JPH075481B2 - 創傷の治癒 - Google Patents
創傷の治癒Info
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- JPH075481B2 JPH075481B2 JP1509811A JP50981189A JPH075481B2 JP H075481 B2 JPH075481 B2 JP H075481B2 JP 1509811 A JP1509811 A JP 1509811A JP 50981189 A JP50981189 A JP 50981189A JP H075481 B2 JPH075481 B2 JP H075481B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pdgf
- egf
- purified
- wound
- composition
- Prior art date
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は創傷の治療に関する。
成長因子は、標的細胞の定義された母集団を刺激するポ
リペプチドホルモンである。成長因子の例は血小板由来
成長因子（PDGF）、インシュリン様成長因子、形質転換
成長因子ベータ（TGF−β）、形質転換成長因子アルフ
ァ、表皮成長因子（EGF）、そして繊維芽細胞成長因子
を含む。PDGFは陽イオン性の熱安定な蛋白質で、循環性
血小板の顆粒中に見出され、インビトロでの蛋白質合成
と繊維芽細胞によるコラーゲン生成を刺激することが知
られている。PDGFはまた、繊維芽細胞と平滑筋細胞に対
してインビトロでの有糸分裂促進物質（マイトージェ
ン）として、および化学走性剤として働くことも知られ
ている。
リペプチドホルモンである。成長因子の例は血小板由来
成長因子（PDGF）、インシュリン様成長因子、形質転換
成長因子ベータ（TGF−β）、形質転換成長因子アルフ
ァ、表皮成長因子（EGF）、そして繊維芽細胞成長因子
を含む。PDGFは陽イオン性の熱安定な蛋白質で、循環性
血小板の顆粒中に見出され、インビトロでの蛋白質合成
と繊維芽細胞によるコラーゲン生成を刺激することが知
られている。PDGFはまた、繊維芽細胞と平滑筋細胞に対
してインビトロでの有糸分裂促進物質（マイトージェ
ン）として、および化学走性剤として働くことも知られ
ている。
PDGFをインビボでの傷の治療を促進させるために使用す
ることは提唱されている。例えば、グロテンドースト
（Grotendorst）,J.Trauma,24;549−52（1984）は、コ
ラーゲンゲルをしみ込ませたハント−シリング（Hunt−
Schilling）網チャンバーにPDGFが加えられ、ラットの
背中に移植されたと記載している;PDGFは新しく合成さ
れるコラーゲンの量を増加させることが見出された。し
かしながら、レイチェル（Leitzel）ら,J.Dermatol.Sur
g.Oncol.,ll,:617−22（1985）は：ハムスターでPDGFの
みを用いるかまたはFGFとEGFとの組合せで用いて、傷の
正常治癒を促進することは出来なかった。
ることは提唱されている。例えば、グロテンドースト
（Grotendorst）,J.Trauma,24;549−52（1984）は、コ
ラーゲンゲルをしみ込ませたハント−シリング（Hunt−
Schilling）網チャンバーにPDGFが加えられ、ラットの
背中に移植されたと記載している;PDGFは新しく合成さ
れるコラーゲンの量を増加させることが見出された。し
かしながら、レイチェル（Leitzel）ら,J.Dermatol.Sur
g.Oncol.,ll,:617−22（1985）は：ハムスターでPDGFの
みを用いるかまたはFGFとEGFとの組合せで用いて、傷の
正常治癒を促進することは出来なかった。
ミカエリ（Michaeli）らは、ソフト・アンド・ハード・
ティシュー・リペア（ハント（Hunt）,T.K.ら編），プ
リーガー・パブリシャーズ（Praeger Publishers），ニ
ューヨーク,380−394頁（1984）で高血小板血漿から得
た部分精製調製されたPDGFの適用は、ウザギ角膜に移植
されたとき脈管形成（angiogenesis）を促進したと報告
している。PDGFは脈管形成性成長因子ではないので、こ
の研究者らは彼らの部分精製PDGF調製物質中の未知の因
子が脈管形成効果の原因であると示唆している。
ティシュー・リペア（ハント（Hunt）,T.K.ら編），プ
リーガー・パブリシャーズ（Praeger Publishers），ニ
ューヨーク,380−394頁（1984）で高血小板血漿から得
た部分精製調製されたPDGFの適用は、ウザギ角膜に移植
されたとき脈管形成（angiogenesis）を促進したと報告
している。PDGFは脈管形成性成長因子ではないので、こ
の研究者らは彼らの部分精製PDGF調製物質中の未知の因
子が脈管形成効果の原因であると示唆している。
ローレンス（Lawrence）ら,203,Ann.Surgery,142（198
6）は、EGF−β、PDGFおよびEGFが各100ng/mlで一緒に
用いられた時に協力作用的な傷の治癒活性を持つが、EG
Fのみと組み合わせたPDGFではそのような活性をもたな
いことを示した。リンチ（Lynch）ら,84,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,7596（1987）は、等量（5ng/mm2）のEGFとPD
GFを含む調製物は、EGFまたはPDGF単独でもたらされる
以上の創傷治癒活性は示さなかったと記載している。
6）は、EGF−β、PDGFおよびEGFが各100ng/mlで一緒に
用いられた時に協力作用的な傷の治癒活性を持つが、EG
Fのみと組み合わせたPDGFではそのような活性をもたな
いことを示した。リンチ（Lynch）ら,84,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,7596（1987）は、等量（5ng/mm2）のEGFとPD
GFを含む調製物は、EGFまたはPDGF単独でもたらされる
以上の創傷治癒活性は示さなかったと記載している。
発明の概要 一般に、本発明は哺乳類動物、例えばヒト患者における
外傷の治癒を特徴とする。精製EGFと精製PDGFの組み合
わせを、少なくとも5:1、好ましくは少なくとも10:1の
重量比で含む組成物の効果的量が外傷に適用される。好
ましくはEGFはヒト組換え体EGFであるが、他の哺乳類動
物種、例えばラットのものでもよい。EGFは自然源から
単離されるが、またはより好ましくは組換え細胞によっ
て、または固相ペプチド合成によって生成される。本発
明の組成物は、少なくとも一部は表皮と結合組織の成長
および総蛋白質とコラーゲンの合成を促進することによ
り、傷の治癒を助ける。本発明の組成物を用いた外傷の
治療は、治療無し（即ち外部からの薬剤の適用無し）ま
たは精製PDGF単独であるいは精製EGF単独で治療して得
られる治癒よりも効果的である。
外傷の治癒を特徴とする。精製EGFと精製PDGFの組み合
わせを、少なくとも5:1、好ましくは少なくとも10:1の
重量比で含む組成物の効果的量が外傷に適用される。好
ましくはEGFはヒト組換え体EGFであるが、他の哺乳類動
物種、例えばラットのものでもよい。EGFは自然源から
単離されるが、またはより好ましくは組換え細胞によっ
て、または固相ペプチド合成によって生成される。本発
明の組成物は、少なくとも一部は表皮と結合組織の成長
および総蛋白質とコラーゲンの合成を促進することによ
り、傷の治癒を助ける。本発明の組成物を用いた外傷の
治療は、治療無し（即ち外部からの薬剤の適用無し）ま
たは精製PDGF単独であるいは精製EGF単独で治療して得
られる治癒よりも効果的である。
本発明の好ましい態様において、本発明の組成物は、薬
学的に許容される担体物質、例えば市販品として入手可
能な不活性ゲル、液体、または他の徐放供給システム
（例えばアルブミンまたはメチルセルロースの添加され
た塩類）に、重量比が5:1ないし10:1の範囲もしくは10:
1より大きい比の精製EGFおよびPDGF（いずれも市販され
ている。）を混合することによって調製される。精製PD
GFはヒト血小板から、または組換えDNA技術によって得
てもよい。このように用語「PDGF」とは、血小板由来の
ものおよび、哺乳類、好ましくは霊長類に由来する組換
え物質の両者を意味する。最も好ましくは霊長類はヒト
であるがまたチンパンジーあるいは他の霊長類でもよ
い。組換えPDGFは組換えヘテロダイマーでよく、それは
両方のサブユニットをコードするDNA配列を、培養され
た原核または真核細胞へ挿入して、その後翻訳されたサ
ブユニットが細胞によってヘテロダイマーを形成するよ
うに処理させて作られるか、あるいはまたサブユニット
のうち一つだけ（好ましくはβ鎖もしくは“2"鎖）コー
ドするDNAを細胞内に挿入してもよく、その細胞はその
後ホモダイマーPDGF（PDGF−１もしくはPDGF−２ホモダ
イマー）産生のため培養される。
学的に許容される担体物質、例えば市販品として入手可
能な不活性ゲル、液体、または他の徐放供給システム
（例えばアルブミンまたはメチルセルロースの添加され
た塩類）に、重量比が5:1ないし10:1の範囲もしくは10:
1より大きい比の精製EGFおよびPDGF（いずれも市販され
ている。）を混合することによって調製される。精製PD
GFはヒト血小板から、または組換えDNA技術によって得
てもよい。このように用語「PDGF」とは、血小板由来の
ものおよび、哺乳類、好ましくは霊長類に由来する組換
え物質の両者を意味する。最も好ましくは霊長類はヒト
であるがまたチンパンジーあるいは他の霊長類でもよ
い。組換えPDGFは組換えヘテロダイマーでよく、それは
両方のサブユニットをコードするDNA配列を、培養され
た原核または真核細胞へ挿入して、その後翻訳されたサ
ブユニットが細胞によってヘテロダイマーを形成するよ
うに処理させて作られるか、あるいはまたサブユニット
のうち一つだけ（好ましくはβ鎖もしくは“2"鎖）コー
ドするDNAを細胞内に挿入してもよく、その細胞はその
後ホモダイマーPDGF（PDGF−１もしくはPDGF−２ホモダ
イマー）産生のため培養される。
本明細書で用られる用語「精製」とは、PDGFまたはEGF
について、他方との混和に先立って、重量で95％または
それ以上の純度、即ち自然に伴う他の蛋白質、脂質、炭
水化物が実質的に含まれぬ様なPDGFまたはEGFを意味す
る。
について、他方との混和に先立って、重量で95％または
それ以上の純度、即ち自然に伴う他の蛋白質、脂質、炭
水化物が実質的に含まれぬ様なPDGFまたはEGFを意味す
る。
精製蛋白質の調製物は、一般に各PDGFまたはEGF成分に
対し、ポリアクリルアミドゲルで単一の主要バンドを示
す。最も好ましくは、本発明の組成物に用いられる精製
PDGFまたはEGFは、アミノ末端のアミノ酸配列分析によ
って純粋と判定されたものである。
対し、ポリアクリルアミドゲルで単一の主要バンドを示
す。最も好ましくは、本発明の組成物に用いられる精製
PDGFまたはEGFは、アミノ末端のアミノ酸配列分析によ
って純粋と判定されたものである。
本発明はまたは、少なくとも500ng/150mm2のEGFを、好
ましくは少なくとも5000ng/150mm2のEGFを精製PDGFとの
組み合わせで、傷に適用する外傷治療法に関するもので
もある。
ましくは少なくとも5000ng/150mm2のEGFを精製PDGFとの
組み合わせで、傷に適用する外傷治療法に関するもので
もある。
本発明の組成物は、哺乳類動物の外傷、例えば床擦れ、
裂傷、角膜の傷、火傷等の治癒に対し、迅速で効果的な
方法を提供する。本発明の組成物は自然治癒（即ち外的
薬剤の添加が無い場合）または純粋PDGFまたはEGF単独
の場合と比較して結合組織の生成を促進する。純粋PDGF
の単独適用とは異なり、本発明の組成物は新しい結合組
織と上皮組織の両者の顕著な増加を促進する。得られた
上皮層は自然治癒またはEGF単独で生成されたものより
も厚く、また該上皮層を新しい結合組織に結合する上皮
性突起もより多く含んでいる；このように上皮層はより
強固に結合され保護されている。
裂傷、角膜の傷、火傷等の治癒に対し、迅速で効果的な
方法を提供する。本発明の組成物は自然治癒（即ち外的
薬剤の添加が無い場合）または純粋PDGFまたはEGF単独
の場合と比較して結合組織の生成を促進する。純粋PDGF
の単独適用とは異なり、本発明の組成物は新しい結合組
織と上皮組織の両者の顕著な増加を促進する。得られた
上皮層は自然治癒またはEGF単独で生成されたものより
も厚く、また該上皮層を新しい結合組織に結合する上皮
性突起もより多く含んでいる；このように上皮層はより
強固に結合され保護されている。
本発明の他の特徴とするおよび有効性は、以下の好まし
い態様の説明および請求の範囲の記載から明らかになる
であろう。
い態様の説明および請求の範囲の記載から明らかになる
であろう。
好ましい態様の説明 ここで本発明の好ましい態様を記載する。
外傷、例えば床擦れ、糖尿病性潰瘍、火傷などが本発明
に従って純粋PDGFとEGFを組み合わせて調製されたPDGF/
EGF混合物を用いて治療される。組換えヒトEGFはアムジ
ェン社（Amgen），サウザンド・オークス，カリホルニ
ア）およびコラボレイティブ・リサーチ社（Collaborat
ive Research），ベッドフォード，マサチューセッツか
ら購入できる。精製組換えPDGFとヒト血小板に由来する
精製PDGFは、PDGF社（PDGF,Inc.）（ボストン，マサチ
ューセッツ）およびコラボレイティブ・リサーチ社から
購入可能である。精製PDGFはまた、下記の様にして調製
することもできる。
に従って純粋PDGFとEGFを組み合わせて調製されたPDGF/
EGF混合物を用いて治療される。組換えヒトEGFはアムジ
ェン社（Amgen），サウザンド・オークス，カリホルニ
ア）およびコラボレイティブ・リサーチ社（Collaborat
ive Research），ベッドフォード，マサチューセッツか
ら購入できる。精製組換えPDGFとヒト血小板に由来する
精製PDGFは、PDGF社（PDGF,Inc.）（ボストン，マサチ
ューセッツ）およびコラボレイティブ・リサーチ社から
購入可能である。精製PDGFはまた、下記の様にして調製
することもできる。
500ないし1000単位の洗浄ヒト血小板を1M NaCl（血小板
単位当たり2ml）に浮遊し、100℃で15分間加熱する。そ
の後上清を遠心分離し、沈澱を1M NaClで２回抽出す
る。
単位当たり2ml）に浮遊し、100℃で15分間加熱する。そ
の後上清を遠心分離し、沈澱を1M NaClで２回抽出す
る。
抽出物をまとめ、0.08M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム
バッファー（pH7.4）中で透析を行い、バッファーで平
衡化したCM−セファデックスＣ−50と混合して４℃で一
夜放置する。この混合をカラム（５×100cm）に詰め、
0.08M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.
4）での十分な洗浄の後、1M NaClで溶出し、10mlづつの
フラクションを集める。
バッファー（pH7.4）中で透析を行い、バッファーで平
衡化したCM−セファデックスＣ−50と混合して４℃で一
夜放置する。この混合をカラム（５×100cm）に詰め、
0.08M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.
4）での十分な洗浄の後、1M NaClで溶出し、10mlづつの
フラクションを集める。
活性の存在するクラクションを集めて、0.3M NaCl−0.0
1Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）に対して透析
し、遠心分離後0.3M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウムバッ
ファー（pH7.4）で平衡化されたブルーセルロース（フ
ァルマシア社）の2.5×25cmカラムに４℃で通過させ
る。次いでカメラを同バッファーで洗浄し、部分精製さ
れたPDGFを1M NaClとエチレングリコールの1:1溶液で溶
出する。
1Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.4）に対して透析
し、遠心分離後0.3M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウムバッ
ファー（pH7.4）で平衡化されたブルーセルロース（フ
ァルマシア社）の2.5×25cmカラムに４℃で通過させ
る。次いでカメラを同バッファーで洗浄し、部分精製さ
れたPDGFを1M NaClとエチレングリコールの1:1溶液で溶
出する。
部分精製されたPDGFフラクションを1M NaClで希釈し
（1:1）、1M酢酸液に対して透析し、そして凍結乾燥す
る。凍結乾燥試料を0.8M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム
バッファー（pH7.4）に溶解し、同バッファーで平衡化
したCM−セファデックスＣ−50の1.2×40cmカラムに通
過させる。次にNaCl濃度勾配（0.08ないし1M）でPDGFを
溶出させる。
（1:1）、1M酢酸液に対して透析し、そして凍結乾燥す
る。凍結乾燥試料を0.8M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム
バッファー（pH7.4）に溶解し、同バッファーで平衡化
したCM−セファデックスＣ−50の1.2×40cmカラムに通
過させる。次にNaCl濃度勾配（0.08ないし1M）でPDGFを
溶出させる。
活性を有するクラクションを集めて、1M酢酸に対して透
析し、凍結乾燥後少量の1M酢酸で溶解する。0.5ml量を1
M酢酸で平衡化したバイオゲルＰ−150（100ないし200メ
ッシュ）の1.2×100cmカラムに通過させる。その後PDGF
を1M酢酸で溶出し、2mlづつのクラクションを集める。
析し、凍結乾燥後少量の1M酢酸で溶解する。0.5ml量を1
M酢酸で平衡化したバイオゲルＰ−150（100ないし200メ
ッシュ）の1.2×100cmカラムに通過させる。その後PDGF
を1M酢酸で溶出し、2mlづつのクラクションを集める。
100ないし200mgの蛋白質を含む各活性クラクションを凍
結乾燥し、0.4％のトリフルオロ酢酸100mlに溶解して、
フェニルボンダパックカラム（ウォーターズ社（Water
s））の逆相高性能液体クロマトグラフィーに付する。
アセトニトリルの直線勾配（０〜60％）のよる溶出で純
粋PDGFが得られる。
結乾燥し、0.4％のトリフルオロ酢酸100mlに溶解して、
フェニルボンダパックカラム（ウォーターズ社（Water
s））の逆相高性能液体クロマトグラフィーに付する。
アセトニトリルの直線勾配（０〜60％）のよる溶出で純
粋PDGFが得られる。
組換えDNA技術によって作られるPDGFは以下の様にして
調製できる。
調製できる。
ヒト血小板に由来する血小板由来成長因子（PDGF）は、
二つのポリペプチド配列を含む（PDGF−１およびPDGF−
２ポリペプチド；アントニアディスおよびハンカピラー
（Antoniades,H.N.and Hunkapiller,M.）,Science,220:
963−965（1983））。PDGF−１は第７染色体に位置する
遺伝子によってコードされており（ベットショルツら
（Betsholtz,C.）,Nature,320:693−699）、PDGF−２は
第22染色体に位置する（ダラーファベラ（Dalla−Faver
a,R.）,Science,218:686−688（1982））sisオンコジー
ン（ドリトルら（Doolittle,R.）,Science,221:275−27
7（1983））によってコードされている。sis遺伝子は、
PDGF−２ポリペプチドと密接に関連するサル肉腫ウイル
ス（SSV）の形質転換を行う蛋白質をコードしている。
ヒト細胞性ｃ−sisはまたPDGF−２鎖もコードする（ラ
オら（Rao,C.D.）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:2392−2
396（1896））。PDGFの二本のポリペプチド鎖は別の染
色体上の二つの異なる遺伝子によってコードされている
ので、ヒトPDGFはジスルフィド結合したPDGF−１とPDGF
−２のヘテロダイマーであるか、あるいは二つのホモダ
イマー（PDGF−１のホモダイマーとPDGF−２のホモダイ
マー）の混合物か、またはヘテロダイマーと二つのホモ
ダイマーの混合物からなる可能性がある。
二つのポリペプチド配列を含む（PDGF−１およびPDGF−
２ポリペプチド；アントニアディスおよびハンカピラー
（Antoniades,H.N.and Hunkapiller,M.）,Science,220:
963−965（1983））。PDGF−１は第７染色体に位置する
遺伝子によってコードされており（ベットショルツら
（Betsholtz,C.）,Nature,320:693−699）、PDGF−２は
第22染色体に位置する（ダラーファベラ（Dalla−Faver
a,R.）,Science,218:686−688（1982））sisオンコジー
ン（ドリトルら（Doolittle,R.）,Science,221:275−27
7（1983））によってコードされている。sis遺伝子は、
PDGF−２ポリペプチドと密接に関連するサル肉腫ウイル
ス（SSV）の形質転換を行う蛋白質をコードしている。
ヒト細胞性ｃ−sisはまたPDGF−２鎖もコードする（ラ
オら（Rao,C.D.）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:2392−2
396（1896））。PDGFの二本のポリペプチド鎖は別の染
色体上の二つの異なる遺伝子によってコードされている
ので、ヒトPDGFはジスルフィド結合したPDGF−１とPDGF
−２のヘテロダイマーであるか、あるいは二つのホモダ
イマー（PDGF−１のホモダイマーとPDGF−２のホモダイ
マー）の混合物か、またはヘテロダイマーと二つのホモ
ダイマーの混合物からなる可能性がある。
PDGF−２をコードする遺伝子を持つサル肉腫ウイルスに
感染した培養哺乳類細胞は、PDGF−２ポリペプチドを合
成し、それをジスルフィド結合したホモダイマーにプロ
セシングすることが示されている（ロビンスら（Robbin
s,K.）,Nature,305:605−608（1983）。加えて、PDGF−
２ホモダイマーはヒトPDGFに対して作製された抗血清と
反応する。さらに、分泌されたPDGF−２ホモダイマーの
機能的特徴は、血小板由来のPDGFに似ていて、培養繊維
芽細胞内でDNA合成を刺激し、185kd細胞膜蛋白質のチロ
シン残基のリン酸化を誘発し、そして特異的細胞表面PD
GFリセプターへの結合についてヒト1 25Ｉ−PDGFと競合
可能である（オーエンら（Owen,A.）,Science,225:54−
56（1984））。同様な特徴は、培養正常ヒト細胞（例え
ばヒト動脈内皮細胞）で、またはsis/PDGF−２遺伝子を
発現しているヒト悪性細胞で産生されたsis/PDGF−２遺
伝子産物についても示された（アントニアディスら（An
toniades,H.）,Cancer Cells,3:145−151（1985））。
感染した培養哺乳類細胞は、PDGF−２ポリペプチドを合
成し、それをジスルフィド結合したホモダイマーにプロ
セシングすることが示されている（ロビンスら（Robbin
s,K.）,Nature,305:605−608（1983）。加えて、PDGF−
２ホモダイマーはヒトPDGFに対して作製された抗血清と
反応する。さらに、分泌されたPDGF−２ホモダイマーの
機能的特徴は、血小板由来のPDGFに似ていて、培養繊維
芽細胞内でDNA合成を刺激し、185kd細胞膜蛋白質のチロ
シン残基のリン酸化を誘発し、そして特異的細胞表面PD
GFリセプターへの結合についてヒト1 25Ｉ−PDGFと競合
可能である（オーエンら（Owen,A.）,Science,225:54−
56（1984））。同様な特徴は、培養正常ヒト細胞（例え
ばヒト動脈内皮細胞）で、またはsis/PDGF−２遺伝子を
発現しているヒト悪性細胞で産生されたsis/PDGF−２遺
伝子産物についても示された（アントニアディスら（An
toniades,H.）,Cancer Cells,3:145−151（1985））。
組換えPDGF−２ホモダイマー（ここでは組換えPDGFと呼
ぶ）は、ｃ−sis/PDGF−２遺伝子のcDNAクローンを発現
ベクターを用いてマウス細胞へ導入することにより得ら
れる。発現のために使用されるｃ−sis/PDGF−２クロー
ンは、正常なヒト培養内皮細胞から得られる（コリンズ
ら（Collins,T.）,Nature,216:748−750（1985））。
ぶ）は、ｃ−sis/PDGF−２遺伝子のcDNAクローンを発現
ベクターを用いてマウス細胞へ導入することにより得ら
れる。発現のために使用されるｃ−sis/PDGF−２クロー
ンは、正常なヒト培養内皮細胞から得られる（コリンズ
ら（Collins,T.）,Nature,216:748−750（1985））。
外傷の治療 傷の治癒を促進する、PDGF/EGF混合物の有効性を決定す
るため以下の実験を行った。
るため以下の実験を行った。
10ないし15kgの若い白色ヨークシャーブタ（パーソンズ
ファーム（Parson's Farm），ハドリー，マサチューセ
ッツ）を、手術に先立って少なくとも６時間絶食させた
後、麻酔した。無菌条件下で背中と胸の部分の毛を剃り
取って、穏やかな石鹸および水で洗浄した。傷をつける
領域を70％アルコールで消毒した。
ファーム（Parson's Farm），ハドリー，マサチューセ
ッツ）を、手術に先立って少なくとも６時間絶食させた
後、麻酔した。無菌条件下で背中と胸の部分の毛を剃り
取って、穏やかな石鹸および水で洗浄した。傷をつける
領域を70％アルコールで消毒した。
改良されたカストロビーヨ（Castroviejo）エレクトロ
ケラトーム（electrokeratome）（ストーツ社（Stor
z），セントルイス，ミズーリ，ブラウネル社（Brownel
ls）によって改良された）を用いて、1cm×2cmの大きさ
の傷を深さ0.5mmで作製した。この傷は表皮を完全に、
さらにその下の真皮も同様に除去する結果となった（火
傷の２度に匹敵する）。各々の傷は少なくとも15mmの間
隔で正常皮膚により隔たっていた。同じ治療を受ける傷
は、グループ分けされ、他のグループとは少なくとも3c
m離された。成長因子の治療を受けない傷は、そのよう
な治療を受ける傷から少なくとも10cm離した。
ケラトーム（electrokeratome）（ストーツ社（Stor
z），セントルイス，ミズーリ，ブラウネル社（Brownel
ls）によって改良された）を用いて、1cm×2cmの大きさ
の傷を深さ0.5mmで作製した。この傷は表皮を完全に、
さらにその下の真皮も同様に除去する結果となった（火
傷の２度に匹敵する）。各々の傷は少なくとも15mmの間
隔で正常皮膚により隔たっていた。同じ治療を受ける傷
は、グループ分けされ、他のグループとは少なくとも3c
m離された。成長因子の治療を受けない傷は、そのよう
な治療を受ける傷から少なくとも10cm離した。
傷は、生物親和性ゲルに浮遊させた以下の成長因子の一
回適用によって直接治療された:1）500ngの純粋ヒトPDG
F（高性能液体クロマトグラフィーで精製したもの）ま
たは組換えPDGFのみ;2）最高5000ngまでのヒト、マウス
または組換えEGFと組合わせた500ngの純粋組換えPDGF;
3）500ngないし5000ngのヒトもしくはマウスEGFまたは
組換えヒトEGFのみ。
回適用によって直接治療された:1）500ngの純粋ヒトPDG
F（高性能液体クロマトグラフィーで精製したもの）ま
たは組換えPDGFのみ;2）最高5000ngまでのヒト、マウス
または組換えEGFと組合わせた500ngの純粋組換えPDGF;
3）500ngないし5000ngのヒトもしくはマウスEGFまたは
組換えヒトEGFのみ。
創傷の作製に続いて、３〜10日目にかけて生検標本を採
取した。組織学的判定のための生検標本は、約3mmの深
さにクサビ状に採取し、10％ホルマリン中に貯蔵した。
生化学的分析およびオートラジオグラフィーのための標
本は、エレクトロケラトームを用いて採取した。標本の
最終寸法は1.5mm×10mm×1.5mmであった。生化学分析の
ために傷１つにつき三つの標本を集めた。標本は採取の
後液体窒素で凍結し、−80℃で保存した。生検標本は以
下のように分析された。
取した。組織学的判定のための生検標本は、約3mmの深
さにクサビ状に採取し、10％ホルマリン中に貯蔵した。
生化学的分析およびオートラジオグラフィーのための標
本は、エレクトロケラトームを用いて採取した。標本の
最終寸法は1.5mm×10mm×1.5mmであった。生化学分析の
ために傷１つにつき三つの標本を集めた。標本は採取の
後液体窒素で凍結し、−80℃で保存した。生検標本は以
下のように分析された。
組織学的判定 組織学的標本は標準的パラフィン浸漬と埋め込みの技法
を用いて調製した。４ミクロンの切片を作製し、濾過後
のハリスヘマトキシリンおよびアルコール性エオシンを
使って染色した；その後染色標本を顕微鏡下で観察し
た。全ての標本は二人の研究者が、切片全体をとおして
均等に分布する地点で標本名を隠して採点した。上皮と
結合組織層の幅は顕微鏡の接眼レンズ内に置いた格子盤
を用いて判定した；測定値は同じ条件下で眺めたミクロ
メーターを使ってミリメーターに換算した。細胞密度は
格子盤面積あたりの核数を数えて決定した。
を用いて調製した。４ミクロンの切片を作製し、濾過後
のハリスヘマトキシリンおよびアルコール性エオシンを
使って染色した；その後染色標本を顕微鏡下で観察し
た。全ての標本は二人の研究者が、切片全体をとおして
均等に分布する地点で標本名を隠して採点した。上皮と
結合組織層の幅は顕微鏡の接眼レンズ内に置いた格子盤
を用いて判定した；測定値は同じ条件下で眺めたミクロ
メーターを使ってミリメーターに換算した。細胞密度は
格子盤面積あたりの核数を数えて決定した。
コラーゲンおよび蛋白質の測定 ヒドロキシプロリンの含有量（即ちコラーゲン）は、解
剖用顕微鏡下で、1.5mm幅の凍結断面において、新しく
形成された傷組織を残りの組織からひき剥がして測定し
た。傷組織を6M HCI中で一夜120℃で加水分解し、この
加水分解物について、以前に報告された方法で（シュバ
イツァーら（Switzer）,Anal.Biochem.,39,487（197
1））ヒドロキシプロリンの分析を行った。
剖用顕微鏡下で、1.5mm幅の凍結断面において、新しく
形成された傷組織を残りの組織からひき剥がして測定し
た。傷組織を6M HCI中で一夜120℃で加水分解し、この
加水分解物について、以前に報告された方法で（シュバ
イツァーら（Switzer）,Anal.Biochem.,39,487（197
1））ヒドロキシプロリンの分析を行った。
濃水酸化アンモニウムによる組織抽出液の蛋白質含量を
ブラッドフォード法（ブラッドフォード（Bradford）,A
nal.Biochem.,72:248−54（1976））によって仔牛血清
アルブミンを標準として測定した。
ブラッドフォード法（ブラッドフォード（Bradford）,A
nal.Biochem.,72:248−54（1976））によって仔牛血清
アルブミンを標準として測定した。
結果 組織学的判定による結果は、組換えEGFとPDGFが重量比
で5:1ないし10:1の組み合わせで治療された傷は、全く
治療を受けなかった或いは組換えEGF単独もしくは純粋P
DGF単独の治療を受けた傷よりも、多くのコラーゲン
（コントロールより約２倍上昇）と上皮層（コントロー
ルより約0.8倍上昇）を持つより厚い結合組織とこれら
の層に結合するより広範な上皮性突起を有していた。
で5:1ないし10:1の組み合わせで治療された傷は、全く
治療を受けなかった或いは組換えEGF単独もしくは純粋P
DGF単独の治療を受けた傷よりも、多くのコラーゲン
（コントロールより約２倍上昇）と上皮層（コントロー
ルより約0.8倍上昇）を持つより厚い結合組織とこれら
の層に結合するより広範な上皮性突起を有していた。
PDGF/EGFで治療された傷はまた、より多くの細胞質、蛋
白質およびコラーゲン含量を有していた。
白質およびコラーゲン含量を有していた。
投与量 精製されたPDGFとEGFの適当な投与量を決定するため上
記実験を繰り返し、傷を１平方ミリメーター当たり5n
g、10ng、20ng、30ngの精製PDGFとEGFを30μ１の相容性
ゲル中に分散した混合物で治療した。その結果、PDGFの
含量が4ng/mm2またはそれ以上、EGFは20ng/mm2またはそ
れ以上のときに最高の効果が得られることが示された。
記実験を繰り返し、傷を１平方ミリメーター当たり5n
g、10ng、20ng、30ngの精製PDGFとEGFを30μ１の相容性
ゲル中に分散した混合物で治療した。その結果、PDGFの
含量が4ng/mm2またはそれ以上、EGFは20ng/mm2またはそ
れ以上のときに最高の効果が得られることが示された。
純粋PDGFのEGFに対する適当な比率を決定するため、PDG
FのEGFに対する重量比が1:10から25:1の範囲である組合
せが上記のようにして判定された。最適な結果は、1:5
以上の比率によって得られた。
FのEGFに対する重量比が1:10から25:1の範囲である組合
せが上記のようにして判定された。最適な結果は、1:5
以上の比率によって得られた。
他の態様は後述の請求の範囲にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アントニアデス，ハリー・エヌ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02158, ニュートン，マグノリア・ドライブ 21 (72)発明者 リンチ，サミュエル・イー アメリカ合衆国マサチューセッツ州01915, ビヴァリー，イースト・ストリート 26 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84（1987），Ｐ. 7696−7700 Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，Ｖｏｌ．203，Ｎ ｏ．２（1986），Ｐ．142−147
Claims (5)
- 【請求項１】精製表皮成長因子（EGF）および精製血小
板由来成長因子（PDGF）からなり、前記EGFとPDGFがそ
れぞれ重量比で少なくとも5:1の割合で存在する傷治癒
用組成物。 - 【請求項２】前記の比が少なくとも10:1である、請求項
１記載の組成物。 - 【請求項３】精製EGFおよび精製PDGFを重量比で少なく
とも5:1の比率で混和することよりなる、傷治癒のため
の組成物の製造方法。 - 【請求項４】精製PDGFおよび精製EGFからなる組成物の
傷治癒量を外傷部へ適用し、その際、該組成物中の精製
EGFを外傷中に少なくとも500ng/150mm2の濃度で存在さ
せるための請求項１または２記載の組成物。 - 【請求項５】精製EGFを少なくとも5000ng/150mm2の濃度
で外傷中に存在させるための請求項４記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/231,145 US5034375A (en) | 1988-08-10 | 1988-08-10 | Process of wound healing using PDGF and EGF |
| US231,145 | 1988-08-10 | ||
| PCT/US1989/003490 WO1990001331A1 (en) | 1988-08-10 | 1989-08-10 | Wound healing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03500782A JPH03500782A (ja) | 1991-02-21 |
| JPH075481B2 true JPH075481B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=22867921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1509811A Expired - Lifetime JPH075481B2 (ja) | 1988-08-10 | 1989-08-10 | 創傷の治癒 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5034375A (ja) |
| EP (1) | EP0382841B1 (ja) |
| JP (1) | JPH075481B2 (ja) |
| AU (1) | AU4319789A (ja) |
| CA (1) | CA1336816C (ja) |
| DE (1) | DE68912758T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990001331A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2016175358A1 (ko) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | 주식회사 제네웰 | 만성창상 치료용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 만성창상 치료용 드레싱재 |
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-
1988
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-
1989
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- 1989-08-10 WO PCT/US1989/003490 patent/WO1990001331A1/en not_active Ceased
- 1989-08-10 EP EP89910545A patent/EP0382841B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-10 AU AU43197/89A patent/AU4319789A/en not_active Abandoned
- 1989-08-10 JP JP1509811A patent/JPH075481B2/ja not_active Expired - Lifetime
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