JPH0349682A - 新規なα―Ｌ―フコシダーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、バチルス属に属する細菌により生産されるα
一Ｌ−フコシダーゼおよびその製造方法に関する。

（従来の技術） 糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質の糖鎖の非還元末
端あるいは枝別れ部分には、α−Ｌ−フコシル基が頻繁
に見出され、近年、これの代謝と細胞のガン化に深い関
係があることが示唆されている。例えば、ＣＡ１９−９
などガングリオシド系の腫瘍マーカーの殆どはＬ−フコ
シル基を含んでいる。また、細胞のガン化に伴い血中の
Ｌ−フコース量が増加することが種々のガン患者で観察
されている。α−Ｌ−フコシダーゼはこのようなα−Ｌ
−フコシル結合を分解する酵素であり、複合糖質の糖鎖
の構造解析や構造と機能との関連を研究する上でフコー
スを特異的にはずす修飾試薬として重要な意味を持って
いる。α一Ｌ−フコシダーゼは細菌からカビ、植物、軟
体動物、啼乳類にいたるまで広く分布している。サザエ
やボウシュウボラ（Ｊ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　，　７５
，　５０９．　（１９７４））などの動物由来の酵素は
広いアグリコン特異性を持っており、ｐ−ニトロフェニ
ルα一Ｌ−フコシドのような合成基質およびブタ顎下腺
ムチンや２′−フコシルラクト−スなどに存在するα−
１→２フコシル結合、オロソムコイド（α１一酸性糖タ
ンパク質）などに存在するα−１→３フコシル結合、ヒ
ト母乳由来のラクト−Ｎ−フコペンタオース■などに存
在するα−１→４フシコル結合あるいはウシイムノグロ
プリンＧなどに存在するα−１→６フコシ　ル結合を分
解する。しかしながら、これらは材料の安定供給の面で
工業生産には不利である。

一方、バチルス属（Ｊ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７４，
　ｆｌ４１．　（１９７３））、アスペルギルス属（Ｊ
，　Ｂｉｏｌ，　ｃｈｅｍ，　，　２４５，　２９９．
　（１９７０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｂｉｏｐｂ７ｔ　
Ｒｅｓ．Ｃｏｎ＋ｍｏｎ．　，　１３６，　５６３．　
（１９８６）　）などの微生物由来の酵素およびアーモ
ンド（Ｊ．Ｂｉｎ１　　．ｃｈｅｗ．，　２５７　．　
８２０５．　（１９ｇ２））の酵素は厳密なアグリコン
特異性を持っており、ｐ−ニトロフェニルα一Ｌ−フコ
シドのような合或基質には作用せず、上記結合のうちの
一種類のみを分解する。そのため、結合様式にかかわら
ずフコースをはずしたい場合には非常に不利である。更
に、いずれの起源の酵素も糖脂質に作用するかどうかは
殆ど調べられていない。従って、広いアグリコン特異性
を有し、糖タンパク質および糖脂質のどちらにも作用し
うる微生物由来のα−Ｌ−フコシダーゼの開発が望まれ
る。

（発明が解決しようとする問題点） 近年、コリネバクテリウム属またはフラボバクテリウム
属（特開昭６２−１５５０８６号公報）およびフザリウ
ム属（特開昭６１−５８５８７号公報）に属する微生物
が、ｐ−ニトロフェニルαＬ−フコシドのような合成基
質に作用するのみならず天然基質にも作用する広い基質
特異性を持つα一Ｌ−フコシダーゼを生産することが見
出だされた。しかしながら、前者の生産する酵素は菌体
内酵素であるため工業生産には不利であること、後者の
酵素はｐ〜ニトロフェニルα一Ｌ−フコシドに比べブタ
胃ムチンなどの大分子の基質に対する作用が弱いこと、
更に、両酵素共に糖脂質に作用するかどうかは調べられ
ておらず、共に満足なものではない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはかかる問題点を解決するためにα一Ｌ−フ
コシダーゼ生産能を有する微生物を広く自然界より検索
した。その結果、兵庫県竜野市の土壌より分離された細
菌が、広いアグリコン特異性を有し、糖タンパク質およ
び糖脂質のどちらにも作用しうるα一Ｌ−フコシダーゼ
を培養液中に生産することを見出し、本発明を完成した
。

本発明において用いられる菌株は、以下のような菌学的
性質を有する。

（形態的所見） １．細胞の形態、大きさ：桿菌０．５Ｘ４−６μｍ２．
多形性：なし ３．運動性：あり ４．胞　子：あり　　　　ｌ．ＯＸ２．５７ｚｍ５．胞
子の部位：準端 ６．グラム染色性：陽性 （生育状態） １．肉汁寒天平板培養 集落の形状は円形であり、周縁は金縁で、表面隆起は扁
平状である。又、集落の色調は、乳白色〜白黄色である
。

２．肉汁液体培養 生育し混濁する。

３．ゼラチン穿刺培養 液化せず。

（生理学的性質） １．蛸酸塩の還元：陰性 ２，硫化水素の生成：陰性 ３．インドールの生或：陰性 ４．デンプンの分解：陽性 ５．カゼインの分解：陰性 ６．クエン酸の利用：陰性 ７．ウレアーゼ：陰性 ８．カ　タ　ラ　ー　ゼ：陽性 ９．オキシダーゼ：陰性 １０，　Ｍ　　Ｒ　　テ　ス　ト：陰性１１．Ｖ　　Ｐ
　　テ　ス　ト：陰性 １２．生育温度：１０−４４°Ｃ 至適温度　３０−３５°Ｃ １３．酸素に対する態度；好気性 １４．糖類からの酸およびガスの生成 （＋：生成、一：生成せず） 酸　　　ガス Ｄ−グルコース　　　　＋ Ｄ−アラビノース　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　＋ イノシトール　　　　　　＋ ソルビトール　　　　　　　＋ シ　　ヨ　　糖　　　　　　　　　十 メリビオース　　　　　　　＋ トレハロース　　　　　　　＋ １５．ＶＰ培地−（ｐＨ６，Ｏ）　におけるｐＨｐＨ５
．４８　（６日） １６．食塩含有培地における生育 ５％　生育する ７％　生育しない 以上の性質から、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆロｅｔｅｒ−ｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ
ｏｇ７，第８版を参照し、この菌株をバチルスに属する
菌株と同定し、バチルス　スピイシイズ　Ｍ２　８　（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　Ｍ２ｇ）　　と命名した。

本菌株は、微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０７
８８号として寄託されている。

次に、本菌株により生産されるα一Ｌ−フコシダーゼの
酵素学的および理化学的性質について記述する。

！）酵素の作用 本発明酵素はα一Ｌ−フコシドを特異的に加水分解して
Ｌ−フコースを遊離する。

２）基質特異性 本酵素の種々のα一Ｌ−フコシド含有基質に対する作用
を第１表に示した。本酵素はｐ−ニトロフェニルα一Ｌ
−フコシドやメチルα一Ｌ−フコシドのような合成基質
には全く作用しない。一方、天然基質中のα−１→２、
α−１→３およびα−１−４フコシル結合のいずれをも
分解し、Ｌ−フコースを遊離する。更に合成糖脂質であ
るラクトＮ−フコペンタオースＩ−ＰＡ．（ラクト−Ｎ
フコペンタオースＩにフェニルアルキル基が結合）やＯ
型赤血球膜上のＯ型活性糖脂質をも分解する。従って、
本発明酵素は従来の微生物起源の酵素のみならずあらゆ
る起源のα−Ｌ−フコシダーゼとは全く異なる新しいタ
イプのα−Ｉ７−フコシダーゼである。

なお、本発明酵素のブタ胃ムチン、２′−フコシルラク
ト−スおよび３−フコシルラクト−スに対するＫｍ値は
、それぞれ　８．ＯＸＩＯ−’Ｍ，６．３Ｘ１０−４Ｍ
および１．２Ｘ１０−３Ｍである。

３》力価の測定法 酵素活性の測定はブタ胃ムチンを基質とし、ｐＨ６．０
のリン酸カリウム緩衝液中、３７℃で１０分間反応を行
い、沸騰浴中３分間加熱して反応を停止した後、遠心し
、その上清中の遊離Ｌフコース量をブタ肝由来のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼを用いて測定することにより行
った。酵素の単位は１分間に１μｍｏｌのＬ−フコース
を遊離する酵素量を１ユニットとした。

ヒトＯ型赤血球膜上に存在するＯ型活性糖脂質に対する
作用は、Ｏ型赤血球に本発明酵素を３７℃で１時間作用
させた後、赤血球より糖脂質を抽出し、抗Ｉ−１活性を
持つモノクローナル抗体と＋２″ｌ−プロテインＡを用
いるＴＬＣ−イムノステイニング法により確認した。ｐ
−ニトロフェニルグリコシドを基質とした場合には、ｐ
Ｉ−Ｔ６．０のリン酸カリウム緩衝液中、３７℃で反応
を行い、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．８）を加えて反応を停
止させた後、遊離のｐ−ニトロフェノールの量を４００
ｎｍの吸光度を測定することにより行った。また、種々
の天然基質や合成糖脂質に対する作用は、ブタ胃ムチン
に準じて行った。

４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐ　Ｈは第１図に示すとおり　ｐＩ１５．５−６．
５であり、安定ｐＨ範囲は４℃、６３時間の処理条件の
場合、第２図に示すとおりｐＨ４．　　５−９．５であ
った。なお、第↑図および第２図において使用した緩衝
液をクエン酸−ｔｌｃｌ：○○、酢酸：▲−▲、クエン
酸二〇一〇、リン酸カリウム●−●、トリスーＨＣＩ：
△−△、グリシンーＮａＯＨ：■−■で示した。

５）反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は５０℃であった。安定温度範囲はｐＨ
７．０．１０ｍＭリン酸緩衝液中に各温度で１０分間保
温して残存活性を測定した。その結果、本発明酵素は第
３図に示したように、４５℃まで安定であり、５０℃で
約５０％の残存活性を示した。

６）精製方法 本発明酵素の精製は、塩析法、各種クロマトグラフ法等
を適宜に組み合わせて行うことができる。

精製の具体例は実施例に示すとおりである。

７）分子量 本発明酵素の分子量はトヨパール｝ＩＷ６５Ｆを用いる
ゲル濾過法により約２８５、０００と測定された。

８）ポリアクリルアミド電気泳動 精製された酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動におい
て単一のバンドを示した。

９）阻害剤等の影響 本酵素に対する種々の添加物質の影響について検討した
ところ、水銀（１ｍＭ）により著しく阻害されたが、そ
の他の金属イオン（１ｍＭ）やＳ１Ｉ試薬（１ｍＭ）お
よび糖（１０ｍＭ）によりほとんど影響を受けなかった
。

次に本発明をより具体的に説明する。

本発明に使用する微生物は、バチルス属に属し、上記性
質を有するα一Ｌ−フコシダーゼを生産する能力を持つ
ものであればいかなるものでも良い。

それらのうち好ましい菌株は、本発明者らにより土壌か
ら分離された　Ｍ２８　　株があげられる。

本菌を用いてα−Ｌ−フコシダーゼを生産するには、通
常の微生物の培養に用いられるものであれば特に限定さ
れない。

炭素源としては例えば、グルコース、フコース、アラビ
ノース、シュークロース、可溶性デンプン、デキストリ
ン、糖蜜、ヒト母乳、プタ胃ムチンなどの糖質、窒素源
としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カザミノ
酸、コーンスチープリ力、各種アンモニウム塩、各種哨
酸塩、尿素等が用いられる。また、ブタ胃ムチンのみを
含むものも培地として用いることができる。本発明のα
Ｌ−フコシダーゼは、誘導酵素であるゆえ、ブタ胃ムチ
ンやヒト母乳より調製したオリゴ糖などのα−Ｌ−フコ
シドを含む糖質を培地に添加すれば、著しく酵素生産量
が増大する。例えば、ブタ胃ムチンを１．０％添加する
ことにより、グルコースを添加した場合に比べ、約１５
０倍の本発明αＬ−フコシダーゼが生産される。培養は
、培地を通常の方法で滅菌し、本発明の菌株を接種し、
２５−３５℃、ｐＩ｛６．０−７．　０で２−３日間振
とうまたは通気攪拌により好気的に行う。本酵素は培養
後の菌体を用いた誘導生産によっても得ることができる
。

培養終了後、培養液から、α一Ｌ−フコシダーゼを採取
、精製するには既知の方法を組合わせて行うことができ
る。本酵素は培養液中に生産されるので、遠心分離等に
より菌体を除いた培養上澄液を硫安分画後、イオン交換
、ゲル濾過、吸着等のクロマトグラフィーを行い精製す
ることができる。

以下、実施例により詳しく説明するが、本発明がこれに
限定されるものではない。

（実施例） 実施例１ グルコース１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．５
％、塩化ナトリウム０．　　５％　（ｐｌ１６．５）を
含む培地を５００ｍｌ容振とうフラスコに１００ｍｌ分
注し、滅菌した後、バチルス　スビイシイズ　Ｍ２８を
接種し３０゜Ｃで振とう培養し種培養とした。ついでブ
タ胃ムチン２。０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０
．　　５％、塩化ナトリウム０。

５％（ｐＩＩ６．５）からなる培地８ＬをＩＯＬ容ジャ
ーファーメンターに入れ、１２０℃、３０分間殺菌した
。冷却後、上記の種培養液を接種し、３０℃で３日間、
毎分３．５Ｌの通気量と毎分３５０回転の攪拌速度の条
件で培養した。培養終了後、遠心分離により菌体および
不溶物を除き、培養濾液を得た。この濾液をＯ−４℃に
保ちながら硫安を添加し、３３−８０％飽和の間の沈殿
画分を採取した。得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液
　（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で一夜透析した。

この透析内液を同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セ
ル口ファインＡＭ力ラム（５．６Ｘ４５ｃｍ）に通し、
同緩衝液で非吸着画分に溶出された活住画分を集め、硫
安を３５％飽和になるように加えた。生成した沈殿を遠
心分離により除き、３５％飽和硫安を含む１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐ｝１７．０）で平衡化したトヨパールｌＩ
Ｗ６５Ｃカラム（６．ＯＸ２６ｃｍ）に通し、吸着した
酵素を１０％（ｗ／　ｖ　）硫安を含む同緩衝液で溶出
した。活性画分を集め、硫安を８０％飽和になるように
加えた。生成した沈殿を１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＩ−１
７．０）に溶解し、同緩衝液で一夜透析した。この透析
内液を同緩衝液で予め平衡化したハイドロキシルアパタ
イト力ラム（２．６Ｘ１６ｃｍ）に通し、吸着した酵素
をリン酸緩衝液（ｐ１１７．Ｏ）１−２００ｍＭのリニ
アーグラジェント法で溶出した。溶出された活性画分を
集めて濃縮し、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ？，Ｏ
）で平衡化したトヨパールＨＷ６５Ｆカラム（１，５Ｘ
１２０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行った。活性画分を集
めて濃縮した後、２０％（ｗ／ｖ）硫安を含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐｌ｛７．　　０）に対して一夜透析し
た。透析内液を同緩衝液で予め平衡化したプチルトヨパ
ール６５０カラム（１．２Ｘ１６ｃｍ）に通し、２０−
Ｏ％（Ｗ／Ｖ）硫安のリニアーグラジエント法で溶出し
た。活性画分を集めて濃縮した後、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して一夜透析し、α−Ｌ−フコシ
ダ−ゼの精製製品７００μｇ　（比活性２０ｕｎｉｔｓ
／ｍｇ，収率０．９％）を得た。

実施例２ グルコース０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０
．　　５％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ６．５）を
含む培地５００ｍｌを２Ｌ容振とうフラスコに分注し、
１２０℃、２０分間滅菌した後、同じ組或の培地で前培
養したバチルス　スピイシイズ　Ｍ２８の種菌を５ｍｌ
接種し、３０℃、一夜振とう培養した。培養終了後、遠
心により菌体を集菌し、生理食塩水で充分洗浄した後、
５００ｍｌの２％ブタ胃ムチンを含む２０ｍＭリン酸緩
衝液に懸濁し、３０℃、２４時間振とうし、酵素を誘導
生産した。誘導終了後遠心により菌体を除き、０．　　
０　９ｕｎｉｔｓ／ｍｌの活性を持つ誘導酵素液を得た
。

（発明の効果） 以上、説明したように本発明のα一Ｌ−フコシダーゼは
糖タンパク質のみならず糖脂質にも作用しかつ広いアグ
リコン特異性を有しているため糖鎖の構造解析や機能の
研究に極めて有用である。

また、本発明酵素は菌体外に分泌されるため、フコース
を特異的にはずす修飾試薬として大量かつ安価な供給が
可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐ　Ｉ−１を示すグラフ、第２図
は本酵素の安定ｐＨを示すグラフ、第３図は本酵素の安
定温度をしめずグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼ 〔１〕作用 糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質のα−Ｌ−フコシ
   ド結合に良く作用し、Ｌ−フコースを遊離する。 〔２〕基質特異性 本酵素はｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコシドやメチル
   α−Ｌ−フコシドのような合成基質には全く作用しない
   。一方、天然基質中のα−１→２、α−１→３およびα
   −１→４フコシル結合のいずれをも分解し、Ｌ−フコー
   スを遊離する。更に合成糖脂質であるラクト−Ｎ−フコ
   ペンタオースＩ−ＰＡ＿３（ラクト−Ｎ−フコペンタオ
   ースＩにフェニルアルキル基が結合）やＯ型赤血球膜上
   のＯ型活性糖脂質をも分解する。 〔３〕至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ５．５−６．５であり、安定ｐＨ範囲は
   ４℃、６３時間の保持条件においてｐＨ４．５−９．５
   である。 〔４〕反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は５０℃であり、ｐＨ７．０で１０分間
   処理した時、４５℃まで安定であり、６０℃以上で失活
   する。 〔５〕分子量 ゲル濾過法により測定した分子量は約２８５，０００で
   ある。 〔６〕阻害剤等の影響 水銀により著しく阻害されるが、その他の金属イオンや
   ＳＨ試薬および糖によりほとんど影響を受けない。
2. （２）バチルス属に属し、菌体外にα−Ｌ−フコシダー
   ゼを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物より
   α−Ｌ−フコシダーゼを採取することを特徴とするα−
   Ｌ−フコシダーゼの生産方法。