JPH03500782A - 創傷の治癒 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷の治癒 光夙皇１１ 本発明は創傷の治療に関する。

成長因子は、標的細胞の定義された母集団を刺激するポリペプチドホルモンであ る。成長因子の例は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子 、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、形質転換成長因子アルファ、表皮成 長因子（ＥＧＦ）、そして繊維芽細胞成長因子を含む。ＰＤＧＦは陽イオン性の 熱安定な蛋白質で、循環性血小板の顆粒中に見出され、インビトロでの蛋白質合 成と繊維芽細胞によるコラーゲン生成を刺激することが知られている。ＰＤＧＦ はまた、繊維芽細胞と平滑筋細胞に対してインビトロでの有糸分裂促進物質（マ イト−ジエン）として、および化学走性剤として働くことも知られている。

ＰＤＧＦをインビボでの傷の治療を促進させるために使用することは提唱されて いる。例えば、グロテンドース　ト　（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ）、　Ｊ、　Ｔ ｒａｕｍａ。

２４　；’５４９−５２　（１９８４）は、コラーゲンゲルをしみ込ませたハン ト−シリング（Ｈｕｎｔ−３ｃｈｉ１１ｉｎｇ）ｍチャンバーにＰＤＧＦが加え られ、ラットの背中に移植されたと記載している１ＰＤＧＦは新しく合成される コラーゲンの量を増加させることが見出された。しかしながら、レイチェル（Ｌ ｅｉｔｚｅｌ）ら。

Ｊ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｓｕｒｇ、　０ｎｃｏ＋　、　、１１゜：６１７−２２ 　（１９８５）は：ハムスターでＰＤＧＦのみを用いるかまたはＦＧＦとＥＧＦ との組合せで用いて、傷の正常治癒を促進することは出来なかった。

ミカエリ（Ｍｉｃｈａｅｌｉ）らは、ソフト・アンド・ハード・ティシュ−・リ ペア（ハント（Ｈｕｎｔ）。

Ｔ、Ｋ、ら編）、プリーガー・バプリシャーズ（Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ）、ニューヨーク、３８０−３９４頁（１９８４）で高血小板血漿から 得た部分精製調製されたＰＤＧＦの適用は、ウサギ角膜に移植されたとき脈管形 成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進したと報告している。ＰＤＧＦは脈管形 成性成長因子ではないので、この研究者らは彼らの部分精製ＰＤＧＦ調製物質中 の未知の因子が脈管形成効果の原因であると示唆している。

ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）ら、２０３．Ａｎｎ。

Ｓｕｒｇｅｒｙ、１４２　（１９８６）は、ＥＧＦ−β、ＰＤＧＦおよびＥＧＦ が各１００　ｎｇ／　ａ！で一緒に用いられた時に協力作用的な傷の治癒活性を 持つが、ＥＧＦのみと組み合わせたＰＤＧＦではそのような活性をもたないこと を示した。リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５９６（１９８７）は、等ｉｔ　（５ｎｇ／　ｍ　”　）の ＥＧＦとＰＤＧＦを含む調製物は、ＥＧＦまたはＰＤＧＦ単独でもたらされる以 上の創傷治癒活性は示さなかったと記載している。

発」Ｌの１し要 一般に、本発明は哺乳類動物、例えばヒト患者における外傷の治癒を特徴とする 。精製ＥＧＦと精製ＰＤにＦの組み合わせを、少なくとも５：１、好ましくは少 なくとも１０：１の重量比で含む組成物の効果的量が外傷に適用される。好まし くはＥＧＦはヒト組換え体ＥＧＦであるが、他の哺乳類動物種、例えばラットの ものでもよい。ＥＧＦは自然源から単離されるが、またはより好ましくは組換え 細胞によって、または固相ペプチド合成によって生成される。本発明の組成物は 、少なくとも一部は表皮と結合組織の成長および総蛍白質とコラーゲンの合成を 促進することにより、傷の治癒を助ける。本発明の組成物を用いた外傷の治療は 、治療無しく即ち外部からの薬剤の適用無し）または精製ＰＤＧＦ単独であるい は精製ＥＧＦ単独で治療して得られる治癒よりも効果的である。

本発明の好ましい態様において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体物 質、例えば市販品として入手可能な不活性ゲル、液体、または他の徐放供給シス テム（例えばアルブミンまたはメチルセルロースの添加された塩類）に、重量比 が５：１ないし１０：１の範囲もしくは１０：１より大きい比の精製ＥＧＦおよ びＰＤＧＦ（いずれも市販されている）を混合することによって調製される。精 製ＰＤＧＦはヒト血小板から、または組換えＤＮＡ技術によって得てもよい。こ のように用語「ＰＤＣ；ＦＪとは、血小板由来のものおよび、哺乳類、好ましく は霊長類に由来する組換え物質の両者を意味する。

最も好ましくは霊長類はヒトであるがまたチンパンジーあるいは他の霊長類でも よい。組換えＰＤＧＦは組換えヘテロダイマーでよ（、それは両方のサブユニッ トをコードするＤＮＡ配列を、培養された原核または真核細胞へ挿入して、その 後翻訳されたサブユニットが細胞によってヘテロダイマーを形成するように処理 させて作られるか、あるいはまたサブユニットのうち一つだけ（好ましくはβ鎖 もしくは”２″鎖）コードするＤＮＡを細胞内に挿入してもよ（、その細胞はそ の後ホモダイマーＰＤＣ；Ｆ　（ＰＤＧＦ−１もしくはＰＤＧＦ−２ホモダイマ ー）産生のため培養される。

本明細書で用られる用語「精製」とは、ＰＤＧＦまたはＥ（１，Ｆについて、他 方との混和に先立って、重量で９５％またはそれ以上の純度、即ち自然に伴う他 の蛋白質、脂質、炭水化物が実質的に含まれぬ様なＰＤＧＦまたはＥＧＦを意味 する。

精製蓋口質の調製物は、一般に各ＰＤＧＦまたはＥＧＦ成分に対し、ポリアクリ ルアミドゲルで単一の主要バンドを示す。最も好ましくは、本発明の組成物に用 られる精製ＰＤＧＦまたはＥＧＦは、アミノ末端のアミノ酸配列分析によって純 粋と判定されたものである。

本発明はまたは、少なくとも５００ｎｇ／　１５０ｍ＋＋”のＥＧＦを、好まし くは少なくとも５０００ｎｇ／１５０ｍ２のＥＧＦを精製ＰＤＧＦとの組み合わ せで、傷に適用する外傷治療法に関するものでもある。

本発明の組成物は、哺乳類動物の外傷、例えば床擦振裂傷、角膜の傷、火傷等の 治癒に対し、迅速で効果的な方法を提供する。本発明の組成物は自然治癒（即ち 外的薬剤の添加が無い場合）または純粋ＰＤＧＦまたはＥＧＦ単独の場合と比較 して結合組織の生成を促進する。純粋ＰＤＧＦの単独通用とは異なり、本発明の 組成物は新しい結合組織と上皮組織の両者の顕著な増加を促進する。

得られた上皮層は自然治癒またはＥＧＦ単独で生成されたものよりも厚く、また 該上皮層を新しい結合＆１１ｗ１に結合する上皮性突起もより多く含んでいる； このように上皮層はより強固に結合され保護されている。

本発明の他の特徴とするおよび有効性は、以下の好ましい態様の説明および請求 の範囲の記載から明らかになるであろう。

ましい“旨　のｉ゛ ここで本発明の好ましい態様を記載する。

外傷、例えば床擦れ、糖尿病性潰瘍、火傷などが本発明に従って純粋ＰＤＧＦと ＥＧＦを組み合わせて調製されたＰＤＧＦ／ＥＧＦ混合物を用いて治療される０ 組換えヒトＥＧＦはアムジエン社（Ａｍｇｅｎ）、サウザンド・オークス、カリ ホルニア）およびコラポレイテイプ・リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ 　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ペンドフォード、マサチューセッツから購入できる。精 製組換えＰＤＧＦとヒト血小板に由来する精製ＰＤＣＦは、ＰＤＣ；Ｆ社（ＰＤ ＧＦ、Ｉｎｃ、）（ボストン、マサチューセッツ）およびコラボレイティブ・リ サーチ社から購入可能である。精製ＰＩ０；Ｆはまた、下記の様にして調製する こともできる。

５００ないし１０００単位の洗浄ヒト血小板をＩＭＮａＣｌ　（血小板単位当た り２威）に浮遊し、１００°Ｃで１５分間加熱する。その後上清を遠心分離し、 沈澱をＩＭＮａＣｌで２回抽出する。

抽出物をまとめ、０．０８Ｍ　ＮａＣ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバッファ ー（ｐＨ７，４）中で透析を行い、バッファーで平衡化したＣＭ−セファデック スＣ−５０と混合して４℃で一夜放置する。この混合をカラム（５Ｘ１００ｃｍ ）に詰め、０．０８Ｍ　ＮａＣ１−０゜０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐ Ｈ７，４）での十分な洗浄の後、ＬＭ　ＮａＣｌで溶出し、ＩＯｄづつのフラク ションを集める。

活性の存在するフラクションを集めて、０．３ＭＮａｃ］−０．ＯＩＭリン酸ナ トリウムバッフｙ−ＣｐＨ１゜４）に対して透析し、遠心分離後０．３Ｍ　Ｎａ Ｃ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，４）で平衡化されたブ ルーセルロース（フラクション）の２゜５Ｘ２５Ｃ１１カラムに４℃で通過させ る。次いでカラムを同バッファーで洗浄し、部分精製されたＰＤＧＦをＩＭＮａ Ｃｌとエチレングリコールの１：１溶液で溶出する。

部分精製されたＰＤＧＦフラクションをＩＭ　ＮａＣ１で希釈しく１：１）、１ Ｍ酢酸液に対して透析し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥試料を０．８Ｍ　Ｎａ Ｃ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７、４）に溶解し、同バッ ファーで平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−５０の１．２Ｘ４０ａｉカラムに 通過させる。次にＮａＣｌ濃度勾配（０，０８ないしＬＭ）でＰＤＧＦを溶出さ せる。

活性を有するフラクションを集めて、１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥後少量 の１Ｍ酢酸で溶解する。０゜５ｄ量を１Ｍ酢酸で平衡化したバイオゲルＰ−１５ ０（１００ないし２００メツシユ）の１．２Ｘ１００（］カラムに通過させる。

その後ＰＤＧＦを１Ｍ酢酸で溶出し、２ｄづつのフラクションを集める。

１００ないし２００■の蛋白質を含む各活性フラクションを凍結乾燥し、０．４ ％のトリフルオロ酢酸１００ｉに溶解して、フェニルボンダパックカラム（ウォ ーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ））の逆相高性能液体クロマトグラフィーに付する。

アセトニトリルの直線勾配（０〜６０％）による溶出で純粋ＰＤＧＦが得られる 。

組換えＤＮＡ技術によって作られるＰＤＧＦは以下の様にして調製できる。

ヒト血小板に由来する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、二つのポリペプチド 配列を含む（ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２ポリペプチド；アントニアディス およびバンカピラー（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、ＨｏＮ、ａｎｄ　Ｈｕｎｋａｐｉ ｌｌｅｒ、Ｍ、）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２０：９６３　９６５　（１９８３）） 、ＰＤＧＦ−１は第７染色体に位置する遺伝子によってコードされており（ペッ トショルツら（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ、Ｃ。

）、Ｎａ　ｔｕｒｅ、３２０　：　６９３−６９９）、ＰＤＧＦ−２は第２２染 色体に位置する（ダラーファベラ（Ｄａｌ　１ａ−Ｆａｖｅｒａ、Ｒ，）、５ｃ ｉｅｎｃｅ、２１８　：６８６−６８８　（１９８２））ｓ　ｉｓオンコジーン （トリトルら（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｒ，）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１　：２７ ５−２７７　（１９８３））によってコードされている。ｓｉｓ遺伝子は、ＰＤ Ｃ；Ｆ−２ポリペプチドと密接に関連するサル肉腫ウィルス（ＳＳ■）の形質転 換を行う蛋白質をコードしている。ヒト細胞性ｃ−ｓｉｓはまたＰＤＧＦ−２鎖 もコードする（ラオら（Ｒａｏ、Ｃ，Ｄ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：２３９２−２３９６　（１９８６））。ＰＤＧＦの二 本のポリペプチド鎖は別の染色体上の二つの異なる遺伝子によってコードされて いるので、ヒトＰＤＧＦはジスルフィド結合したＰＤＧＦ−１とＰＤＧＦ−２の へテロダイマーであるか、あるいは二つのホモダイマー（ＰＤにＦ−１のホモダ イマーとＰＤＧＦ−２のホモダイマー）の混合物か、またはへテロダイマーと二 つのホモダイマーの混合物からなる可能性がある。

ＰＤＧＦ−２をコードする遺伝子を持つサル肉腫ウィルスに感染した培養哺乳類 細胞は、ＰＤＣ；Ｆ−２ポリペプチドを合成し、それをジスルフィド結合したホ モダイマーにプロセシングすることが示されている（ロビンスら（Ｒｏｂｂｉｎ ｓ、に、、）、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：６０５−６０８　（１９８３）。加えて 、ＰＤＧＦ−２ホモダイマーはヒトＰＤＧＦに対して作製された抗血清と反応す る。さらに、分泌されたＰＤＧＦ−２ホモダイマーの機能的特徴は、血小板由来 のＰＤＧＦに似ていて、培養繊維芽細胞内でＤＮＡ合成を刺激し、１８５ｋｄ細 胞膜蛋白質のチロシン残基のリン酸化を誘発し、そして特異的細胞表面ＰＤＧＦ リセプターへの結合についてヒト’　”　Ｉ　−Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆと競合可能であ る（オーエンら（Ｏｗｅｎ、Ａ、）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：５４−５６（１ ９８４））。同様な特徴は、培養正常ヒト細胞（例えばヒト動脈内皮細胞）で、 またはｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝子を発現しているヒト悪性細胞で産生されたｓ ｉｓ　／　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　−２遺伝子産物についても示された（アントニアデ ィスら（Ａｎｔｏｎｊａｄｅｓ、Ｈ，）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌ−ｓ、３：１ ４５−１５１（１９８５））。

組換えＰＤＧＦ−２ホモダイマー（ここでは組換えＰＤＧＦと呼ぶ）は、ｃ−ｓ 　ｉ　ｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝子のｃＤＮＡクローンを発現ベクターを用いてマウ ス細胞へ導入することにより得られる。発現のために使用されるｃ　−ｓ　ｉ　 ｓ　／　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　−２クローンは、正常なヒト培養内皮細胞から得られ る（コリンズら（Ｃｏ　Ｉ　Ｉ　ｉｎｓ。

Ｔ、）、Ｎａｔｕｒｅ、２１６：７４８−７５０　（１９８５））。

九１皇止１ 傷の治癒を促進する、ＰＤＧＦ／ＥＧＦ混合物の有効性を決定するため以下の実 験を行った。

１０ないし１５ｋｇの若い白色ヨークシャーブタ（パーフンズファーム（Ｐａｒ ｓｏｎ’ｓ　Ｆａｒｍ）、ノｓドリー、マサチューセッツ）を、手術に先立って 少なくとも６時間絶食させた後、麻酔した。無菌条件下で背中と胸の部分の毛を 剃り取って、穏やかな石鹸および水で洗浄した。傷をつける領域を７０％アルコ ールで消毒し池改良されたカストロビーヨ（ＣａｓｔｒｏｖｉｅｊＯ）エレクト ロケラドーム（ｅｌｅｃｔｒｏｋｅｒａｔｏｍｅ）（ストーン社（Ｓｔｏｒｚ） 、セントルイス。

ミズーリ、プラウネル社（Ｂｒ　ｏｗｎｅ　ｌ　ｌ　ｓ）によって改良された） を用いて、１　ｃｍ　Ｘ　２　（］の大きさの傷を深さ０．５Ｍで作製した。こ の傷は表皮を完全に、さらにその下の真皮も同様に除去する結果となった（火傷 の２度に匹敵する）。各々の傷は少なくとも１５−の間隔で正常皮膚により隔た っていた。同じ治療を受ける傷は、グループ分けされ、他のグループとは少なく とも３ｃＩＩ離された。成長因子の治療を受けない傷は、そのような治療を受け る傷から少なくともｌ０Ｃ１１離した。

傷は、生物親和性ゲルに浮遊させた以下の成長因子の一回適用によって直接治療 された：１）５００ｎｇの純粋ヒトＰＤＧＦ　（高性能液体クロマトグラフィー で精製したもの）または組換えＰＤＧＦのみ；２）最高５０００ｎｇまでのヒト 、マウスまたは組換えＥＧＦと組合わせた５００ｎｇの純粋組換えＰＤＧＦ　； ３）５００ｎｇないし５０００ｎＨのヒトもしくはマウスＥＧＦまたは組換えヒ トＥＧＦのみ。

創傷の作製に続いて、３〜１０日目に白目て生検標本を採取した。組織学的判定 のための生検標本は、約３ｍの深さにクサビ状に採取し、１０％ホルマリン中に 貯蔵した。生化学的分析およびオートラジオグラフィーのための標本は、エレク トロケラドームを用いて採取した。

標本の最終寸法は１．５腸×ｌＯ閣ＸＩ、５ｍであった生化学分析のために傷１ つにつき三つの標本を集めた。

標本は採取の後液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した生検標本は以下のように 分析された。

１搬ヱ魚１淀 組織学的標本は標準的パラフィン浸漬と埋め込みの技法を用いて調製した。４ミ クロンの切片を作製し、濾過後のハリスへマドキシリンおよびアルコール性エオ シンを使っ、て染色した；その後染色標本を顕微鏡下で観察した。全ての標本は 二人の研究者が、切片全体をとおして均等に分布する地点で標本名を隠して採点 した。上皮と結合組織層の幅は顕微鏡の接眼レンズ内に置いた格子盤を用いて判 定した；測定値は同じ条件下で眺めたミクロメーターを使ってミリメーターに換 算した。細胞密度は格子盤面積あたりの核数を数えて決定した。

コーーーンおよび　白　の′ ヒドロキシプロリンの含有量（即ちコラーゲン）は、解剖用顕微鏡下で、１．５ −幅の凍結断面において、新しく形成された傷組織を残りの組織からひき剥がし て測定した。傷組織を６Ｍ　ＨＣｌ中で一夜１２０℃で加水分解し、この加水分 解物について、以前に報告された方法で（シュバイツアーら（Ｓｗｉｔｚｅｒ） 、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３９，４８７　（１９７１））ヒドロキシプロリンの分析を 行った。

濃水酸化アンモニウムによる組織抽出液の蛋白質含量をブラッドフォード法（ブ ラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７２：２ ４８−５４　（１９７６））によって仔牛血清アルブミンを標準として測定した 。

級１ 組織学的判定による結果は、組換えＥＧＦとＰＤＧＦが重量比で５：１ないし１ ０：１の組み合わせで治療された傷は、全く治療を受けなかった或いは組換えＥ ＧＦ単独もしくは純粋ＰＤＣ，Ｆ単独の治療を受けた傷よりも、多くのコラーゲ ン（コントロールより約２倍上昇）と上皮層（コントロールより約０．８倍上昇 ）を持つより厚い結合組織とこれらの層に結合するより広範な上皮性突起を有し ていた。

ＰＤＧＦ／ＥＧＦで治療された傷はまた、より多くの細胞質、蛋白質およびコラ ーゲン含量を有していた。

皮与１ 精製されたＰＤＧＦとＥＧＦの適当な投与量を決定するため上記実験を繰り返し 、傷を１平方ミリメーター当たり５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇの精製 ＰＤＧＦとＥＧＦを３０μｍの相客性ゲル中に分散した混合物で治療した。その 結果、ＰＤにＦの含量が４　ｎｇ／　ｍ　”またはそれ以上、ＥＧＦは２０　ｎ ｇ／■２またはそれ以上のときに最高の効果が得られることが示された。

純粋ＰＤＧＦのＥＧＦに対する適当な比率を決定するため、ＰＤＧＦのＥＧＦに 対する重量比が１：１０から２５：１の範囲である組合せが上記のようにして判 定された。最適な結果は、１：５以上の比率によって得られた。

他の態様は後述の請求の範囲にある。

国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．精製表皮成長因子（ＥＧＦ）および精製血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）か らなり、前記ＥＧＦとＰＤＧＦがそれぞれ重量比で少なくとも５：１の割合で存 在する組成物の創傷治癒量を、外傷部に適用することよりなる、哺乳類動物の外 傷の治療方法。
2. ２．前記組成物中のＥＧＦとＰＤＧＦとの重量比が少なくとも１０：１である、 請求項１記載の方法。
3. ３．精製ＥＧＦおよび精製ＰＤＧＦの少なくとも５：１の重量比からなる、創傷 治療組成物。
4. ４．前記の比が、少なくとも１０：１である、請求項３記載の組成物。
5. ５．精製ＥＧＦおよび精製ＰＤＧＦを重量比で少なくとも５：１の比率で混和す ることよりなる、創傷治癒のための組成物の調製方法。
6. ６．精製ＰＤＧＦおよび精製ＥＧＦからなる組成物の創傷治癒量を外傷部へ適用 し、その際、該組成物中の精製ＥＧＦを外傷中に少なくとも５００ｎｇ／１５０ ｍｍ２の濃度で存在させることよりなる、哺乳類動物の外傷の治療方法。
7. ７．精製ＥＧＦを少なくとも５０００ｎｇ／１５０ｍｍ２の濃度で外傷中に存在 させる、請求項６記載の方法。