時間、５００■で１６時間
泳動を行なう。泳動終了後ゲルを２．５　ｍｍ巾で切り
出し、次いて各ゲル片を０．１５　Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．０２　Ｍ　）リス−塩１１を衝ｉｎ　（ｐＨ８
，２）　０．２　ｍｌで抽出し、各抽出液について、Ｍ
−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評価を行なう。

Ｄ）熱安定性 本発明の細胞分化誘導物質を０．０１χポリエチレング
リコールを添加したｐＨ７，４リン酸緩衝液にて３倍に
希釈し、所定の時間、所定の温度にて加熱した後、Ｍ−
１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評１１１ｉを行なう
。本発明の細胞分化誘導物質は、７０℃、１時間の熱処
理において、その活性を失わない、熱的に安定な生理活
性物質である。

Ｅ）レクチンカラムへの吸着性 市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコールミニカ
ラム（バイオラット社製）に充填し１５０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
で充分に洗浄後、本発明の細胞分化誘導物質試料を添加
し、同緩衝液にて洗浄し、次いて、各種糖類を含む溶離
ｌαで溶出を行なう。

コンカナバリン−Ａ、および、レンチルレクチンのカラ
ムを用いた場合に、レクチンカラムへの吸着が認められ
、いずれのカラムにおいても０．２Ｍα−メチル−ｄ−
マンノシド溶液により、細胞分化誘導活性が溶出する。

Ｆ）ジスルフィド結合の還元剤による影響ジスルフィド
結合の還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、
又は、２−メルカプトエタノール（２−Ｍ　Ｅ　）を、
本発明になる細胞分化誘導物質の溶液中に加え、３７℃
で、４時間反応させる。

反応後、Ｍ−１細胞に対するとん食能誘起活性を測定す
る。５０　ｍＭのジチオスレイトールを添加した場合に
、その活性の低下が認められる。

Ｇ）ｐＨ安定性 本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液に、４倍量の
各種ｐＨの纏衝液を添加し、２４時間、３７℃に加温し
た後、ｐＨを中性にもどし、Ｍ−１細胞に対する細胞分
化誘導活性を測定する。ｐＨ２〜１０の範囲において、
活性の低下は認められない。

■）蛋白分解酵素安定性 ゛る細胞分化誘導活性の低下は認められない。上記実験
に０．１％ＳＤＳを添加したこと以外は、同一の条件に
て蛋白分解酵素の効果を検討したところ、０．１％ＳＤ
Ｓの添加時のプロナーゼ−Ｅにより、細胞分化誘導活性
が消失ずろことが認められろ。

１）ヒト白血病細胞に対する生理作用 牛胎児血清を１０％含むＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地に
ヒト単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）、ヒト前骨髄性白
血病細胞（ＨＬ−６０）を３７°Ｃ５炭酸ガス培養器中
でそれぞれ培養し、増殖間にある細胞をリン酸緩衝液で
よく洗浄した後５％生胎児血清および　１０　ｎＭヒタ
ミンＡｍを添加したＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　−１１３４０培地
くヒタミン、アミノ酸強化）に、それぞれ２Ｘ１０５個
／　ｍｌ培地になるように懸濁する。細胞懸濁？αｌＯ
Ｏμｍと細胞分化誘導物質溶液（試験液）１００１１１
との混合液を９６穴プレートに入れ、３７℃、５％炭炭
酸ガス台空気の下で、３日間培養する。

０．２％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＥＴ、シグマ
社）の溶液（０，２μｇ／ｍ１ＴＰＡ含有培地に溶かし
たｍｅ）ＩＯ０７ｚｌを加えて、さらに４５分間、−、
とにより、Ｔ　ＨＰ−１細胞、ＨＬ−６０細胞にＮＢＴ
゛還元能が誘導されるのみならず、ラテックス粒子どん
食油、培養容器壁への付着能、酵母菌殺菌能、ｉ性ホス
ファターゼ活性、β−グルクロニダーセ活性など、Ｍφ
の特徴として、細胞鑑定に常用される（「マニュアル　
オブ　マクロファージ　メソドロジー（Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｍａｃｒｏｐｈａ、ｇｅ　Ｍｅ↑、ｈｏｄｏｌｏ
ｇｙ）、マーセル　デツカ−社、米国、１９８１年」　
「図解白血球、金芳堂、１９８２年」）各種指標の活性
の増強が認められる。

なお、これまでの説明で明らかなように、本発明になる
新規生理活性物質は、Ｍφ前駆細胞であるヒトおよびマ
ウスの骨髄性白血病細胞に作用して、Ｍφ様細胞へと分
化を誘導し、Ｍφに特有な各種機能の赤道をもたらし、
溶液中での分子量、すなわちゲルろ適時の分子量が５０
．０００±５，０００てあり、５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動ての分子量も５０．０００±５，００
０であること、コンカナバリン−へ、レンチルレチン等
のレクチンに対して結合性を有することから、本発明の
細胞本発明で使用される細胞の培養には、高等動物細胞
の培養に適した各種合成培地が用いられる。

代表的な培地としては、例えばＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０
培地、イーグルのＭＥＭ培地、ダルベツコ変法のＭＥＭ
培地、ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地、）Ｊａｍの培地、１９９
培地、　ＭｃＣｏｙ　５Ａ培地、Ｉ　５ｃｏｖｅの培地
などを単独もしくは適宜混合した培地が用いられる。こ
れらの培地の組成は「細胞、Ｉ織培養マニュアル、講談
社、１９８２年」に記載されている。これらの培地には
、アルブミン、インシュリン、トランスフェリンなとの
血清由来の蛋白質、ヒト血清、牛胎児血清、牛血清、馬
血清などの動物血清を単独で、あるいは適宜組み合わせ
て添加してもよい。また必要に応じて、微生物による汚
染を防止するために、例えばペニシリン１０−１００単
位／ｍ１１ｇ１ｔ！！、硫酸ストレプトマイシン１０〜
１００μｇ／ｍｌ培地、硫酸カナマイシン４０〜６０Ｉ
１ｇ／ｍｌ培地などの抗生物質を添加することができろ
。培養液のｐＨの制ｉ、ＴＩＩや、炭酸イオン濃度の：
Ａ節のために、例えは１０〜６０ｍＭのヘペス［４−（
２−ハドロキシエチル）−１−ビベラ優れたものが好ま
しい。

細胞分化誘導物質を産生さ仕るためには、適当な培地を
用いて、ヒト白血病細胞を、培地１　ｍｌ当たりに約ｌ
ＸＩＯ３〜４　Ｘ　ｌ　０６個、好ましくは、約４×１
０５〜２ＸＩ０６個となるように懸濁し、培養容器へ１
＋Ｗえ込む。次いて、分化誘導能を有する物質（分化誘
導剤）およびＭφ活性１ヒ物質を添加する。細胞、分化
誘導剤及びＭφ活性化ｖＩＪ質を含む培養容器を約３５
〜３８°（：、好ましくは約３７℃、約５〜ｌＯ％炭酸
ガス含有空気中、温度約９０〜１００％の条件の下で、
４０〜１００時間培養することにより、細胞分化誘導物
質が産生され、培養上清中に放出される。

培地のｐＨは、培養間間中約６．０〜７．５に維持ずろ
ことが好ましい。

次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するか
、本発明はこれらに限定されるものでないことは言うま
でもない。なお以下の記載において、「％」は特に記載
しない限り容量パーセント（Ｖ／Ｖ％）を表わす。また
特に記載がない限り、培養は３７°Ｃ，湿度９０〜１０
０％、５％炭酸ガス含有空気中で１〒なった。

実施例１ ヒト急性単球性白血病細胞Ｔ　ＨＰ−１細胞を１．５０
単位／ｍｌのペニシリンおよび５０７１ｇ／ｍｌのスト
レプトマイシンを含有し、血清を含まないＲＰ　Ｍ　１
１６４０培地にて、細胞密度６ｘｌｏ５個／ｍｌとなる
ように、細胞浮遊液を調製し、その１０　ｍｌを１００
枚の鞘織培青用プラスチック製ペトリディッシュに植え
込み、分化誘導剤として、１２−０−テトラデカノイル
ホルボール−１３−ア七チー）（ＴＰＡ）、Ｍφ活性化
物質としてビタミンＡ酸（ＲＡ）をそれぞれ！７ｚｇ／
ｍｌとなるように添加し、３７℃、５％炭酸ガス含有空
気中で７２時間培養した。７２時間後に各ディツシュの
ｔｑｉ上清を収集し、３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し
、細胞層を除去した後、上清中の細胞分化誘導物質の活
性を測定した。即ち、ｉｖ殖期にあるＭ−１胞５Ｘ１０
”ｃｅ！Ｉｓ／ｍｌ　（培地：イーグルＭＥＭ＋２培量
ビタミン・アミノ酸＋１０％牛脂児血清）浮遊液に得ら
れた培養液を混し・、その１ｍ１を１０ｍ１ガラス管に
とり、横に倒して、炭酸ガス培養器中で、３７℃で２日
間培養後、遠心処理（１０００ｒｐｍ、　１０分間）を
施し、上澄み液を捨て、血清を含まない培養液１ｍｌを
加えて再び細胞を懸濁し、２μＩ／ｍｌの濃度のポリス
チレン・ラテックス粒子（１，ｏ０４ｚｚｍ　：積木化
学社製）を加え攪はんした後、さらに４時間培養する。

この細胞をＰＢＳｌｍｌでよく洗浄、遠心し、細胞外の
ラテッ・クス粒子を除去する。この操作を２回繰り返し
たのち、遠心管の底に沈殿した細胞をピペットで吸い」
二げ、スライドガラス上に１部落とす。これに　１０．
５％エオシン液１　’Ｉｌｔを加え、カバーガラスをの
せ、顕微鏡で観察する。赤く染色される死細胞を　　１
除き、生細胞のみについて、ラテックス粒子をど　′ん
食した細胞と非どん食細胞とを計数し、どん食細胞の比
率を求める。培Ｒｍを適宜希釈して、上記の測定を行な
い、どん食細胞の比率す月０％になるのに必要な、培養
液の希釈率の逆数をもって、１単位（Ｕ）／ｍｌ　と定
義される本発明の細胞分化誘導物質の活性型は、得られ
た培養液において、１３８単位／ｍｌであった。

得られた培養液のレクチンにたいする吸着性を検討した
。市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコールミニ
カラム（バイオラット社製）に充填し　１５０　ＴＯＭ
の塩化ナトリウムを含む５０　ｍＭリンλンのカラムを
用いた場合に、レクチンカラムへの吸着が認められ、い
ずれのカラムにおいても０．２Ｍ誘導活性が溶出した。

Ｃｏｎ−Ａカラムに吸着、溶出した細胞分化誘導活性に
ついて、分子量、等電点の測定を行なった。

分子量測定のため、該細胞分化誘導物質の活性画分を、
ダルベツコ　リン酸緩衝液（塩化カリウム０．２ｇ／Ｉ
、塩化ナトリウム８ｇ／　ｌ　、リン酸第１カリウム０
．２ｇ／１．リン酸第２ナトリウム１．１５ｇ／１．　
　ｐＨ７，４）にｏ、ｏｔｘポリエチレングリコールを
添加した溶液にて平衡化した５ｕｐｅｒｏｓｅ　６　＋
　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２（ファルマシア社製）を用い
るゲルろ過法により分画し、Ｍ−１細胞でのどん食油の
誘起による細胞分化誘導活性を測定したところ、分子：
１５０，０００±５，０００の両分に細胞分化誘導物質
の活性が認められた。

５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子型測
定のため、トリス／グリシン／５ＤＳ（ｐ）Ｉ　８．３
）で、電気泳動を行なった。標準分子量−分化誘導物質
の活性が認められた。

等電点測定のために、等電点電気泳動法を以下の方法に
よって行なった。即ち、アト−株式会社製の等電点電気
泳動装置（Ｓ　、Ｊ　Ｉ０？ＩＥＣ型）を用い、ファル
マライト（ファルマシア社製、ｐＨ４〜８）とグリセロ
ールを含む５％ポリアクリルアミド平板ゲルを作成した
。陽極側に０．０４Ｍ　ＤＬ−グルタミン酸、陰極側に
０．２Ｍ　Ｌ−ヒスチジンを使用して、７００■て５０
分間の前泳動を行なった。続いて試！４を付与し、７０
０ｖて１時間、５００　Ｖ　１１６時間泳動を行なった
。泳動終了後ゲルを２．５　ｍｍ巾で切り出し、次いて
各ゲル片を０．１５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
　Ｍ　＋−リス−塩酸緩衝１夜（ｐＨ８，２’）０．２
　ｍｌで抽出し、各抽出液について、Ｍ−１細胞を用い
た細胞分化誘導活性の評価を行なったところ、等電点は
ｐＨ：６．５±１．０であった。

次に示す方法により、細胞分化誘導物質の熱安定性を検
討した。培養液に、０，０１χポリエチレングリコール
を添加したｐＨ７，４リン酸緩衝液にて３倍に希釈し、
所定の時間、所定の温度にて加熱表　　　１ 実験番号　条件　　　Ｍ−１細胞とん含率　％（相対値
　％） １　　　（無処置）５８％（１００％）２５６°Ｃ９１
５分　　　　５７％（９８％）３　　　　　　６０分　
　　　５９％　（１０２％）４　　７０℃　１５分　　
　　５４％　（９３％）５　　　　　　６０分　　　　
５３％　（９１％）６１００６Ｃ１５分　　　　２２％
　（３８％）ジスルフィド結合の還元剤による影響を検
討するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、又は
、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を、培養）α
中に加え、３７℃で、４時間反応させた。反応後、Ｍ−
１細胞に対するとん食油誘起活性を測定した。

表　　　２ 実験番号　条件　　　Ｍ−１細胞どん含率　％（相対値
　％） １　　　（無処理）５４％＜１００％）２　　２ＭＥＯ
，１％　　　４９％（９１％）３　　　　　１％　　　
４６％（８５％）４　　　ＤＴ７５ｍＭ　　　　４３％
（８０％）５　　　　　５０　ｍＭ　　　　１３％（２
４％）ｐ　Ｈ安定性を次に示す。細胞分化誘導物質を含
む培養；夜に、４倍量のｐＨ２，４，７，３，９，１０
の各種緩衝液を添加し、２４時間、３７℃に加温した後
、ｐＨを中性にもどし、Ｍ−１細胞に対する細胞分化誘
導活性を測定した。ｐＨ２〜１０の範囲のいずれにおい
ても活性の低下は認められなかった。

ついて、蛋白分解酵素に対する安定性を検討した。

細胞分化誘導物質を含む培養液に蛋白分解酵素トリプシ
ン、または、プロナーゼ−Ｅ　　（２００単位）を添加
し、３７°Ｃにて、３時間反応させた。反応後、Ｍ−１
細胞に対する細胞分化誘導活性を測定したが、いずれの
条件においても、活性の低下は認められなかった。−上
記実験に０．１％ＳＤＳを添加したこと以外は、同一の
条件にて、蛋白分解酵素の効果を検討したところ、０．
１％ＳＤＳの１．后加時のプロナーゼ−Ｅにより、細胞
分化誘導活性が完全に消失した。

さらに、ヒト白血病′ｓ＠に対する生理作用を確認すへ
く、牛胎児血清を１０％含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０
培地にヒト単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）、ヒト−ガ
ス培養器中でそれぞれ培養し、増Ｍｌｔｌｌにある細胞
をリン酸緩衝液でよく洗浄した後、ｌＯ％牛脂児血清お
よび１０　ｎＭビタミンＡＭを添加したＲ　Ｐ　Ｍ、、
ｒ−１６４０培地（ビタミン、アミノ酸強化）に、そ１
゛れぞれ２ＸＩＯ５個／ｍｌ培地になるように！？３濁
した。

細胞懸濁液１００ａｌと培養＃ｆｆ１００μｍとの混合
液を９６穴プレートに入れ、３７℃、５％炭酸ガス混合
空気の下で、３日間培養した。０．２％ニトロブルーテ
トラゾリウム（ＮＢＴ、シグマ社）の溶液（０，２μｇ
／ｍｌ　Ｔ　Ｐ　Ａ含有培地）　　ｌｏｃμｌを加えて
、更に４５分間培養下後２顕微鏡下で観察した。青く沈
着した色素を有するＮＢＴ還元能陽性細胞が、Ｔ　ＨＰ
−１細胞において３３％、）ｉＬ−６０細胞において２
７％に観察された。

実施例２ ヒト急性単球性白血病細胞Ｔ　ＨＰ−１細胞を用いて、
実施例１と同様にして細胞１度６ＸＩＯ５個／ｍｌの細
胞浮遊液を調製し、その１０　ｍｌを１０枚の絹織培養
用プラスチック製ベトリディッシュに植え込み、分化誘
導剤として、１２−０−テトラデカノイルホルボール−
１３−アセテート（ＴＰＡ）、ホルボユの培養１．清を
収集し、３０００　ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞層を
除去したＥ連中の細胞分化誘導物質の活性を測定した。

それぞれの培養上清について、Ｃｏｎ−Ａカラムへの吸
着処理およびα−メチル−ｄ−マンノシド溶）αによる
脱着処理によって得られる活性画分は、分子量約５０．
０００　（Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミ）・電気泳動
法）で、ｐＨ２〜１０での処理にて失活せずに、７０６
Ｃの加熱処理においＣも、その活性を保持していた。

（以下　余白） 表　　　　　３ 実験番号　分化誘導剤　　細胞分化誘導物質Ｍφ活性化
物質 Ｉ　　　　ＴＰＡ　　　ｌｏｎｇ／ｍｌ　　　９７単位
／ｍ１ＲＡ　　　　１７Ｂ／ｍ１ ２　　　　ＴＰＡ　　１００　ｎｇ／ｍｌ　　１２１Ｒ
Ａ　　　　１．　ｕ　ｇ／ｍ１ ３　　　　Ｔ　Ｐ　Ａ　　１０００　ｎｇ／ｍｌ　　１
０９ＲＡ　　　Ｏ，Ｉμｇ／ｍｌ Ｌ　Ｐ　Ｓ　　　ｌＯμｇ／ｍ１ ４　　　　ＰＤＤ　　１０００　ｎｇ／ｍｌ　　　８５
ＲＡ　　　　Ｉμｇ／ｍ１ ６　　　　Ｍ　Ｅ　Ｚ　　１０００　ｎｇ／ｍｌ　　　
９１ＲＡ　　　　１μｇ／ｍｌ （比較例）　Ｔ　Ｐ　Ａ　　１０００　ｎｇ／ｍｌ　　
　１３Ｓ−ＣｏｎＡ　　２０　ｔｔ　ｇ／ｍｌ実施例３ ヒト急性単球性白血病細胞Ｔ　ＨＰ−１細胞を用いて、
細胞濃度を変えたこと以外は、実施例１と同様にして細
胞浮遊液を調製し、その１０　ｍｌを　１０枚のＭ１織
培襖ｍプラスチック製ペトリディッシュに植え込み、Ｔ
ＰＡを１００　ｎｇ／ｍｌ、ＲＡをｌｕｇ／ｍ１となる
ように添加し、３７℃、５％炭酸ガス含有空気中で７２
時間培養した。７２時間後に各ディツシュの培養上清を
収集し、３０００　ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞層を
除去した上清中の細胞分化誘導物０肩の活性を測定した
。それぞれの培養上清ζじいりアクリルアミド電気泳動
法）で、ｐＨ２〜ｌＯでの処理にて失活せずに、７０℃
の加熱処理においても、その活性を失わなかった。

（以下　余白） 表　　　４ 実験番号　細胞濃度　　　細胞分化誘導物質１　　　　
　１　Ｘ　１０５／ｍｌ　　　　　８Ｇ単位／ｍ１２　
　　　　４　Ｘ　１０５／ｍｌ　　　　　＋０４３　　
　　　８　Ｘ　１０５／ｍｌ　　　　　１２９４　　　
　１３　Ｘ　１０５／ｍｌ　　　　　７３５　　　　　
２５　Ｘ　１０５／ｍｌ　　　　　４１いること以外は
、実施例２と同様に培養を行ない、培養上清を得た。培
養上清中の細胞分化誘導物質の活性を測定したところ、
１１９単位／ｍｌの活性が認められた。ＣｏｎＡカラム
への吸着処理およびα−メチル−ｄ−マンノシド溶液に
よる脱着処理にて得られる活性画分は、その分子量約５
０，０００　（５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法
）であり、７０℃の前払処理においても、その活性を保
持していた。

以上詳細に説明した、本発明の細胞分化誘導物質を医薬
品製造の常套手段、例えば加熱処理、ろ過滅菌、凍結乾
燥、分注等の処理を適宜族して製剤化することにより、
従来にない新しい医薬品を得ろことができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）マクロファージ様細胞に分化しうるヒト白血病細
   胞を分化誘導能を有する物質およびマクロファージ活性
   化物質の存在下に培養することを特徴とする、下記の特
   性を有し、 ａ）分子量５０，０００±５，０００（ゲルろ過法）５
   ０，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   電気泳動法） ｂ）等電点６．５±１．０（等電点電気泳動法） ｃ）熱安定性７０℃にて失活しない白血病細胞に対して
   細胞分化誘導活性を有するヒト由来生理活性物質の生産
   方法