JPH03500649A - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の精製方法 イオン交換クロマトグラフィーは通常のクロマトグラフ技法テあり、本来穏やか な技法であって、低コストであり、容量が大きく、しかも簡単に評価できる技術 である。しかしながら、現在のところ、この技法はタンパク質（特に、ｒＤＮＡ タンパク質）からこれと密接に関連した不純物を分離するための有用な技法であ るとは言えない。

前記ｒ　Ｄ　Ｎ　Ａタンパク質の例はヒト組換えＧＭ−Ｃ５Ｆである。血液中の 顆粒球とマクロファージの生長および発生を促進する因子であるＧＭ−Ｃ５Ｆの 相ＭＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、最近になって、多くの研究室によってクローン化さ れ、その塩基配列が決定された。さらに、非線換えＧＭ−Ｃ３Ｆは（米国特許第 ４４３８０３２号に記載される）Ｍｏ細胞系列の培養上清から精製され、Ｎ末端 からの最初の１６債のアミノ酸が決定された（ＧａｓｓｏＩＩｅｌ　ａｌ、、　 ５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２之６．１３３９−１３４２　（＋９１１４）を参 照されたい）。多くのヒトＧＭ−Ｃ５Ｆの中に、ヌクレオチド配列とアミノ酸配 列の不均質性が観察された。

例えば、アミノ酸レベルでは、Ｎ末端アラニンに対して１００位にトレ”オニン とインロイシンの両方が観察されており、このことはＧＭ−Ｃ３Ｆの数種類の対 立遺伝子形態（すなわち、多形）がヒト集団内に存在しうろことを示唆している 。

現在、ＧＭ−Ｃ３ＦのｃＤＮＡのような、ｃＤＮＡの新たな作製およびクローニ ング、並びに。ＤＮＡライブラリーの構築には、いろいろな方法が利用されてい る。

−例として、所望の活性を示すポリペプチドを生産する細胞（例えば、非形質転 換ヒトＴ細胞源）から全ｍＲＮＡが抽出される。この全ｍＲＮＡから、プライマ ー開始逆転写を用いて、初めに各ｍ　ＲＮ　Ａ配列の相補体をつくり、次に第二 鎖の合成を開始させることにより、二本鎖ｅＤＮＡが作製される。続いて、この ｃＤＮＡは、相補的なホモポリマー尾部を介して、あるいは適当な制＠部位を含 んだリンカ−セグメントにより作られた付着末端を介して、それらを適切なプラ スミドまたはバクテリオファージベクターに結合させ、その後適当な宿主を形質 転換することによって、クローニングされる。本発明方法により精製されるタン パク質を生産させるためには、広範囲の発現系（すなわち、宿主−発現ベクター の組み合わせ）を使用することができる。利用可能な宿主細胞の種類には、限定 するものではないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物などの細胞が含まれる。

宿主細胞からＧＭ−Ｃ３Ｆを抽出し次いでそれを精製するｊ：めの方法がいろい ろ開示されているが、ＧＭ−Ｃ３Ｆは必ずしもよい収量でかつ生物学的活性を保 持した状態で適切に精製されるとは限らない。

発明の要約 本発明は、粗製タンパク質を比較的純粋なタンパク質両分と不純なタンパク質画 分とに分離する方法を提供し、その方法は純粋なタンパク質と不純物とが反対の 電荷をもつようなｐＨで粗製タンパク質をイオン交換樹脂に接触させ、これによ り前記画分の一方をイオン交換樹脂に選択的に結合させることを特徴としている 。イオン交換樹脂は好ましくは強イオン交換樹脂であり、純粋なタンパク質画分 をイオン交換樹脂に結合させることが好ましい。そして、イオン交換樹脂に結合 された画分が好ましくは溶離される。

粗製タンパク質のＩ）Ｈは、好ましくは、前記画分間に増幅された実効電荷数の 差が存在するような、分離すべきタンパク質画分の等電点の範囲内のｐＨに調節 される。

また、本発明は、粗製タンパク質を比較的純粋なタンパク質両分と不純なタンパ ク質画分とに分離するためのｐＨを決定する方法を提供し、その方法は回収すべ き純粋なタンパク質と除去すべき不純物の等電点を測定し、純粋なタンパク質と 不純物とが反対の電荷をもちかつ前記電荷数間に増幅された差が存在するような 等電点の範囲内のｐＨを決定することを特徴としている。タンパク質画分の等電 点は、好ましくはコンピュータシミュレーシＢンにより、または導電点電気泳動 ゲルを使用することにより決定される。

前記方法はｒＤＮＡタンパク質、特に顆粒球・マクロファージコロニー形成刺激 因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）の精製に有用であり、より詳細には、ＧＭ−Ｃ３ＦをΔ４ ＧＭ−Ｃ３Ｆから分離することによるＧＭ−Ｃ３Ｆの精製に有用である。

特に好適な方法では、タンパク質は順次以下の物質二Ａ、好ましくは架橋デキス トラン、セルロース、アガロース、またはアクリル樹脂担体に結合された、第四 アミン樹脂のような陰イオン交換樹脂； Ｂ、架橋デキストラン、セルロース、アガロース、またはアクリル樹脂担体に結 合されたスルホネート官能基をもつ陽イオン交換樹脂：および Ｃ９好ましくは約ｓ、ｏｏｏ〜約１００，０００ダルトンのタンパク質分画化範 囲をもつ、ゲル濾過手段と接触させることにより精製される。

詳細な説明 本発明は、粗製タンパク質、特に粗製ｒＤＮＡタンパク質を精製するための、高 分離能のイオン交換クロマトグラフィー分離技法に関する。この技法では、回収 しようとする純粋なタンパク質と除去しようとする不純物の等電点付近でクロマ トグラフィーが実施され、好ましくは純粋なタンパク質と不純物の電荷数間に増 幅された（例えば、最大の）差が存在しかつこれらの分子が相反して荷電される （分極される）ようなｐＨで実施される。この増幅された実効電荷数の差（等電 点付近でのみ起こる）は、電荷がほとんど存在しない状態でイオン交換樹脂への 選択的結合をもたらす適当なイオン交換クロマトグラフイル条件を選択するため に使用することができる。便宜上、この技法は以後デルタ等電点（Ｄｅｌｔａ　 １ｓｏｅｌｅｃＬｒｉｃＰｏｉｎｔ　：　Ｄ　Ｉ　Ｐ）クロマトグラフィーと呼 ぶことにする。

目的のｒＤＮＡタンパク質に密接に関連したｒ　ＤＮＡ不純物は、ゲル濾過クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラ フィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、金属キレート化アフィニティーク ロマトグラフィー、および他の常用されるクロマトグラフィーによって粗製タン パク質から分離することが困難である。通常、これらの密接に関連した不純物は 対象のタンパク質産物に近似した分子量および電荷分布をもつタンパク質であり 、一般に１個（またはそれ以上）の荷電アミノ酸を欠いている。これらの不純物 の例は、タンパク質加水分解やクロマトグラフィー相互作用を受けやすいペプチ ド末端にニックが導入されることにより形成されたタンパク質加水分解産物であ る。

コノ種の不純物は通常のイオン交換クロマトグラフィーでは分離できないと考え られる。

ＤＩＰクロマトグラフィー技法は通常のイオン交換クロマトグラフィーといろい ろな点で異なっている。ＤＩＰは分離しようとするタンパク質が極めて小さい実 効電荷をもつような］）Ｈで行われる。これは目的タンパク質およびそれに密接 に関連した不純物の等電点（ｐＩ）かられずかな分数の］）Ｈ単位だけ離れたｐ ）（でイオン交換樹脂に負荷することにより達成される。このことは対象のタン パク質が強い電荷をもつＩ）Ｈで突流される通常のイオン交換クロマトグラフィ ーと対照的であり、通常のイオン交換クロマトグラフィーでは、ＤＩＰクロマト グラフィーより大きく、ｐＩから約１−２の整数のｐＨ単位離れたｐＨで負荷が 行われる。

ＤＩＰを行うためのｐ）ｌは、荷電密度対タンパク質および関連不純物のｐＨの コンピュータシミュレーションにより、あるいは等電点電気泳動ゲルの使用のよ うな分析技術により予測される。通常のイオン交換クロマトグラフィーでは、負 荷ｐＨが目的タンパク質の全体の実効電荷をめることにより決定され、そして負 荷条件は最適化されるにしても経験的に最適化される。溶離条件を決定するため には、退屈な試行錯誤の実験作業を必要とする。

目的タンパク質に対して不純物を分極する試みが全くなされない通常のイオン交 換クロマトグラフィーと這って、ＤＩＰクロマトグラフィーでは、負荷ｐＨが密 接に関連した不純物のｐＩと目的タンパク質のｐＩとの間にあるように選ばれ、 従って、目的タンパク質は分極された不純物と反対の電荷を獲得する。

ＤＩＰクロマトグラフィーにおいては、負荷の間のタンパク質−タンパク質相互 作用を低減させるために、高イオン強度の環境が課せられ、そして強イオン交換 体が用いられる。通常のイオン交換技法では、最大の分離能を得るために、より 低いイオン強度の負荷条件と共に弱イオン交換樹脂を使用することが適している 。ＤＩＰクロマトグラフィーにむいて、負荷の間のタンパク質−タンパク質相互 作用を低く抑えると、高度に選択的な結合並びに極めて精密な分離が負荷の間に 得られ、そして通常の勾配溶離の間に更なる分離が得られる。通常のイオン交換 クロマトグラフィーでは、負荷の間に非選択的な結合が起こり、それ故に負荷中 には大まかな分離が達成されるにすぎない；分離はもっばら、固体マトリックス に高度に局所的に結合されたタンパク質の密集状態から生じる強いタンパク質− タンパク質相互作用のもとで、溶離の間に得られる。

荷電密度対ｐＨのコンピュータシミュレーションは、市販のソフトウェアおよび 適当なコンピュータ（例、大型メインフレームコンピュータ、マイクロコンピュ ータ、パーソナルコンピュータ）を使って行われる。例えば、ＶＡＸコンピュー タ（Ｄｉｇｉｔｘｌ　Ｃａｒｐ−）は“ポリペプチド分析システム”　（ＩｎＬ ｅｌｌｅｇｅｎｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、　１９Ｎ、　１９８２゜１９Ｎ、　１９ ８４．１１８５および１９８６年に版権を得る）のようなソフトウェアパッケー ジと共に使用することができる。このソフトウェアを使うことにより、−次アミ ノ酸配列がインプットされ、異なるｐＨでの荷電密度分布を得ることができる。

別の方法として、当分野でよく知られた方法による等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲ ルを使って、ｐＩを測定することができる。

ＤＩＰクロマトグラフィーは、タンパク質が変性を受けないｐＨ範囲に等電点を 有するタンパク質、特に組換えタンパク質に適用される。多くのタンパク質の等 電点は知られている。例えば、Ｊ、Ｃｂｒａｍ−、２２０（＋９ｇ＋）、　ｐ、 ］ｌ５−１９４　（Ｃｂｒｏ＋ｉａＬｏｇｒａｐｂｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）中の ＲｉｇｂｅＬｔｉ　らによる“タンパク質の等電点および分子量−新しい表”に 掲載される広範な記録を参照されたい。ＤＩＰクロマトグラフィーに適する等電 点アロトロビズムを示す治療上重要なタンパク質の例は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、白血球 およヒリンパ芽球インターフェロン、成長ホルモン、スーパーオキシドジスムタ ーゼ、およびエリトロポエチンである。その他のタンパク質にはアンチトロンビ ンｍ１ラクトーゲン、プラスミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、および ビタミンＢｌｊ−結合タンパク質が含まれる。

ＤＩＰクロマトグラフィーの適用例は以下のヒト組換えＧＭ−Ｃ３Ｆの精製方法 である。ＧＭ−Ｃ５Ｆ精製の特に困難な面は、デルタ４（Δ４）として知られる 、４個のＮ末端アミノ酸を欠＜ＧＭ−Ｃ３Ｆの分解産物の除去である。ＧＭ−Ｃ ３Ｆは一般に第四アミノエチルカラムによる陰イオン交換、ゲル濾過および逆相 クロマトグラフィーの組み合わせにより精製されるが、この方法はΔ４不純物を 途去するのに効果的でない。

しかしながら、ＤＴＰクロマトグラフィーはΔ４不純物を除くことに成功した。

最初に、完全なＧＭ−Ｃ５Ｆタンパク質のコンピュータシミュレーションが、Δ ４不純物のコンピュータシミュレーションと比較され、ＧＭ−Ｃ３ＦのＩ）Ｉが ５．２４であり、Δ４不純物のｐＩが４−９８であると判明した。次に、この範 囲内の使用ｐＨを決定しなければならなかった。この使用ｐＨにおいて、（ａ） ＧＭ−ＣＳＦはΔ４不純物と反対の電荷を獲得し、かつ（ｂ）これらの電荷数の 差の相対的大きさが分離を可能にする程度に増幅される。完全なＧＭ−Ｃ５Ｆと Δ４不純物との間には、１電荷／分子（ｌｃｂ／ｍｏｌ）のわずかな電荷数差が 広いｐＨ範囲にわたって存在する（すなわち、ｐＨ０，５では、それぞれの電荷 は＋１６および＋１５であり、ｐＨ１１−５では、それぞれの電荷は−１１，１ および−１２である）。しかしながら、コンピュータ模擬実験により予測された ように、ｐＨ５付近において、完全なＧＭ−Ｃ３ＦとΔ４不純物との電荷数の差 は増幅され（すなわち、相対的電荷数差が増加され）かつ分子が分極される：す なわち、ｐＨ５において、ＧＭ−Ｃ３Ｆは＋〇、　９　ｃｂ／ｍｏｌ　を有する が、Δ４不純物はたったの−０，１ｃｂ／＋ｃｏｌをもつにすぎない。

こうして、ＤＩＰに必要な２つの条件（荷電分極および増幅）が満たされる。

残存する大腸菌宿主細胞の低ｐｉ不純物およびタンパク質加水分解不安定化因子 からの完全なＧＭ−Ｃ５Ｆの分離をざらに高めるために、負荷の間ｌこ高イオン 強度が用いられた。これは分子間の静電相互作用を少なくする口それ故に、これ らの高イオン強度条件下で、ｐＨ５にて強陽イオン交換体、例えば架橋デキスト ラン、セルロース、アガロ−ス、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能基 が結合されているカラム（例、　Ｓ−５ｅｐｂａｒｏｓｅ。

Ｐｂ！ｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、製、　ＰｉｓｃａＬａｖａｙ、　ＮＪ　）を使用 することが好適である。

このような陽イオン交換樹脂カラムを使用すると、望ましくないム４不純物、種 々の低ｐｉ不純物、２０に大腸菌不純物（他の方法で以前に除去されなかった） 、およびタンパク質加水分解因子の一段階除去が達成され、これにより最終産物 が安定化されることが分かった。陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことに より、ＧＭ−Ｃ５Ｆの純度は約５０％から約９０％に上昇し、そのときの収率は ７０−８０％である。これに続いてゲル濾過段階を行う場合には、Ｇｔ−Ｃ３Ｆ の純度は約９９％に高められる。

以下はＧＭ−Ｃ５Ｆの分離・精製方法の一般的な説明である。陰イオン交換クロ マトグラフィー（好ましくは、第四アミノエチルカラムを使用）はＧＭ−Ｃ３Ｆ の通常の精製段階であり、宿主細胞死滅後の上溝から高ｐｌ不純物を除くために 行われる。やはり慣用されるゲル濾過段階は高および低分子量不純物を除くため に行われる。

以下の記載は精製されたタンパク質画分を強イオン交換樹脂に結合させる方法に 関するものであるが、本発明のいくつかの実施態様では、不純なタンパク質画分 を強イオン交換樹脂に結合させることもできるだろう。同様に、以下の記載およ び実施例は粗製タンパク質をイオン交換樹脂カラムを通して連続通過させること に関するが、バッチ接触のような他の接触方法も使用できるだろう。

一般的解説：操作は特に指定しない限り２−１５°Ｃで行う。タンパク質濃度は クー７シーブルー結合検定により各段階で測定する。クロマトグラフィーで期待 された精製度が得られない場合は、溶出画分を同一カラムで再度クロマトグラフ ィーにかけることができ、また別の方法として、前段階または先の一連の段階を 通して再循環させることもできる。この再処理は１つのバッチまたは複数のバッ チのプールからの溶出された副画分に対して実施してもよい。どの段階において も、濃縮は硫安沈澱、等電点沈澱および／または限外濾過により行われる。緩衝 溶液は脱イオン水（ＤＩ）、逆浸透水（ＲＯ）、または注射用の水（ＷＦＩ）を 用いて調製される。

段階■：第四アミンカラムによるクロマトグラフィーＧＭ−Ｃ３Ｆの粗製抽出物 のｐＨは、ＩＭ　ビス−トリス（ビス［２−ヒドロキシエチルコイミノ−トリス −［ヒドロキシメチルコメタン）のような緩衝液および／または４ＮＨＣ１で５ −７．５に調節する。次に、この溶液を遠心および／または濾過により澄明化す る。水で希釈するか、または４Ｎ　ＮａＣ＋のような塩溶液を添加して、この溶 液の導電率を１０ミリシーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）以下に調整す る。第四アミンカラム（すなわち、架橋デキストラン、セルロース、アガロース 、またはアクリル樹脂担体に第四アミン官能基が結合しているカラム、例えばＰ ｂａｒｍａｃｌｍ、　ｌｉｅ、製の０−５ｅ＋＋ｂａｒｏｓｅ）に５０ｇタンパ ク質／Ａゲルを越えなし１員荷量でバッチを装填する。溶離は２０ｍＭビス−ト リスのような緩衝液中の０−Ｃ１，４Ｍ　ＮａＣ１または他の適当な塩の勾配を 用いて行う。適当な画分は合わせて後続の処理に供する。

段階■：スルホネート力ラムによるクロマトグラフィー合わせた両分は酸（例、 １Ｍ酢酸、４Ｎ　ＨＣＩ）または塩基（例、６Ｎ　Ｎａ０Ｈ）を用いて、ＤＩＰ クロマトグラフィーで分離されるタンパク質画分の等電点の範囲内であるｐＨ５ に調節する。ＮａＯＨでｐＨ５に調節した０、０１Ｍ酢酸のような緩衝液を加え て、導電率を１３ｍ５／ｃｍに調整する。この溶液は０．２ミクロンフィルター を通して濾過し、スルホネートカラム（すなわち、架橋デキストラン、セルロー ス、アガロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能基が結合している カラム、例えばＳ−５ｅｐｂｘｒｏｓｅ）に２０ｇタンパク質／ａカラム材料を 越えない負荷量で装填する。溶離は緩衝液（例、２０ｍＭ酢酸、０．１３Ｍ　Ｎ ａＣ］。

ｐＨ５，０緩衝液）中に０．５Ｍまでの濃度勾配の塩（例−ＮａＣ１）を含む溶 液を用いて行う。適当な両分を合わせて後続の処理に供する。このクロマトグラ フィ一段階は通常繰り返して行う。

段階■：硫安沈澱 合わせたＳ−５ｅｐｂｘｒｏｓｅ画分に硫安を加えて５０％〜６０％飽和の最終 濃度とする。沈澱物を遠心により集める。沈澱物は冷蔵保存することができる。

段階■ニゲル濾過クロマトグラフィー 硫安沈澱物を０．３５Ｍまでの塩（例、塩化ナトリウム）を含む緩衝液（例−１ ０ｍＭ　リン酸ナトリウム、５０ｍＭ　クエン酸、ｐＨ６緩衝液）に溶解する。

この溶液を遠心し、０．２ミクロン範囲のフィルターを通して濾過し、その後同 一緩衝液で予め平衡化しておいた、約ｓ、ｏｏｏ〜約１００，０００ダルトンの タンパク質分画化範囲をもつゲル濾過カラム（例、　５ｅｐｂａｃｒｙｌ　Ｓ− ２００■に、　Ｐｂａｒ＋＊ａｅｉａ、Ｉｎｃ、製）に装填する。負荷量は３． ５ｇタンパク質／ｐゲルを越えない。このカラムを同一緩衝液で溶離し、適当な 画分を合わせる。両分は１０ｍＭリン酸塩、２ｍＭ　クエン酸、ｐＨ’ｌ　２緩 衝液のような緩衝液に対して透析する。これとは別に、段階■の全体をこの後者 の緩衝液により実施することができる。竪階Ｖ：精製されたバルクＧＭ−ＣＳ　 Ｆ合わせた画分は細孔寸法が０．２ミクロンまたはそれ以下のフィルターを通し て濾過し、−２０℃以下で保存する。　１ 代表的なＩＥＦゲル電気泳動法は以下の文献に記載されている： １、電気泳動技術、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　（＋！Ｈ３）Ｅｄ：　 Ｇ、Ｆ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　＆　Ｍ、ＷｈｉｔＬａｋｔｒ−等ＭＬ点電気泳動の最 近の動向″Ｊ、Ｓ、Ｆａｗｃｅｌｔ、　ｐ、５７２０等電点電気泳動：理論、方 法論および応用。

Ｆ、Ｇ、Ｒｉ（ｈｅｌＬｉ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒ ｒｓｓ、　（１９＆３）：３．ｐｌ−１４−６のｔｉ囲内での等電点電気泳動分 離の適用。

Ｐ−Ｇｉｌｌ、　Ｅｌｅｃｌｒｏｐｌｉｏｒｅｓｉｓ　６：２８２　（ｊ１５） ４、ポリアクリルアミドゲルによる超薄層等電点電気泳動におけるタンパク質の 迅速染色。

ｌＪ、Ｄ、Ｆｒｅｙ、　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　３：２７−３２　（ １９ε２）５、セキレイの肝臓試料における酵素の超薄層等電点電気泳動。

Ｍ、ＧｅｒｎｅＩＤｅｒ、　Ｅｌｅｅｔｒｏｐｂｏｒｅｓｉｓ　３：１４６　（ １９Ｎ）以下の実施例はＤＩＰ技法に基づいたＧＭ−ＣＳＦの精製方法を例示す るものである。

１８０　＆の粗製ＧＭ−Ｃ３Ｆ抽出物のｐ　ＨをＩＭ　ビス−トリス緩衝液（ｐ Ｈ６，０）３．６　Ａおよび４ＮＨＣＩ　２．Ｏｌ１ＴｐＨ６−０に調節した。

この溶液は５ｈａｒｐｌｅｓ遠心機を使って０．７５　Ｌ／分の供給量で遠心す ることにより澄明化した。上溝を冷脱イオン水で約１゜５５倍に希釈して最終導 電率を５−５ｍ５／ｃｍとした。

１２ＭのＱ−５ｅｐｈｘｔｏｓｅカラムを１０倍カラム容量の２０　ｍ　Ｍビス −トリス緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化し、４３−６ｎの抽出物を２０ｍｇタン パク質／　ｍ　Ｑ樹脂の負荷量でこのカラムに装填した。カラム（直径２５ｃｍ ）は１２０　党の平衡緩衝液を用いて２５０ｍＱ／分の流量で洗った。０．０３ ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ６，ｏ）７８　Ｑと０．３ ２ＭＮａＣ）を含む２０ｍＭビス−トリス緩衝液（ＰＨ６，０’）７８　直との 間に線状勾配を確立した。ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に基づいて両分（ 各々１．２ｍ）を合わせ、プールしたタンパク質（４，９Ｍ）を段階２でクロマ トグラフィーにかけた。

段階２：スルホネートカラムクロマトグラフィ一段階１からの合わせた両分（４ ，９１）は１Ｍ酢酸（ｐＨ５，０）４９ｍＭでｐＨ５に調節し、ＮａＯＨでｐＨ ５に’１４ｊ４しｆ：０．Ｏ１Ｍ酢酸２　ｋを用いて導電率’ｉ：　１５　ｍ　 Ｓ　／　ｃ　ｍに調整した。この溶液は０．２ミクロンフィルターを通して濾過 し、その後０．１３ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５）で予め平衡化して おいた０、８１のＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに４−７　ｍ　ｇ　／　ｍａカ ラム材料の負荷量で装填した。この方ラムは２．４　ｋの平衡緩衝液で洗い、そ の後０．１３ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５）５．６　Ｍと０．５ＭＮ ａＣ１を含む２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５）ｓ、６　Ａとの間に確立した線状勾配で溶 離した。ゲル電気泳動に基づいて画分を合わせた。このクロマトグラフィ一段階 は繰り返して８階２からの合わせた両分（２’４０Ａ）に硫安を加えて３５１ｇ 、＃ｋ　（５５％飽和）の濃度とした。この溶液は混合せずに４℃で２時間放置 し、その後４５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心して沈澱物を得た。

ＩＪ：Ｆｔｆ４ニゲル濾過クロマトグラフィー硫安沈澱物を１８ｍＭ　リン酸ナ トリウム、２ｍＭ　りｘ　７９、ｐ　Ｈ７，２緩衝液３６ｍ１に溶解した。この 溶液を４５０Ｏｒｐｍで３０分間遠心し、上溝を０．２ミクロンフィルターを通 して濾過した。濾液はリン酸塩−クエン酸ｐＨ７，２緩衝液で予め平衡化してお いた１、８ＰのＳｅｐｈｍｃｒｙｌ　Ｓ−２００］］Ｒカラムにｏ、ｚｘｍｇ／ ｍｆｉゲルの負荷量で装填した。このカラムを同じｐＨ７，２緩衝液１．９Ａで 溶離した。タンパク質検定に基づいて両分を合わせた。

段階５：濾過 段階４からの合わせｌ；両分は０．２ミクロンフィルターを通して濾過し、−２ ０°Ｃで保存した。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　２年　４月２３日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿　ｔ４１、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３５８９ ２、発明の名称 タンパク質の精製方法 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ニューシャーシー州０７０３，３．ケニルヮース。

ギヤロッピング・ヒル・ロード　２９００名　称　シェリング・コーポレーショ ン。

住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正書の提出日 請求の範囲 １．粗製タンパク質を比較的純粋なタンパク質画分と不純なタンパク質両分とに 分離する方法であって、純粋なタンパク質と不純物との間に増幅された実効電荷 数の差が存在するような等電点の範囲内のｐＨを決定し、前記ｐ）ｌにおいて粗 製タンパク質を強イオン交換樹脂と接触させ、これにより純粋なタンパク質と不 純物とが反対に荷電されテ、前記画分の一方がイオン交換樹脂に選択的に結合さ れることを特徴とする方法。

２、比較的純粋なタンパク質画分をイオン交換樹脂に結合させることを特徴とす る請求項１記載の方法。

３、統いてイオン交換樹脂に結合した画分を溶離することを特徴とする請求項ｌ または２記載の方法。

４、タンパク質両分の等電点はコンピュータシミュレーシュンにより、または導 電点電気泳動ゲルを用いて測定することを特徴とする請求項３記載の方法。

５、前記画分間の増幅された実効電荷数の差は、Ａ−純粋なタンパク質と不純物 の等電点を測定し；そして Ｂ、純粋なタンパク質と不純物とが反対に荷電されかつ前記画分間に増幅された 実効電荷数の差が存在するような、等電点の範囲内のｐＨを選択することにより 決彊することをさらに特徴とする、請求項１．２または４のいずれか１項記載の 方法。

６、純粋なタンパク質はｒＤＮＡタンパク質であることをさらに特徴とする、請 求項３記載９方法。

７、比較的純粋なタンパク質画分は顆粒球−マクロ７アージコロニー形成刺激因 子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）、白血球インターフェロン、リンパ芽球インターフェロン、 成長ホルモン、スーパーオキシドジスムターゼ、エリトロポエチン、アンチトロ ンビンｍ１ラクトーゲン、プラスミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、ま たはビタミンＢＩ！−緒合タンパク質から成ることをさらに特徴とする、請求項 １，２，４．６または１３のいずれか１項記載の方法。

８、純粋なタンパク質はＧＭ−Ｃ３Ｆであることをさらに特徴とする、請求項１ ．２．４．６．１３．１４まｔ；は１５のいずれか１項記載の方法。

９、高等電点不純物を陰イオン交換樹脂に結合させ、そして高および低分子量不 純物をゲル濾過カラムにより除くことをさらに特徴とする、請求項１．２．４． ６．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９または２０のいずれか１項記載 の方法。

１０、請求項１．２．４．６．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９．２ ０または２２のいずれか１項記載の方法により調製された精製タンパク質。

１１、ｙＩ＊項１，２．４．６．１３．１４．１５．１６．１７．１Ｂ、１９． ２０または２２のいずれか１項記載の方法により調製された精！ＩＧＭ−Ｃ３Ｆ 。

１２、純粋なダンバク質はｒＤＮＡタンパク質であることを特徴とする請求：！ Ｊｌ、２または４のいずれかＩＪ記載の方法。

１３、純粋なタンパク質はｒＤＮＡタンパク質であることを特徴とする請求項５ 記載の方法。

１４、比較的純粋なタンパク質画分は顆粒球−マクロ７アージコロニー形成刺激 因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）、白血球インターフェロン、リンパ芽球インターフェロン 、成長ホルモン、スーパーオキシドジスムターゼ、エリトロポエチン、アンチト ロンビン■、ラクトーダン、プラスミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、 またはビタミンＢ、！−結合タンパク質から成ることをさらに特徴とする、請求 項３記載の方法。

１５、比較的純粋なタンパク質画分は顆粒球−マクロファージコロニー形成刺激 因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）、白血球インターフェロン、リンパ芽球インターフェロン 、成長ホルモン、スーパーオキシドジスムターゼ、エリトロポエチン、アンチト ロンビン■、ラクトーダン、プラスミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、 またはビタミンＢ＋ｘ−結合タンパク質から成ることをさらに特徴とする、請求 項１２記載の方法。

１６、純粋なタンパク質はＧＭ−Ｃ５Ｆであることをさらに特徴とする、請求項 ３記載の方法。

１７、純粋なタンパク質はＧＭ−Ｃ３Ｆであることをさらに特徴とする、請求項 ５記載の方法。

１Ｂ、純粋なタンパク質はＧＭ−Ｃ５Ｆであることをさらに特徴とする、請求項 ７記載の方法。

１９、純粋なタンパク質はＧＭ−Ｃ３Ｆであることをさらに特徴とする、請求項 ８記載の方法。

２０、純粋なタンパク質はＧＭ−Ｃ３Ｆであることをさらに特徴とする、請求項 １２記載の方法。

２１、高等電点不純物を陰イオン交換樹脂に結合させ、そして高および低分子量 不純物をゲル濾過カラムにより除くことをさらに特徴とする、請求項５記載の方 法。

２２、高等電点不純物を陰イオン交換樹脂に結合させ、そして高および低分子量 不純物をゲル濾過カラムにより除くことをさらに特徴とする、請求項８記載の方 法。

２３、請求項５記載の方法により調製された精製タンノ（り質。

２＋、ｔ＃請求項７記載方法により調製された精製タンパク質。

２５、請求項５記載の方法により調製された精製ＧＭ−Ｃ５Ｆ。

２６、請求′ｑ４９記載の方法により調製された精製ＧＭ−Ｃ５Ｆ。

国際ｙ４貴報告 Ｉ陶−Ｉｌｌ−＾峠縦峠峠−９ＰＣＴ／ｌＪｓ　８８／１）３５８９国際調査報 告 メリカ合衆国ニューシャーシー州０７０３９．　リビングストン、キャロット・ ドライブ　１９

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．粗製タンパク質を比較的純粋なタンパク質画分と不純なタンパク質画分とに 分離する方法であって、純粋なタンパク質と不純物とが反対の電荷をもつような ｐＨで、粗製タンパク質をイオン交換樹脂と接触させ、これにより前記画分の一 方をイオン交換樹脂に選択的に結合させることを特徴とする方法。
2. ２．イオン交換樹脂は強イオン交換樹脂であることを特徴とする、請求項１記載 の方法。
3. ３．比較的純粋なタンパク質画分をイオン交換樹脂に結合させることを特徴とす る、請求預１または２記載の方法。
4. ４．続いてイオン交換樹脂に結合した画分を溶離することを特徴とする、請求項 １〜３のいずれか１項記載の方法。
5. ５．粗製タンパク質のｐＨは、前記画分間に増幅された実効電荷数の差が存在す るような、分離すべさタンバク質画分の等電点の範囲内のｐＨに調節することを 特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. ６．タンパク質画分の等電点はコンピュータシミュレーシュンにより、または等 電点電気泳動ゲルを用いて測定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか １項記載の方法。
7. ７．前記画分間の増幅された実効電荷数の差は、Ａ．純粋なタンパク質と不純物 の等電点を測定し；そして Ｂ．純粋なタンパク質と不純物とが反対の電荷をもちかつ前記画分間に増幅され た実効電荷数の差が存在するような、等電点の範囲内のｐＨを選択することによ り決定することをさらに特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. ８．純粋なタンパク質はｒＤＮＡタンパク質であることをさらに特徴とする、請 求項１〜７のいずりか１項記載の方法。
9. ９．比較的純粋なタンパク質画分は顆粒球−マクロファージコロニ−形成刺激因 子（ＧＭ−ＣＳＦ）、白血球インターフェロン、リンパ芽球インターフェロン、 成長ホルモン、スーバーオキシドジスムクーゼ、エリトロポエチン、アンチトロ ンビンＩＩＩ、ラクトーゲン、プラスミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ 、またはビタミンＢ１２−結合タンパク質から成ることをさらに特徴とする、請 求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. １０．純粋なタンパク質はＧＭ−ＣＳＦであることをさらに特徴とする、請求項 １〜９のいずれか１項記載の方法。
11. １１．高等電点不純物を陰イオン交換樹脂に結合させ、そして高および低分子量 不純物をゲル濾過カラムにより除くことをさらに特徴とする、請求項１〜１０の いずれか１項記載の方法。
12. １２．請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により調製された精製タンパク 質。
13. １３．請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法により調製された精製ＧＭ−Ｃ ＳＦ。