JPH0198485A - 微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 近年、生体内で複合糖質の糖鎖部分が細胞の分化・成長
、細胞間認識あるいは悪性腫瘍を含む多くの病気の発症
などに重要な役割を果していることが明らかにされてい
る。

こうした糖鎖の機能の解明には、糖鎖の構造解析、結合
様式の決定が必要とされ、複合糖質の糖鎖構造に高い特
異性を有する各種のグリコシダーゼの利用が重要な手段
となっている。

血液型物質はその＃Ｍ鎖構造が細胞内認識機構に大きな
役割を果たしていることが示される顕著な例である。血
液型のＡ型物質はｔＩ！鎖の非還元末端にＮ−アセチル
ガラクトサミンがα結合し、Ａ型物質としての抗原決定
基を形成している。

Ａ型物質に作用し、末端にα結合しているＮ−アセチル
ガラクトサミンを以下の様に切断遊離する酵素であるα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（以下α−Ｇａｌ
ＮＡｃａｓｅと略す。）は糖鎖構造の解析のための試薬
としてのみならず、Ａ型皿液の０型への転換等抗原性を
変化させる手段として用いられる酵素である。

Ｇａ１ＮＡｃ　ｃｒｌ　−＋３　Ｇａｌ　β１　・−−
↑ Ｇａ１ＮＡｃ、　　＋　　Ｇａｌ　β１−０↑ Ｆｕｃα１ （従来の技術） （発明が解決しようとする問題点） 従来微生物起源のα−ＧａｌＮＡｃａｓｅとしては、ク
ロストリジウムパーフリンゲンス（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｌ
ｕ＋ｗＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびアスペルギルス
ニガー（Ａｓｐ−ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来
の酵素が部分精製されているにすぎない、この内クロス
トリジウムバーフリンゲンスは嫌気性の病原菌のため培
養が困難であり、一方アスペルギルスニガー由来の粗酵
素中には多くの他のグリコシダーゼが存在し、精製酵素
を得るには不適当である。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはα−ＧａｌＮＡｃａｓｅ生産能を有する微
生物を広く自然界より検索した結果、土壌より分離され
たー菌株が、その目的にかなった性質を有していること
を見出し、本発明に到達したものである。

本発明に用いられる菌株の菌学的性質は以下に示す通り
である。

（１）形態学的性質 分生子（胞子）：球形、突起物を有する粗面、１．５〜
１．７Ｘ１．５〜１．８　μｍという特徴を持った分生
子からなる アクレモニウム型分生子構造を 存する。栄養菌糸からは、はっ きり分化しない分生子柄上また は直接栄養菌糸上に２．３個か ら２０個ぐらいの分生子が球状 にかたまりを形成。

分生子柄　二　分生子形成細胞は隔壁がみられ、分生子
柄は先端がとがっており、 無分枝のものと分枝したものと が認められる。

栄養菌糸　：　巾１．５〜３．２　μ国と太く明瞭な隔
壁が認められる。表面は滑ら かで先端は丸（、屈曲した細胞 もみられる。

気菌糸　　：　　ｒｔｌＯ，５〜１．２μｍで先端は丸
みを帯び、隔壁が認められる。

（２）各培地における生育状態 ■　麦芽汁寒天培地 発育の良否　：　適度 菌糸の形態　：　白色、綿毛状 培地裏面　　：　黄褐色 ■　バレイショ、ブドウ糖寒天培地 発育の良否　；　良好 菌糸の形態　：　中央は白色綿毛状、周辺はフェルト状
。

培地裏面　　：　淡黄色 ■　ツアペック寒天培地 発育の良否　：　不良 生育の様相　：　寒天に潜行するように放射状に伸長。

菌糸の形態　：　中央は白色綿毛状、時間経過とともに
白点数 在。

（３）生理的性質 生育のｐＨは中性付近、生育温度は２８°Ｃが適当で、
３７°Ｃでは生育はきわめて遅い。

通常の微生物の培養に用いられる培地によく生育し、炭
素源としてはアミノ糖よりグルコースを責化しやすい。

以上の諸性質よりこの菌株はアクレモニウム属に属する
新菌株と同定し、アクレモニウム・エスピーＮａ　４１
３　（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｓ　ｓｐ、　Ｎｏ　４１３）
　　と命名した０本国株は微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第　ｑ５８’；号として寄託されている。

次に、本発明により製造されるα−ＧａｌＮＡｃａｓｅ
の酵素化学的および理化学的性質を示す。

ｆｉ＋酵素の作用 本発明酵素は末端にＧａ１ＮＡｃがα結合しているｍｉ
Ｊ￥に作用して以下のようにＧａ１ＮＡｃを遊離せしめ
る。

Ｇａ１ＮＡｃ　α１　−走→３　Ｇａｌ　　β１−−−
−−・−（２）基質特異性 種々のｐ−ニトロフェニル−グリコシドに対して、本発
明酵素を作用させた結果を第１表に示した０表から明ら
かなように本発明酵素はｐ−ニト第　　１　　表 ロフェニルーα−ＧａｌＮＡｃ　　以外のｐ−ニトロフ
ェニル−グリコシドに対しては実質的にはほとんど活性
を示さない。

一方、本発明酵素はｐ−ニトロフェニル−α−ＧａｌＮ
Ａｃ　　の他、非還元末端にα結合したＧａ１ＮＡｃを
有する糖鎖に作用し、馬胃Ａ型物質、アシアロ牛顎下腺
ムチン、豚胃ムチン塘ペプチド、羊ムチン、Ａ型ヒト唾
液糖ペプチド、Ａ１型血球等の天然物質抗原決定部位よ
りＧａ１ＮＡｃを遊離する。

（３）力価の測定法 酵素活性の測定は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ　−Ｇ
ａ１ＮＡｃを基質としてｐＨ４，５のクエン酸緩衝液中
３７°Ｃで反応を行い、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，８）を
加えて反応を停止させた後、遊離のｐ　−二トロフェノ
ールの量を４００ｒ＋＋ｗの吸光度を測定することによ
り行った。酵素活性の単位は１分間に１μ５ｏｌｅのｐ
−二トロフェノールを遊離する酵素量を１ユニツトとし
た。

血球以外の天然物質を基質とした場合は、ｐＨ４，５の
クエン酸緩衝液中３７°Ｃで反応を行い、Ｒｅ１５５１
ｇ法で遊離のＧａ１ＮＡｃを定量した。

天然物質のうちＡ型の型活性を持つものについては、抗
Ａ血清に対する血球凝集阻止能の減少を測定し、酵素活
性を確認した。

（４）至適ＰＨおよび安定ＰＨ範囲 反応の至適ＰＨは４．０〜４．５にあった。

安定ｐＨ範囲は４℃、２日間の処理条件の場合ｐＨ６，
０〜７．５であった。

（５）反応至適温度および安定温度範囲反応の至適温度
は５５°Ｃであった。安定温度範囲はｐＨ７，０，１０
ｍＭリン酸緩衝液中に１０分間保温したとき３５°Ｃ以
下であり、４５°Ｃでは約８０％の活性が残存していた
。

（６）阻害剤等の影響 本酵素に対する種々の添加物質の影響について検討した
結果を第２表に示した。表から明らかなように水銀によ
り著しく阻害されたが、ＳＨ試薬やその他の金属イオン
および糖によりほとんど阻害されなかった。

第２表 （７）精製方法 本酵素の精製は、塩析法、各種クロマトグラフ法等を適
宜に組合わせて行うことができる。精製の具体例は実施
例に示すとおりである。

（８）分子量 本酵素の分子量はセファデックスＧ−１５０を用いるゲ
ルが適法により約５５．０００、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって約５７゜０００と算出され
た。

（９）ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製された酵素
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバ
ンドを示した。

００）アミノ酸分析 精製酵素標品を６　Ｎ　−１−（α中で１１０°Ｃ１２
２時間加水分解した後、アミノ酸自動分析機でアミノ酸
組成を測定した。その結果を第３表に示した。

第３表 次に本発明をより具体的に説明する。

本発明に使用する微生物は、アクレモニウム属に属し、
上記性質を有するα−ＧａｌＮＡｃａｓｅを生産する能
力を有するものであれば如何なるものでもよい。このよ
うな微生物の具体例としては、本発明者らにより土壌か
ら分離された　Ｎα４１３　　株があげられる。

当該菌を用いてα−ＧａｌＮＡｃａｓｅを生産するには
、通常の微生物の培養に用いられるものであれば特に限
定されない。

炭素源としては例えば、グルコース、アラビノース、シ
二−クロース、可溶性澱粉、糖密、デキストリン、豚ア
シアロムチンなどの糖質、窒素源としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンステイープ
リカー、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等があ
げられる。培地のＰＨは６．５、培養温度は２８°Ｃ１
培養時間は７２時間程度が適当であり、好気的に培養を
行う。

本酵素は培養後の菌体を用いた誘導生産によっても得る
ことができる。

培養終了後、培養液からα−ＧａｌＮＡｃａｓｅを採取
、精製するには既知の方法を適当に組合せて行うことが
できる０本酵素は培養液中に分泌されるので遠心分離等
により菌体を除いた培養上澄液を硫安分画後、イオン交
換、ゲルが過、吸着等のクロマトグラフィーを行い精製
することができる。

（実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、以
下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない
。

実施例１ グルコース０，５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０
．５％、塩化ナトリウム０．５％を含む培地を２１容振
盪フラスコ１０本に各５００ｄ分注し、滅菌した後、同
培地で前培養したアクレモニウムエスピーＮα４１３を
５ｄ接種し、２８°Ｃで３日間振盪培養した。培養終了
後、遠心分離により菌体を除き、培養が液を得た。この
が液を０〜５°Ｃに保ちながら硫安を添加し、０．４０
〜０，５５飽和の間の沈澱画分を採取した。

得られた沈澱を０．０ＩＭリン酸緩衝液（Ｐｌ＋　７．
０）に）容解し、同緩衝液で一夜透析した。この透析内
液を同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−５０カラム（４，８Ｘ　５　、Ｏｃｍ　）に通し
、０．１ＭのＮａαを含むリン酸緩衝液ＰＨ６，０で洗
浄後、０．２５ＭＮａαを含む同緩衝液で酵素を溶出し
た。活性画分を限外が過にて濃縮後、９０％硫安飽和に
て沈澱を集めた。

この沈澱に０．００１？　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
を加えて溶解し、同緩衝液で透析した。この透析内液を
同緩衝液で予め平衡化したハイドロキシアパタイトカラ
ム（１，４％５ｃｍ）に通し、同緩衝液で洗浄後、０．
００５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。活
性画分を限外が過にて濃縮後、０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ＰＨ７，０）で平衡化したセファデンクスＧ−１５０
カラム（１，８Ｘ１２３ｃ＋＋＋）を用いてゲルが過を
行った。活性画分を濃縮後、０．ＩＭＮａ　（Ｊを含む
０．０２Ｍ　　リン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で平衡化し
たＣｏｎＡセファロースカラム（０，８ｘ２゜５　ｃ＋
＋）に通した。同緩衝液で非吸着画分に溶出された活性
画分、及び０．００５Ｍα−メチル−マンノシドを含む
同緩衝液で溶出された活性画分を濃縮し、ａ　−Ｇａ　
ＩＮＡｃａｓｅの精製標品３ｍｇ（比活性９０　ｕｎｉ
ｔｓ＃＋＋ｇ収率Ｉ５％〕を得収率１飾 ペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウ
ム０．５％、豚アシアロムチン０．５％を含む培地１　
０　０　ｒｙｒｌを容ｆｆ１５　０　０ａｆｆｉの振盪
フラスコに分注し、１２０°Ｃ１　１５分間加圧滅菌し
た後、同じ組成の培地で前培養したアクレモニウムエス
ピーＮα４１３の菌株を５ｄ接種し、２８℃、２日間振
盪培養した。培養終了後遠沈により菌体を集菌し、生理
食塩でよく洗浄した後、培養液と等容の０．５％Ｎ−ア
セチルガラクトサミンを含む培地に懸濁し、２８°Ｃ，
１８時間振盪し、酵素を誘導産生させた。

誘導終了後遠心分離によって菌体を除き、０．１１ｕｎ
ｉｔｓ／ｄの活性をもつ誘導液を得た。

（発明の効果） 本発明によれば、α−ＧａｌＮＡｃａｓｅを大量かつ筒
便、安価に製造できるので、糖鎖構造の解析や抗原性の
転換に極めて有用な手段を捷供するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　アクレモニウム属に属し、α−Ｎ−アセチルガラクト
   サミニダーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、
   培養物からα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを採
   取することを特徴とする微生物によるα−Ｎ−アセチル
   ガラクトサミニダーゼの製造法。