JPH03500928A - ポリペプチド誘発モノクローナル受容体を用いる蛋白リガンド検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチド誘発モノクローナル受容体を用いる蛋白リガンド検出 関連出願に対する相互参照 本出願は、１９８７年４月１６日出願のシリアルＮｏ、０３９，５３４の一部継 続出願であり、該出願は、１９８５年５月２１日出願され、出願係属中の出願シ リアルＮｏ、７３６，５４５の一部継続出願であり、該出願は、出願係属中の出 願シリアルＮｏ、７０１．９５４の一部継続出願であり、該出願は、１９８４年 ８月１７Ｂ出願の出願係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０１３０４の一 部継続出願で、その米国国内段階は１９８５年２月！り日に入り、シリアルＮｏ 、７１３，４１０で、該出願は、１９８３年８月１７日に出願され、放棄された 出願係属中の米国出願シリアルＮｏ、５２４，０８４の一部継続出願である。

癌遺伝子への関心は過去１０年にどんどん起こってきた。ＲＮＡ腫瘍ウィルスは 、５０年以上の間、ニワトリに新形成を実験的に誘発する原因物質として関連付 けられて来たが、ウィルスで誘発され、た新形成の機構が現れはじめたのは１９ ７０年代半ばまではなかった［ビショップ（１９８３）アン、レブ、ビオケム、 ５２．３０１〜５４コ。そのような機構の一つによれば、複製適格鳥類ウィルス および欠損哺乳類ウィルスは、ウィルスに形質転換可能性をもたらす細胞遺伝子 を獲得する。

技術分野 本発明は、免疫学的受容体及びリガンドに関し、より詳しくは、そのアミノ酸残 基配列がレトロウィルスの癌蛋白リガンドの配列に対応するポリペプチドに対し て生じたモノクローナル受容体に関する。

背景技術 レトロウィルスは、ゲノム物質としてＤＮＡでなくＲＮＡの一本鎖を含むウィル スである。これらウィルスの各々の一本鎖ＲＮ　Ａゲノムは、ウィルスが感受性 宿主を感染した後に二本＃＊ＤＮＡを生じさせる。ウィルスゲノムのこのＤＮＡ レプリカは次に、成功裡に感染された細胞の染色体中に永久的に入り込み、この 宿主染色体中で複製する。

以下において及び請求の範囲で述べられるレトロウィルスはさらに、複製欠陥レ トロウィルスであると定義することができる。すなわち、これらウィルスは、ウ ィルスのＲＮ　Ａゲノムが感染宿主の染色体中に導入されうるＤＮＡへと翻訳さ れるのを可能にするのに通常必要な逆転写酵素をコードする遺伝子を自身で含ま ない。また、以下で述べるレトロウィルスは典型的には、その感染において複製 能力ある、いわゆるヘルパーウィルスにより補助されなければならない。この第 二のウィルスは、両ウィルスからのゲノム物質を成功裡に感染された宿主細胞中 に組み込んでこの細胞を形質転換する逆転写酵素をコードする遺伝子を含む。

理解の容易のために以下で及び請求の範囲において、複製欠陥レトロウィルスは 単にレトロウィルスとして述べられているが、これらが複製欠陥的であり、感染 の成功及び宿主細胞の形質転換のためにヘルパーウィルスの助けを必要とすると いうことか理解されよう。

レトロウィルスという言葉のこの用法は当該分野で知られており、更に説明する ことなくそのまま当該分野で用いられてきた。

レトロウィルス類のあるものは、宿主に接種された後短期間に固体腫瘍の形成を ひき起す能力により判断して高度に発癌性である。

これらウィルスはまた、実験室で育てられ培養される細胞において“癌的“変化 を起すことができる。そのような変化は、″形質転換″と呼ばれ、発癌ウィルス の信頼できるインビトロの応用生物学的評価を与える。このようなウィルスのい くつかが、鶏、七面鳥、マウス、ラット、ネコ及びサルから分離されている。

これら高度に発癌性のウィルスのゲノム上にある単一の遺伝子つまり癌遺伝子が 、ウィルスの腫瘍発生能力の原因となっている。いくつかのウィルスの場合、こ れら癌遺伝子の蛋白生成物（以下では癌蛋白又はオンコブロチインと云う）は、 ウィルス誘発腫瘍を持つ動物からの血清がこれら癌蛋白に対する抗体を含むとい う事実をｆｌＪ用して免疫学的に同定されてきた。

急速に増加している各種証拠は、レトロウィルスの癌遺伝子が総てのを椎動物の 正常細胞遺伝情報中の特定の遺伝子部位に密接に関係し、かつこれから誘導され ることを示している。

ｓｉｓ癌遺伝子の遺伝子生成物と血小板由来成長因子鎖の間の類似性［ドウリト ル等、（１９８３）サイエンス２２１．２７５〜２７７゜ウォーターフィールド 等、（＋９８３）ネイチャー３０４．３５〜３９］は、癌遺伝子による悪性形質 転換と成長因子による正常細胞分裂の促進との間に最も強固な結びっけを与える 。この癌遺伝子生成物と成長因子と細胞受容体の間の同一性は、ｅｒｂ　Ｂの正 常相同物であることか判った表皮成長因子細胞受容体の配列分析で一層確証され た［トロンワード等、（１９８４）ネイチャー３０７．５２１〜５２７、クルリ ッチ等、（１９８４）ネイチャー３０９．４１８〜４２５コ。さらに、ｆｍｓ抗 体とコロニー促進因子−１受容体の［シラー等、（１９８５）セル、６６５〜６ ７６コ、同様に蛋白キナーゼ類似性とインシュリン受容体の［ウルリッヒ等（１ ９８５）ネイチャー３１３．７５６〜７６１］および多くの配列化オンコブロチ インのキナーゼ活性を示した成牛因子受容体［ヤードン等（１９８６）ネイチャ ー３２３．２２６〜２３２］の免疫交叉反応性は、幾つかの放生因子のシグナル トランスダクションに重要であろう。

レトロウィルスにより獲得され、またはトランスフェクション実施により同定さ れた癌遺伝子の配列化は、キナーゼ家族数の数を大きく越えた。［ハンター等、 （１９８５）アン、シブ。ビオヘム、５４．８９７〜９３０］この配列分析は、 キナーゼ関連蛋白数が大きくて家族数は配列同一性および全体の構類似性に基づ くサブグループに分けられることを示唆した。キナーゼ家族は、好都合には、ド メインを結合している細胞外の（ホルモン／成長・因子）を有しまたは有しない 遺伝子生成物に分けられる。

ｓｒｃおよびｙｅｓキナーゼ蛋白間の非常な類似性は、ここ数年の間現れてきて いる。［キタムラ等、（＋９８２）ネイチャー２９７．２０５〜２０８コ最近、 付加遺伝子のシーフェンシングは、この同一性をｒｇｒ、［す−７／”ｉＱ等、 （１９８４）サイエンス２２２．６３〜６６］ｌ！ｃｋ、　Ｃマーシュ等、（１ ９８６）ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー８３．５４５９〜５４６ ３３および１２ｙｎ［ヤマナシ等（１９８７）モル、アンド・セル・パイオル、 １．２３７〜２４３コに拡大した。これら６つの全ての遺伝子は、はぼ同じ大き さ５５−６５ｋｄの蛋白を暗号に書き出し、遺伝子は、それらが同一先祖のプロ ト−癌遺伝子から進化したことを示しているイントロン／エクソン領域に分けら れる。しかしながら、各遺伝子は、別々のクロモシーム上に位置し、異なる組織 内の異なる蛋白を表現する。

多くの付加キナーゼ家族数もまた、サブグループに置かれ得る。

ｍｏｓ　［パン・ベヴユラン等（＋９８１）ネイチャー２９８．２５８〜２６２ コは、ｐｉｍ−１［セルテン等（１９８６）セル４６．６０３〜６１１］に深く 関連し、モロニー白血病ウィルスの好ましい統合部位の一つである。ａｂ１２　 ［レッディ等（１９８３）ブロク、ナトル、アセト。

サイ、ニーニスニー８０．３６２３〜３６２７］は、ａｒｇ［クルー等（１９８ ６）サイエンス２３４、■５４５〜１５４７コに深く関連している。ｆｅｓ［ハ ムプ等（１９８２）セル３０．７７５〜７８５］およびｆｐｓ［シブヤ等（１９ ８２）セル３０．７８７〜７９５］は、同一遺伝、子の哺乳類およびニワトリの 片ねれである。同様に、ｒａｆ　ニストレイヴ等（＋９８４）ネイチャー３０９ ．８５〜８８］およびｍ１ｆｆ：７−り等（１９８４）サイエンス２２４．２８ ５〜２８９コは、同一遺伝子の哺乳類およびニワトリの類似体である。これらは 、Ａ　−ｒｏｆ／ｐｋｓ［ワレイヘル等（＋　９８６）モル、アンド・セル・パ イオル、６．２６５５〜２６６２、マーク等（１９８６）ブロク、ナトル、アカ ド、サイ。

ニーニスニー８３．６３１２〜６３１６］に深く関連する。

ウィルスの片われを有しないサブグループは、蛋白キナーゼＣ１ホルボールエス テル用受容体を暗号に書き出す遺伝子を含む。このサブグループよりなる少なく とも３つの深く関連した遺伝子がある。

［コラセンス等（１９８６）サイエンス２３３．８５９〜８６６、クノフ等（１ ９８６）セル４６．４９１〜５０２］。さらに、遺伝子の一つは、二者択一のエ キメン使用による二つの蛋白を暗号に書き出す［オーツ等（＋　９８７）ネイチ ャー３２５．１６１〜１６１コ。他のよりわずかに関連する細胞質キナーゼは、 ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ−およびｃ　Ｇ　Ｍ　Ｐ−依存蛋白キナーゼ［ショージ等（１９ ８１）ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー７８．８４８〜８５１．タ カオ等（［９８４）バイオケミストリー２３．４２０７〜４２１８］、同様に、 ミオシンＬ鎖キナーゼ［タカオ等（１９８５）バイオケミストリー２４．６０２ ８〜６０３７］を含む。幾つかのトランスメンブランキナーゼもまた、過去数年 間に配列決定された。

ヒト表皮成長因子受容体（ＨＥＲ）に深く関連する遺伝子もまた、１３２〜１１ ３９］およびラット（ｎｅｕ）　［バーブマン等（１９８６）ネイチャー３１９ ．２２６〜２３０］を見出された。ｒｏｓ　［ネツカメイヤー等（１９８５）ジ ェイ、ヴイロル、５３．８７９〜８８４］に結合する成長因子は、その配列はイ ンシュリン受容体（Ｈｒ　Ｒ）［クルリッヒ等（１９８５）ネイチャー３１３． ７５６〜７６１］に最も深く関連しているにもかかわらず、知られていない。コ ロニー促進因子ｌ受容体、ＦＭＳ［ハムプ等（１９８４）ブロク、ナトル、アカ ド。

サイ、ニーニスニー８１，８５〜８９〕は、ｋｉｔおよび血小板誘発成長因子、 ＰＤＧＥ−Ｒ［ヤードン等（１９８６）ネイチャー３２３．２２６〜２３２］用 受容体とサブグループを形成する。加えて、ｔｒｋ［マーチンーザンカ等（１９ ８６）ネイチャー３１９．７４３〜７４８コおよびｍｅｔ　−８［ディージ等（ ＋９８５）ネイチャー３１８．３８５コ癌遺伝子の配列は、対応成長因子が知ら れていないにもかからず、発表された。

広くはないが同様の進展は、ｒａｓ癌遺伝子家族により表現される蛋白を結合し ているヌクレオチドにも見られる。配列データは、ｂａＳ［レディ等（１９８５ ）ジエイ、ヴイロル、５３．９８４〜９８７］がＨ−ｒａｓ［グー等（１９８２ ）サイエンス２１７．９３４〜９３７コのマウス形であること、およびＨ−なら びにＫ　−ｒａｓ生成物がカルボキシル部分で原則的に異なることを示す［ツチ ダ等（１９８２）サイエンス２１７．９３７〜９３９１゜二者択一のエキメンを 経てに−ｒａｓは、２蛋白［４Ａおよび４Ｂ］を暗号に書き出すことができる［ マツフグラス等（＋９８３）ネイチャー３０１，５０１〜５０６コ。第三のメン バー、Ｎ　−ｒａｓもまた、この部位中のＨ−およびに−ｒａＳから分かれる［ タパロウスキイ等（１９８３）セル３４．５８１〜５８６］。他の密接に関連す る遺伝子は、Ｒ−ｒａｓで［ロウ等（＋　９８７）セル４８．１３７〜１４６］ 、この遺伝子は３つのｒａｓ遺伝子、これらは同一先祖の遺伝子から進化してい る、と密接に関連しているが、Ｒ−ｒａｓは異なるイントロン／エクソンボーダ ーを有する。他の遺伝子、ｒｈｏ７［マヅル等（１９８５）セル４Ｌ３１−４０ コは、ｒａｓと類似の部位が分散する。さらに、第三のグループ、ｒｄも、同様 の類似部位を有する［チャーディン等（１９８６）エムボ・ジエイ、５．２２０ ３〜２２０８］。そのうえ、酵母遺伝子ｙｐｔ［ガルウイツ等（１９８３）ネイ チャー３０６．７０４〜７０７コは、ｒａｓと類似の部位を有し、この遺伝子は 、ｒａｓと非常に類似の２つの酵母遺伝子と明らかに異なる。即ち、これらはＲ −ＲＡＳにより類似する。

他の遺伝子、これらもｒａｓと類似する、はＧ蛋白［イト−等（１９８６）ブロ ク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー８３．３７７６〜３７８０］同様にト ランスダクションおよび伸長因子、ＴｕＪロクリー等（１９８５）サイエンス２ ２８．９６〜９９］を含む。Ｇ蛋白は、（Ｇｓ）を促進しくＧｉ）アデニレート シクラーゼを阻害するサブユニットから構成される。池の関連蛋白（Ｇｏ）は、 未知の機能を有する。これらの蛋白は、密接に関連した配列を有する、種々の異 なる形態に存在する。

核蛋白ｍｙｂ［ルン５０つ等（１９８２）サイエンス２＋６．１４２１〜！４． ２３］、ｍｙｃ　［コルビイ等（１９８３）ネイチャー３０１．７２２〜７２５ ］およびｆｏｓ［ヴアン・ストラーテン等（＋９８３）ブロク９ナトル、アカド 、サイ、ニーニスニー８０．３１８３〜３１８７コは、配列よりも！胞位置でよ り関連している、他の科の癌遺伝子よりなる。しかしながら、これらの癌遺伝子 に関連する付加遺伝子が同定された。Ｎ−ｍｙｃ［スタントン（１９８６）ブロ ク、ナトル、アカド。

サイ、ニーニスニー８３．１７７２〜１７７６］およびレ−Ｂｃ［ナラ等（１９ ８５）ネイチャー３１８．６９〜７３］配列は、発表され、そして発表された関 連配列は同定された。さらに、配列は、ｆｏｓとわずかに関連する。関連ｆｏｓ （ｒ　−ｆｏｓ）［コクラン等（１９８４）サイエンス２２６．１０８０〜Ｉ　 Ｏ８２Ｆ配列が、発表され、未発表のデータは、ｊｕｎ癌遺伝子が制限するよう にホスホリラーゼ阻止因子が類似性を制限することを示す。

他のグループの核癌遺伝子関連蛋白は、ステロイドおよび甲状腺ホルモン受容体 を含む。ｅｒｂ　Ａに関連する唯一の配列が発表された［サブ等（１９８６）ネ イチャー３２４．６３５〜６４０．ワインバーガー等（＋９８６）ネイチャー３ ２４．６４１〜６４６二：すれども、ハイブリッド形成研究は、ついに２つの関 連配列がヒトゲノムに存在することを示す［ワインバーガー等（１９８６）ネイ チャー３２４．６４１〜６４Ｌ］、ステロイド受容体配列は、ｅｒｂＡ（甲状腺 ホルモン受容体）が幾つかの受容体（エストロゲン、ダムコエルチェイド、プロ ゲステロン、アルデステロン）を含む上材の部分であることを示す［グリーン等 （１９８６）サイエンス２３１Ｓ　１１５０〜！［５３、ホルンバーブ等ネイチ ャー３１８．６３５〜６４１およびコンリイ等（１９８６）サイエンス２３３． ７６７〜７７０］。

成長因子グループにおいて、わずかにＰＤＧＦ−１鎖［ドールトル等（＋９８３ ）サイエンス２２１．２７５〜２７７およびウォーターフィールド等（１９８３ ）ネイチャー３０４．３５〜３９Ｅか５ｉｓ（ＰＤＧＦ−２）に類似の配列を有 する。しかしながら、他の成長因子：グレゴリイ（１９７５）ネイチャー２５７ ．３２５〜３２７、マーガーヅ等（＋　９８３）ブロク、ナトル、アカド、サイ 、ニーニスニー８０．４、６８４〜４６８８］（ＥＧＦおよびＴＧＦ）は、ｅｒ ｂＢプロトオンコジーンの生成物に結合し、Ｃ９Ｆ−１［カワサキ等（＋　９８ ５）サイエンス２３０，２９１〜２９６コは、ｆｍｓプロトオンコジーンに結合 する。さらに、ＴＧＦ［プリンク等（＋９８５）ネイチャー３１６．７０１〜７ ０５コは、ミューラー阻害物質〔ケイト等（Ｉ　９８６）セル４５．６８５〜６ ９８］と類似の理由で他のサブグループおよび種々の形の阻害中に見出される３ つの鎖［メイソン等（１９８５）ネイチャー３１８．６５９〜６６３およびヴエ イル等（１９８６）ネイチャー３２１．７７６〜７７９］を形成する。

最後に、ＭＭＴＶの２つの関連続合部位を表現している配列が発表された［ヴア ン・オーヤン等（１９８４）セル３９．２３３〜２４０およびムーア等（＋９８ ６）エムボ・ジエイ、５．９１９〜９２４コ。

このように過去数年、多くの関連、発表配列が劇的に増えて釆た。

こｉｔらの配列は、限られた数の、細胞分裂および分化を制御する通路が存在す ること、しかし多くの異なる要素がこの制御に関係しているらしいことを示唆す る。

レトロウィルスによる細胞遺伝子のごく一部のトランスダクションの例は、ｅｒ ｂＢ癌遺伝子である。ｅｒｂＢ癌遺伝子は、既に記載されたように、ＥＣＧ受容 体の一部と高度に類似する［コルリッチ等ネイチャー３０９．４１８（１９８４ ）］。全体の受容体遺伝子の配列分析は、全細胞内ドメイン、トランスメンブラ ンドメイン、および細胞外ドメインの部分を証明する。

特定の核酸検知手段を用いる分子的ハイブリッド化研究、及び続くウィルス癌遺 伝子及びその細胞関連物の遺伝子組換え技術による遺伝子クローニングは、レト ロウィルス癌遺伝子（ｖ−ｏｎｃ）と総ての正常を椎動物細胞に見られる細胞癌 遺伝子（ｃ−ｏｎｃ）の間の密接な関連を明らかにした。

このように十分分離された幾つかのレトロウィルスの分子的分析は、１ダ一ス以 上の異なる癌遺伝子を明らかにした。その多くの場合、対応する細胞レトロウィ ルス癌遺伝子またはオンコブロテインが分離された。たとえばヒトＥＪまたはＴ ２４膀胱癌遺伝子は、バービイ（Ｈａｒｖｅｙ）マウス肉腫ウィルス（ｒａｓＭ ａ）の及びＢＡＬＢ肉腫ウィルス（ｂａｓ）の形質転換遺伝子の相同体であると 同定された（バラタら、ネイチャー、２９７．４７４〜４７８（＋９８２）＋デ ルら、ブロク　ナトル　アカド　サイ　ニーニスニー、７９．３６２７〜３６３ ４（１９８２）；及びサントスら、ネイチャー、２９８．３４３〜３４７（１９ ８２））。また、ヒト癌腫細胞系統ＬＸ−１の癌遺伝子は、マウス肉腫ウィルス （ｒａｓＫ　ｉ）のキルステン（Ｋ　１ｒｓｔｅｎ）系統の形質転換遺伝子に相 同であると見い出された（デルら、前出）。さらに、トリ起源のｆｐｓと呼ばれ るｃ−ｏｎｃに対して同じＶ−。ｎｃが、限られた数のトリレトロウィルス分離 物のうち、少なくとも二度表現される；ネコ種においてｆｅｓと呼ばれるその哺 乳類同族物がネコ肉腫ウィルスの二つの異なる系統で見い出された。

ウィルス癌遺伝子によりコードされる蛋白及び宿主細胞内の対応する相同蛋白を 持つ蛋白は共に以下では癌蛋白と呼ばれるが、しかし細胞癌蛋白は典型的には正 常細胞中に少量で存在し、すなわち、新生状態にのみ伴う必要はない。また、関 連する癌遺伝子によりコードされる癌蛋白は異なる分子量を持つことができ、ｆ ことえば各々ｖ−ｆｅｓＳＴ及びｖ−ｆｅｓＧＡによりコードされるｐ８５及び ｐ１０８の癌蛋白、及び正常なミンク細胞のｃ　ｆｅｓ遺伝子によりコードされ ると考えられる１００〜１０５にダルトンの蛋白である［センら、ブロク、ナト ル、アカド、サイ、ニーニスニー、８０．１２４６〜１２５０（１９８３）］。

癌蛋白という言葉は本明細書で、その遺伝子及びアミノ酸残基配列が少なくとも 部分的に相同である蛋白に対して一般に用いられる。

癌蛋白は一般に、細胞を感染するウィルス粒子中には存在せず、感染及び形質細 胞中で精々最小に発現され、新生細胞中ではより多く発現される。すなわち、癌 蛋白は典型的には、ウィルスから得られない。また細胞からの癌蛋白の分離は、 存在量が少ないこと、正常細胞中に見られる蛋白の複雑な混合物及び形質転換さ れた細胞中にさえ存在するそのような蛋白の比較的少量の故に、困難である。

ｖ　−ｏｎｃ及びｃ−ｏｎｃ遺伝子によりコードされる癌遺伝子は、相同である が、にも拘わらず通常同一でないアミノ酸残基の大きな配列を含む。また各々が 表面上同じ癌遺伝子を含む異なるウィルス系統の遺伝子によりコードされる癌蛋 白に、上述に及び第１２番目のアミノ酸残基の位置で異なるｒａｓ遺伝子の四つ の刊行物に記載された配列により例示されるように、そのアミノ酸残基配列にお いて僅かな変化を持フことが見い出された。すなわち、癌蛋白が手中にある時で さえ、それらを区別することは困難であろう。

モノクローナル及びポリクローナル抗体又はこれら抗体のイディオタイプ含有蛋 白のような免疫学的に誘発された受容体分子は、それらが結合する蛋白リガンド を精製する際において、蛋白リガンドの存在及び量を評価するための診断剤とし て、及び相同の蛋白リガンド間を区別するために有用である。

多量の癌蛋白を得ることの困難性は、ｖ−ｆｅｓ及びｖ−ｆｐｓコードされる癌 蛋白に対する細胞誘発モノクローナル抗体全体がベロネセらにより報告されてい る（ジェイ　バイロル、４３．８９６〜９０４（１９８２））が、これら癌蛋白 に対する受容体の調製を一般的に妨げている。また、蛋白全体がそのような受容 体の製造を誘発する免疫原として利用できるとしても、免疫原として大きな蛋白 分子を使用すると、大きな蛋白分枝の多数のエピトープに対するポリクローナル 抗体を含む抗血清ができる。

蛋白全体又は大きな蛋白断片を免疫原として用いるハイブリドーマ及びモノクロ ーナル抗体技術は、そのような免疫原に対する免疫学的応答をせばめるのに有用 であった。しかし従来行われたそのような技術は、極めて時間を要し、免疫原を 認識する有用な抗体を分泌する比較的少数のハイブリドーマのみを与える。ま几 、成功である場合でも、そのような技術は、受容体分子がそれに対して生じられ るところのエピトープの化学的同一性を予測できない。従って免疫原を認識する 受容体が作られた後でも、蛋白リガンドの特定の化学的に同定されるエピトープ 部分に対する受容体を獲得することは、究局的に作られる有用なハイブリドーマ の数をさらに減少する、でたらめな操作である。

アルンハイターらは、５６のアミノ酸残基を含みかつアミノ酸残基配列において 完全なインターフェロン分子のカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドに対 して生じたモノクローナル抗体の製造を報告した（ネイチャー、２９４．２７８ 〜２８０（１９８１））。この５６−ｍａｒポリペプチドは、全分子の配列の約 ３分の１に対比した。

アルンハイターらは、１１のモノクローナル抗体の製造を報告した。しかしこれ ら１１のモノクローナル抗体のうち僅か１つのみが、ポリペプチド免疫原及び完 全なインターフェロン分子の双方に結合した。また、この結合は、合成ポリペプ チドからの抗体と競合するのに要する完全なインターフェロンの３０００倍過剰 により判定すると、あまり強くなかった。他のモノクローナル抗体のどれも、完 全な分子に結合しなかった。

また、これらモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの製造は、三匹の免 疫化されたマウスからのヒ臓を必要とする。望むインターフェロン結合性モノク ローナル抗体の低収量、及びこれらハイブリドーマ細胞系統の製造に三匹のマウ スヒ臓が必要であったという事実は、これら研究者が彼らの仕事において比較的 不成功であったことを示している。

レルナーらは、免疫原として短いものから中間の長さまでの合成アミノ酸残基配 列を用いて病原体に対するワクチンの使用により動物の保護を得ることに成功し た。サブトクリフェら、サイエンス、２１９．４９５〜４９７（１９８３）を参 照されたい。

しかし、本発明まではハイブリドーマ及びそれの分泌するモノクローナル受容体 の調製の成功は、オリゴクローナル受容体を含むワクチンの調製の成功とは別で あることを理解しなければならない。

すなわち、高収率のモノクローナル抗体調製のために、多量の親和な（ａｖｉｄ ）抗体を分泌するようにＢ細胞を刺激する必要である。一方、合成ワクチンにつ いて、オリゴクローナル抗体のより巾広いスペクトルはより少量でかつより乏し い親和性のものが作られるであろう。

また、病原体に対する動物の保護は典型的には、細胞応答及び液性応答が各々動 物において誘発さ２−うるようにＴ細胞及びＢ細胞活性化の双方を必要とする。

完全な蛋白を認識し動物宿主を保護する抗体を製造する際における合成ポリペプ チド含有ワクヂンの成功のポピユラーな説明は、免疫応答の多様性がまれな事象 すなわちポリペプチドが生得分子におけるその対応する配列の配座（コンホメー シクン）を採用することの観察を可能にする確率モデルを含む。中程度の長さの ポリペプチドはしばしば生得の構造に一致しうるという概念は、理論的及び実験 的研究に反する。むしろそのようなポリペプチドは、動的平衡にある多数の遷移 的配座状態の総体（アンサンプル）として存在すると考えられる。この配座のア ンサンプルのいくつかによるＴ細胞活性化及びいくつかに対して生じる抗体のＢ 細胞生産は、ワクチン接種による保護を与えるのに十分であると考えられてきた 。

発明の要約 本発明は、（ａ）レトロウィルス遺伝子によりコードされる蛋白リガンド、及び （ｂ）レトロウィルスの遺伝子によりコードされる蛋白の一部のアミノ酸残基配 列に対応するアミノ酸残基配列を持つ、約７〜約４０の残基、好ましくは約ｌＯ 〜約３０のアミノ酸残基の中庸な長さのポリペプチドの両者に結合するモノクロ ーナル受容体分子を考慮している。この受容体分子は、ポリペプチドを含む免疫 原に対して生じる（これにより誘発される）。最も好ましくは、受容体分子は、 免疫グロブリンのＩｇＧ又は１ｇＭクラスのようなモノクローナル受容体である 。

本発明の特定の好ましいモノクローナル受容体分子は、下記に列挙する遺伝子に よりコードされる蛋白に対して、及びこれら癌遺伝子に位置して列挙するポリペ プチドに結合する。

癌遺伝子　Ｋ皿 ｒ　ｅｓ　５ＤＶＷＳＦＧ　ＩＬＬＹＥＴＦＳＬＧＡＳＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ ：５ＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ。

ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ。

ＬＭＥＱＣ貰ＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ、及びＶＰＶＫＷＴＡＰＥＡＬＮＹＧＲ； ｍｙｂ　ＲＲＫＶＥＱＥＧＹＰＱＥＳＳＫＡＧ　：Ｉ’１）ＩＹＴＤＥＤＰＥＫ ＥＫＲＩＫＥＬＥＬ、及びＬＧＥＨＨｃＴＰｓＰＰＶＤＨＧ　。

ｆｏｓ　５ＧＦＮＡＤＹＥＡＳＳＲＣ；ＬＳＰεＥＥＥＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭ ＡＡＡＫＣ；及びＲＫＧＳＳＳＮＥＰＳＳＤＳＬＳＳＰＴＬＬ：ｓｉｓ　ＲＫＩ ＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶ；ＲＶＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＩ（ＲＫＣ ，及ヒｒａｓ　ＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤｉＰＭＶＬＶＧＮＫＣ：ＹＴＬＶＲ ＥＩＲＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣ；ＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩ ＳＫＥＥＫＴＰＧＣ：ＫＬＶＶＶＧＡＲＧＶＧＫ　。

ＫＬｎ’ＶＧＡＳＧＶＧｋ　：及び ）ｆＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ　： ｍｙｃ　ＣＤＥＥＥＮＦＹＱＱＱＱＱＳＥＬ：Ｆ’ＡＰＳＥＤＩｌ’ＫＫＦＥＬ 。

ＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲ３ＧＬＣ。

Ｃ５ＴＳＳＬＹＬＱＤＬＳＡＡＡＳＥＣ：及びＣＴＳＰＲＳＳＤＴＥＥＮＶＫＲ ＲＴ　；ｍｏｓ　ＬＰＲＥＬＳＰＳｖＤＳＲ； １１ＱＳＣＹＥＡＲＧＬＱＲＰＳＡ。

ＬＧＳＧＧＦＧＳＶＹＫＡ　。

ＰＱＡＳＰＰＨＩＧＧＴＹ　；及び ＴＴＲＥｌ’ＰＹＳＧＥＰＱ　： ｅｒｂ−Ａ　ＫＳＦＦＲＲＴＩＱＫＮＬＨＰＴＹＳＣ：ＶＤＦＡＫＩＰＭＦＳＥ ＬＰＣＥＤＱ　；及びＣＹＧＨＦＴＫ　Ｉ　ＩＴＰＡ　ＩＴＲＶＶＤＦＡ　。

ｅｒｂ−Ｂ　ＥＮＤＴＬＶＲＫＹＡＤＡＮＡＶＣＱ；ＬＧＳＧＡＦＧＴＩＹＫＧ ：及び ＩＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＦ。

ＰＤＧＦ−２ＳＬＧＳＬＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫ。

１？ＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶ、及びＲｖＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧ ＫＩ（ＲＫＣ。

ＰＤＧＦ−Ｉ　５ＩＥＥＡＶＰＡＥＣＫＴＲ；ＥＧＦ　ＣＩＨＤＧＶＣＭＹＩＥ ＡＬＤＫＹＡＣ：ａｂｌ　ＬＭＲＡ（ＪＱＷＮＰＳＤＲＰＳＦ：ＬＧＧＧＱＹＧ ＥＶＹＥＧ　；及び ＩＪＥＩＡＴＹＧＭＳＰＹＰＧＩＤ［，５ＱＶＹ。

ｆｍｓ　ＦＭＱＡ（ＪＡＬＦＰＴＲＲＰＴＦ　；及びＬＧＴＧＡＦＧＬｖＶＥＡ ＳＲＣＬＭＣＱＣＩＲＫＤＰＥＥＲＰＴＦ　；ＬＧＱＧＣＦＧＥＶＷＭＧ、及び ＣＧ５５ＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲＦＩＲ５：ｙｅｓ　ＬＭＫＬＣｖＫＫＤＰＤＥＲ ＰＴＣ；及びＬ置ＶＴＫＧＲＶＰＹＰＧＭＶＮＲＥＶＬ；ｆｑｒ　Ｌ置丁ＴＫＧ ＲＶＰＹＰＧＭＧＮＧＥＶＬ：ｂａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＫＧＶＣｉＫ　；１ｎｔ −Ｉ　ＬＨＮＮＥＡＧＲＴＩＶＦＳ；ｍｉｌ／ｒａｆ　ＬＶＡＤＣＬＫＫＶＲＥ ＥＲＰＬＦ：及びＩＧＳＧＳＦＧＴＶＹＩ？Ｇ　； ｒｏｓ　ＬＧＳＧＡＦＧＥＶＹＥＧ　；ＶＷＥＴＬＴＬＧＱＱＰＹＰＧＬＳＮＩ ＥＶＬ、及びＬＭＴＲＣＷＡＱＤＰＩ（ＮＲＰＴＦ。

本発明はまた、蛋白分子リガンドに対するモノクローナル受容体分子を作る方法 に関する。この方法において、中庸な長さく約７〜約４０の残基）の、好ましく は合成的に作られた、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチ ドの接合体が提供される。

このポリペプチドのアミノ酸残基配列は、蛋白リガンドのアミノ酸残基配列の一 部に対応する。この免疫原ポリペプチドは、キーホール　リンベット　ヘモシア ニンの担体に接合体として結合されてマウスを免疫化するのに用いられるとき、 三回後の免疫化の後に少なくとも約１：４．００希釈のポリペプチドに対する免 疫化されたマウス血清の５０パ一セント結合漢定量（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｉｔｅ ｒ）を与えるのに十分なほど免疫原的かつ抗原的である。ここで三回の免疫化の 各々は、接合体中に少なくともＩＯマイクログラムのポリペプチドを含み、第一 回の免疫化では完全なフロイントのアジュバントを、第二回及び第三回の免疫化 ではアジュバントとして明ばんを用いる。

哺乳動物は、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチドの接合 体で過免疫遇され、少なくとも約１　＋４００希釈のポリペプチドに対して５０ パ一セント結合滴定量を示す過免疫血清を与える。この血清の受容体分子はまた 、ポリペプチドがアミノ酸基配列において対応するところの蛋白分子リガンドに 結合する。

過免疫化された哺乳動物は、少なくとも約１　：４００の希釈の５０パ一セント 結合滴定量を与える免疫化を行った後、少なくとも約３０日間維持される。その 後、静脈内注射によるような効能促進免疫化を動物に付与する。

効能促進された哺乳動物のヒ臓細胞（スプレフサイト）のような抗体生産細胞が 、ハイブリドーマ細胞を作るために、効能促進投与の日から約３〜約５日の間に 骨髄腫細胞と融合される。このように作られたハイブリドーマ細胞は、蛋白分子 リガンド（この一部に免疫原ポリペプチドがアミノ酸残基配列において対応する ）に結合するモノクローナル受容体分子の生産について評価される。好ましくは ハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチドに結合するモノクローナル受容体分子 の生産について評価される。

蛋白分子リガンドに結合するモノクローナル受容体分子を生産するハイブリドー マ細胞は次に、その細胞の追加量を作るために培養される。好ましい実施におい ては、培養されたこれらハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチドに結合するモ ノクローナル受容体を作るものである。

本発明の別の実施態様は、癌蛋白リガンドの存在を評価する几めのキットのよう な診断系を与える。この系は、本発明のモノクローナル受容体分子を含む第一包 装を少なくとも含む。これら受容体の所定量を癌蛋白リガンドの存在を評価され るべき水性組成物の所定量と混合すると、癌蛋白が、受容体分子により結合され たポリペプチドのアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を含む場合には 、免疫反応により受容体−リガントコンプレックスを形成する。

コンプレックスの存在は、好ましくは系の第二包装に含まれるところのラベルに より同定されうる。好ましい癌蛋白リガンド含有水性組成物は、細胞抽出物、羊 水、尿および濃縮尿を含む。尿または尿濃縮物は、非侵入的手段により容易に得 られ、簡単に濃縮されて本明細書で述べる診断テストの実施を可能にする。細胞 抽出物及び形質転換された細胞によりコンディションされ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｅｄ）メディウムもまた、癌蛋白リガンドを含む適当な水性組成物であるよ評価 方法は、本発明のもう一つの考慮される実施態様である。ここで癌態様リガンド の存在を評価されるべき体試料、例えば血清、細胞抽出物、羊水、尿または濃縮 尿は、抗癌蛋受容体分子含有液状溶液に混合される。形成された混合物は、コン プレックス（免疫コンプレックス：反応生成物または免疫反応物）が癌蛋白リガ ンドと受容体分子（抗原−抗体コンプレックス）の間を形成するのに十分な時間 維持される、コンプレックスの存在は、その後決定される。

得られた、または濃縮形の尿が評価されるべき組成物であるのに対し、いかなる 基源、例えばポリクローナル、オリゴクローナル又はモノクローナルの抗癌蛋白 受容体も本発明に用いられる。本発明のモノクローナル抗体は、評価されるべき 他の試料に有用である。

免疫反応物の存在の決定は、典型的にはラジオアイソトープ又は酵素でラベルさ れた抗体又は形成免疫コンプレックスの受容体に結合するスタフィロコッカスア ウレウスプロティンＡを用いて行われる。

本発明の特に新規な側面は、体試料としての尿の使用である。ここに記載される 評価は、記載された如き濃縮尿を用いて実施されうる。癌遺伝子関連蛋白は、こ れまでの尿試料中で同定されていない。

本発明の評価側面は、特異的被評価試料の免疫反応性様式を与える多数の癌蛋白 関連ポリペプチドリガンドを用いることにより行なうことができる。得られる様 式は、診断を与える既知症状を有する個体から得られる尚武と比較する。

子宮内の雌胎児の存在確認方法も意図される。ここに妊娠した母親から得た、煮 沸し、少量化し、好ましくは濃縮した尿試料を、右から左に、そしてＮ末端から Ｃ末端に記載され１こ、（ｉ）ＬＭＥＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ　および（ｉ ｉ）ＹＲＥＱ　ＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣからなる群から選ばれ た式を有するポリペプチドと免疫反応しｆ二叉容体分子と混合する。尿試料は、 妊娠して約１６から約２０週間の間に採取される。混合物を、受容体分子が尿試 料中に存在する癌蛋白リガンドと免疫反応するのに十分な期間保持する。特殊免 疫反応体の存在は、その後評価される。免疫反応体は、受容体分子および癌蛋白 リガンドの間に形成され、上記ポリペプチドと免疫反応する受容体分子に対し約 ４０キロダルトンの５−１７バーセントポリアクリルアミドゲル中に、および上 記ポリペプチド（ｉｉｉ）と免疫反応する受容体に対し約５５キロダルトンの相 対分子質量を示す。これらの受容体分子のいずれかと免疫反応体の存在は、子宮 内に雌胎児が存在することを示す。受容体分子は、好ましくはモノクローナルで ある。

本発明の別の実施態様においては、モノクローナル受容体分子が、癌蛋白リガン トを結合し精製するのに有用な親和性吸着剤の活性な結合性部分を形成する。こ こで受容体は、癌蛋白に対して化学的に不活性な固体支持体たとえば寒天又は架 橋寒天に結合される。このようにして調製された親和性吸着剤は次に、蛋白リガ ンドを含む水性組成物に混合されて、蛋白リガンドが、受容体に結合されｆニボ リペプチドのアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ場合に、可逆 的受容体−リガントコンプレックスを形成する。このように形成されたコンプレ ックスは次に解離されて、純粋な形の蛋白リガンドを与える。

本発明は、いくつかの利益及び利点を与える。

本発明の一つの利益は、既知のアミノ酸残基配列のポリペプチドに含まれるエピ トープに結合するモノクローナル受容体分子である。

本発明の別の利益は、レトロウィルスによりコードされる蛋白リガンドの既知の アミノ酸残基配列に含まれるエピトープに結合するモノクローナル受容体分子が 作られることができ、ここでこれら蛋白リガンドは受容体分子の生産を誘発する ことを必要とされないことである。

本発明の利点の一つは、中庸な長さの免疫原ポリペプチド、及び蛋白リガンド分 子のアミノ酸残基配列にポリペプチドが部分的に対応するところの蛋白リガンド 分子の両者に結合するモノクローナル受容体の高収量生産法である。

本発明の別の利点は、癌蛋白の存在を評価できるモノクローナル受容体分子を含 むキットのような診断系の提供である。

本発明の別の利点は、非侵入的手段で得られた体試料を用いて達成できる診断法 の提供である。

本発明の別の利点は、種々の分子量の蛋白を検出でき、生体内で発現される正確 な癌遺伝子の差別的かつ高精度の評価を可能にすることである。

本発明の別の利点は、胎児発育、または新形成を含む他の成長状態の予知を可能 にし、非侵入評価で、母親または個体の尿を用いる診断方法の提供にある。

本発明のさらに別の利益及び利点は、下記の記述及び請求の範囲から当業者にと って明らかであろう。

図面の簡単な説明 本開示の一部を成す図面において： 第１図は、５Ｔ−ＦｅＳＶ　ｖ−ｒｅｓ癌蛋白の存在を検出するための免疫学的 評価を例示するオートラジオグラフの写真である。ネコ肉腫ウィルス（ＳＴ−Ｐ ｅＳＶ）及びネコ白血病ウィルスＢ　（Ｆ　ｅＬ　Ｖ−Ｂ）のシニデルー；工（ Ｓ　ｎｙｄｅｒ　−Ｔ　ｈｅｉｌｅｎ）系統で感染された生産的に形質転換した ミンク細胞系統であるＭＳＴＦ細胞の約１０５からの細胞抽出物（センら、ブロ ク　ナトル　アカド　サイ　ニーニスニー、８０．１２４６〜１２５０（１９８ ３））を５〜１７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次にニトロセルロ ースンートに移した。移した蛋白を次に、５１０ＦＯ３（レーンｌ）又は５２２ Ｃｏ　６（レーン２）と呼ばれるハイブリドーマ組織培養物又はネガテブ対照と して用いられた抗インフルエンザ赤血球凝集素ハイブリドーマからの上澄みと反 応させた。ポリアクリルアミドゲル分離及び続くニトロセルロースへの移転及び 可視化のこの手順は、以下ではウェスターンプロット法と呼ばれる。蛋白可視化 は、後記の材料及び方法の部で説明するようにして達成された。

第２図は、第１図と同様にウェスターンプロットによるｐ８５（８５キロダルト ン：８５にダルトン）と示されるＦｅ５Ｖ融合蛋白の存在を検出するための免疫 学的評価を例示するオートラジオグラフの写真である。約２♂１０６のＭ　Ｓ　 Ｔ　Ｐ細胞の細胞抽出物を５〜１７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、 次にニトロセルロース片に電気泳動的に移した。このニトロセルロース片を５Ｉ ＯＦＯ３（レーンＡ）：Ｐ４３Ｄ　ｌ　９（レーンＢ）、Ｐ４２Ｃ１０（レーン Ｃ）、Ｐ４４、Ｅｌｌ（レーンＤ）と呼ばれるハイブリドーマからのｌ：５０希 釈されたハイプリドーマ培養物上澄みの各５１１１１で又はネガテブ対照として 抗うウシェル（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）ｇｐ　７０蛋白受容体生産ハイブリドーマで あるＲ、０６ＢＯ８（レーンＥ）（ナイマン及びエルダー、プロフナトル　アカ ド　サイ　ニーニスニー、７７．４５２４〜４５２８（１９８０））でインキュ ベートした。

結合は、後に材料及び方法の部で述べるようにパーオキシダーゼラベルしたラビ ット抗マウスＩｇＧの添加により可視化された。第２図の左側のマーカー″ｐ８ ５−”は、ｆｅｓ遺伝子によりコードされる８５にダルトンの５Ｔ−ＦｅＳＶポ リプロティンの移動位置を示す。

レーンＥの蛋白から判るように、この手法は、本発明のモノクローナル受容体に より特異的に結合されない蛋白分子の可視化を可能にする。レーンＥで可視化さ れた非特異的に結合された蛋白をレーンＡ−Ｄで可視化された蛋白から引くと、 特異的にのみ結合された蛋白がｖ−ｆｅｓによりコードされるｐ８５癌蛋白であ ることを示す。

第３図は、ｐ８５と示される３５ｐラベルされたＦｅ５Ｖ融合蛋白の存在の免疫 沈澱評価を例示するオートラジオグラフの写真である。

ＣＣＬ６４ミンク細胞（ＭＳＴＦ細胞；レーンＢ及びＤ）、又はＦｅＬＶ−Ｂ及 びＦｅ５Ｖで感染されたこれら（Ｍ　Ｓ　Ｔ　Ｐ細胞；レーンＡ及びＣ）を各々 、Ｉマイクロキューリーの’３２Ｐで２時間ラベルした。

ラベルした細胞抽出物を次に、３μｇのヤギ抗ＦｅＬＶ　ｐ１５抗体（レーンＡ 及びＢ）又は５０μぐの培養されたハイブリドーマＳ　Ｉ　０ＦＯ３からの上澄 み（レーンＣ及びＤ）でインキュベートした。このように調節した免疫コンプレ ックスを、蛋白Ａを発現するスタフィロコッカス　アウレウス　バクテリアを用 いて集めた。このように集めた沈澱したコンプレックスを洗い、次にその成分部 分に解離した。その後の蛋白を、５〜１７％ポリアクリルアミドゲルを用いて還 元変性電気泳動下で分析した。第３図の左のマーカー“ｐ３５．−”及び“ｐｒ ３５−”は、ｆｅｓ遺伝子でコードされる８５にダルトンの５Ｔ−ＰｅＳＶ融合 蛋白、及び６５にダルトンのＦｅＬＶギャグ前駆体蛋白の移動位置を示す。

第４図は、アミノ酸残基配列において、（ｉ　）ｐ２８　ｓｉｓと呼ばれるサル 肉腫ウィルス形質転換蛋白の予告される配列の位置１３９〜１５５（デバレら、 ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、８０．７３１〜７３５（１９８ ３）に対応する合成ポリペプチド（以下ではポリペプチド（ｃ）またはナンバー １１３及びＰＤＧＦ２（７３〜８９）と呼ばれる）、及び（ｉｉ））り赤芽球ウ ィルス癌蛋白の予告されるアミノ酸残基配列の残基２〜１８に対応する合成ポリ ペプチド（ルシュロウら、サイエンス、２１６．１４２１〜１４２３（１９８２ ））（以下ではポリペプチド（ｄ）またはナンバー１３１と呼ばれる）に対して 生じたオリゴクローナル抗体の免疫反応性を示すグラフである。キイホール　リ ンペット　ヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合しｆ二合成ポリペプチドは、材料及び 方法の部で一般に述べるようにマウスを免疫化するのに用いられた。

このように調製されたオリゴクローナル抗体含存血清の特異性をテストするため に、非接合ポリペプチドの２５０ナノグラム又はＫＬＨの５００ナノグラムをマ イクロ滴定溜の底で乾燥し、ナイマン及びエルダー、モノクローナル　アンヂボ ディーズ　アンド　ティゼル　プロダクツ、カッッ編集、シーアルシー　プレス 、ボヵラトン、フロツク、ｐｐ２３〜５１（＋９８２）に記載されるようにメタ ノールで固定した。溜りの残留部分を、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３ ７°Ｃで４時間のインキュベーション時間を用いて非特異的蛋白吸着に対してブ ロックした。

マイクロ滴定プレートの各々の溜りに、１０％胎児牛血清で補われた組織培養媒 体を用いてｌ　：４００の希釈から出発して二倍希釈の免疫化マウス血清の各２ ５μｅを滴下し、ＥＳＡブロックした。

蒸留水で１０回洗った後、１％ＢＳＡでＩ　：５００希釈された、リン酸塩緩衝 されｆ二食塩水（ＰＥＳ）中のラビット抗マウス　カッパ抗体（シントン　バイ オニクス　インク、ケンシントン、メリーランド）の２５μＣを加え、３７℃で ２時間インキュベートした。蒸留水で更？こ１０回洗った後、グルコースオキシ ダーゼに接合され、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでＩ：５００希釈されたヤギ抗ラビッ トＩｇＧの２５μＣを加え、３７℃で１時間インキュベートした。

このように結合されたグルコースオキシダーゼの量は、１．２％のグルコースの 存在下で１００μｇ／Ｉ＋ｌｌのＡＢＴＳ染料（ベーリンガー・マンハイム）及 びｐＨ６，０の持つ０．１モル濃度リン酸塩緩衝液中の１０μｇ／ｍｌのホース ラディシュバーオキシダーゼを含む溶液５０μＱを加えることにより決定される 。このように調製された溶液の光学的密度は、ティターチク　マイクロスキャナ ー、（フローラボラトリーズ　インク、イングルウッド、カルナルニア）を用い て４１４ｎｍで読んだ。

ｓｉｓ及びｍｙｂに関係するポリペプチドに対して生じた血清中のオリゴクーロ ナル抗体により示される結合は、各々白抜き及び塗りつぶしたシンボルで示され る。抗体抗原は、ｓｉｓ関係ポリペプチド（Ｃ）（○、Ｏ）；　ｍｙｂ関係ポリ ペプチド（ｄ）（、）１及びＫＬＨ（、）である。

第５図は、合成ポリペプチド（ｃ）及び（ｄ）により誘発されたオリゴクローナ ル抗体（受容体）を含むマウス抗血清をプローブとして用いて、非還元の及び還 元され１．、、　、、　、、、：＼板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の存在を検出す るための免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。ＰＤＧＦ抽出物 は、材料及び方法の部で述べるように古式の血小板から精製された。

約２．５単位の血小板からの精製したＰＤＧＦ抽出物は、０．５％ドデシル硫酸 ナトリウム（ＳＤＳ）及び５％の２−メルカプトエタノールを含む溶液の極小量 と混合された。得た混合物を２分間沸騰し、次に５〜１７％ポリアクリルアミド ゲルで電気泳動した。次に蛋白を電気泳動的にニトロセルロースに移し［ナイマ ン及びエルダー、ヴアイロロジー、１２３．１８７〜２０５（１９８２）］、ウ ェスターン　プロット法に続いて、次に細片を切断した。

このようにして調製したニトロセルロース片を次に、非得意的蛋白結合を禁止す るためにＰＢＳ中に３％ＢＳＡ、０．１％ポリオキシエチレン（９）オクチルフ ェニルエーテル（トリトン（商標）Ｘ−１００、ローム　アンド　ハースカンパ ニー、フィラデルフィア）を含む溶液で処理した。！＋２００希釈されたマウス 抗血清の４ｍｌを次にニトロセルロース片でインキュベートした。

ＰＢＳ中０．１％　トリトン（商標）Ｘ−１００の溶液で３度洗った後、ニトロ セルロース片を１″■でラベルしたスタフィロコッカス　アウレウス蛋白Ａ（レ ーン２及び３）の１分当りｌＯＩ′カウントで又はパーオキシダーゼを接合され たヤギ抗マウス血清（タボインク、バーリンガム、カリフォルニア）のｌ：１０ ００希釈でインキュベートし、そして再びＰＢＳ中０．１％トリトン（商標）Ｘ −１００で洗った。パーオキシダーゼ接合体は、７．４のｌ）Ｈ値を持つトリス 緩衝液１０ｍ１中に０．０００９％Ｈ３Ｏ７，０，００２５％３，３゛−ジメト キシベンチジンジヒドロクロライド（イーストマンーコダック社、ロチニスター 、ニューヨーク）を含む溶液で現像された。１″５Ｉラベルされた片を、クロネ ックス　ハイ−プラス（イー、アイ、デュポン・ド・ネモアス・アンド・コ１． ウイルミントン、プラウエア）を用いてＸＲＰ−１フイルム（イートマンーコダ ック社、ロチニスター、ニューヨーク）上に露出し、−７０℃で４８時間スクリ ーンを補力して現像した。

レーンＩはアミドブラックで染色された全蛋白を含む。精製された血小板抽出物 は、ｓｉｓ関係ポリペプチド（Ｃ）（レーン２及び４）又はネガヂブ対照として ｍｙｂ関係ポリペプチド（ｄ）（レーン３及び５）に対して生じた抗血清でプロ ーブされて示される。ＢＳＡ、オバルブミン、キモトリプシノゲン又はβ−ラク トグロブリンに基づく外部分子量基準は左方に示される。

第６図１よ、前述したのと同様のウェスターン　プロット法を用いてＰＤＧＦの 存在のための免疫学的評価を例示するためのオートラジオグラフの写真である。

ＦＤＯＦは、ナイマン、ネイチャー、３０７．１８０−１８３（１９８４）に記 述される手順に従って、電気泳動的蛋白分離の前に１０％２−メルカプトエタノ ールの存在（レーンＡ−Ｆ）又は不存在（レーンＧ−Ｌ）下で沸騰された。ＰＤ ＧＦ−１のアミノ末端の１２のアミノ酸残基（ＰＤＧＦ−１（１−１２）と呼ぶ ）により誘発された二つのオリゴクローナル抗体含有抗血清をレーンＡ及びＧ１ 及びレーンＢ及びＨで用いた。ＰＤＧＦ−２の中央部からのポリペプチド［ＰＤ ＧＦ−２（７３−８９）及びポリペプチド（ｃ）と呼ぶコ（これはｐ２８ｓｉｓ の位置１３９−１５５のアミノ酸残基配列に対応する）で誘発された二つのオリ ゴクローナル抗体含有抗血清をレーンＤ及びＪル−ンＥ及びＫで用いた。ＰＤＧ Ｆ−２のアミノ末端の１７の残基［ＰＤＧＦ−２（＋　−１８）と呼ぶ］で及び カルボキシ末端から３６−１６残基に位置するＰＤＧＦ−２の２０の残基［ＰＤ Ｃ；Ｆ−２（＋　２６−１４５）と呼ぶｊｌこれはｐ２８ｓｉｓの位置＋９１− ２１０の配列に対応する、により誘発されたオリゴクローナル抗体含有抗血清を 、各々レーンＣ及び１１及びレーンＦ及びＬで用いた。蛋白に結合している抗体 は、ナイマン（前出）、及び後述の材料及び方法の部ぶ述べるようにラビット抗 マウスｒｇＧＩを用い、次にＩｔＪでラベルされたスタフィロコッカスアウレウ スプロティンＡのＩ　、　ＯＩｌｃｐｍにより可視化された。

第７図は、ウェスターンプロット手段を用いる３つのセルライン中の７０，００ ０ダルトン蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。

ＳＳＶ形質転換され７′：Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３細胞（レーンＡ−Ｅ）、ＴＲＤＩ 細胞（自然形質転換され几Ｂ　ａｌｂ／　３　Ｔ３セルライン）（レーンＦ−Ｊ ）およびＭ　Ｓ　Ｔ　Ｐ細胞［ＦｅＬＶ−ＢおよびＦｅ５Ｖのスナイダーサイレ ン株で増殖性感染さメ−たミンク肺ライン（ＣＣＬ６４）］（レーンに一〇）の 各々からのレーン当り約ｌＯ＠細胞からの抽出物を、ニトロセルー−スシートに 移し、ウェスターンプロット法に付した。ＰＤＧＦ−１（＋　−１２）により誘 発されたオリゴクローナル抗体含有抗血清は、レーンＡ−Ｃ＜　Ｆ−Ｈおよびに −Ｍに用いられた。ＰＤＧＦ−２（７３−８９）により誘発されたオリゴクロー ナル抗体含有抗血清は、レーンＤＳＥ、ｒ、Ｊ。

Ｎおよび０に用いられた。抗血清は、転移された細胞抽出物で免疫反応する前に 、１００マイクログラムのポリペプチドＰＤＧＦ−１（＋−１２０レーンＡ、Ｄ 、Ｆ、Ｉ、ＫおよびＮ）、ＰＤＧＦ−２（１−１８）（レーンＢＳＧおよびＬ） およびＰＤＧＦ−２（７３−８９ＸレーンＣ，Ｅ、ＨＳ　Ｊ、ＭおよびＯ）とイ ンキュベートした。蛋白は、第６図に記載されるように視覚化された。

第８図は、５ＳＶ−変形正常ラット腎臓および正常ラット腎臓（ＮＨＫ）細胞に よりそれぞれコンディションされた培養培地中、ｐ２０ｓｉｓの存在の免疫学的 評価を示すオートラジオグラフの写真である。

２５ミリリツトルの非濃縮培地に均等の、５ＳＶ−変形細胞（レーンＡ、ＣＳＥ およびＧ）またはＮ　ＨＫ細胞（レーンＢＳＤ、ＲおよびＨ）によりコンディシ ョンされた、濃縮培地からの蛋白は、ニトロセルロースに移され、次いでウェス ターンプロット法を行なった。

）（レーンＡ−Ｄ）およびＰＤＧＦ−２（７３−８９ＸレーンＥ−Ｈ）により誘 発されたオリゴクコ−ナル抗体含有抗血清と混合される。

血清は、転移された蛋白と免疫反応する前に、１００ミリグラムのポリペプチド ＰＤＧＦ−２（７３−８９）（レーンＡ、ＢＳＧおよびＨ）およびＰＤＧＦ−２ （１−１ｓＸレーンＣ，Ｄ、ＥおよびＦ）とインキュベートされた。免疫反応は 、第６図に記載されるように視覚化された。第８図の左側のマーカーｐ２０ｓｉ ｓは、ｐ２０ｓｉｓの位置を示す。

第９図は、ヒト癌也者からの尿中のｓｉｓ及びｆｅｓ抗血清により誘発された又 はこれと関係する蛋白の存在の免疫学的評価を例示する几めのオートラジオグラ フの写真である。この評価における液状の体試料は、材料及び方法の部ぶ述べる ようにして得られた尿濃縮物であった。濃縮された尿は、５〜１７％ポリアクリ ルアミドゲルで電気泳動され、次にニトロセルロース上で電気泳動された。

三人の供与者からの尿を２００倍ａ縮し、透析し、そして各濃縮物の２０μＣを 電気泳動し、その中の蛋白を前述のようにニトロセルロースに移した。これら三 人の供与者は、直腸癌（レーンＡ、Ｄ、Ｇ及びＪ）、肝臓癌（レーンＢ、Ｅ、Ｈ 及びＫ）、及びエライン肉腫（Ｅ　ｗｉｎｇ’　ｓ　ｓａｒｃｏｍａ）（レーン Ｃ，Ｆ、Ｉ及びＬ）を持っていた。免疫化ポリペプチドでブレインキュベートさ れたｓｉｓ関係ポリペプチドＰＤＧＦ−２（７３−８９）により誘発されたオリ ゴクローナル受容体含有抗血清をレーンＤ−Ｆで用い、一方、ｖ−ｆｅｓＳＴ癌 蛋白の位置７４４−７５９に位置する配列に対応するｆｅｓ関係ポリペプチドで ブレインキュベートされに同じ抗血清をレーンＡ−Ｃで用いた。同様に、免疫化 ポリペプチドでブレインキュベートされた上記ｆｅｓ関係ポリペプチドにより誘 発さイーたオリゴクローナル受容体含有抗血清をレーンＧ−ｒで用い、一方、上 述のｓｉｓ関係ポリペプチドでブレインキュベートされた同じ抗血清をレーンＪ −Ｌで用いた。

オリゴクローナル受容体と蛋白の間の免疫反応（結合している）は、第６図につ いて記述のように可視化さノまた。尿濃縮物中で検出されたｓｉｓ及びｒｅｓ　 Ｉａｌ係蛋白の位置は、左及び右端に各々マーカー“ｓｉｓ”及び“ｆｅｓ”に より示される。

第１Ｏ図は、尿中のｒａｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグ ラフの写真である。

尿は、２５０倍（レーンＡおよびＢ）、３５倍（レーンＣ）、７０倍（レーンＤ ）、７５倍（レーンＥ）および３２５倍（レーンＦ）に濃縮した。尿を透析し、 ２０ミクロリツトルの各濃縮物を電気泳動し、その中の蛋白を前述のようにニト ロセルロースに移した。供与者は、正常（レーンＡ、ＢおよびＦ）または以下の コンディション、３８週妊娠（レーンＣ）、リンパ腫（レーンＤ）および結腸癌 （レーンＥ）の一つを有するとして診断された。同一正常患者は、１４日間隔で 実収され、且つレーンＡ、ＢおよびＦで用いられた尿試料を提供した。

全尿試料を、ポリペプチドｒｅｓｓＴ（レーンＡ）の残基７４４〜７５９、ポリ ペプチドｒａｓＨａ（レーンＢ）の残基９６−１１８またはポリペプチドｃ−ｓ ｉｓ（レーンＣ−Ｆ）の残基１３８−１５４でブレインキュベートしたｐ２　＋ 　ｒａｓ（ポリペプチド１４２）残基９６−１１８で誘発されたｌＯミクロリッ トルの抗ｒａｓ腹水を用いて評価した。

オリゴクローナルおよび蛋白間の免疫反応し結合している）は、第６図について 述べたように可視化された。尿濃縮物中に検出されたｒａｓ関連蛋白の位置は、 マーカーｒａｓによる左辺縁上に示される。

ｒａｓ癌遺伝子に関連していることが検出された蛋白は、ｒａｓ関連ポリペプチ ド１４２まで上げられたＡＴ　ＣＣＮｏ、ＨＢ　８６７９と名付けられたハイブ リドーマにより分泌されたモノクローナル抗体により検出される。この約５５に ダルトンの蛋白は、レーンＡ中に検出され、その活性は、免疫ペプチド（レーン Ｂ）とのブレインキュベーションによりブロックされた。同一正常個体から実収 された尿は、２週間後間−蛋白を含む（レーンＦ）。この蛋白は、妊娠患者（レ ーンＣ）および癌患者（レーンＤおよびＥ）の尿から実収された。

第１１図は、ウェスターンプロット手段を用いる３つのセルライン中の２３にダ ルトン蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である８図面 のレーンは、それぞれ、ミンク肺ライン肉腫ウィルス（ＭＳＴＦ）細胞（レーン Ａ−Ｆ）のスナイダーシーレン昧により形質転換されたミンク肺セルラインまた は非感染Ｍ　Ｓ　ＴＦセルラインＣＣＬ（レーンＧ−Ｌ）からのレーン当り約１ ０＠細胞からの抽出物を含む。各細胞抽出物は、ポリアクリルアミドゲルからニ トロセルロースシート上に移され、次いでウェスターンプロット手段に付される 。

抽出物は、ｖ　−ｒａｓＨＡ　（ｒａｓ　−２、レーンＡ、Ｇ）の残基５−１６ に対応するポリペプチド＋４１又は、ｐ２１　ｒａｓ（ｒａｓ　−１、レーンＢ １Ｈ）の残基９６−１１８に対応するポリペプチド１４２とブレインキュベート したｐ２１　（ｒａｓ　−１、レーンＡ、Ｂ、ＧＳＨ）の残基９６−１１８に対 応するポリペプチド１４２に上げられた抗血清を用いて評価した。

同じ細胞抽出物を、ｐ８５−　ｆｅｓ（ｆｅｓ　−１、レーンＣ，Ｄ、Ｉ、Ｊ） の残基７４４−７５９又はｐ８５−　ｆｅｓ（ｆｅｓ　−２、レーンＥ％Ｆ、Ｋ 。

Ｌ）の残基７４４−７５９に対応するポリペプチド！２１に上げられた抗血清で 評価される。抗血清は、転移された細胞抽出物と免疫反応する前にｆｅｓ−１ポ リペプチド（レーンＤ、Ｊ）、ｒｅｓ−２ポリペプチド７４４−７５９（レーン Ｆ、Ｌ）又はｒａｓ　−１ポリペプチド（レーンＣ，Ｅ、ｌ５Ｋ）とブレインキ ュベートされる。蛋白は、第６図について記載したように視覚化された。

第１２図は、自然形質転換マウス３Ｔ３セルラインＴＲＤ−１（レーンＡＳＢ） 又はヒトＴ−２４膀胱癌ライン（レーンＣ５Ｄ）からの上清中の分泌蛋白の存在 の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。上清は、分泌ｒｅｓ関 連蛋白の存在が評価された。

セルラインは、血清の非存在下に成育され、生成の４８時間後集収された。３５ マイクロリツトルの、１５００：ｌ　Ｔ−２４セルライン上清濃縮物または１０ ００：Ｉ　ＴＲＤ−１細胞濃縮物を、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、 次いでニトロセルロースに移した。

ｐ８５　ｒｅｓ（ｆｅｓ−２）の残基７４４−７５９に対応するｖ−ｆｅｓＳＴ 合成ポリペプチドに対するマウス抗血清を評価に用いた。抗血清はｖ　−ｒｅｓ ｓ　Ｔ　（ｆｅｓ　−１、レーンＡおよびＢ）の残基５１９−５３０に対応する 合成ポリペプチド又は抗血清にまで上げられるｒｅｓ−２ポリペプチドとブレイ ンキュベートされた。

抗血清は、次いで転移された細胞上清と免疫反応される。蛋白は、第６図につい て記載したようにして視覚化される。

第１３図は、ウェスターンプロット手段を用いる細胞抽出物中のｒａｓ関連蛋白 の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。

約ＩＯの自然形質転換マウスを３Ｔ３細胞の細胞抽出物をレーンＡ−Ｄに用いた 。３５ミクロリツトルの、マウス３Ｔ３　ＴＲＤ−Ｉ細胞からの４８時間上清の １５００倍濃縮物をレーンＥＨに用いた。上清の蛋白は、ポリアクリルアミドゲ ルで電気泳動に付し、次いでニトロセルロース上に移される。ｖ−ｆｅｓＨＡの 残基９８−１１８に対応するポリペプチド！４２に対するオリゴクローナル抗体 含有抗血清は、非関連ｆｅｓポリペプチド（レーンＡＳＣ，Ｅ、Ｇ）又は免疫（ レーンＢ、Ｄ、ＦＳＨ）に用いられるｒａｓポリペプチドとブレインキュベート される。蛋白は、第６図において記載したようにして視覚化された。

第１４図は、ウェスターンプロット手段を用いる細胞抽出物中のｒａｓ、　ｓｉ ｓまたはｆｅｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真 である。図面のレーンは、それぞれネコ肉腫ウィルス（ＭＳＴＦ細胞）のスナイ ダーシーレン株で形質転換しｆニミンク肺細胞のレーン当り約１０’細胞からの 抽出物を含む。

抽出物を、ｐ２１　ｒａｓ（ポリペプチド１４２、レーン２）の残基９６−１１ ８、ＰＤＧＦ−２（ポリペプチド１１２、レーンりの残基１−１８およびｖ−ｆ ｅｓ（ポリペプチド１２７、レーン３）の残基７４４−７５９に対応するポリペ プチドまで上げられた抗血清を用いて評価された。蛋白は、第６図について記載 されたようにして視覚化された。

第１５図は、上で記載したと同様のウェスターンプロット手段を用いる尿中のｓ ｉｓ、　ｆｅｓおよびｒａｓ癌遺伝子により暗号に書き出されるか、又は関連す る種々の蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。本 評価における溶液体試料は、材料および方法の部に記載したようにして得られた 尿濃縮物であった。濃縮した尿は、５−１７％ポリアクリルアミドゲルに電気泳 動し、次いでニトロセルロース上で電気泳動した。

８人の供与者からの尿を４０倍に濃縮し、透析し、モして２５ミクロリツトル（ ａ縮しない尿の１人ｇと同等）を電気泳動し、その中の蛋白を前に記載したよう にニトロセルロースに移した。これらの供与者は、多発性骨髄（レーンｌ、パネ ルＡおよびＢ）胃癌（レーン２、パネルＡおよびＢル−ン１、パネルＣおよびＤ ）３５週妊娠（レーン３、パネルＡおよびＢ）リンパ腫（レーン４、ベイン（ｐ ａｎｅ）　ＡおよびＢ）、胃癌（レーン１、ベインＣおよびＤ）、３６週妊娠（ レーン２、パネルＣおよびＤ）、乳癌（レーン３、ベインＣおよびＤ）３９週妊 娠（レーン４、パネルＣエンド（ｅｎｄ）　Ｄ　）および乳癌（パネルＥ）を有 する。

５ｉｓ（パネルＡおよびＢ）　ｒａｓ（パネルＣおよびＤ）又はｒｅｓ関連ポリ ペプチド（パネルＥ）により誘発されたモノクローナル又はオリゴクローナル受 容体含有抗血清は、免疫ポリペプチドを評価する几め各試料をプローブするのに 用いらメー几。２０ミクロリツトルの腹水（ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢにより 誘発され、以下に記載された、およびＰＤＧＦ−２の配列中、位置１−１８に対 応するｓｉｓ関連ポリペプチド＋１２まで上げられたハイブリドーマにより誘発 された、それぞれベインＣおよびＤ、およびＡおよびＢ）又はマウス血漿（ｆｅ Ｓ癌蛋白の配列中、位置７４４−７５９に対応するポリペプチドまで上げられた 、パネルＥ）は、＋００ミクログラムの免疫ｒａｓポリペプチド１４２（パネル Ａ、Ｄ、およびパネルＥのレーン２）、ｓｉｓポリペプチド１１２（パネルＢお よびＣ）またはｆｅｓポリペプチド（パネルＥ１　レーン３）と、ｅｒｂＢ（パ ネルＥ、レーン３）により暗号に書き出された位置３６６−３８１に対応するポ リペプチド１７１と、またはａＭ（パネルＥル−ン４）の位置５９０−６０５に 対応するポリペプチド３１２と３７℃で３０分間ブレインキュベートされた。

ブレインキュベーションに続いて、試料は、ＰＢＳ中、７．４のｐＨ値テ３パー セントＢＳＡ、０．１パーセントトリトン（商標）Ｘ−１００にｌから１０００ 希釈した。抗血清を、次いで上記したと同様にして評価した。結合は、第６図で 記載したようにして視覚化した。

第１６図は、尿中、ｒａｓ、ｓｉｓおよびｒｅｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価 を示すオートラジオグラフの写真である。

尿は、１ケ月の間隔で、活性乳癌を有するとして既に診断された供与者から実収 した（レーンｌ、７．２．５．８．３．６．９、パネルＡ）。尿を集め、透析し 、１ｍ（２非濃縮尿の相等量をパネルＡの各レーンに適用した。

パネル已において、パネルＡル−ン３，６又は９に用いた同一試料の一部を、下 記等量の非濃縮尿に適用した。１００Ｏミクロリツトル（レーンｌ）、５００ミ クロリツトル（レーン２）、２５０ミクロリツトル（レーン３）、１２５ミクロ リツトル（レーン４）、６０ミクロリツトル（レーン５）、３０ミクロリツトル （レーン６）、＋５ミクロリツトル（レーン７）、７．５ミクロリツトル（レー ン８）。

試料は、ｒａｓ　（位置９６−１１８、ポリペプチド１４２、パネルＡル−ン１ −３、パネルＢ）、ｒｅｓ（位置７４４−７５９、ポリペプチド１２７、パネル Ａ１　レーン４−６）又はｓｉｓポリペプチド（ＰＤＧＦ−２位置１−１８、ポ リペプチド＋１２、パネルＡル−ン７−９）で、合成ペプチドとブレインキュベ ーションを行なわない以外は第１５図に記載したと同様にして調製しプローブし た。

第１７図は、尿中のｒａｓおよびｆｅｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価を示すオ ートラジオグラフの写真である。評価される尿試料の供与者は、再発の乳癌（レ ーンｌ、２）を宵すると診断されたか又は正常個体（レーン３−８）であった。

ｒａｓ関連蛋白（パネルＡ）およびｆｅｓ関連蛋白（パネルＢ）の評価は、第１ ６図に記載したようにして実施した。評価される試料は、乳癌（レーン３）から の臨床解除にある患者、３ケ月後、乳癌が再見された（レーン２）ときの同一患 者および正常女性（レーン３−５）からの尿で、試料は、３日置きに実収し、正 常女性は１２時間置きに採集しくレーン６−７）および正常男性（レーン８）で あった。

第１８図は、癌を有する供与者からの尿試料中のｒａｓ、ｆｅｓおよびＳｉｓ関 連蛋白の検出を示すオートラジオグラフの写真である。乳癌（レーンｌ）、前立 腺癌（レーン２）、前立腺小結節（レーン３）又はリンパ腫（レーン４）の供与 者からの尿を、採集し、第１６図で記載したと同様に、５ｉｓ（パネルＡ）、ｒ ａｓ（パネルＢ）又はｆｅｓ（パネルＣ）に対する抗血清を用いてプローブした 。レーン１，２中にあるｐｓｇＳよりわずかに遅く移動する横じまは、これらの 試料中における過剰量のアルブミンを示す。増加レベルのｐ”ｓｉｓおよびｐ” ｓｉｓは、パネルＡル−ン１．２中の増加したアルブミンレベルと関連するけれ ども、乳又は前立腺癌ををする供与者からの他の尿試料は、上昇したアルブミン レベル（データ提示せず）の不存在下における増加レベルのｓｉｓ関連蛋白を含 む、パネルＢル−ン１−３中の最も遅い移動槽じまは、ｐ　Ｉ　ＯＯｒ　ａ　ｓ を確認する。一方、パネルＢレーンｌ−４中のし鎖よりわずかに速い横じまは、 ｐ”　’　ｒａｓを確認する。

第１９図は、妊娠供与者からの尿中の癌遺伝子関連蛋白の検出を示すオートラジ オグラフの写真である。

妊娠の最終月の間１週間間隔で採集した同一固体からの４つの尿試料を、ｓｉｓ 関連ポリペプチド１１２（ＰＤＧＦ−２位置！−１８、パネルＡ）、ｒａｓポリ ペプチド１４２（位置９６−１１８、パネルＢ）又はｆｅｓポリペプチド１２７ （位置７４４−７５９、パネルＣ）に対する抗血清でプローブした。パネルＣの 過剰暴露は、ｐ″５ｆｅｓ５ｆｅｓレーン３およびｐ”ｆｅｓ（レーン４）の存 在を示す。Ｌ鎖横じまよりわずかに速く移動するか又はゲルの底の（パネルＣル −ン２−４）の蛋白は、ｔｅａペプチドに対するマウス抗血清で検出された。加 えて、１５０，０００ダルトンの蛋白も、ｆｅｓペプチドに対するマウス抗血清 で検出された。尿試料は１週間間隔で採集した。

第２０．２１および２２図は、プロティンキナーゼ活性を有する癌蛋白の３つの 保存された部分のアミノ酸配列を示す表である。これらの部分は、第２０．２１ および２２中、保存されたキナーゼ部分として、それぞれ命名される、プロティ ンキナーゼ活性を有する癌蛋白をプログラムしている癌遺伝子は、左手カラムに 普通の記号により示した。中央のカラ１１は、Ｎ末端から、保存されたアミノ酸 残基配列の癌蛋白ポリペプチド配列中の位置を確認する。右手カラムは、左から 右に、およびＮ末端からＣ末端の方向に、これらの保存された部分のアミノ酸残 基配列を示す。アミノ酸残基配列も、本発明のモノクローナル受容体の生成を誘 発するための免疫源とじて有用なポリペプチドの配列である。

第２３図は、５！コントロール（正常供与者）の尿試料および種々の悪性を伴う 供与者からの尿試料中の癌遺伝子関連蛋白の検出の度数を示す表である。尿中の 癌遺伝子関連蛋白の量は、イムノプロット法を用いて評価し、４つのカテゴリー 、検出不可能、検出可能、５から１５倍上昇および１５倍上昇より大の−っに置 いた。

ｐ”ｒａｓは、新生腫瘍疾病を持っている供与者からの全試料の約７０パーセン トに検出された。しかしながら、同様の度数は、明らかに正常な個体に見出され た。ｐ”ｒａｓの最もきわたった上昇は、子宮および胃癌、同様にミエローマお よび奇胎（ｍｏｌａｒ）妊娠の供与者からの試料に検出され、その全ては、試料 の少くとも３０パーセントに：この蛋白の１５倍上昇よりも大であった。

第２４図は、妊娠供与者からの２６０尿試料中の癌遺伝子関連蛋白の種々のレベ ルの検出を反映するデータの表である。試料は、妊娠の３ケ月期に従ってグラフ 分けした。多重尿採集物は、多くの供与者から得られた。評価は、以下の材料お よび方法の部に記載した手法および方法に従って実施されｆこ。乳癌を存する供 与者のザブセットを持つので、以下に論するが、非常に高レベルのｐ”ｒａｓが 、妊娠の経過中ずっと、妊娠供与者のグループに検出された。ｓｉｓおよびｆｅ ｓ関連蛋白は、妊娠の進行とともに増加した。

ｐｓｓｒａＳのレベルは、妊娠の幾つかの過程で劇的に変化した。対象的に、ｐ ５５ｒａｓのレベルは、正常又は乳癌供与者からの多重試料に検出し、ｒａｓ関 連蛋白の濃度は、幾らかの供与者では、１週間に１５倍以上大きく増加した。

３つのｓｉｓ関連蛋白の濃度は、妊娠の最終月はずっとほとんど同じであった。

Ｉ）３５ｆｅｓは、妊娠の最終２週間に検出され、一方ｐ”ｆｅｓは、最終の週 だけに検出された。

分娩後６週間採集した尿試料は、これらのｓｉｓ関連蛋白の上昇した濃度を含有 し続けたが、ｒａｓおよびｆｅｓ関連蛋白は正常にもどった（データ提示せず） 。

第２５図は、ｆｅｓにより形質転換しｆニミンク肺細胞イムノプロットを示す。

ミンク細胞抽出物は、ｒｅｓ（レベルＡ−Ｉ）又はｅｒｂＢ　（レベル、　Ｊ　 、Ｋ）に対する種々の抗体でプローブした。

第２６図は、ヒト類表皮癌細胞のイムノプロットを示す。ヒト類表皮癌セルライ ンの抽出物は、第１図に用いたと同じ抗体でプローブした。

第２７図は、妊娠糖尿病患者からの濃縮尿試料のイムノプロットを示す。妊娠糖 尿病患者からの濃縮尿試料は、第１図に用いた抗体でプローブした。

第２８図は、子宮内膜腫瘍抽出物のイムノプロットを示す。子宮内膜腫瘍の抽出 物、（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号０７１−７８１４７３−１）、は、ｆｅｓ（レー ンＡ−Ｈ）又はｅｒｂＢ（レーンＩ−Ｌ）に対する抗体でプローブした。レーン Ａ−Ｄ中の抗体は、エリサ評価においてレーンＥ−Ｈのそれらとは異なる反応性 パターンを与える。レーン■およびＪは、ｖ−ｅｒｂＢの領域に向けられ、そし てレーンにおよびＬは、同じ癌遺伝子に対し異なる反応性パターンを生ずる。

第２９図は、胸肉腫抽出物のイムノプロットを示す。乳肉腫（ＮＩＨ受は入れ番 号＋２ｌ−９６（１−１）は、リンパ節まで転移（ｍｅｔａｓｔｅｒｉｚｅ）Ｌ 、たが、その抽出物は、第４図に用いた抗体でプローブされた。

第３０図は、乳肉腫、（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号３ｌ−１４４５９）のイムノプ ロットを示し、その抽出物は、第４図に用いた抗体でプローブした。

第３１図は、子宮肉腫、（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号３ｌ−１３５３０）のイムノ プロットを示し、その抽出物は、第４図に用いた抗体でプローブした。

第３２図は、胸肉腫（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号１２１−９６０−１）、それはリ ンパ節まで転移（ｍｅｔａｓｔｅｓｉｚｅ）シたが、のイムノプロットを示す。

この転移性乳肉腫抽出物は、　ｒｏｓ（レーンＡ）、ｒｅｓ（レーンＢ）、ＢＴ ＧＦ（レーンＣ−Ｃ）、ｒａｓ（レーンＨ−Ｊ）およびｅｒｂＢ　（レーンに− Ｎ）に対する抗体でプローブした。

第３３図は、ＮＩＨ肉腫３１−１８２６５から誘導された転移性子宮癌のイムノ プロットを示す。この癌は網まで転移し、第８図に用いた抗体でプローブでした 。

第３４図は、転移性結腸癌（ＮＩＨ受は入れ番号３ｌ−１８１５２）、これはリ ンパ節まで転移した、のイミノプロットを示す。本抽出物は、第８図に用いた抗 体でプローブした。

第３５図は、転移性子宮癌（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号０３１−１０１２８−１） のイムノプロットを示す。子宮癌、それは網まで転移したが、この本抽出物は、 第８図に用いｆこ抗体でプローブした。

第３６図は、膵臓からのリンパ腫１ＮＩＨ受は入れ番号０２１−５００７３−１ ）のイムノプロットを示す。本抽出物は、第８図に用いた抗体でプローブした。

第３７図は、乳癌抽出物（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号０３１−１２３９−１）のイ ムノプロットを示す。本抽出物は、第８図に用いた抗体でプローブした。

第３８図は、直腸肉腫抽出物（ＮＩＨ受は入れ番号０３１−１２３９−１）のイ ムノプロットを示す。本抽出物は第８図に用い几抗体でプローブした。

第３９図は、転移性肺癌（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号０４１−７８２９７−１）の イムノプロットを示す。本肺癌、これはリンパ節まで転移した、この抽出物は、 第８図に用いた抗体でプローブした。

第４０図は、ラット線条体のイムノプロットを示す。ラット線条体の抽出物は、 １８日令胎児から取り、２日令、１８日令、７０日令および１年令ラットを、Ｈ ／Ｎ−ＲＡＳ（レーンＡ）、Ｈ−ＲＡＳ（レーンＢ）、ＭＹＣ（レーンＣ）、ｖ 　−ｍｙｂ（レーンＤ）、ｉｎｔ　−１（レーンＥ）および２つの異なるｓｉｓ 誘発抗体（レーンＦおよびＧ）でプローブした。

第４１図および４２図は、Ｎ　Ｉ　Ｈ寄託機関に寄託のセルラインから誘導され た肉腫抽出物の反応性パターンを示す表である。抽出物は、種々の抗体でプロー ブし、反応結果のパターンは、癌遺伝子生成物の存在およびレベルで点を与えた 。得点は、イムノプロット技法を用いて導かれる横じまの強さを基準にした。

第４３図は、化学療法を受けている妊娠栄養膜を者の尿中癌遺伝子関連蛋白の同 期出現（ａｓｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）を示す。化学療 法を受けている妊娠栄養間患者からの連続的尿試料は、ｓｉｓ残基（レーンＡ　 ）　Ｈ／　Ｎ　−ＲＡ　Ｓ残基（レーンＣ）、ＭＹＣ残基（レーンＤおよびＥ） 、ｓｒｃ残基（レーンＦおよびＧ）および１ｎｔ−１残基（レーンＨ）に何けら れた抗体でプローブした。

発明の詳細な説明 本発明は、癌蛋白全部リガンドに対するモノクローナル受容体分子、かかる受容 体を誘発又は生じさせる一般的方法、及びこれら受容体を用いる製品及び方法に 関する。本明細書でしばしば用いる言葉を以下で定義する： 受容体−受容体に、リガンドに結合する生物学的に活性な分子である。本発明の 受容体分子は、完全な全体の抗体又はほぼ完全な抗体又は抗体のイディオタイプ 含有ポリアミド部分である。受容体分子の生物学的活性は、少くとも生物学的ｐ ）（値及びイオン強度で水性媒体中で混合されると抗原性リガンドに受容体が結 合することにより証明される。好ましくは受容体はまた、約５〜約９のｐ）ｌ値 範囲及び蒸留水のイオン強度ないしＩＭの塩化ナトリウムのイオン強度のような イオン強度で抗原リガンドに結合する。

抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド部分（抗体結合部位）は、イディオタイ プを含み、リガンドに結合し、かつ抗体のＦａｂ及び（ａｂ゛）１部分を含む抗 体分子の部分で、当業界で周知であり、はぼ完全な抗体への各々パパインとベブ ンンの周知法での反応により作られる。たとえばチオフィロポラスとディキソン への米国特許Ｎｏ、４゜３４．２．５６６を参照されたい。完全な抗体が好まし く、本発明で考えられる受容体分子の例として用いられる。

モノクローナル受容体−モノクローナル受容体（Ｍａｂ）は、唯一種の受容体分 子のみを分泌するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンにより作られた 受容体である。ハイブリドーマ細胞は、抗体生産細胞と骨髄腫又は他の自己永続 する細胞系統かみ融合される。

そのような受容体は最初にコーラ−及びミルスティン、ネイチャー又ｌ且、４９ ５−４９７（１９７５）により記述され、この記述は引用することによりここに 含められる。

オリゴクローナル受容体−オリゴクローナル受容体は、中庸な長さ、たとえば約 ７〜約４０、より好ましくは約１０〜約３０のアミノ酸残基のポリペプチド上の 一以上のエピトープにより誘発されこれにより結合する受容体である。オリゴク ローナル受容体は通常、−以上の細胞により生産された受容体の混合物である。

そのように作られたオリゴクローナル受容体は通常、蛋白績（単数又は複数）の 長さ全体に亘りエピ−ドブ領域を持ちつる全蛋白分子に対して生じたポリクロー ナル受容体よりも、その結合においてよりエピ−ドブ特異性である。ここで有用 なポリペプチドで免疫化された動物は、オリゴクローナル受容体（抗体）を含む 血清を作る。

リガンド−リガンドは、本発明の受容体がそれに結合するところの蛋白又はポリ ペプチドである。

対応する（又は相当する）一対応する又は相当するという言葉がアミノ酸残基配 列と関係１．７で用いられるとき、第一のポリペプチド又は蛋白のアミノ酸残基 配列が第二のポリペプチド又は蛋白に含まれるアミノ酸残基配列に十分に類似し ており、従って第一のもの（たとえば抗原合成ポリペプチド）に対して生じた受 容体が第二のもの（几とえば癌蛋白）と水性組成物中で混合されたとき免疫学的 に結合するものであることを意味する。かかるポリペプチドおよび／又は蛋白は 、また、同種エピトープを含んでおり、それゆえ少くとも約６から約８、例えば ７の残基の同種配列を共通にしているということができる。

対応する第−及び第二のポリペプチド又は蛋白のエピトープ含有アミノ酸残基配 列は、最も好ましくは同一である。しかし、エピトープ内におけるアミノ酸残基 の変更、好ましくは保守的変更、及び残基の削除又は付加を行うことができ、第 一のポリペプチド又は蛋白に対する受容体と第二のものとの周知のような架橋反 応をなお可能とする。アミノ酸残基における保守的変更は周知であり、リシン（ Ｌｙｓ；ｋ）とアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）の間、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ） とグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）の間、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）とイソロイシン（ ■ｌａ；　Ｉ　）の間などの残基の交換が含まれる。

本発明で有用なポリペプチドは、蛋白のアミノ酸残基配列の一部に対応するアミ ノ酸残基配列を持つとしばしば記述される。そのようなポリペプチドは好ましく は、担体にポリペプチドを結合する又はリンクするために用いられるＣｙｓ残基 のような末端残基に加えて同定的に対応するアミノ酸残基のみを含む。蛋白中の 残基に対応しない追加的アミノ酸残基がポリペプチド末端に存在してもよく、し かしその上うな残基の使用は、本発明では考慮はされるが通常無駄であり、かつ 好ましくない。

同様に、蛋白は、ポリペプチドのアミノ酸残基配列がその一部に対応するところ のアミノ酸残基配列を持つと記述される。この云い方は、ポリペプチドと蛋白の 間の上述と同じ関係を示すことを意図している。

個々のアミノ酸残基のフルネームは、周知の三文字略記と同様に、ときに用いら れる。アミノ酸残基のための一文字記号が最もしばしば用いられる。下記の対応 表は、ここで挙げられる各アミノ酸残基のフルネーム、ならびに略記及び記号を 示す。

アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ アスパラギン＋アスパラギン酸　Ａｓｘ　Ｂシスティン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グルタミン＋グルタミン酸　Ｃ１ｘ　Ｚグリシン　Ｇ１．ｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ スレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリプトフォン　Ｔｒｐ　Ｗ チロシン　Ｔｙｒ　Ｙ バリン　Ｖａｌ　Ｖ （ニー・エル・レーニンガー、バイオケミストリー：ワースパブリツシャーエヌ 、ワイ、、エヌ、ワイ、、１９７０年）上述したように本発明は、中庸な長さた とえば約７〜約４０の残基、好ましくは約１０〜３０の残基の免疫原性ポリペプ チドに結合し、ならびにそのアミノ酸残基配列の一部がこのポリペプチドのアミ ノ酸残基配列に対応するところの蛋白分子リガンドと接合するモノクローナル受 容体分子を考慮する。本発明のモノクローナル受容体は、免疫原ポリペプチド又 は担体に結合されたこのポリペプチドの接合体の使用により生じる又は誘発され る；ここで免疫原ポリペプチドは、蛋白分子リガンドのアミノ酸残基配列の一部 に対応する中庸な長さのアミノ酸残基配列を含む。

モノクローナル抗体のエピトープ局在化は技術的問題を持つ。全バクテリア遺伝 子生産物に対するモノクローナル抗体は、自然の又は変性した二つの異るタイプ の免疫原により作ることができる。自然の蛋白の使用は、精製及び続くエピトー プ遺伝地図作製全部に関して最も重大な技術的問題を持つ。自然蛋白を用いるこ との主な利点は、目標蛋白の生理学的機能をブロックするモノクローナル抗体の 生産である。

バクテリアで作られた癌遺伝子生産物は、より高度の生体で合成された遺伝子生 産物と典型的に、構造的にでなく同一である。この対照的にバクテリアｐ２８ｓ ｉｓは解離されず、また二量体を形成もしない。バクテリア又はトリ細胞で作ら れた他の癌遺伝子生産物の間の差異の間接的証拠は、大腸菌生産蛋白生産物に対 して生じたモノクローナル抗体は形質転換されたトリ細胞で合成された蛋白に対 してよりも免疫原にはるかにより効果的に結合する（免疫原は変性されているに もかかわらず）という観察により与えられる。

種々の癌遺伝子の配列が、付加的モノクローナル受容体の出現および分離のため の付加的ペプチド合成に有用でありうるプロトオンコジーン配列の付加的部分を 確認するための基礎を提供できるように思われる。

従って、変性蛋白の精製は技術的に比較的容易であるが、得られる抗血清はバク テリア遺伝子生産物に特有の配残（コンホメーション）を認識するかも知れない 。この観察は、エピトープ地図作成研究のための重大な技術的困難性を持つ。

抗体のエピトープを定義するためのアプローチは、部分的蛋白分解により作られ た蛋白フラグメント又はサブゲノムフラグメントの発現を利用する。蛋白フラグ メン）・を用いるエピトープの地図作成はサイマンとブロク、ナトル、アクト、 サイ、ニーニスニー７７．４５２４（１９８０）：により最初に示されるが、い くつかの消化物がモノクローナル抗体の大きなパネルにより評価される場合でさ え結合部位のおおよその決定ができるだけであった。すなわち、蛋白フラグメン トを用いても免疫化は結合部位の定義を制限する。また興味を持たれた領域がモ ノクローナル抗体を誘発するという保証はない。

一方、本発明で行われるような既知アミノ酸残基配列の適当なポリペプチドによ る免疫化は、良く定義された領域、すなわち免疫化ポリペプチドの配列に対応す る領域と免疫反応する抗体（受容体）の生産を保証する。

エピトープの地図作成は、一つのアミノ酸によるエビ、トープの変化はかなり異 なる反応性を生むかも知れないことを示唆し、一方、他の研究は、エピトープ内 において−又は二辺上のアミノ酸残基が異る場合に交叉反応性が得られることを 示す。さらに、マウスの同じ系統の同じ合成ポリペプチドによる免疫化は、血清 中で検出される異る反応性を生むかも知れない。

合成ポリペプチドで作られたハイブリドーマはまた、認識が配座的に大いに独立 であるので、種々の反応条件下で完全な全体蛋白と反応するモノクローナル受容 体を作る。従って、ウェスターンプロット、ドツトプロット、固定細胞および固 定組織及び細胞抽出物、羊水のような体液、及び濃縮した又はそのままの尿を自 然の蛋白と同様に評価できる。また、エピトーク中の既知の正確に定義されたア ミノ酸残基は、単一のアミノ酸変化を区別できる抗体の単離を可能にし、従って 関係する蛋白の保存されｆ二領域における限られた変化の重要性を決定する手段 を与える。

合成ポリペプチドに対するモノクローナル抗体はまた、蛋白相互作用の部位を地 図化する手段を提供する。ｐｐ６０ｓｒｃに伴われた分子の差別共沈澱が報告さ れており、そのような相互作用に関与するＳｒＣ蛋白の領域の同定を示唆してい る。

すなわち、免疫化するポリペプチドの配列により定義される領域を伴う免疫原合 成免疫反応を伴うモノクローナル抗体（受容体）の生産の誘発は、対応する免疫 涼感蛋白の単離の分離又はその癌蛋白のエピトープ部位の同定のために複雑な手 段を必要としないことを保証し、配座（コンホメーション）に独立に癌遺伝子生 成物を認識する受容体を作る。これら総ては、そのような受容体の利用を種々の 研究に広げるものである。

動物宿主保護はワクチンにおける作用剤として免疫原ポリペプチドを用いること により可能であることが示されたが、ハイブリドーマ抗体（Ｍａｂｓ）を高収率 で作るためにそのような免疫原ポリペプチドを用いる可能性は、従来ありそうだ とは考えられていなかったことを先に述べた。各Ｍａｂは唯一っの特異性を生む 単一細胞から誘導されるので、完全な蛋白分子をも認識する抗ポリペプチド抗体 を作るクローンの数対クローンを認識するポリペプチドの総数の比はポリペプチ ドの真の配座頻度の合理的推定を与えることができる。

ここで述べる結果は前述の確立モデルとは逆であり、ここで用いられた中庸な長 さのポリペプチドの頻度は自然の蛋白と類似の配座を仮定して、従来予想された もの、よりはるかに高い、ハイブリドーマのＭａｂがこれに対して生じた合成ポ リペプチド及び完全な分子の双方を認識するところのハイブリドーマを作る頻度 は、確率モデルにより予想されるよりも約４のオーダー（約１０，０００倍）大 きい。

従来の研究者は、これらポリペプチドを認識する抗体をつくるために免疫原ポリ ペプチドを数１０年間用いてきた。加えて、モノクローナル抗体の製造に関する 先に引用したコーラ−とミルスティンの文献は１９７５年に刊行された。この年 、１９７５年以後、アルンハイターら、ネイチャー（ロンドン）２９４．２７８ −２８０（１９８１）は、ポリペプチド免疫原を用いてモノクローナル抗体を作 る試ろを記述した。先に述べたように、アルンハイターらの結果は、三匹の免疫 化したマウスのヒ臓の使用を必要とし、大きな５６−ｍａｒポリペプヂド、なら びに蛋白の配列にポリペプチドが対応するところの蛋白を認識する唯一つのＩｇ Ｃタイプモノクローナル抗体を得た点で失敗と見られるべきである。

免疫原、及び蛋白リガンドのアミノ酸配列に免疫原ポリペプチドが部分的に対応 するところの蛋白リガンドの両者を認識する免疫原ポリペプチドから作られたモ ノクローナル受容体の製造に関する報文が比較的少ないのは、少なくとも二つの 要因によると考えられる。

第一に、少しの、もしあれば、モノクローナル抗体しか作られないと予測する確 率モデルに従う。支配的であった考え方がある。第二に、アルンハイターらのよ うな研究者はモノクローナル受容体の製造に適当な方法を持っていなかったこと がある。なぜならポリペプチドに対して生じた本発明のモノクローナル受容体は 、完全蛋白に対して作られたモノクローナル抗体から別なやり方で作られるから である。

すなわち、免疫原ポリペプチド、及び蛋白リガンドのアミノ酸残基配列にこのポ リペプチドが部分的に対応するところの蛋白リガンドの両者を認識するＩｇクラ スモノクローナル受容体を成功裡に作るために、以下に概要を述べる段階で逐行 しなければならない。

免疫原ポリペプチド単独か又は担体に結合（リンク）されたポリペプチドの接合 体が作られる。このポリペプチドは、約７〜約４０、好ましくは約１０〜約３０ のアミノ酸残基配列のような中庸長さのアミノ酸残基を持つ。免疫原ポリペプチ ドのアミノ酸残基配列は、癌蛋白のような蛋白分子リガンドのアミノ酸残基配列 の一部に対応する。免疫原ポリペプチドはリガンドとして単独で用いうるが、キ イホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体、ウシ血清アルブミン （Ｂ　Ｓ　Ａ）、ヒト血清アルブミン（Ｉ　Ｓ　Ａ）のようなアルブミン、赤面 細胞たとえばヒツジ赤血球、強縮トキソイド及びエデスチン（ｅｄｓｔｉｎ）、 ならびにポリアミノ酸ｒ二とえばポリ（Ｄ−リジン＝Ｄ−グルタミン酸）、など に結合された接合体としてポリペプチドを用いることが好ましい。

ポリペプチドの免疫原性及び抗原性は、ポリペプチドをキイホールリンペットヘ モシアニン担体に結合して接合体とし、次にそのように得た接合体を用いてマウ スを免疫化することによりテストできる。免疫化するポリペプチド又は接合体は 、生理学的に許容しうる希釈剤たとえば生理学的食塩水、リン酸塩緩衝食塩水ま たは当業界で周知の他のものの中に溶解又は分散される。後述する補剤（アジュ バント）も免疫化に用いる接合物に含められる。

有用なポリペプチドは、１ケ月に３回の免疫化の後に、少くとも１：４００希釈 のポリペプチドに対する免疫化されたマウスのオリゴクローナル受容体含有抗血 清の５０パ一セント結合滴定ｆｉ（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｉ　ｔｅｒ）を与えるの に十分なほど免疫原的及び抗原的である。ここで各免疫化は、接合体中に少くと も約ｌＯμｇ１好ましくは少くとも約５０μｇのポリペプチドを含み、第一回の 免疫化には完全フロインドアジュバントを、後には明ばんアジュバントを用いる 。

このテストは免疫原として所与のポリペプチドの使用前に行われる必要はないが 、しかしポリペプチドが望むモノクローナル受容体を作るのに有用かどうか見る 予備スクリーニング手法としてそうすることが好ましい。予備スクリーニングと して用いられるかどうかに拘らず、゛免疫原としてここで有用なポリペプチドは 上述の免疫化剤を用いて上述の滴定量を与える。

免疫原ポリペプチドの供与後に、マウス、ラビット、ヤギ、ウマのような哺乳動 物は、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたポリペプチドの接合体により過 免疫化され、受容体分子が少くともｌ：４００希釈のポリペプチドに対して５０ パ一セント結合滴定量を示すところ過免疫血清を与える。すなわち、ポリペプチ ドの免疫原性を予備テストしたいのと同じ動物たとえばマウスを、Ｍａｂを生ず るために用いることができる。

予備テストで用いられるのと同じ動物をＭａｂ誘発のために用いることが特に好 ましい。この好ましさは、上述の５０パ一セント結合滴定量が一度達成されると 、偶然の実験室での不幸な事故たとえば細胞培養物の汚染又はこれらの培養物の 破壊を除いて、抗体生産細胞の源としてこの動物のヒ臓を用いて望む特異化のハ イブリドーマ分泌モノクローナル抗体を作ることがほとんど保証されることによ る。

過免疫状態を与えるのに必要な免疫化規制（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｇ ｉｍｅｎ）は、知られているようになかんずく動物タイプ、動物体重、ポリペプ チド及び担体（もし用いられるなら）、アジュバント（用いられるなら）の免疫 原性及び量、及び所定の時間に投与される免疫化の数の関数であることが述べら れてる。少くとも１　：４００希釈の５０パ一セント結合滴定量を得るための上 述の免疫化剤は、テストマウスにおいて過免疫状態を作り、他の動物において過 免疫状態を誘発するための比例的基礎として用いることができる。三回の免疫化 は過免疫状態を作るために必ずしも必要でないが、しかし有用なポリペプチドに とって１ケ月間でのそのような三回の免疫化がその状態を作るために十分であり 、さもなければポリペプチドは本発明のハイブリドーマ及びそのモノクローナル 抗体の高収率生産のために十分に免疫原的でないことが更に述べられる。

過免疫化された動物においてそのように作られた血清オリゴクローナル受容体分 子はまた、免疫原ポリペプチドがアミノ酸残基配列においてその一部に対応する ところの蛋白分子リガンドに結合するユ結合評価は、後述の材料及び方法の部で 述べられる。蛋白分子リガンドの純粋サンプルをこれら評価で用いる必要がなく 、むしろ細胞抽出物又は組織調製物たとえば蛋白リガンドを含む顕微鏡スライド を用いうろことが述べられる。

過免疫化された動物は維持される；すなわち更に免疫化を与えることなく、少く ともｌ＋４．００希釈の５０パ一セント結合滴定量を作る免疫化の投与の後少く とも約３０日間生き続けさせられる。言いかえれば動物は最初に過免疫状態を与 えるよう免疫化さ２１１次１こ過免疫が後退するのを許す。

結合作用の低減はマウスにおいて典型的には１〜約５ケ月かかる。

結合滴定量のこの低減は、免疫原が再び導入されたときに、準備された（ｐｒｉ ｍｅｄ）芽細胞が激しい反応を始めることができるようになる期間に対応すると 考えられる。

免疫原ポリペプチド、又はその接合体を用いて、静脈内注射によるこのような促 進免疫化が維持Ｍ間の完了後、たとえば最後の付与の少くとも３０日後に動物に 与えられる。促進された動物のヒ臓細胞又はリンパ細胞のような抗体生産細胞は 、次にハイブリドーマ細胞を作るために、効果促進投与の日から約３〜約５日以 内に同じ動物タイプ（種）からの骨髄腫細胞系統と融合される。効果促進は、芽 細胞の成熟をこれら細胞がほぼ最適の量のポリペプチドに対するオリゴクローナ ル抗体を分泌する点まで刺激すると考えられる。

他の細胞系統も用いうるが、ＳＰ２１０−Ａｇｌ　４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８ １．）、ヒボキサンチン−チミジン（ＨＡＴ）感受性、骨髄腫セルラインがマウ スヒ臓細胞との融合に用いるのに好ましい。

融合のためのこのＨＡＴ系統を用いる詳細は、後記の材料及び方法の部に記載さ れる。ハイブリドーマ細胞は次に、非生産性細胞による過成長を低めるため及び インビトロ条件で容易に成長する細胞の選択法を与えるためにフィーダ一層又は マクロファージの存在しない又は必要としない限界希釈でクローン化される。し かしそのようなフィーダ一層を用いてもよい。

このように作られたハイブリドーマ細胞を次に、蛋白分子リガンドに結合するモ ノクローナル受容体分子の生産（分泌）について評価する。このリガンドは、免 疫原ポリペプチドがアミノ酸残基配列において対応するところの蛋白の一部であ る。その後、蛋白リガンドに結合するモノクローナル受容体分子を作るハイブリ ドーマ細胞をさらに培養して、これらハイブリドーマ細胞の追加量及び蛋白分子 リガンドに結合するこれら細胞により分泌されるモノクローナル受容体を作る。

典型的にはそのような培養は、限界希釈で、たとえば培養物を育てる溜り当り平 均約１個の細胞で行われる。

好ましいやり方では、４作られたハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチド免疫 原ならびに蛋白リガンドに結合するモノクローナル受容体分子の生産についても 評価される。その後、免疫原ポリペプチドと蛋白リガンドの両者に結合するモノ クローナル受容体分子を作るハイブリドーマ細胞が、好ましくは培養されたとこ ろのこれら細胞である。

蛋白分子リガンドのサンプルが限られている場合、免疫原ポリペプチドに結合す るモノクローナル受容体の分泌についてハイブリドーマを最初にスクリーンする ことが便利である。このポリペプチドへのポジティブな結合を示すハイ”ブリド ーマクローンは次に典型的には貯蔵のために凍結される。その後それらは解凍さ れζそして多数のモノクローナル受容体が多数の異なるハイブリドーマ細胞から 作られるのではなくて真にモノクローナルな抗体が作られることを確実にするた めに、限界希釈によりサブクローンされる。この限界希釈のサブクローン培養は 再び、典型的に、食作用体又はマクロファージなしで（これらは必要でないので ）行われる。

最終的に作られたハイブリドーマ細胞は、周知のようなこのような細胞のための 通常のインビトロ組織培養技術に従って培養できる。

より好ましくは、ハイブリドーマ細胞は、同様周知の技術を用いて動物中で培養 され、モノクローナル受容体はそのようにして発生した腹水から得られる。腹水 の発生のために用いられる動物は典型的には、スクリップス　クリニック　アン ド　リサーチ　ファンデーション、ラジョラ、カリホルニアのマウス舎で飼育さ れた１２９×ＢＡＬＢ／ｃマウスである。しかしマウス以外の動物がハイブリド ーマの調製のために用いられる場合、その動物種が腹水の生産のために用いられ る。

先述したように、骨髄腫細胞系統が受容体と同じ種からであることが好ましい。

従ってマウス−マウスハイブリッド〔ンユルマンら、のような融合ハイブリッド が典型的に用いられる。しかし、いくつかのラット−マウスハイブリッドもまた 、ハイブリドーマ形成において成功裡に用いられた〔ゴディング、「プロダクシ ョン　オブモノクローナル　アンデボデイーズ　バイ　セル　フュージョン」、 アンデボディ　アズ　ア　ツール中の記事、マルヵロニスら編、ジョーン　ワイ リー　アンド　サンズ社、ｐ２７３（１９８２））。本発明で用いるのに適した 骨髄腫としては、ＭＰＣ−ＩＩ（ＡＴＣＣＣＲＬ　＋６７）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５１１１０）、５ｐ−２／Ｑ−Ａｇ１４（ＡＴＣ ＣＣＲＬ　＋５８１）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８０．１（ＡＴＣＣＳＲＬ　ｌ　５９７ ）、Ｙ　３−Ａｇ＋、２．３．（コレクヂオン　ナショナーレ　デ　ヵルチュレ 　デ　ミクロオルガニズムス、パリ、フランス、に寄託、Ｎｏ、ｌ−０７８）、 及びＰ３ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ　９）が挙げられる。骨髄腫系統Ｓｐ− ２１０−Ａｇ１４およびＰ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３が本発明で用いるのに好ま しい。

すなわち本発明の方法に従い、癌蛋白のような蛋白分子の既知の所定のエピトー プに結合する又は免疫反応するモノクローナル受容体を比較的高収量で作ること が今や可能となった。加えて、免疫化ポリペプチドに対して少くとも約１　：４ ００の５０パ一セント結合滴定量を示すオリゴクローナル抗体を含む過免疫血清 をひとたび当業者が作ったなら、この者は前述の段階を逐行し、過免疫化動物か らヒ臓を取り出し、その抗体生産細胞を同じ動物タイプ又は系統からの骨髄腫系 統の細胞と融合し、そしてこの融合から作られたー又は二辺上のハイブリドーマ が免疫化ポリペプチド及び対応する蛋白たとえば癌蛋白に結合するモノクローナ ル受容体を分泌することが実質上保証される。このような結果は、従来は不可能 であった。

上述の方法は、実質上任意の蛋白分子リガンドに対するモノクローナル受容体を 分泌するハイブリドーマを作るのに有用である。このようなハイブリドーマ及び そのモノクローナル受容体の例は、そのアミノ酸残基配列が癌遺伝子でコードさ れる癌蛋白のアミノ酸残基配列に対応する中庸な長さの免疫原ポリペプチドに対 して生ぜられたものである。癌遺伝子及び有用な免疫原ポリペプチドの例は下記 に示され、ポリペプチドがそれに対応するところの癌蛋白配列におけるアミノ末 端からの数字位置がカッコ内に付されている。ここで、これらポリペプチドのア ミノ酸残基配列は、左から右へがつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に考え られ、下記の表１に示される式より成る群から選ばれる式により表わされる。

見上衣 １　１　４　ｖ−ｓｉｓ　ＲＶＴ　Ｉ　ＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＨＲＫＣ１１ ０　ｃ−ｓｉｓ　ＬＶＳＡＲＱＧＤＰ　Ｉ　ＰＥＥＬＶＥ　（１−１６）１１１ 　ＰＤＧＦ−Ｉ　５ＩＥＥＡＶＰＡＶＣＫＴ（１−１２）＋＋２　ＰＤＧＦ−， ２ＳＬＧＳＬＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴ（＋　−１８） １１３　ＰＤＧＦ−２ＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶ１１４　ＰＤＧＦ− ２ＲＶＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＨＲＫＣ（＋２６−１４５） ＳＴ ］　２３　ｖ−ｒｅｓ　ＶＰＶＫＷＴＡＰＥＡＬＮＹＧＲ（６９３−，７２２） （１６０１７５）” ｉ ＋　４７　ｖ−ｒａｓ　ＶＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣ（ １５７−１８０）ｕ １４４　ｖ−ｒａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（５−１６）１４５　Ｎ−ＲＡ Ｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ（５−１６）２３１　Ｎ−ＲＡＳ　ＤＧＥＴＣＬ ＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ２３７　Ｎ　−ＲＡ　Ｓ　ＹＴＩＪＲＥＩＲＱＹＲＭ ＫＫＬＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣ（１５７−１８１）２３３　Ｈ−ＲＡＳ　ＹＫＲＭ ＫＫＬＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣ（＋６６−１８２） ２３４　Ｋ−ＲＡＳ　ＡＧＰＥＡＱＲＬＰＧＬＬＫ（−１３ｔｏ−１）２３５に −ＲＡＳ　ＣＧＤＳＬＡＡＲＱＧＡＧＲＲ（１８０ｔｏ−１６７）４Ｂ ２３６　ｒａｓ　ＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣ＋　４９　ｖ− ｂａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＫＧＶＧＫ（５−１６）１　５０　ＭＹＣＡＰ　ＳＥＤ 　Ｉ　ＷＫＫＦＥＬＬＰ　ＴＰ　Ｐ　Ｌ　Ｓ　Ｐ１５１　ＭＹＣＣＤＥＥＥＮＦ ＹＱＱＱＱＱＳＥＬ（２５−４０）１５２　ＭＹｃ　ＰＡＰＳＥＤ　ＩＷＫＫＦ ＥＬ（４３−５５）１５３　ＭＹＣＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲＳＧＬＣ（５６−７ ０）１５４　〜（ＹＣＣＤＰＤＤＥＴＦＩＫＮＩＩＩＱＤＣ（＋１７−１３３） １５５　ＭＹＣＣ５ＴＳＳＬＹＬＱＤＬＳ、ＡＡＡＳＥＣ（＋７ｌ−１８８） ＋５６ＭＹＣＣＡＳＱＤＳＳＡＦＳＰＳＳＤＳｌ、ＬＳＳＴＥＳＳＰ（２０８− ２３＋）１５７　ＭＹＣＣＴＳＰＲ９ＳＤＴＥＥＮＶＫＲＲＴ１５８　ＭＹＣ５ ＶＱＡＥＥＱＫＬ　Ｉ　５ＥＢＤＬＬＲＫＲＲ１５９　ＭＹＣＬＲＫＲＲＥＱＬ ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＣ１６０ＭＹＣ１１１ＱＤＣＭＷＳＧＦＳＡＡ（１２８− １４１）１　８２　Ｎ−ＭＹＣＰＰＧＥＤ　ＩＷＫＫＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰ１ ８３　Ｎ−ＭＹＣＶＩＬＱＤＣＭＷＳＧＦＳＡＲ（＋　１Ｏ−１２３）１８４　 Ｎ−ＭＹＣ５ＬＱＡＥＥＨＱＬＬＬＥＫＥＫＬＱＡＲＱ１８５　Ｎ−ＭＹＣＬＱ ＡＲＱＱＱＬＬＫＫＩＥＨＡＲＴＣ１９２　Ｌ−ＭＹＣＡＰＳｉＥＤＩＷＫＫＦ ＥＬＶＰＳＰＰＴＳＰ１９３Ｌ−ＭＹＣ１１ＲＲＤＣＭＷＳＧＦＳＡＲ（１１０ −１２３）１６８　ｖ−ｍｏｓ　ＴＬＷＱＭＴＴＲＥＶＰＹＳＧＰＱＹＶＱＹＡ １６７ＭＯＳ　ＶＩＱＲＣＷＲＰＳＡＡＱＲＰＳＡ７６２　ＭＯＳ　ＴＬＷＱＭ ＴＴＫＱＡＰＹＳＧＥＲＱＨＩ　ＬＹ１７２ｖ−ｅｒｂ　Ｂ　ＬＧＳＧＡＦＧＴ ＩＹＫＧ（１３８−１４９）１７３ｖ−ｅｒｂ　Ｂ　ＥＮＤＴＬＶＲＫＹＡＤＡ ＮＡＶＣＱ（２３−３９）１７４　ｖ−ｅｒｂ　Ｂ　ＶＷＥＬＭＴＦＧＳＫＰＹ ＤＧ　Ｉ　ＰＡＳＥ　Ｉ　５＋７５　ｎｅｕ　ＩＭＶＫＣＷＭＩＤＳＥＣＲ，Ｐ ＲＦ１７８　ｎｅｕ　ＶＷＥＬＭＴＦＧＡＫＰＹＤＧＩＰＡＲＥＩＰ１７９　ｎ ｅｕ　ＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧ（７３１−７４２）１７６　ＨＥＲ−Ｉ　ＲＲ ＲＨＩＶＲＫＲＴＬＲＲＬＬＱＥＲＥ１７７ＨＥＲ−Ｉ　ＶＷＥＬＭＴＦＧＳＫ ＰＹＤＧＩＰＡＳＥＩＳ］　０７　ｖ−ｓｒｃ　ＬＬＮＰＥＮＰＲＧＴＦＬＶＲ ＥＳＥＴＴＫＧ（１６’２−１８２） ２０６　ＳＲＣＬＭＣＱＣＷＲＫＢＰＥＥＲＰＴＦ（ノート２）２１１　ｖ−ｆ ｇｒ　ＡＭＥＱＴＷＲＬＤＰＥＥＲＰＴＦ２１４　ＦＧＲＬ置ＩＴＫＧＲＩＰＹ ＰＧＭＮＫＲＥＶＬ２１　５　ＦＧＲＬＬＮＰＧＮＰＱＧＡＦＬ　ＩＲＥＳＥＴ ＴＫＧ２２２　ｉｎｔ　−Ｉ　ＬＨＮＮＥＡＧＲＴＴＶＦ　Ｓ（２００２１２） ２６１　ｖ−ｒａｆ　ＶＬＹＥＬＭＡＧＥＬＰＹＡＨＩＮＮＲＤＱ　Ｉ２５３　 ＲＡＰ　Ｉ　ＧＳ、ＧＳＦＧＴＶＹＫＧ（３５５−３６６）２６２　Ａ−ＲＡＦ 　ＬＬＴＤＣＬＫＦＱＲＥＥＲＰＬＦ２６６　Ａ−ＲＡＦ　ＶＬＹＥＬＭＴＧＳ ＬＰＹＳＨＩＧＳＲＤＱＩ２５４　ＰＫＳ　ＩＧＴＧＳＦＧＴＶＦＲＧ（２５− ３６）２５５　ＰＫＳ　ＶＬＹＥＬＭＴＧＳＬＰＹＳＨＩＧＣＲＤＱＩ２５６　 ＰＫＳ　ＬＬＳＤＣＬＫＦＱＲＥＥＲＰＬＦ２７０　ｖ−ｒｅｌ　ＴＬＨＳＣＷ ＱＱＬＹＳＰＳＰＳＡ７０１　ＰＫＣＬＧＫＧＳＦＧＫＶＭＬＡ（３４４３５５ ）７０２　ＰＫＣＬＹＥＭＬＡＧＱＰＰＦＤＧＥＤＥＤＥＬＦ７０３　ＰＫＣＬ ＭＴＫＨＰＧＫＲＬＧＣＧＰＥＧＥ７１１　ＰＫＣＬＧＫＧＳＦＧＫＶＭＬＳ（ ３５６−３６７）７１２　ＰＫＣＬＹＥＭＬＡＧＱＡＰＦＥＧＥＤＥＤＥＬＰ７ １３　ＰＫＣＬＩＴＫＨＰＧＫＲＬＧＣＧＣＰＥＧＥ７２２　ＰＫＣＬＹＥＭＬ ＡＧＱＰＰＦＤＧＥＤＥＥＥＬＦ７２３　ＰＫＣＦＬＴＫＨＰＡＫＲＬＧＳＧＰ ＤＧＥ（２３２−’２５１） ８４３　ｓｙｎ　ＬＭＩ　ＨＣＷＫＫＤＰＥＥＲＰＴＦ８６１　Ｇｓ　ＲＬＬＬ ＬＧＡＧＥＳＧＫ（４２−５３）８６２　Ｇｓ　ＲＷＬＲＴＩＳＶＩＬＦＬＮＫ （２７９−２９３）８７１　Ｇｉ　ＫＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧＫ（３５−４６）８ ７２　Ｇｉ　ＫＷＦＴＤＴＳＩＩＬＦＬ、ＮＫ（２５８−２７１）８８２　Ｇｏ 　ＫＦＦＩＤＴＳＩＩＬＦＬＮＫ（２＋４−２２７）８９２　Ｔ　ＲＹＦＡＴＴ ＳＩＶＬＦＬＮＫ（２５３−２６６）８９４　Ｔ’　ＫＰＦＡＡＴＳＩＶＬＦＬ ＮＫ（２５７−２７０）９０１　ＰＢＫ　ＬＧＲＧＶＳＳＶＶＲＲＣ（２５−３ ６）９０２　ＰＢＫ　ＭＹＴＬＬＡＧＳＰＰＦＷＨ，ＲＫＱＭＬＭＬ９０３　Ｐ ＢＫ　ＬＶＳＲＦＬＶＶＱＰＱＫＲＹＴＡＥＥ（２６３−２，８０） ９１１　ＣＧＫ　ＬＧＶＧＧＦＧＲＶＥＬＶ（３６５−３７６）９１２　ＣＧＫ 　ＭＹＥＬＬＴＧＳＰＰＦＳＧＰＤＰ＼ＩＫＴ”ｉ’９１３　ＣＧＫ　Ｌ　ＩＫ ＫＬＣＲＤＮＰＳＥＲＬＧＮＬ、Ｋ９２Ｊ　ＭＬＣＫ　ＬＧＧＧＫＦＧＡＶＣＴ ＣＴ（６７−７９）９２１　ＭＬＣＫ　ＴＹＭＬＬＳＧＬＳＰＦＬＧＤＤＤＴＥ ＴＬ９２３　ＭＬＣＫ　ＰＶＳＮＬ　Ｉ　ＶＫＥＱＣＡＲＭＳＡＡＱＣ４００　 ＭＥＴ　ＭＬＫＣＷＨＰＫＡＧＭＲＰ（Ｎｏむｅ　２）２９０　ｖ−ｆｍｓ　Ｌ ＧＴＧＡＦＧＬＶＶＥＡ（１０９３−１１０４）’（１３７９−１３９４）’ ２９３　ｖ−１ｍｓ　ＬＧＴＧＡＦＧＫＶＶＥＡ（１０７８−１０８９）２９５ 　ＦＭＳ　ＩＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＨＲＰＴＦ２９６　ＦＭＳ　ＬＥＡＧＶＳＬ ＶＲＶＲＧＲＰＬＭＲ２９７　ＦＭＳ　ＬＹＶＫＤＰＡＲＰＷＮＶＬＡＱＥ（９ ９−１１４）２９８　ＦＭＳ　ＶＰＡＥＬＶＲＩＲＧＥＡＡＱＩＶＣ３２０　８ ＰＫ、ＣＬＧＴＧＳＦＧＲＶＭＬＶ（４５−５９）３２２　ＢＰＫ　ＣＩＹＥＭ ＡＡＧＹＰＰＦＦＡＤＱＰＩＱＩＹ３２１　ＢＰＫＲＤＮＨＧＳＦＧＥＬＡＬＭ （１９７−２０９）３２３　ＢＰＫ　ＲＬＬＲＮＬＬＱＶＤＬＴＫＲＦＧＮＬＫ ３４０　ＣＤＣ２８ＶＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫＡ（１４−２５）３５２　ｖ−ｆｐ ｓ　ＬＷＥＡＦＳＬＧＡＶＰＹＡＮＬＳＮＱＱＴＲ３５３　■−ロ）Ｓ　Ｌ　Ｍ 　Ｑ　ＲＣＷ　Ｅ　Ｙ　Ｄ　Ｐ　ＲＲＲＲＳ　Ｆ３５５　ｃ−ｆｐｓ　ＮＫＬＡ ＥＬＧＳＢＥＰＰＰＡＬＰＬＱ３６６　ＲＯＳ　ＩＷＥＩＬＴＬＧＨＱＰＹＰＡ Ｈ６ＮＬＤＶＬ３６７　ＲＯＳ　ＬＭＴＱＣＷＡＱＥＰＤＱＲＰＴＦ３７１　Ｈ ＩＲＬＧＱＧＳＦＧＭＶＹＥＧ（９９０−１００１）３７２　ＨＩＲＬＷＥＩＴ ＳＬＡＥＱＰＹＱＧＬＳＮＥＱＶＬ３７３　ＨＩＲＬＭＲＭＣＷＱＦＮＰＮＭＲ ＰＴＦ６００　ＴＲＫ　ＬＧＥＧＡＦＧＫＶＦＬＡ（３３１−３５０）６０１　 ＴＲＫ　ＬＷＥＩＦＴＹＧＫＱＰＷＹＱＬＳＮＴＥＡＩ６０２　ＴＲＫ　ＩＭＲ ＧＣＷＱＲ，ＥＰＳＮＡＴＡＳ４０１　ＭＥＴ　ＬＷＥＬＭＴＲＧＡＰＰＹＰＤ ＶＮＴＦＤＦｌ（ノート　２） ４０２　ＭＥＴ　ＶＭＬＫＣＷＨＰＫＡＧＭＲＰＳＦ（／　）　２）４１１　Ｆ ＯＳ　５ＧＦＮＡＤＹＥＡＳＳＲＣ（４−１７）４１２　ＦＯＳ　ＬＳＰＥＥＥ ＥＫＥＫＲＲＩＲＫＧＴＥＹＥＴＤ４２１　ＴＧ　Ｆ　−ａＩｐｈａ　ＶＶＳＡ Ｐ　ＮＤ　ＣＰＤＳ　ＨＴＱＦ　Ｃ（１−１６）４２３　ＴＧＦ−ａｌｐｈａ　 ＦＨＧＴＣＲＰＬｙＱＥＤＫＰＡ（１７−３１）４２４　ＴＧｆ−ａｌｐｈａ　 ＨＳＧＹＶＧＶＲＣＥＨＡＤＬ（３４−４７）４３１　ＥＧＦ　Ｎ５ＤＳＥＣＰ ＬＳＨＤＧＹＣ（１−１３）４．３２　ＥＧＦ　ＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤ ＫＹＡＣ４６１ｖ−ｅｒｂＡ　ＫＳＦＦＲＲＴＩＱＫＮＬＨＰＴＳＣ４６２　ｖ −ｅｒｂ　Ａ　ＶＤＦＡＫＮＬＰＭＦＳＥＬＰＣＥＤＱ４６３ｖ−ｅｒｂＡ　Ｅ ＬＰＰＲＲＣＲＡＬＱＩＬＧＳＩＬＰＦＶ４７０　ＨＧＲＫＶＦＦＫＲＡＶＥＧ ＱＨＮＹＬＣＡ（１；Ｒ４７１　ＨＧＲＮＶＭＷＬＫＰＥＳＴＳＨＴＬ　Ｉ４７ ２　ＨＧＲＴＮＱｒＰＫＹＳＮＧＮＩＫＫＬＬＦＨＱＫ４７３　ＨＧＲ’　ＶＫ ＷＡＫＡＩＰＧＦＲＮＬＨＬＤＤＱ）　８００　ＥＲＫＡＦＦＫＲＳＩＱＧＨＮ ＫＹＭＣＰＡ８０１　ＥＲＩ　ＮＷＡＫＲＶＰＧＦＶＤＬＴＬＨＤＯ４７７　ｃ ＰＲＫＶＰＦＫＲＡＭＥＧＱＨＮＹＬＣＡＧＲ（ノート　２） １０００　Ｂｅｔａ−ＴＧＦ　ＡＬＤＴＮＹＣＰＳＳＴＥＫＮＣ１上記癌遺伝子 および配列の引用文献 ＰＤＧＦ−１−ドウリトルら、サイエンス、２２１．２７５−２７７（１９８３ ）。

ＰＤＧＰ−２−ドウリトルら、サイエンス、２２１．２７５−２７ｖ−ｍｙｂ− ラシ５０つら、サイエンス、２１６．１４２１−１４２３（＋９８２）。

ａ ■−エ　−ダーら、サイエンス、影１７，９３４−９３７（＋　９８２）。

ｖ−ｒａｓ　−ツチダら、サイエンス、２１７．９３７−９３９（１９８２）。

Ｎ−ＲＡＳ−タパロウスキら、ｉム、灸４，５８１（１９Ｓ３）。

Ｎ−ＲＡＳ−ケイボンら、ネイチャー、１隻２．３３（１９８３）。

Ｋ−ＲＡＳ−マツフグラスら、ネイチャー、３０４，５０１（１９８３）。

４Ｂ ｒａｓ　−チャーディンら、エムポジエイ、Σ、２２０３（１９ＭＹＣ−コルビ イら、ネイチャー、影０１，７２２−７２５（１９８３）。

Ｎ　ＭＹＣ−コールら、ネイチャー、影しジ、７３（１９８６）。

Ｌ−ＭＹＣ−ナラら、ネイチャ二３１８，６９（＋　９８３）。

ｖ−ｍｏｓ−ヴアナ・ベヴアレンら、ネイチャー、２８９，２５８−２６２（１ ９８１）。

ｃ−ｍｏｓ−ヴアン・ベヴアレンら、−Ｍ）ｋ、２７．９７（１９８１）。

ＭＯＳ−ワトソンら、ブロク、ナトル、アウトサイニーニスニー。

７９．４０７８（１９８２）。

ｖ−ｅｒｂ−Ｂ−ヤマモトら、セル、３５．７１（＋　９８３）。

ｎｅｗ−バーブマンら、ネイチャー、３１９，２２６（１９８６）。

ＨＥＲ−１−クルリックら、ネイチャー、先主９．４１８（＋　９８４）。

ｖ−ｓｒｃ−タケヤら、ジエイ・ヴアイロル、４４．１２（１９８２）。

ＰＣ。

■−針二　−ンユワルツ、１火１１１，８５３（１９８３）。

８（＋９８０）。

５ＲＣ−パーカーら、モル、セル、パイオル、５，８３１（１９８５）５Ｖ−１ 「ナハロら、サイエンス、２２３．６３（１９８４）。

匹−１−オーヤンら、エムボ、ジエイ、　４．．２９０５（１９８５）。

シーａｂｌ　Ｉ−レディら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスＩＣ−ａ ｂｌｍ−ベンーネリクら、上記。

ｃ−ａｂｌｍ−ベンーネリクら、上記。

ｃ−ａｂｌＮ−ベンーネリクら、上記。

８５）。

匪ｍ−１−セルテンら、セル、４６，６０３（１９８６）。

す△−センバら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、■。

５４５９（１９８６）。

Ｇｓ−イト−ら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、影と。

３７７６（１９８６）。

Ｇｉ−イト−ら、上記。

Ｇｏ−イト−ら、上記。

Ｔ−イト−ら、上記。

Ｔ′−イト−ら、上記。

ＰＢＫ−ライマンら、バイオヘム、２３．４１８５（１９８４）。

ＣＲＲ−コニーリイら、サイエンス、２３３．７６７（１９８６）。

ベーターＴＧＦ　デサンクら、ネイチャー、３１６，７０１（１９８５）。

２ポリペプチドの数の位置は、報告された配列が不完全なので、利用できなかっ た。

３これらのポリペプチドは、報告された配列と比較して、削除、付加又は置換さ れたアミノ酸残基を含む。

上記の４つのｒａｊ遺伝子によりコードされる相同のポリペプチドは、左から右 へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に式％式％） により示される一つのアミノ酸残基配列として簡便に記述できる。

ここでカッコ内のアミノ酸残基は、式中の直前のアミノ酸残基Ｒの名代替物であ る。

本発明のモノクローナル受容体の製造を誘発するために有用な更に別のポリペプ チドは、その癌遺伝子、癌蛋白配列における位置及びポリペプチドアミノ酸残基 配列を第２０．２１および２２図に示すポリペプチドである。これらポリペプチ ドは、蛋白キナーゼ癌蛋白（その癌遺伝子のいくつかは先に述べた）の周知の族 の中の配列保存領域に対応する。

■、モノクローナル受容体 本発明は多数のモノクローナル受容体を考慮しているが、比較的少数のような受 容体についてのみ、完全なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の形で、群の代表とし て本明細書で詳しく述べる。ポリペプチドの免疫原性及び抗体性のための前述し ｒニテストを、異なる癌蛋白に結合（免疫反応）する別のモノクローナル受容体 に対応するポリペプチドについて下記に述べる。

Ａ、受容体の例 ここに記載される手段を用いて、受容体が癌遺伝子関連ポリペプチドに対して生 じた。

本発明のモノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約に 従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・オブ・ロックビル、Ｍ Ｄに寄託された。これらのＡＴＣＣ受理番号（Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、）、実験室引 用番号（ＲｅｆＮｏ、）、ＡＴＣＣで受領のデータ（ＡＴＣＣＲＥＣＥＩＰＴ） 及び第１表のポリペプチドに交叉対照された免疫化ポリペプチドの数（Ｐ　ＯＬ 　Ｙ　Ｐ　Ｅ　Ｐ　Ｎｏ、）は、以下、第２表に提示される。

第２表 ＨＢ８５９３　Ｐ４．４ＥＩ＋’　０８１０２／８４　１２５ＨＢ８５９４　Ｐ ４３ＤＯ９’０８１０２／８４　１２５ＨＢ８５９５　５２２ＣＯ６０８１０２ ／８４　１２５ＨＢ８５９６　５１０ＦＯ３０８１０２／８４　１２５ＨＢ８６ ７９　１／２４−２４ＥＯ５１２／＋２／８４　１４２ＨＢ８８００　１８−９ Ｂ＋００５１０９／８５　１１２ＨＢ８８８８　１３３−ＩＥＩＯ０８／１５／ ８５　１３３ＨＢ８８９４　１７３−１ｃＩＩ　０８／２７／８５　＋７３ＨＢ ８８９５　２０２−１１ＡＢ　０８／２７／８５　２０２ＨＢ８８９６　１７３ −８Ｄ２０８／２７／８５　１７３ＨＢ８８９７　１３３−６ＣＩＯ０８／２７ ／８５　１３３ＨＢ８８９８　２０３−７Ｄ１０　０８／２７／８５　２０３Ｈ Ｂ８８９９　２０３−６Ｆ５０８／２７／８５　２０３ＨＢ８９００　２０２− ９Ｄ１０　０８／２７／８５　２０２ＨＥ８９２４　１３２−７Ｃ９０８／２９ ／８５　１３２ＨＢ８９２５　１１４−５０Ｄ４　０８／２９／８５　１１４Ｈ Ｂ８９２６　１１４−５０Ｇ２　０８／２９／８５　１１４ＨＢ８９２７　１３ ２−１ｃ８０８／２９／８５　１３２ＨＢ８９４８　１２＋−ＩＦ９　１２１０ ３／８５　１２１ＨＢ８９４．９　１２＋−３Ｈ５１２１０３／８５　１２１Ｈ Ｂ８９５０　１２１−４Ｆ８１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９５１　１２＋− ５ＥＳ　１２／２３／８５　１２１ＨＢ８９５２　１２１−９０ＩＯ＋２／０３ ／８５　１２１ＨＢ８９５３　１２１−９Ｅ５　１２１０３／８７　１２１ＨＢ ８９５４　１２１−１５Ｂ１０　１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９５５　１２ １−１９８ＩＯ’１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９５６　１２＋−８Ｄ８　１ ２１０４／８５　１２１ＨＢ８９６５　１２７−２４Ｃ７１２／１１／８５　１ ２７ＨＢ８９６６　１２７−２４Ｅ１．１　１２／１１／８５　１２７ＨＢ８９ ６７　１２７−３８０２　１２／１１／８５　１２７ＨＢ８９６８　１２７−５ ０Ｄ４　１２／Ｉ　Ｉ／８５　１２７ＨＢ８９６９　１２７−５０ＤＩ２　１２ ／１１／８５　１２７ＨＢ８９７０　１２７−５３Ｆ８　１２／１１／８５　１ ２７ＨＢ８９７１　１２７−６０Ｆ３　＋２／１１／８５　１２７１２７−４２ Ｃ１１１２７ ＨＢ８９７６　１５５−１１Ｃ７１２／１７／８５．　＋５５ＨＢ８９９６　１ ５２−６Ｄ１１　０１／２８／８６　１５２ＨＢ８９９７　１４６−３Ｅ４　０ １／２８／８６　１４６ＨＢ８９９８　１４６−１７Ａ３　０＋／２８／８６　 １４６ＨＢ８９９９　１４６−８Ｄ１１　０＋／２８／８６　１４６ＨＢ９００ ０　１５５−９Ｆ６　０１／２８／８６　１５５ＨＢ９００１　１５．）−８（ １；１　０１／２８／８６　１５５ＨＢ９００２　３１０−５Ｆ５　０１／２８ ／８６　３１０ＨＢ９００３　１３１−９４Ｈ４０１／２８／８６　１３１８Ｂ ９００４　１７２−１２Ｇ７　０１／２８／８６　１７２ＨＢ９００５　１７２ −１２Ａ４　０１／２８／８６　１７２ＨＢ９０４０　１６４−３Ｆ３　０３／ １９／８６　１６４ＨＢ９０５２　２２２−３５Ｃ８０３／２７／８６　２２２ ＨＢ９０５３　３１０−２９Ｆ７　０３／２７／８６　３１０ＨＢ９０７７　１ ３３−１０Ｆ６　’０４／１７／８６　１３３ＨＢ９０９７　１７１−１０ＥＳ 　０５１０８／８６　１７１ＨＢ９１］７　１７１−１１Ｂ９　０５／２９／８ ６　１７１ＨＢ９１３３　２９０４Ｅ１０　０６／２６／８６　２９０ＨＢ９１ ４４　２４０−１．３Ｄ１０　０７／１０／８６　２４０ＨＢ９２０８　３１２ −１３ＥＯ８０９／２４／８６　３１２ＨＢ９２２７　３６１−３ＩＣＯ５１０ ／１５／８６　３１６ＨＢ９２６０　２５０−９ＧＯ６１１１０６／８６　２５ ０ＨＢ９’２７８　１４７−６７Ｃ６１１／２０／８６　１４７ＨＢ９２７９　 １６５−３４Ｅ４　１１／２０／８６　１６５ＨＢ９２８０　３６０−２７ＥＤ ６　１１／２０／８６．３６０１ハイブリドーマＰ４４Ｅ１１は、ミエローマセ ルラインＰ３Ｘ６３−Ａｇ３．６５３を用いて生成された。他の全てのハイブリ ドーマは、材料及び方法の部に述べたように、ミエローマセルライン５Ｐ２−０ を用いて生成された。

５つの例示的、モノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマが、後記のｖ− ｆｅｓ関係の３０−ｍａｒ免疫原的合成ポリペプチド（ポリペプチドａとしても 引用されるポリペプチド番号１２５）に対して生じ、各々はまた下記のカルボキ シ末端１２−ｍａｒポリペプチドＳペプチド（ポリペプチドｂとしても引用され るポリペプチド番号１２６）に結合し、また５Ｔ−ＦｅＳＶのｖ　−ｆｅΣ遺伝 子によりコードされるｐ８５（８５にダルトン）とされる癌蛋白に結合する。こ れらのハイブリドーマは、引用番号、５１０Ｆ０３．５２２ＣＯ６、Ｐ４３Ｄ０ ９、Ｐ４２ＣＩＯ及びＰ４４Ｅ１１が与えられた。左から右へかつアミノ末端か らカルボキシ末端の方向の合成ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）のアミノ酸残基配 列は次の式で表わされる。

ポリペプチドａ　ＳＤＶ％’ＳＦＧ　ＩＬＬＴｔ’ＥＴＦＳＬＧＡＳＰ−ＹＰＮ ＬＳＮＱＱＴＲ。

ポリペプチドｂ　５ＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ第２表のＡＴＣＣに寄託された７つ のハイブリドーマは、ｖ−ｆｅｓ関連ポリペプチド番号１２５に対して生じ、第 １表に示され、ポリペプチドに対して生じた■９のハイブリドーマ中による。こ れら７つのハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル受容体も、ｐ８５遺 伝子蛋白に結合する。

５２２ＣＯ６及び５ＩＯＦＯ３を命名されたハイブリドーマにより分泌される本 発明のモノクローナル受容体は、特にモノクローナル受容体が好ましい。共に好 ましいモノクローナル受容体は、カッパＬ鎖を有し、免疫化ポリペプチドと、ま た、免疫化ポリペプチドの配列と対応するアミノ酸残基配列を宵するｆｅｓ関連 癌蛋白と免疫反応するｒｇＣＩモノクローナル受容体である。

ハイブリドーマは、下に示すｒａｓ　２３−　ｍａｒ免疫原性、合咬ボリベプヂ ド番号＋　４２　（ｒａｓ）を用いて生成された。

ＹＲＥＱ　Ｉ　ＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣモノクローナル抗体は、 ハイブリドーマが免疫原性ポリペプチドに、またハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）配列 のｒａｓ遺伝子によりコードされる５５にダルトン蛋白に結合することによって 分泌した。モノクローナル抗体は、試験された全てのｒａｓ生成セルライン中の ２３にダルトン蛋白、およびより高分子量の蛋白を認識する。

５１０Ｆ０３．５２２Ｃ０６、Ｐ４３ＤＯ９、Ｐ４４Ｅ１１およびｌ／２４／Ｅ Ｏ５と命名されたハイブリドーマは、カッパし鎖、ＩｇＧＩモノクローナル受容 体を分泌する。

最後に命名された、５つのハイブリドーマは、３つの異なる細胞融合により生成 された。そのＭａｂｓが、免疫原性ポリペプチド、同様に、最初の調製用の対応 癌蛋白分子リガンドを認識するハイブリドーマの製造効率は１００パーセントで あった。即ち、２つのＭａｂｓ（Ｓ１０ＦＯ３及び５２２ＣＯ６からの）は、ポ リペプチドを認識するものを生成し、これら２つのＭａｂｓは、また癌蛋白を認 識した。

第二及び第三の調製については、同様に計算された効率は、約２０パーセントで あった。

他のハイブリドーマは、下記に示した、ｅｒｂ−Ｂ関連、１６−ｍｅｒ免疫原性 合成ポリペプチド番号１７１を用いて生成した。合成ポリペプチドのアミノ酸残 基配列は、左から右に、及びＮ末端からＣ末端の方向に、式 ＩＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＥにより示される。

このハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体も、ｆｅｓ。

１’ｍｓ、ａｌｂ、ｓｒｃ及びｆｇｒ癌遺伝子によりコードされる癌蛋白に関連 するポリペプチドに結合する。

第１図は、ｐ８５癌蛋白リガンドのための外部標準及びネカチブ対照としてのイ ンフルエンザへマグルチニン認識性Ｍａｂを用いて、ハイブリドーマ５ＩＯＦＯ ３（ＡＴＣＣＨＢ　８５９６）及び５２２ＣＯ６（ＡＴＣＣＨＢ　８５９５）に より分泌されたモノクローナル受容体によりｐ８５癌蛋白リガンドの免疫学的検 出を例示する。

第２図は、同様にハイブリドーマ５ＩＯＦＯ３からのＭａｂならびにハイブリド ーマＰ４３ＤＯ９（ＡＴＣＣＨＢ　８５９４）及びＰ４４Ｅ１１（ＡＴＣＣＨＢ 　８５９３）、及びまたハイブリドーマＰ４２ＣＩＯからのＭａｂを用いての同 様の結果を例示する。ｇｐ７０ローシェルウィルス蛋白に対するモノクローナル 抗体〔ナイマン及びエルダー、モノクローナル　アンチボディーズ・アンド・テ ィ・セル・プロダクツ前出〕がネカチブ対照として用いられた。

第３図は、本発明のモノクローナル受容体の特異性を更に例示する。そこで、Ｃ ＣＬ６４ミンク細胞（レーンＢ及びＣ）、及びＦｅＬＶ−Ｂ及びＦｅ５Ｖにより 感染されたＭＳ　Ｔ　Ｆ細胞（レーンＡ及びＢ）は３′Ｐにより放射活性にラベ ルされた。次にラベルされた細胞から抽出物を、ｖ−ｆｅｓ！伝子のｇａｇ部分 によりコードされかつｐｒ６５と言われる蛋白前駆体として表わされるｐ１５蛋 白に対するヤギ抗血清（レーンＡ及びＢ）、又はハイブリドーマ５ＩＯＦＯ３か らの組織培養上清（レーンＣ及びＤ）でインキュベートした。

図から見られるように、ハイブリドーマ５ＩＯＦＯ３からの本発明のＭａｂはｐ ８５蛋白リガンドにのみ結合し、一方、ヤギ抗−ｐ１５血清は感染された細胞か らのｐｒ６５及びｐ８５融合癌蛋白の両者に結合した（レーンＡ）。非感染細胞 からの蛋白は結合されない（レーンＢ及びＤ）。これら結果、及び第１３図に関 する評価の類似の検討より、本発明のＭａｂは、アミノ酸残基配列の一部が各Ｍ ａｂを分泌するハイブリドーマを作るために用いられた免疫原ポリペプチドの配 列に対応するところの癌蛋白にのみ結合することを確認する。

図示されていない同様の結果において、上述の５つのハイブリドーマからのＭａ ｂはまた、ＧＡ−ＦｅＳＶにより形質転換された細胞において表現されたＩＯ２ にダルトンの癌蛋白リガンドにも結合した。ＧＡ−ＦｅＳＶ株によりコードされ る癌蛋白リガンドはアミノ酸残基配列において、免疫原的に有用なポリペプチド の領域において５Ｔ−２０９７株によりコードされる癌蛋白リガンドと本質的に 同じである。ハンベら、セル、支止、７７７−７８５（１９８２）参照。

上述の５つのＭａｂのどれも、トリ肉腫ウィルスのフジナミ株のＶれるｖ−０１ 癌蛋白、その配列は、シブヤら、セル、３０．７８７（１９８２）により報告さ れている、ちまた、予測されるｖ−ｆｅｓ癌蛋白に対する強い相同性を含み、か つ上述の１２−ｍｅｒ（ポリペプチド（ｂ））に対応する領域において第−及び 第四の残基の置換の点でのみこの１２−ｍａｒポリペプチドのアミノ末端と異な る：すなわち、ｖ　ｆｅｓ関連ポリペプチド及び癌蛋白のアミノ末端セリン（Ｓ ）は、ｖ−ｆｐｓ関連癌蛋白においてバリン（Ｖ）により置換され、アミノ末端 から第二番目のプロリン（Ｐ）残基はアラニン（Ａ）残基で置換される。

ｖ　−ｒｐΣ関連癌蛋白への上述のＭａｂの非結合は、形質転換さ２−た細胞に おける表現された癌蛋白を区別する基礎、及びｖ　−１’ｐｓ関連癌蛋白の存在 下でｖ　−ｒｅｓ関連癌蛋白リガンドの存在を評価する基礎を与える。結合にお けるこの差はまた、後記する親和性吸着剤の一部として本発明のＭａｂを用いる アフィニティクロマトグラフィーにより二つの蛋白の混合物を精製する際におい ても有用である。

ｖ−ｒｐｓ関連癌蛋白に対する本発明のモノクローナル抗体の上述の非結合はま ｆ二、従来得られｆこオリゴクローナル受容体に比べてモノクローナル受容体の 特異性における改善を目立たせる。すなわちセン、ブロク、ナトル、アカド、サ イ、ニーニスニー、８０，１２４６−１２５０（１９８３）は、ラビットオリゴ クローナル抗体を作るためにＫＬＨに接合された前述のポリペプチド（ｂ）を用 いた。これらオリゴクローナル抗体は、各々ｖ　−ｆｅｓｓ　Ｔ、　ｖ　−ｒｅ ｓＧ　Ａ及びｖ−ｆ’匹癌遺伝子を含む５Ｔ−ＦｅＳＶＳＧＡ−ＦｅＳＶ及びＦ ＳＶ（フジナミ肉腫ウィルス）により形質転換された細胞中で表現された癌蛋白 に結合した。従って、本発明のモノクローナル受容体から得られる特異性は、オ リゴクローナル受容体で得られたもの上り、大いに改善される（両者が同じ免疫 原ポリペプチドに対して生じられた場合でさえ）ことが判る。

同様に、癌蛋白分子リガンド（たとえばＰＤＧＦ）に、ｒｅｓｓ　ｍｙｂ−匣、 Ｕ！、ｒａｓ、ｍｙｃ及びｍｏｓと呼ばれるレトロウィルス癌遺伝子によりコー ドされる免疫原ポリペプチドに、ならびにその配列がｆｐｓ。

ｓｒｃ、巳、ｆｇｒ、　ｂａｓ％ｉｎｔ　−１、匡、ｅｒｂ−Ａ、　ｅｒｂ−Ｂ １四、川、ＧＦ　１　、ＰＤＧＦ−２，ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファによりコード される癌蛋白の配列に対応する免疫原ポリペプチドに、及びまたこれら遺伝子を 含むレトロウィルスにより形質転換された細胞中で表現された癌蛋白に結合する モノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマが作られる。本発明の特異的モ ノクローナル受容体は、上述の癌遺伝子？こよりコードされる免疫原ポリペプチ ドに結合する。

これら癌遺伝子のいくつかは、下記第３表に命名され、本発明の好ましいモノク ローナル受容体がそれに結合する癌遺伝子、配列および第１表のポリペプチド番 号に関連したポリペプチド番号の隣りに示されている。

少くとも１つのモノクローナル受容体（Ｍａｂ）の結合又は各ポリペプチドに対 し作られたオリゴクローナル抗血清（血清）に関する。ウェスターンプロット評 価でのデータは、又、第３表中、ポリペプチド番号の隣りに示される。

第３表 ボリペブ　癌蛋白３に結合　癌蛋白４に結合１２２　ＮＴ　ＮＴ ＋２３　ＮＴ　＋ １２４　ＮＴ　ＮＴ ＋４４　ＮＴ　ＮＴ １４７　ＮＴ ｂａｓ　１４９　＋　ＮＴ １５４　ＮＴ　ＮＴ １５５　＋　＋ １　５６　ＮＴ　ＮＴ ２４＋　＋　ＮＴ ２９２　＋　ＮＴ ３６１　＋　ＮＴ ４１６　÷　ＮＴ ＴＧＦ−アルファ４．２１　＋　ＮＴ １ウェスターンプロット評価における癌蛋白への受容体分子の結合。プラス称号 （＋）は、結合が見られることを示す。ＮＴ−試験せず １ボリベプ、ＮＯ，−第１表からのポリペプチド番号３モノクローナル受容体分 子の癌蛋白への結合４オリゴクローナル抗ポリペプチド血清の癌蛋白への結合オ リゴクローナル受容体の生産を誘発するのに有用な０、そして結局モノクローナ ル受容体の生産に有用なポリペプチドは好ましくは、本明細書で述べるように担 体分子に結合され、ここではＫＬＨに結合され、たポリペプチドが例示的ポリペ プチド−担体接合体として終始用いられた。約３５より少ないアミノ酸残基を含 むポリペプチドについて、オリゴクローナル及びモノクローナル受容体の生産を 誘発するために担体を用いることが好ましい。約３５〜約４０のアミノ酸残基を 含むポリペプチドを、担体と結合せずに単独で、受容体生産を誘発するために用 いることができる。しかしこれらの受容体生産のために担体を用いることがやは り好ましい。すなわち、受容体は、ポリペプチド単独又は担体と結合されたポリ ペプチドにより誘発されうる、又はこれらに対して生じられる。

Ｂ、免疫結合研究 数度述べたように、オリゴクローナル抗体、及びモノクローナル抗体を分泌する ハイブリドーマを生じるのに用いられるポリペプチドは、自体、免疫原的かつ抗 原的であり、これらの特性はハイブリドーマ調製のために有用なポリペプチドを 同定するための判断基準を与える。以下の検討は、ｒａｓ、　５ｉｓＳｅｒｂ− Ｂ及び哄癌遺伝子によりコ・−ドされる癌蛋白に対するモノクローナル受容体（ 抗体）を分泌するハイブリドーマの調製において用いられるポリペプチドにより 誘発された又はこれに対して生じられたオリゴクローナル抗体（受容体）含有抗 血清についての研究に関係する。後に記述するように、ｓｉｓ関連ポリペプチド は、このポリペプチドに対してのみならず対応する癌蛋白、ヒト血小板由来成長 因子（ＰＤＧＦ）に対しても結合するオリゴクローナル受容体の生産を誘発する 。

このように作られたオリゴクローナル抗体は、免疫化ポリペプチドに対する前述 した５０パ一セント結合滴定量を示し、これにより本発明のモノクローナル抗体 （受容体）はまた抗体生産ヒ臓細胞と適当な骨髄腫系統の細胞との融合により作 られうろことを示した。

血小板から単離されたＰＤＧＦは、アミノ末端において約６０％相同である二つ の鎖より成る。これら鎖の一つ（ＰＤＧＦ−２）は、サル肉腫ウィルス（ｖ−ｓ ｉｓ）遺伝子生産物（ｐ２８５ｉｓ）の一部と事実上同じである。ヒトｃ−ｓｉ ｓ及びｖ−ｓｉｓの配列は、同じ位置で終り、ＰＤＧＦ−２分子はｐ２８ｓｉｓ と大きな相同性を持つより大きな舶駆体から発生する。ｐ２８ｓｉｓとＰＤＧＦ −２の間の相同性は、ｐ２８ｓｉｓのアミノ酸残基６７及びＰＤＧＦ−２のアミ ノ末端で始まり、最近、ヒトｃ−ｓｉｓクローンの単離及び配列化によりｐ２８ ｓｉｓの予測されたカルボキシ末端にまで広げられた。ジョセフスら、サイエン ス、主ｐ２８ｓｉｓは迅速に解離されて、ＰＤＧＦ−２と同じアミノ末端をたぶ ん持つｐ２０ｓｉｓを発生する。ｐ２０ｓｉｓ及びＰＤＧＦ−２をコードする領 域内に、三つの領域内に置かれうる八つのアミノ酸変化がある。アミノ末端近く の二つの変化は保存的であり、五つの変化は分子の中心近くに集まっており、一 つの変化はカルボキシル末端部分に位置する。

二つの例示的なポリペプチドが作られた。ポリペプチド（ｃ）としても引用され るポリペプチド番号１１３と呼ばれる第一のものは、ｐ２８ｓｉｓと呼ばれるサ ル肉腫ウィルス形質転換蛋白の予測された配列の残基１．３９〜１５５にアミノ 酸残基配列において対応する。デバルら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニー ニスニー、８０．７３１−７３５（１９８３）。ポリペプチド（Ｃ）の配列はま た、前述したヒト血小板由来生長因子のＰＤＧＦ−２と呼ぶ蛋白瑣のアミノ末端 から位置７３〜８９の配列に対応する。ポリペプチド（ｄ）と呼ぶ第二のものは 、トリ骨髄芽球症ウィルス（ｖ−ｍ＞±）の癌蛋白の形質転換蛋白の予測された 配列の残基２〜１８にアミノ酸残基配列において対応する。ラシュロウら、サイ エンス、２＋６．１４２１−１４２３（１９８２）。ポリペプチド（ｃ）及び（ ｄ）のアミノ酸残基配列を、左から右へかつアミノ末端からカルボ末端の方向に 、下記に示す：ポリペプチド（ｃ）　ＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶ；ポ リペプチド（ｄ）　ＲＲＫＶＥＱＥＧＹＰＱＥＳＳＫＡＧ０ポリペプチドの各々 は合成され、そしてそれらのカルボキシ末端（上式で示さず）のＣｙｓ残基を用 いてＫ　Ｌ　Ｈに結合され、得られた各接合体は次に材料及び方法の部で一般的 に述べるようにマウスを免疫化するために用いられた。第４図の検査から判るよ うに、ポリペプチド（ｃ）に対して生じた血清は、ポリペプチドならびにＫＬＨ に結合するオリゴクローナル受容体を含み、ポリペプチド（ｄ）に対して生じた 血清は、ポリペプチド（ｄ）及びポリペプチド（ｄ）並びにＫＬＨに結合するオ リゴクローナル受容体を含んでいた。どの血清も、それらを生ずるために用いら れなかったポリペプチドと交叉反応し結合する受容体を含んでいなかった。

旧式の（ｏｕｔｄａｔｅｄ）ヒト血小板からの抽出物が、ＰＤＧＦの部分的に精 製されたサンプルを得るために用いられた。すでに述べたように、ＰＤＧＦは約 ３０にダルトンの見かけ分子量を持ち、同じ見かけ分子量の二つの高分子量ポリ ペプチド（ＰＤＧＰ−１及び−２と呼ばれる）に還元的に解離されうる癌蛋白で ある。

第５図は、この図の説明でより詳しく説明されるようにポリペプチド（ｃ）及び （ｄ）に対して生じたオリゴクローナル受容体含有抗血清を用いた。ＰＤＧＦの ウエスタンーンプロット分析の結果を示す；ポリペプチド（ｄ）に対して生じた 抗血清はネガテブ対照として用いられる。第５図の検査から判るように、ｓｉｓ 関連ポリペプチドであるポリペプチド（ｃ）に対して生じたオリゴクローナル受 容体含有血清は、三つの蛋白部分に結合する（レーン２）。これらの部分の一つ は約３０にダルトンの見かけ分子量を持ち、二つは各々約１６〜１８にダルトン である。レーン４はまた、抗幻遺関連ポリペプチド血清に含まれるオリゴクロー ナル受容体による結合を示す。予期されるブチド（ｄ）に対して生じＴこオリゴ クローナル受容体により示される（レーン　及び５）。

ＦＤＣＦ−１及び−２のアミノ酸残基配列がｐ２８ｓｉｓの配列とコリニア−（ ｃｏｌ　１ｎｅａｒ）であると仮定して、ポリペプチド（Ｃ）のアミノ酸残基配 列はＰＤＧＦ−１及び−２の各々位置６７〜８３、及び７３−８９に対応する。

ＰＤＧＦ−２の残基７３〜８０のアミノ酸残基配列は決定されており〔ドウリト ルら、サイエンス、２２１．２７５−２７７（１９８３））、これら残基の総て はポリペプチド（ｃ）の最初の（アミノ末端の）８つの残基と同じである。加え て、ｐ２８ｓｉｓ癌蛋白の残基１４７〜１５５に対応し、かつＰＤＧＦからのポ リペプチドは配列化されており〔ウォーターフィールド、ネイチャー、３０４． ３５−３９（１９８３））、現在までに同定された９つの残基の総てはポリペプ チド（ｃ）の対応する残基と同じである。すなわち、ポリペプチド（ｃ）の１７ の残基のうち１６個は、ヒト由来のＰＤＧＦ及びレトロウィルス形質転換された 細胞系統由来のｐ２８ｓｉｓの両者における残基と同じであり、かつ配列におい て同じである。

上の結果は、本発明のモノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマの調製に つながる免疫化のために有用なさらに二つのポリペプチドの免疫原性及び抗原性 を例示する。これらの結果はまた、ポリペプチド（ｃ）に対して生じたオリゴク ローナル受容体が癌蛋白すなわちＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−１、及びＰＤＧＦ−２に ら結合することをも示す。

二つのＰＤＧＦ配列の種々の領域を表わすさらに別の合成ポリペプチドが作られ た。ＦＤＣＦ−１及びＰＤＧＦ−２のアミノ末端ならびにＰＤＧＦ−２の中央及 びカルボキシル末端部分が合成され、免疫原担体キイホールリンペットヘモシア ニン（ＫＬＨ）に接合され、そして前述した５０パ一セント結合滴定量を示すオ リゴクローナル受容体含有抗血清の生産を誘発するｆこめにマウスに注射された 。

ＰＤＧＦ−２の独特の領域を表わすポリペプチドは、この配列の最初の１８のア ミノ酸を含み、ＦＤＣＦ−２（１−１８０ポリペプチド番号１１２）と呼ばれる 。ここでカッコ付きの数字は、アミノ末端から番号を付された対応する分子のア ミノ酸残基を示す。ＰＤＧＦ−１の独特の領域は、ポリペプチド番号ＩＩＩとし ても引用されるポリペプチドＰＤＧＦ−１（１−１２）により表わされ、これは この配列の最初の１２のアミノ酸を含む。これら１２のアミノ酸の６つはＰＤＧ Ｆ−２と共通であり、しかし上述したように３つだけが連続している。第三のポ リペプチド、ＰＤＧＦ−２（７３−８９）は、本明細書でポリペプチド（ｃ）及 びポリペプチド番号１１３とも言われる。それは、ｐ２８ｓｉｓの予測されたア ミノ酸残基１３９〜１５５を表わし、カップリング目的のためにそのカルボキシ ル末端に追加的システィンを含む。このポリペプチドはＫＬＨにカップリングさ れた場合、血小板抽出物中の精製されたＰＤＧＦの小さくされたサブユニット、 ＭＷ３１０００．３００００．２１０００、及び１８０００−１４０００の蛋白 、及びＳＳ■感染されたマー上セット細胞中の５６にダルトンの蛋白を認識する 抗体の生産を誘発した。

第四のポリペプチド、ＰＤＧＦ−２（＋　２６−１４５）はまた、Ｖ−９ｌ−２ １０）により予測される。これらポリペプチドのアミノ酸配列は、上記に示しで ある。

これら合成ポリペプチド接合体に対して生じたオリゴクローナル受容体含有抗血 清の特異性を分析するために、ＰＤＧＦをこれら抗血清で調べた。精製したＰＤ ＧＦは減少され（ｒｅｄｕｃｅｄ）、ポリアクリルアミドゲル中に電気泳動され 、そしてウエスクーンプロット法を用いてニトロセルロース上に移された（第６ 図、レーンＡ−Ｆ）。

レーンＡ及びＢにおいて、ＰＤＧＦ−１（１−１２）に対する二つの抗血清は、 約１８，０００ダルトンの蛋白と免疫反応した。精製したＰＤＧＦの配列分析は 、ＰＤＧＦ−１鎖の多くがこの位置に移動することを示す〔アントナイデスら、 サイエンス、２２０．９６３−９６５（１９８３））。これら抗血清の反応性の 弱さは、ＰＤＧＦ−１のアミノ末端が抗体結合にとって容易に接近できないこと を示唆する。

対照的に、ＰＤＧＦ−２（＋　−１８８レーンＣ）のアミノ末端に対する抗血清 は、約１８０００及び１４０００ダルトンに移動する蛋白を容易に検出し、ＰＤ ＧＦ−２の配列分析（アントナイデスら、前出）と一致する。

ＰＤＧＦ−２（７３−８９）により誘発された抗血清は、レーンＣで見られる同 じ活性（レーンＤ、Ｅ）を与える。対照的に、ＰＤＧＦ−２（＋２６−１４５） に対する抗血清は精製されたＰＤＧＦに対する検出しうる活性を持たなかった。

ＰＤＧＦ−２（１２６−１４５）ポリペプチドの配列は、位置１４５でｃ−ＰＤ ＧＦと異る（ジョセフら、前出）ので、このアミノ酸残基配列変化がエピトープ 部位内に含まれることは可能である。これは、ポリペプチドが２０個のアミノ酸 残基長さでありかつ変化がポリペプチドをＫＬＨ抗体蛋白にカップリングさせる ために用いられたカルボキシ末端位置にのみ存在するので、ありそうもない。す なわち活性の欠損は、癌ポリペプチド特異的抗体の発生によるのでない。なぜな らこの抗血清は細胞由来のＰＤＧＦ類似分子と反応するからである。精製された 調整物中の検出されたＰＤＧＦの！４０００〜＋８０００ダルトンのサイズは、 この物質の多くが、ｐ２８ｓｉｓの予測された配列のカルボキシ末端を欠くこと を示唆し、これはこの抗血清により認識されるＰＤＧＦ抗原部位の総て又は一部 を除去する。

ＰＤＧＦ類似蛋白がまた他の形質転換された細胞系統において合成されるかどう か決定するために、抽出物を作り、ＰＤＧＦ関連ポリペプチドに対する種々のオ リゴクローナル受容体含有抗血清で免疫化した。第７図において、ＳＳＶ形質転 換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＰＤＧＦ−１（１−１２８レーンＡ−Ｃ，Ｆ−Ｈ 及びに−Ｍ）及びＰＤＧＦ−２（７３−８９ＸＬ／−ンＤ、Ｅ、Ｉ　、Ｊ、Ｎ及 びｏ）で誘発されたオリゴクローナル受容体含有抗血清でテストした。ＰＤＧＦ −２（７３−８９Ｍ第６図、レーンＤ及びＥ）に対する二つの血清のうち、第６ 図、レーンＤで用いられた血清は、精製されたＰＤＧＦとのいく分弱い活性を示 した。しかし、第７図のレーンＤに見られる様に約７０．０００ダルトンの蛋白 との強い反応性が観察され、これは免疫化ポリペプチド、ＦＤＣＦ−２，（７３ −８９ＸレーンＥ）でのブレインキュベーションｊこよりブロックされｒ二（レ ーンＥ）が、ＰＤＧＦ−１（１−１２）での抗血清の予備インキュベーションに よりブロックされなかった。

このように、二つの抗血清によるこれら癌蛋白との特異的反応性は、これはＰＤ ＧＦの小さな領域との偶然の交叉反応性であること、しかしこの分子は少くとも ＰＤＧＦ−１のアミノ末端及びＰＤＧＦ−２の中心領域と相同な配列を含むこと を示す。

ｐ２８ｓｉｓとｐ２０ｓｉｓの量は、この抗ＰＤＧＦ−２（７３−８９）血清で の検出のレベルより低かった。同様の結果が別の抗血清により得られたが、過露 出が時折、２０，０００ダルトン帯が特異的に検出されたことを示した（データ は示さず）。

これら抗血清による二つの池の無関係の形質転換された細胞の抽出物の分析は、 同様の結果を与えた。ＴＲＤＩ細胞系統は、自発的に形質転換され１こＢａ１ｂ ／３Ｔ３された系統である。〔ボーエン−ボーべら、ブロク、ナトル、アカド、 サイ、ニーニスニー、■、２３９６−２４００（１９８４））。この系統はまた 、７０，０００ダルトンの蛋白ならびにより免疫学的に関係する約１００，００ ０ダルトン（第７図、レーンｃ−ｒ）の蛋白を表現する。第三の細胞系統ＭＳＴ Ｐ、及びＦｅＬＶ−ＢとＦｅ５Ｖのシンダーセイレン株で生産的に感染されたミ ンク肺系統（ＣＣＬ６４）はまた、同じサイズの蛋白を表現する（第７図、レー ンに−０）。

７０．０００ダルトンの癌蛋白に加えて、ＦＤＣＦ−１（１−１２）に対するオ リゴクローナル受容体含有抗血清は約５３，０００ダルトンの蛋白を検出しｆ二 （データは示さず）。これら蛋白は、血清の不存在下で１ケ月の間成長した細胞 の抽出物中で検出されかつＴＲＤｌ細胞系統によりコンディションされた無血清 媒体中で見い出されるので、血清汚染物ではない。研究された総ての細胞系統は 、これら二つのＰＤＧＦ類似蛋白を含む（図面の簡単な説明における第１１図の 考察も参照）。

癌遺伝子的に形質転換されない細胞（正常な二倍体ラット平滑筋及びヒト肺繊維 芽細胞）を含む種々の細胞におけるＰＤＧＦ類似分子の表現は、他のプロセスが 形質転換に関係することを示す。細胞系統の総てが、ＰＤＧＦ−１（＋　−１２ ）で誘発されたオリゴクローナル受容体含有抗血清で検出された７０．０００及 び５３，０００ダルトン蛋白を含んでいたが、細胞はＰＤＧＦ−２領域の配列に より予測される決定基に対して向けられた抗血清により検出される他の蛋白のサ イズ及び強度に関して全く相同である（データは示さず）。

これら相違の性質は現在未知である。

同様に、以下で（ｅ−ｈ）と示す四つの免疫原ポリペプチドの各々は、オリゴク ローナル受容体の生産を誘発するために用いられるこれらの免疫原ポリペプチド に、ならびに黒癌遺伝子によりコードされる二つの癌蛋白の各々の結合するとこ ろのオリゴクローナル受容体を誘発するために用いられる。これろ四つのｒａｓ 関連ポリペプチドの配列を、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方 向に、下記式 ％式％） ）： ［４５） 組合わせた式 ポリペプチド（ｅ−ｈ） Ｋｌ、ＶｖＶＧＡＶＧＡＲ（ＳＪ、Ｇ）ＧＶＧＫ；により示される。

ここでカッコ内のアミノ酸残基は各々、式中の直前のアミノ酸残基配列残基に対 する代替物である。このように作られたオリゴクローナル受容体は、約Ｉケ月の 間の後述のような二回の免疫化後に、１：４００を越える希釈の５０パ一セント 結合滴定量を持つ。さらに、ポリペプチド（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）により誘発 された計遍連オリゴクローナル受容体の各々は、（ａ）ヒトＴ２４ぼうこう肉腫 細胞及び分解された（Ｉｙｓｅｄ）細胞抽出物中に存在する癌蛋白に結合するこ とが見られた（データは示さず）。

第１２ＵＩＪに見られるように、下記（ｋ及び１）に示した二つの免疫源性ポリ ペプチドの各々は、それらの生成物を誘発する免疫源性ポリペプチド並びにｖｆ ｅｓＳＴ癌遺伝子によりコードされる２つの癌蛋白の各々に結合するオリゴクロ ーナル受容体を誘発しうる。２つのＶ−ｆｅｓ関連ポリペプチドの配列は、左か ら右へ、及びＮ末端からＣ末端の方向に式、 ポリペプチドｋ　ＬＭＥＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＰ（ポリペプチド１２７） ポリペプチドＩ　ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ（ポリペプチド１２１） により示される。

ポリペプチド（ｋ）及び（１）により誘発されるオリゴクローナル受容体は、ヒ トＴ２４膀胱癌の細胞及び自然形質転換マウス３Ｔ３セルライン（レーンＡ及び Ｃ）からの上清中に存在する癌蛋白に結合するのが見られる。

ポリペプチド＋２１に対し作られたハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ　８９５２．Ｈ Ｂ　８９５４及びＨＢ　８９５５により分泌されるモノクローナル受容体は、胸 、直腸、胃及び子宮の腫瘍から得られたｌ又はそれ以上の蛋白と免疫反応するこ とが認められた。ポリペプチド１２７（ハイブリドーマ＋　２７−４２ｃｔ　１ ）に対して作られたモノクローナル受容体の、妊娠した母親の尿試料中の蛋白と 反応性は、以下に検討される。

第１３図に示されるように、ｒａｓ遺伝子に関連する蛋白は、ｖ−ｒａｓＨａ（ ポリペプチド１４２）の位置９６−１１８に対応するｒａｓ合成ポリペプチドに 対して作られたモノクローナル抗体（ハイブリドーマＡＴＣＣＴ−ｒＢ　８６７ ９からの）により検出された。蛋白は、レーンＡ中に検出され、免疫化ポリペプ チド（レーンＢ）とのプレインキュベーンコンにより阻止される。即ち、免疫化 ポリペプチドとのブレインキュベーションは、強く反応性癌蛋白を阻止した。

本発明のモノクローナル受容体、たとえば５ｉｓ−（ＰＤＧＦ）関連ポリペプチ ド（ｃ）に、又はｒｅｓ関連ポリペプチド（ａ）、（ｂ）、（ｋ）又は（１）に 、又はｒａｓ関連ポリペプチド（ｅ＝ｈ）に、又は下記の親和性吸着剤において 開示される他の癌蛋白関係ポリペプチドに対して生じたものは、さもなければＦ ＤＣＦのような純粋な形で得るのが困難な自然に発生する蛋白状物質を作るため の簡便かつ面倒が比較的少ない手段を提供する。すなわち、後述する純粋なＰＤ ＧＦを得るために長い手順を経る必要よりも、単に細胞を溶解し、遠心分離し、 結合した抗ポリペプチド（ｃ）受容体を含むアフィニティ吸着剤に上澄みを注ぎ 、形成された可逆的リガンド複合体を解離した後に精製した蛋白を溶離すること ができる。いくつかの別の蛋白状物質が親和性吸着剤カラムに非特異的に結合さ れうるが、さもなければ精製された形で得るのが困難な精製蛋白の単離がそのよ うな吸着剤を用いて大いに向上される。

上述しｆコ保存配列に対する抗血清は、広範囲の種々の形質転換セルライン中の 蛋白と反応する。抗血清は、正常コントロール中よりも、癌患者及び妊婦の尿中 に５からフィティ（ｆｉｔｙ）倍ら濃縮されている癌遺伝子関連蛋白を容易に検 出する。表現の独特のパターンが、種々の悪性において及び妊娠の異なる妊娠期 間段階中に検出された。

抗ペプチド抗体は、配列癌遺伝子に免疫学的に関連する蛋白を検出するのに特に 適している〔ウォングら、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、ニーニスニー、７８．７４１２−７４１６（＋　９８１））。それらは配 列であるので、特殊な抗ペプチド抗体が、蛋白の高保存部位に指示することがで き、類似の作用を宵しうる、確認している関連分子の可能性を最大にする。抗ペ プチド抗体による蛋白の免疫認識は、抗原コンフォメーションに大きく依存する 必要がないので、その大半が折りたたみ蛋白に特異な決定基に向けられる抗蛋白 抗体により検出されない蛋白を認識することができる。最後に、抗ペプチド抗体 の結合は、体液又は分泌物中に生じるかも知れない標的抗原の変調又は断片形に 比較的反応しない。

第１及び第３表中、抗体を作るのに用いられた合成ペプチドは、列挙され、他の 癌遺伝子の関連配列と共に表示される。例示的ζ」旦ポリペプチド１４２：ｔ、 ｖ−ｒａｓＨａ又はｖ−ｒａｓＫｉによりコードされるｐ２＋に上り自動リン酸 化されたスレオニン残基から下流の３７−５９アミノ酸に位置するｖ−ｒａΣＨ ａ配列である。配列はＨ−ＲＡＳと同一であり、Ｋ−ＲＡＳとは一個の保存アミ ノ酸変化で異なる。ケイボンら、ネイチャー３０４．５０７（＋９８３）。ｓｉ ｓモノクローナル抗体を作るのに用いられるＰＤＧＦの配列は、鎖（ポリペプチ ド１１２）のＮ末端に位置し、血小板誘発成長因子の他の鎖（ＰＤＧＦ−１）の 最初の１２アミノ酸に類似している。ｆｅｓペプチド（ポリペプチド１２７）は 、ｖ　−ｒｅＳ−５ｔ（ｖ　−ｆｅｓ　−Ｇ　Ａの位置９２７−９４２）の８５ ，０００ダルトン融合蛋白の残基７４４−７５９を構成し、主要チロシンリン酸 化部位から下流の７９−９４アミノ酸である。本研究に用いられたポリペプチド は、それらが個々の癌遺伝子ファミリーの高保存部分を表現するので選択された 。

これらの保存配列に対する抗血清は、広範囲の種々の形質転換セルラインの蛋白 と反応する。３つの抗血清の、ネコ肉腫ウィルスにより形質転換されたミンク原 糸の蛋白との反応性は、第１４図に示される。ｓｉｓペプチドに対する抗体は、 ＳＳＶ形質転換ＮＨＫ細胞中の２０，０００ダルトン蛋白並びにミンク原糸（レ ーン１）中の約５６．０００ダルトン（ｐ５６５ｉｓ）のｓｉｓ関連蛋白を検出 する。ｓａｓベプヂドに対する抗体は、約２１，０００ダルトン（ｐ２１　ｒａ ｓ）の主要蛋白及び細胞抽出物中の約３０，０００ダルトンの第二次の蛋白を検 出す。ｆｅｓ蛋白に対する抗血清は、８５，０００ダルトンｇａｓ−ｆｅｓ融合 蛋白（ｐｐ　８５−　ｇｏｇ　−ｆｅｓ）並びに４０，０００ダルトン蛋白（ｐ ４０ｆｅｓ、レーン３）を検出する。

第１５図において、これらの抗血清の種々の患者からの尿蛋白との反応性を示す 。ｓｉｓ抗血清は、尿濃縮物（パネル４）中５６，０００．３１．０００及び２ ５，０００ダルトンの蛋白を検出する。

３つの全ての蛋白と結合している抗体は、ｓｉｓペプチド（パネルＢ）との予め のインキュベーションにより阻止されるが、ｒａｓペプチド（パネルＡ）とのイ ンキュベーションによってはされない。検出された蛋白の濃縮物は、正常担体よ り５０倍高い（下記参照）。検討された全尿は、３つｓｉｓ関連蛋白を含んだが 、リンパ腫の患者からの試料は例外で、これらには、５６，０００ダルトン蛋白 がなかった（レーン４）。

多発性骨髄腫及び胃癌の供与者からの尿中のＰ５６ｓｉｓ（パネルＡ。

レーンｌ及び２）の幾らか速い可動性は、これら試料中の過剰のアルブミンに基 づき、そこでは、レーン１中の低分子量蛋白のひずみは、過剰量の抗体し鎖に基 づく。

パネルＣにおいて、尿試料中に検出された種々のｒａｓ関連蛋白が提示される。

蛋白は、約１００，０００及び５５，０００ダルトンで、そして検出された（パ ネルＣ，レーン２−４）。再び、抗血清の特異性は、ｒａｓペプチド（パネルＤ ）とのブレインキュベーションにより活性を阻止することによって示されたが、 ｓｉｓペプチド（パネルＣ）とのブレインキュベーションではさ２−札なかった 。

５５．０００ダルトンｒａｓ関連蛋白は、５６，０００ダルトンｓｉｓ関連蛋白 とは異なり（下記参照）、各試料において異なる反応性パターンを示す。蛋白は 、パネルＣ。レーンＩ（胃癌）では検出可能ではないが、一方、はとんど等しい 強さの４つの横じまがレーン２（３８週妊娠）中に見られる。

強い反応性の二重じま；よ、乳癌の患者（供与者）からの尿がプローブされたと き、レーン３に可視化される。約３５．０００ダルトンでの二次的溝じまは、５ ５，０００ダルトン蛋白の高濃縮物と結合する、レーン４において、単一の５５ ，０００ダルトン横じまが検出された。

約２１，０００ダルトンの蛋白がパネルＣの全４レーンに検出された。これらの より小さな蛋白は、パネルＣ、レーンＩ中の蛋白の可動性がすこし遅いけれども 、類似の濃縮物で存在しｆ二。この変化した可動性は、ｒａｓコード化蛋白の電 気泳動可動性上、アミノ酸残基位置１２での変化の効果により、有意である。２ ５．０００ダルトンで検出された結合は、抗体り鎖と共移動することに基づき、 判断するのが困難である。

パネルＥにおいて、３５，０００及び４０，０００ダルトンｆｅｓ関連蛋白が示 される。結合は、免疫化しているｒｅｓペプチド（パネルＥ。

レーン１）とのブレインキュベーションにより阻止されるが、ｒａｓペプチド又 はｅｒｂ　Ｂ又はａｂｌ蛋白（パネルＥ、レーン２−４）中の類似配列を表現し ているペプチドとのインキュベーションによってはされなかった。

要約すると、上述した３の抗血清は、尿中８の異なる蛋白、３ｓｉＳ関連蛋白（ ｐ５６ｓｉｓ、　ｐ３１　ｓｉｓ及びｐ２５ｓｉｓ）、３　ｒａｓ関連蛋白（ｐ ｉ　００ｒａｓ、　ｐ５５ｒａｓ及びｐ２１ｒａｓ）、及び２ｆｅｓ関連蛋白（ ｐ４０ｆｅｓ、　ｐ３５　ｆｅｓ）を特異的に検討した。

第２３図において、５１コントロール（正常：診断された腫瘍疾亮がない）の尿 試料、又は種々の悪性を有する患者（供与者）からの２６０尿試料中の癌遺伝子 関連蛋白の検出の頻度が表示される。妊娠からの２６０尿試料中の同様の頻度が 第２４図に示される。尿中の癌遺伝子関連蛋白の量は、イムノプロットを用いて 評価され、４つのカテゴリー、検出不可能、検出可能、５−１５倍上昇、１５倍 上昇より大の一つに置かれた。

ｌＯ試料以上が試験された悪性の型；よ、個々に表示される。残っている型は、 複合体として表示される。

ｐ２１　ｒａｓは、全腫瘍試料の約７０％に検出された。しかしながら、同様の 頻度は外見上は正常固体中に見られた、乳癌患者の尿中に見出される上昇レベル のｒａｓ及びｆｅｓ関連蛋白と対称的に、膀胱及び前立腺癌敬老は、上昇レベル の５６，０００ダルトンｓｉｓ関連蛋白をしばしば分泌する。この蛋白は、上述 したｒａｓ及びｒｅｓ関連蛋白の非存在下に検出された（第１５図、レーン１． ２、パネルＡ−Ｃ）。５６゜０００ダルトンｓｉｓ関連蛋白に加えて、これらの 患者は、上昇レベルの３１．０００及び／又は２５，０００ｓｉｓ関連蛋白をし ばしば有した。さらに対称的に、良性の前立腺小結節敬老からの尿は、上昇レベ ルのこれらの癌遺伝子関連蛋白を含まなかつ几（第８図、レーン３、パネルＡ− Ｃ）。

高レベルの同様の蛋白は、また、肺及び頚癌並びに非ホノキンリン腫の患者から の尿中にしばしば見出された（第２３図参照）。これら後者の患者では、上昇し た３１，０−００及び／又は２５，０００ｓｉｓ関連蛋白が、５６，０００ダル トン蛋白の非存在下に見られた（第５図、レーン４、パネルＡ−８）。

即ち、癌患者からの尿試料中には、３つの異常なパターンが観察された。乳癌小 者のサブセットは、ｐ４０ｆｅｓ及び／又はｐ３５ｆｅｓと共に上昇レベルのｐ ５５ｒａｓを有した。膀胱及び前立腺隔置１者は、ｐ５５　ｒａｓ、　ｐ４０　 ｆｅｓ及びｐ３５ｆｅｓの非存在下、増加した量の３つの全ｓｉｓ関連′蛋白を 排泄する。最後に、肺癌及びリンパ腫患者のサブセットは、上昇レベルの低分子 量サイズのｓｉｓ関連蛋白の２を排泄した。第１５−１８図並びに第２３図から 見られうるように、表現のパターンは、上レベルの単一癌遺伝子関連蛋白の排泄 よりも疾病段階とよく相関する。明白に正常な個人では、上昇レベルのこれらの 蛋白がほとんど検出されない。

ここに記載された蛋白は、種々の抗ペプチド抗血清の高特異的反応性に基づく癌 遺伝子蛋白に免疫学的に関連している。しかしながら記載した８つの蛋白の、わ ずか２つ（ｐ２１　ｒａｓ、　ｐ３１５ｉｓ）が癌遺伝子コード化全蛋白を表現 する。

ｐ２１ｒａｓ蛋白は、ＧＴＰ結合活性を存する。即ち、ｐ２１ｒａｓは、細胞分 裂と密接に関連しており、それゆえ蛋白がほとんどの尿試料中に容易に検出され ることは驚くに足りない。

同様に、Ｈ−ｒａｓ又はＫ　−ｒａｓに特異的な、上昇レベルの転写（Ｔｒａｎ ｓｃｒｉｐｔ）が、ここに見られるように広く種々の悪性に検出された。

もっとさらに、ｒａｓ関連生成物に対する抗血清ら、腫瘍組織中に、上昇した表 現を検出した。ここに、本蛋白の最も著しい上昇が、悪性の尿中に見られた。

血小板誘発成長因子（ＰＤＧＦ）の鎖の一つである、ｐ３］ｓｉｓ蛋白も、また 検出された。ＦＤＣＦ−１鎖は、血小板から分離されたとき、わずかに１８，０ ００ダルトンで、ヒトｃ−ｓｉｓ配列とｖ−ｓｉｓとの比較は、！　８，０００ ダルトン蛋白を示し、より大きな前駆体蛋白を始める。確かに、部分的精製血小 板抽出物の分析は、約３１゜０００ダルトンの蛋白を明らかにする。ＰＤＧＦは 、力強い分裂誘発活性を有し、組織傷害の部位で血小板から遊離されるので、Ｐ ＤＧＦの生理的作用の一つは、創傷治癒であると思われる。加えてＰＤＧＦ様物 質は、多くの形質転換セルラインから分泌され、分泌は、平滑筋細胞中に、発生 的に調節されるように見える。即ち、ｐ３１ｓｉｓはｐ２１ｒａｓと同様、生理 的に重要であり、それが正常及び異常段階で尿中に存在するのは驚くに足りない 。

予期された分子サイズの癌遺伝子コード化蛋白に加えて、付加的蛋白が本研究で 検出された。それらの存在は、それらが幾つかの癌で並びに妊娠中、特異的に存 在することから、偽交差反応性に基づくものではない。さらに、抗体とこれらの 蛋白の反応は、適当な合成免疫源で特異的に阻止された。免疫源として用いられ る蛋白が癌遺伝ファミリー中の保存配列を表現するので、これら付加的蛋白は、 これらの遺伝子ファミリーの数を表現する。これら遺伝子の表現は、新形成又は 妊娠中、相関調製を受けるであろう。これら蛋白の超厚と関係なく、それらが新 形成及び妊娠の間、特異的に表現さｔ−るという事実は、それらを重要なマーカ ーにする。

■２診断系及び方法 診断系、好ましくはキット形の、は、本発明の更に別の実施独様である。この系 は、免疫反応の形成により癌蛋白の存在を評価するのに有用である。この系は、 本発明の生物学的に活性なモノクローナル受容体分子を含む少くとも一つのパッ ケージを含む。すなわち受容体は、（ａ）レトロウィルスの遺伝子によりコード される癌蛋白リガンドのアミノ酸残基配列の一部に対応する、アミノ酸残基配列 中に約７〜約４０．好ましくは約１０〜約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチ ド、及び（ｂ）レトロウィルス遺伝子によりコードされる癌蛋白に結合する。

所定の量のモノクローナル受容体分子が癌蛋白リガンドを含む水性組成物の所定 量と混合されたとき、免疫反応が起り、受容体とリガンド抗体と抗原の間のコン プレックスを作る。癌蛋白を含む水性組成物の例としては、細胞分解物、血清、 血しょう、尿及び羊水が挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、一つ以上の癌遺伝子関連翻訳生成物に対する抗血清にょるスクリーニン グに有用であることは、特に価値がある。即ち、ここに述べる評価方法は、単一 供与者から得た一部の体液試料アンチコント（ａｉ＋ｔｉｑｕｏｔｓ）上で実施 することができ、悪性状独、妊娠状態などに関して正確な情報を産生ずる。

受容体とりガントの間の混合は水性組成物中で行われる。しかし、受容体又はリ ガンドが、この混合前に実質的に乾燥しており、水不含であることができる。す なわち、ハイブリドーマ上清、腹水又は緩衝液中の受容体の溶液を水性細胞抽出 物と混合して、二つの水性組成物からの反応物を混合することができる：受容体 はミクロタイタープレートの壁土にコーティングされ、そしてリガンドを含む細 胞抽出物又は血清と混合されることができる；又はリガンドはミクロタイタープ レート壁、アクリルアミドゲル中などから移動後ニトロセルロースシートにコー ティングすることができ、又は組織切片、及びハイブリドーマ上清、腹水、又は 混合された受容体を含む緩衝溶液中に存在することができる。

本発明の例示的診断系及び方法の使用を図の説明において例示する。そこでは、 ニトロセルロース上にコーティングされ、次に本発明の受容体と混合される癌蛋 白リガンドが第１，２．５−８及び１Ｉ−１４図と関係して述べられ、一方、免 疫学的コンプレックスを形成するためにハイブリドーマ上清でインキュベートさ れた細胞抽出物は、第３図に関して説明される。尿試料からの癌蛋白は、第９． １０図及び１５−１９図で説明される。

受容体は、「指示基」又は「ラベル」とともに用いられる。指示群又はラベルは 、免疫反応が起り免疫学的複合体が形成されたかどうか決定する、及びある例で はそのような反応の程度を決定するための手段として受容体と組合せて用いられ る。

指示基は、放射性元素の場合におけるような単一原子たとえばヨウ素１２５又は １３１、水素３又は硫黄３５又は炭素１４、又はＮＭＲ活性元素たとえばフッ素 １９又は窒素１５であることができる。

指示基はまた、フルオレセイン、ローダミンＢのような蛍光染料又は酵素たとえ ば西洋わさび　ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はグルコースオキダーゼなどのよ うな分子であることもできる。

指示基は、抗体がｌｔＪでラベルされる場合のように受容体に結合されることが できる。指示基はまた、ＨＲＰに結合された受容体がマウスにおいて生じる、又 は１２５■のような放射性元素がスタフィロコッカス　アウレウスから得られた プロティンＡに結合されるような受容体分子と反応する別の分子の総て又は一部 又は原子であることもできる。

指示基がＨＲＰ又はグルコースオキダーゼのような酵素である場合、免疫反応が 起こり受容体−リガントコンプレックスが形成された事実を可視化するために、 さらに追加の剤が必要である。

ＨＲＰのたぬのそのような追加的剤としては、過酸化水素、及び酸化染料前駆体 たとえばジアミノベンジジンが挙げられる。グルコースオキダーゼのために有用 な追加剤としては、ＡＢＴＳ染料、グルコース及びＨＲＰが挙げられる。

指示基又はラベルという言葉はここで、受容体に結合された又は別々に用いられ る単−原子及び分子を包含して用いられる。これら原子は又は分子が単独で用い られるか又は追加的剤との関係で用いられるかにはよらない。そのような指示基 又はラベルは免疫化学において自体周知であり、それらが他の点では新規な受容 体、方法及び／又は系とともに用いられる限りにおいてのみ本発明の一部を成す 。

指示基又はラベルに好ましくは、受容体とともに供給され、−緒に又は別々に包 装されうる。過酸化水素及びジアミノベンジジンのような追加的剤はまた、ＨＲ Ｐのような指示基が用いられる場合、系に含めることができる。そのような物質 は、多くの指示基と同様に市販で容易に入手でき、診断系と共に供給される必要 がない。また、過酸化水素のようなめる剤は、常時分解し、又はさもなければい くつかの放射性元素のように短寿命であり、最終ユーザーによってより良く供給 される。

本診断系はまた、商標イムロン■として売られている（グイナテック、アルキサ ンドリア、ＶＡ）９６個のウェルのミクロタイタープレートである固体マトリッ クスを含むことができる。ミクロタイターストリップ又はプレートは、明るいプ ラスチック物質、好ましくはポリビニルクロライド又はポリスチレンから成る。

本発明の診断系及び方法で用いられる代りの固体マトリックスとしては、アボッ ト　ラボラトリーズ、ノースジカゴ、ＩＬ、から入手できる直径約１ミクロンか ら約５ミリメーターのポリスチレンビーズ、任意のサイズのポリスチレンチュー ブ、ステップク、パドル、そのポリスチレン粒子が約１ミクロンのサイズであり 、ラテックスから遠心分離できるところのポリスチレンラテックスが挙げられる 。

固体マトリックスはまた、種々の物質、たとえば架橋デキストランたとえばセフ ァデックスＧ−２５、−５０、−１００、−２００など〔ファーマンア・ファイ ン・ケミカルズ、ビスカタウエイ、ＮＪｌから入手できる〕、アガロース及び架 橋アガロースたとえばセファロース−６８ＳＣＬ−６Ｂ、４Ｂ、ＣＬ４６など（ ファーマシア・ファイン・ケミカルズより入手できる）から作ることもできる。

診断系はさらに、評価結果を比較するための標準、及び乾燥した又は液体の形の 種々の緩衝剤（とくにミクロタイタープレート壁を洗うため、サンプルを希釈す るため、ラベルされた反応剤を希釈するためなどのための）を含むことができる 。

温血動物からの体試料中の癌蛋白リガンドの存在の評価方法は、本発明の他の局 面を構成する。一般的評価方法に従って、本発明のモノクローナル受容体は、癌 蛋白リガンドの存在を評価されるべき試料を含む水性組成物に混合される。好ま しくは、モノクローナル受容体及び体試料は、予め定められた量で用いられる。

こうして調製された混合物は、受容体とりガントの間で免疫反応が起こり、免疫 コンプレックス（反応生成物又は免疫反応物）を形成するのに十分な時間の期間 、保持される。免疫コンプレックスの存在が、次いで決定され、その存在は、評 価試料中に癌蛋白リガンドの存在を示す。

免疫コンプレックスの存在は、前述の標識を用い、又は抗体−抗原コンプレック スの存在を決定するための免疫化学でよく知られた他の手段により決定される。

特異的評価方法も考慮される。これらの特異的方法の各は、上記３つのステップ が用いられるが、これら評価方法の細部は、互いに少し異なる。

評価されるべき試料が、固相マトリックス、例えばミクロタイタープレートテス トウェル又はニトロセルロースシートに固定され、固体支持体を形成する固相評 価は、特に好ましい。かかる場合、評価される試料の混合及びモノクローナル受 容体が固液相混合物を形成する。固及び液相は、前述の保持期間後、分離され、 液体−受容体コンプレックスの存在が、固体支持体に結合する受容体の存在によ り決定される。結合した受容体の相対量は、多くの評価で決定でき、これによっ て、評価される試料中に存在した癌蛋白リガンドの量の決定を提供する。

本発明の受容体分子もまた固体マトリックスに固定でき、固体支持体を形成する 。この場合、評価される試料は、添加されて固液相混合物を形成し、混合物は前 述したように保持され、評価された試料中の免疫コンプレックス及び癌蛋白の存 在は、予め決定した量の標識化リガンド、例えば固定受容体分子により結合され るポリペプチド又は癌蛋白の混合体によって決定される。即ち、受容体及び癌蛋 白間で形成しｆニコンプレックスの存在は、標識化リガンド結合の量を提供し、 該結合量は、試料が評価されている該蛋白の遊離の場合に提示される既知の対照 量よりも少ない。試料中の癌蛋白の相対量は、過剰の受容体を用いること及び標 識化リガンドの減少した結合を測定することによって決定できる。

ポリペプチド又は本発明の受容体分子により結合される癌蛋白リガンドも一１固 体マトリックスに添付でき、固体支持体抗原を形成する。既知の過剰量の本発明 の受容体分子は、評価されるべき試料と混合され固体混合物を形成する。こうし て形成された固体混合物は、免疫コンプレックス反応生成物を形成するのに十分 な期間保持され、その後固体支持体と混合され、固−液相混合物を形成する。混 合物は、存在する過剰の未反応受容体分子が免疫反応して固相支持抗原とコンプ レックスを形成するのに十分な期間、保持される。形成されるコンプレックスの 量は、固及び液相の分離後、既に記載された手段を用いて決定される。この方法 は、試料中の癌蛋白の存在に関しての、モして又、予め決定された量の受容体及 び固相リガンドが用いられる場合は、その相対に関して決定を提供できる。

■、特異的評価 液体体試料は、−以上の癌遺伝子コード化蛋白に対する抗血清でスクリーンでき る、スクリーニングは、本発明の評価方法に従って系統的に成し遂げうる。−以 上の抗血清での試料のスクリーニングは、評価される試料中に存在する癌蛋白の パターンを提供する。

乳癌患者において、ｐ５５ｒａｓ及びｐ４０ｆｅｓは、膀胱及び前立腺癌患者に みられるｐ５６ｓｉｓ（第１８図）に比べ上昇していることが見られる（第１６ 及び１７図）。又、膀胱及び前立腺癌患者は、しばしば３１にダルトン又は２５ にダルトンｓｉｓ関連蛋白の上昇レベルを証明する。対照的に、良性の前立腺小 結節の供与者は、これら上昇レベルの蛋白を証明しなかった。

高レベルの小蛋白もまた、肺及び頚癌並びに非ホジキンリンパ腫患者に見られた （第２３図参照）。これらの患者では、上昇した３１にダルトン及び／又は２５ にダルトンｓｉｓ関連蛋白が、５６にダルトンの不存在下に見られた（第１５図 、レーン４．パネルＡ−Ｂ）。

即ち、癌患者からの尿試料中に、３つの異常なパターンが観察された。乳癌患者 のサブセットは、ｐ４０ｆｅｓ及び／又はｐ３５ｆｅｓと接合した上昇レベルの ｐ５５ｒａｓを有する。対照的に、膀胱及び前立腺癌の患者は、ｐ５５　ｒａｓ 、ｐ４０　ｒｅｓ及びｐ３５ｆｅｓの不存在下に増加した量の３つの全ｓｉｓ関 連蛋白を分泌する。最後に、肺癌及びリンパ腫患者のサブセットは、上昇レベル の低分子量サイズのｓｉｓ関連蛋白のみを分泌する。図面かられかるように、表 現のパターンは、高レベルの単一癌遺伝子関連蛋白の分泌よりもよく疾病状態と 相関する。明らかな正常な担体では、上昇レベルのこれらの蛋白は、はとんど検 出されない。

尿中の癌遺伝子関連蛋白の発見は予期されなかったし、他者によりこれまで報告 されていない。この発見は、本発明のもっと別の方法側面のための基礎を提供す る。

この方法に従って、尿又は尿濃縮物試料は、前述のように、癌蛋白と免疫反応す る受容体と水性組成物に混合される。混合物は、免疫コンプレックスが形成する のに十分な期間、保持され、免疫コンプレックスは、前述のように一般的評価方 法及び前述の特異的方法との関連で決定される。

この方法で、癌蛋白と免疫反応に知られているいかなる受容体も使用できる。即 ち、受容体分子は、ポリクローナル、才リゴクローナル又はモノクローナル起源 であることができ、全体又は融合癌蛋白、又はここに記載されるようなポリペプ チドに対して作ることができる。

プロッティング技術、例えば図面のウェスターンプロットの技術及び試料が固体 支持体としてニトロセルロースマトリックスに添付され、そこで液体水性組成物 中の受容体分子がニトロセルロースに固定される、いわゆるスロットプロットが 分析用に好ましい技術である。しかしながら、他の技術、例えばミクロタイター プレートウェルを固体マトリックスとして用いる固相エルサ及びラジオイムノア ッセイ（ＲＩＡ）、及びディツプスティック法もまた有用である。

■、子宮内、胎児性決定 ５部位置径の（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）モノクローナル抗体プローブ及び 単−オリゴクローナル血清プローブが、新生児及び妊婦からの尿中の、ベータＴ 　Ｇ　Ｆ　、Ｅ　Ｇ　Ｆ　、ｉｎｔ　−１、ｆｅｓ、ｒａｓ及びｍｙｂに関連す る癌蛋白を検出するのに用いられる。ベータＴＧＦ関連癌蛋白リガンドのサブミ ツトは、新生雌尿試料中にもっばら見られた。これら試料のサブミツトは、ｆｅ ｓ及びｒａｓ関連蛋白を含み、それらは、既に説明したが、乳癌患音からの尿中 に上昇した。雄及び雌新生児又は妊婦からの尿試料は、付加的癌遺伝子蛋白を含 んだ。２つの蛋白（ｐ５５ｒａｓ及ｐ４０ｆｅｓは、１６−１８週の雌胎児を宿 している妊婦からの尿試料中に上昇していた。抗体プローブを作るのに用いられ たハイブリドーマ及び合成ポリペプチドは、第４表に表示される。試料は、以下 に説明されるようなウェスターンプロット技術を用いてスクリーニングされた。

第４表 部位置径の抗体Ｉ／ 癌遺伝子／ 成長因子　ハイブリドーマ　ポリペプチド数ベータＴＧＦ　（オリゴナール）　 １ｏｏ。

ＥＧＦ　４３２−２５ＧＯ７４３２ ｉｎｔ−１２２２−３５０Ｏ８ ２２２−３３ＡＯ５２２２ ｆｅｓ／ＦＥＳ　１２７−４２Ｃ１１１２７ｓｒｃ　２０３−０７Ｄ１０　２０ ３ Ｈ−ＲＡＳ／Ｎ−１？Ａｓ　Ｉ　４２−２４　Ｅ　Ｏ５ｆ　４２Ｃ−ＭＹＣ／Ｌ −ＭＹＣｌ　５２−０６　Ｄ　ｌ　１　１５２ｖ−ｍｙｂ　１３３−１０Ｆ０６ 　１３３’／各尿試料は、材料及び方法の部で説明したように減少され、煮沸さ れそしてポリアクリルアミドゲルに適用した。ニトロセルロースに移転後、個々 の試料は、６つの各抗血清でプローブされ几。２５個体についての結果は、第５ 表に表示され、表中、相対密度値は光学的に決定された。

ｌ／　癌遺伝子成長因子、ハイブリドーマ名称及びポリペプチド数は、第１及び ２表に表示した通りである。

２／　本ポリペプチドは、ニワトリ配列中に見られる３つの隣接ヒスチジンの一 つが欠けている。

第５表 ＩＢＡ　０　０　１　０　１　０　０　１　０　１　０　１　０　０　０　２　 ０　０　５　０　０ＶＡＬ　ＯＯＯＯＯＯＯ０００００００００００１００ＣＩ Ｎ　ＯＯＯＯ２００１０１００１１０１００４０１ＮＵＮ　Ｇ　ＯＯＯＯＯ００ ００００００００００３００ＡＤＥ　０　０　０　０　１　０　０　０　０　０ 　０　０　０　０　Ｑ　０　０　０　４　０　０ＢＲＯ２１２０１１１１３１０ ０１１１２２１５０２１ＭＥ　２　２　２　１　０　０　１．　１　３　２　０ 　１　０　０　０　２　２　０　５　３　０ＳＴＲ２２２００００２４２０１０ ００１３０４０１ＶＯＬ　３　０　３　０　０　０　０　２　５　３　０　０　 ０　Ｇ　０　０　３　０　５　２　０ＳＥＲ２１２２３０２０２２０３１，１２ ３１０３０１ＣＡＲ３２３Ｇ　ｌ　ｌ　０　０　５　２　０　０　０　１　２　 ３　２　０　４　０　２ＴＯＴル６５７　２６２３　６６８０４４４３７６１１ ２２５ＰＯ３，’ （計） １１０Ｌ　ＯＯＯＯｌ　１　０　０　０　１　１　１　０　０　０　１　０　１ 　０　０　０ＳＡＮ　ＯＯＯＯＯＯ００００００００ｏＯ００００２ＧＥ＾　０ ００　００００　０００００００００００００１ＧＡＲＯ０００１００００１０ １００００００００１ＰＥＡ　０　０　０　０　１　０　０　０　０　０　０　 ０　０　０　０　０　０　０　０　０　２ＳＵＮ　ＯＯＯＯ０００００００００ ０００００００１ＨＡＲＯ０００００００００００００Ｇ　Ｏ００００１ＢＡＴ 　ＯＯ００２２０００１００１１０１００００２ＨＡＲ００００２００００００ ０００００００００３ＳＩＭ　０　０　０　２　２　０　０　０　０　０　０　 ２　０　０　２　０　０　０　０　０　３Ｂｏｏ　０　０　９　０　０　０　０ 　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　１ＦＬＥ　ＯＯＯ０ １１０００（１０００００２００００２ＤＥＳ　０　０　０　０　４　０　０　 ０　０　１　０　０　０　０　１　１　０　０　０　０　２計　０００　１８３ ０　００４　ｌ　３　ｌ　ｌ　２４　ｏ　ｌ　ｏ　ｏ１２び２表に表示した通り でめる。

第６表 ＲＯＢ　００００４２　０００２　００　３　４２ＩＭＰ　０３００　３０　２ ００２　４３　２　００ＧＯＵ　０２００２１　０００２　２２　３　３３ＡＢ Ｂ　１１１１０３　１４０１　０３　０　０１Ｇｏｏ　３３００１３　２００３ 　３３　５　３２ＶＩＣ２２０００００００１３３０ＮＴＮＴ’ＲＡＳ　２３３ ３０２　０４０１　２２　５　４１ＰＥｌ’！　１１００４３　２２０４　００ 　２　４２ＭＥＺ　１１１２　１２　０３１２　１３　４　４１Ｍ５Ｔ　０１２ ２　００　０４２１　００　’３　３１ＢＬＡ　１１１１　２１　２２０２　３ ３　１　ＮＴ八へＴＥＲ２２２２３１２３０２１３３ＮＴへＴＮｌ＼！　２２１ １　３３　１３０２　４３　４　ＮＴＮＴＳＴＲ２１０００３ｆｏｏｌ　３３　 ０　ＮＴＮＴ計　１０１３７７　９１１　８８２１４　８８　１１　７ｐｏｓ、 ” （雌胎児） ＤＵＱ　００００　２２　０００２　２２　３ＢＯＯ０００００１０００１０２ ０ λＩＡＣ０１０３０３１００３３２２ ＥＳＰ　０１０３　０３　１００３　３２　２ＬＯＲ１１０１０００００００２ ２ ＢＥＬ　３２０２０２　１００２　４０ＨＡＲｌ　２　０　０　１　３　０　０ 　０　３　２　３■Ｔ　０２００　１２　１００２　２２ＴＯＴＡＬ　４　６　 ０　３　４　７　４　０　０　７　５　７ｐｏｓ、２ （雌胎児） １、第５表の注１及び２参照 ３ＮＴ−試験せず。

幾つかの癌遺伝子又は成長因子関連蛋白は容易に検出されたけれども、どの試料 も検出可能レベルのＥＧＦに関連する蛋白は含んでいなかった。しかしながら、 全試料は、ベータＴＧＦに向けられたオリゴクロナール抗血清と反応性の蛋白を 含んでいた。さらに、雌試料のみは、検出可能レベルのＰ２４／Ｐ２３ベータＴ ＧＦ（ＰＩ２ベータＴＧＦの存在又は不存在下）を含んでおり、これに対し維新 生児からの尿試料はＰＩ２ベータＴＧＦのみを宵した。

癌遺伝子関連蛋白の性結合表現はまた第５表に示される。雌試料のサブセットは 、容易に検出可能レベルのＰ　３５　ｆｅｓ、Ｐ　３８　ｒｅｓ、Ｐ４．０ｆｅ ｓ及びＰｌｏｏｒａｓを含有し、Ｐ　５５　ｒａｓ、Ｐ　３５　ｆｅｓ、Ｐ　４ ０ｆｅｓ及びＰ　５５　ｒａｓは、前述のように、乳癌患者並びに妊娠のサブセ ットからの尿中に上昇レベルで既に検出された。

胎児尿中に癌遺伝子関連蛋白のパターンは、かなり不均質を示した。幾つかの蛋 白は性関連手法で一様に検出されたけれどもこれらの蛋白をさらに特徴づけるｆ 二めに、濃縮材料尿の連続的収集物がプローブされた。

２２の妊娠した母親から連続的に収集された（１６−２０週の間）ものもまた、 前述の６抗体プローブを用いるウェスターンプロット分析によりスクリーニング された。スクリーニングの結果は、第６表に示される。見られるように、新生児 尿中に検出されたほとんどの蛋白が、正常尿中にも見出される。はとんどの蛋白 のａ捕物はｌ６−２０週の間、一定に保ち、異常ではあるが、パターンは各固体 について見出された。パターンにおける差異は、１６−２０週の期間に均一に検 出される蛋白を比較することによりもっとも容易に認識された。

同一個体からの試料中に相異的に一定であった蛋白に加えて、他の蛋白の濃縮物 は、劇的に変化した。例えば、Ｐ２４／Ｐ２３ベータＴＧＦは、はとんどの個体 からの尿中に検出された。対照的に、Ｐ　４０　ｆｅｓ及びＰ　５５　ｒａｓは 、雌胎児を宿している母親からの尿中にのみ検出された。しかしながら、雌胎児 を有する全ての患者からの毎週の尿収集物は検出可能レベルのこれらの蛋白を含 まなかった。

１ケ月収集期間の間、表示されたほとんどの蛋白は、託児の性に関係なく約半数 の患者に検出された。これら均一に検出される蛋白とは対照的に、Ｐ　４０　ｆ ｅｓ及びＰ　５５　ｒａｓは、雌胎児を宿している患者に特異的に検出された。

８患者からの尿は、検出可能レベルのＰ５５　ｒａｓを含み、これら８患者の７ からの尿は、また検出可能レベルのＰ　４０　ｒｅｓを含有した。全材料及び新 生児患者からの尿中に性結合蛋白の検出が欠けていることは、表現の短期間に基 づく。蛋白を示す、１６−２０週の材料尿の毎日の収集物は、１週よりも少なく 検出された。

短期間の検出は、表現のホルモン調節に基づくようである。インシュリンを受け ている糖尿病の妊娠患者の最初の評価は、延長期間を越えて（少くとも６週）こ れらの蛋白の存在を明・らかにする。さらに、蛋白の検出能力は、胎児の性によ らなかった。同様に、より若い又はより古い雄胎児をもつ正常敬老からの収集物 は、Ｐ　５５　ｒａｓの存在を表わす。即ち、性結合蛋白は、外側の因子又は蛋 白遺伝子の一時的表現により誘発された材料蛋白であろう。

妊娠（期待の）母からの尿試料についての上記の結果は、宿されている胎児の性 を予言する手段を提供する。前に述べたように、雄胎児を宿している妊婦は、Ｐ 　４０　ｆｅｓ又はＰ　５５　ｒａｓ蛋白を表現しなかったが、一方雌胎児を宿 している妊婦は、妊娠の１６−２０週の期間、これらの蛋白の一つ又は両方を表 現した。雌胎児を宿しているこれら妊婦の幾らかは、その期間中、これらの蛋白 の一方を表現しなかった。

雄胎児を宿している妊婦は、間違っｆ二陽性がなかったので、最初の１６−２０ 週の妊娠期にある妊娠の尿に明白なＰ　４０　ｆｅｓ及び／又はＰ　５５　ｒａ ｓ癌蛋白リガンドを見出すことは、子宮内に雌胎児の存在を確かめるための陽性 の、非可逆性評価を提供する。１６−２０週の期間の妊婦の尿試料中に表現され たＰ４０ｆｅｓ及び／又はＰ５５ｒａｓ癌蛋白リガンドが存在しないことは、約 ５０−６０パーセント（各、！４例中７及び！４例中８）妊婦が雄胎児を宿して いることが予言できる。

本方法に従って、妊娠の初めの約１６から２０週における妊婦からの尿の試料が 提供され、好ましくは２−メルカプトエタノールで希釈され、煮沸され、最も好 ましくは濃縮される。試料は、（ｉ）ＬＭＥＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ（第１ 表のポリペプチド１２）及び （ｉｉ）ＹＲＥＱ　ＴＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＹＬＶＧＮＫＣ（第１表のポリペ プチド１４２） からなる群から選ばれた、左から右に及びＮ末端からＣ末端の方向の、式を有す るポリペプチドと免疫反応する受容体分子と混合される。得られる混合物は、受 容体分子が尿中の癌蛋白リガンドと免疫反応するのに十分な期間保持される。免 疫反応の存在は、これら受容体分子と、（ｉ）受容体分子が上記ポリペプチド（ ｉ）と免疫反応する約４０にダルトンの、又は（１１）受容体分子の上記ポリペ プチド（１１）と免疫反応する約５５にダルトンの５−１７パーセントポリアク リルアミドゲル中に相対分子質量を有する癌蛋白リガンドとの間で決定される。

子宮内に雌胎児の存在。

好ましい実施では、用いられる受容体分子はモノクローナルである。最も好まし くは、モノクローナル受容体分子はそれぞれ引用番号１２７−４２ＣＩ　＋及び １４２−２４ＥＯ５（Ｈ８６７９）を有するハイブリドーマにより分泌される。

■、親和性吸着剤 その中で本発明のモノクローナル受容体分子が活性な結合部分を成している親和 性吸着剤が、本発明のさらに別の態様である。

この態様において、本発明のモノクローナル受容体分子は、この吸着剤により精 製されるべき癌蛋白質リガンドに対し化学的に不活性な固体支持体に結合される 。ここで化学的に不活性という言葉は、固体支持体と癌蛋白質リガンドの間の化 学反応が起らないことを意味するものとして用いられる。しかし、固体支持体と 癌蛋白質の間の物理的相互作用たとえば非特異的結合は、好ましくは最小にされ るべきではあるが、起ることができ、かつ実際に起る。

固体支持体は、種々の物質、たとえば架橋デキストランｆ二とえばセファデック スＧ−２５、−５０、−１００、−２００など（ファーマシア　ファイン　ケミ カルズ、ピスカタウエイ、二二一ジャーシイ、より入手できる）、アガロース及 び架橋アガロースたとえばセ’７７０−ス６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４Ｂ、ＣＬ４Ｂ？、 −ど（やはりファーマシア　ファイン　ケミカルズより入手できる）、又はバイ オ−ゲルＡ−０，５Ｍ、Ａ−１，５Ｍ、Ａ−５０Ｍなど（バイオ−ラド　ラボラ トリーズ、リッチモンド、スルホルニ乙より入手できる）、又はポリアクリルア ミドビーズたとえばパイオーゲルＰ−２、Ｐ−３０、Ｐ−１００、Ｐ−３００な ど（バイオ−ラド　ラボラトリーズより入手できる）から成ることができる。ポ リアクリルアミドビーズは、これら支持体のうち最低の非特異的結合の傾向を持 つが、しかしまた典型的に、その結合容量を制限する低い多孔性を持つ。アガロ ース及び架橋アガロース物質がここで好ましく、固体支持体として例示的に用い られるであろう。

アガロース支持体は典型的には、臭化ジシアンを用いて結合のために活性化され る。活性化された支持体は次に洗われ、活性化支持体を乾燥することなく受容体 分子と結合され杭支持体と結合した受容体は次に洗われ、用いられる。支持体上 の未反応反応性基は、もし望むならアミンたとえばエタノールアミン又はトリス と反応させられることができる（これら反応性基は迅速に崩壊するけれど）。

親和性吸着剤は、ビーカー又はフラスコの中でのようにゆるんだ状態で用いるこ とができ、又はそれはカラムに詰めることができる。

使用前に、親和性吸着剤は、非特異的に結合した蛋白又は支持体に不安定に結合 された受容体を除去するために、隔置白質精製のために用いられた緩衝液又は他 の水性媒体中で洗うのが好ましい。

親和性吸着剤の結合した受容体が結合するところのポリペプチドのアミノ酸残基 配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ癌蛋白リガンドを含む水性組成物たとえ ば血清又は細胞抽出物が用意され、次にそして次に親和性吸着剤と混合される。

この混合物は、結合した受容体と癌蛋白リガンドとの間の可逆的な結合受容体− リガントコンプレックスを形成する。

結合受容体−リガントコンプレックスは次に、コンプレックス化されなかった水 性組成物の残部から分離され、それにより親和性吸着剤に結合された精製形の癌 蛋白を得る。混合がビー力又はフラスコで行われる場合、この分離は濾過及び洗 浄により行われることができる。吸着剤がカラム中にある場合、分離は、非コン プレックス化水性媒体の溶離、及び好ましくは続く洗浄段階により行われうる。

精製蛋白が親和性吸着剤を含まないことが望まれる場合、これは典型的に種々の 手順で得ることができる。これら手順のどれにおいても、可逆的な結合受容体− リガントコンプレックスは、支持体に結合された受容体と癌蛋白リガンドの成分 部分に解離され、次にこのリガンドが結合受容体から分離されて、親和性吸着剤 不含の精製癌蛋白を与える。

可逆的コンプレックスの解離は、種々、の方法で行ないうる。約２゜５のｐ）ｌ 値の０．２モルのグリシン塩酸塩が典型的に用いられる。あるいは、結合れさた リガンドは、可逆的コンプレックスを受容体を生じるために用いられた免疫原ポ リペプチドの過剰量と混合することにより、結合受容体から競争して離されるこ とができる工その上うな競争は、リガンドの起りうる変性を避ける親和性吸着剤 との混合物の分離。混合物は、結合受容体と癌蛋白リガンドとの間の可逆的、結 合受容体−リガントコンプレックスを形成する。

リガンド受容体−リガントコンプレックスは、次いで未コンプレックス化水性組 成物の残余から分離され、それにより親和性吸着剤に結合した精製された形で癌 蛋白を得る。混合がビーカー又はフラスコ内で起きる場合、本分離は濾過又は洗 浄によりなされる。吸着剤がカラム中にある場合、分離は未コンプレックス化水 性媒体の溶出により、好ましくは再度、次いで水洗段階により行なわれる。

精製蛋白が親和性吸着剤から遊離で所望される場合、典型的には種々の手段によ り得られる。これらの手段のいずれにおいても、可逆性結合受容体−リガントコ ンプレックスが支持−結合受容体及び癌蛋白リガンドの成分部分に溶解され、次 いで結合受容体からリガンドが分離され、親和性吸着剤から遊離の精製癌蛋白を 提供する。

可逆的コンプレックスの解離は、多くの方式でａ効であろう。０゜２Ｍグリシン 塩化水素溶液のＰＨ値約２．５が典型的に利用される。

別に、結合したリガンドが、可逆性コンプレックスと、受容体を作るのに用いら れた過剰の免疫原性ポリペプチドとの混合による結合受容体から離れて競合でき る。かかる競合は、リガンドの可能な変性を避ける。解離された隔置白リガンド の親和性吸着剤からの分離は上述のようにして得られる。

親和性吸着剤の調整及びその使用は、巾広く古い。しかし本発明の受容体分子を 含むそのような物質及び使用は従来入手できなかった。抗原が支持体に結合され ている親和性吸着剤の詳しい記述、その調製法及び使用は、アンチボディ・アズ ・ア・ツール、マルカロニス及びワール編、プローブ・ワイリイ・アンド・サン ズ、ニューヨーク、第６４−６７及び７６−９６頁（＋９８２）に見られる。

■、パネル評価 抗体のパネルは、未知試料中に形成される抗体／抗原コンプレックスの組合せと 既知体試料から得られる組合せとを比較することによりいかなる生物学的試料を 事実上特徴付けるのにも用いることができる。組織、尿又は他の体液は、癌遺伝 子及び癌遺伝子関連配列の表現に関して特徴づけされうる。この表現は、かくし て組織又は胎児の発展段階又は癌の存在又は厳しさを示すために解釈される。

パネル評価は一つ以上の抗体で試料をスクリーニングすることを含む。試料は各 抗体と反応され、抗体及び試料中に見い出されるリガンドとの間のコンプレック スが検出される。コンプレックスのパターン、これは、未知のものの中のリガン ドと反応する抗体の組合せで、既知試料中の抗体との反応のパターンと比較され る。組合せがより類似すると、すなわち既知及び未知試料のいずれでも同一リガ ントと反応する同一抗体の合致が高いほど、試料はより類似する。

すなわち、未知試料は発展の同一段階にあるか又は既知試料として同一疾病状態 を有する可能性が高い。

評価は、上で述べたようにリガンドで、又は固体基質の使用により、実施できる 。ここに、一部の生物学的体試料がゲル中に電気泳動され、ニトロセルロース上 に移され、それは次いでストリップに切断される。このウェスターンプロットの 試みは同一試料はパネル抗体でプローブされうろことを認める。ニトロセルロー スの基の固まりを作り直すことにより、特異的及び非特異的槽じまの同一性が容 易に決定できる。細胞又は組織抽出物については、約０　、５　ｍｇの蛋白がゲ ルごとに置かれた。尿試料については、１２ｍＣの尿の当量が加えられ、他の体 液（血清、血漿、羊水、卵胞液、腹水、唾液）については、１００μＣが置かれ た。各試料を幾つかの抗体でプローブすることに加えて、２４以上の試料が同一 抗体でプローブされた。

この試みは、異なる抗原濃度に基づく異なる結合活性を生じ、二次的試薬又はイ ンキュベージジン条件に基づく変異性を生じない。結合はまｆ二、プローブして いる試料により半定量でき、試料は連続的に希釈されて検出可能レベル以上の濃 度に相対的増加を得る。

固体支持の使用は、自動スキャナーを用いる試分析手段を提供する。これらのス キャナーは、ニトロセルロース上に情報をディテガイズ（ｃｌｉｔｉｇｉｚｅ） するのをプログラム化でき、さらに試料を比較するのをプログラム化できる。こ の方式で、抗体の多重性を用いるパネル評価が、自動的に実施できる。これは、 例えば共通の性質を決定するため多数の既知試料を特徴付け、並びに既知に対し て多数の未知の試料を特徴付けるのに用いることができる。この技術は又、得点 記録がデジタル化された情報の使用により実施されるような反応性パターンのよ り正確な得点記録を生じる。

試料は、又、抗体のカクテルの使用によると、種々の抗体で同時にプローブ出来 る。この試みは反応性のパターンを作るより有効な手段を提供するが、分析する のが困難であろうコンプレックスパターンを作るかも知れない。

ここに、ニトロセルロースの分けられたストリップ、各々は試料の一定量が走行 しているレーンを含んでいる、は、上に記載したようにイムノプロット評価を用 いて別々にプローブされた。

予め、既知起源の試料が、それに対して未知試料が比較されうるプロフィールを 得るためにプローブされた。種々の試みがそのようなプロフィールを誘導するの に用いられた。一つの試みで、同一蛋白を認識する幾つかの抗体が確識された。

この試みはプロフィール同定の正確さを増加する。第二の試みは抗体の同一パネ ルで異なる腫瘍をプロフィールすることであった。これはそれに対して未知試料 が比較されうる種々のパターンを作った。第三の試みは異なる器官用の進展した プロフィールを開発するために正常組織をプロフィールすることであった。これ ら全ての試みは、それに対して未知試料のパターンが比較できる既知試料用の反 応性のパターンを用いるためにとられた。

異なる特異性を存するハイブリドーマを用いる例は、キナーゼ遺伝子のドメイン を結合しているＡＴＰに対する種々の反応性パターンを生じるｒｅｓ抗体によ？ ）提供される。交叉活性の同じパターンは、種々の生物学的検体を分類し試験す る抗体を認める。第２５図において、ｒｅｓ癌遺伝子生成物を含むセルラインは 、ｆｅｓ配列の２つり部分並びに他の癌遺伝子、ｅｒｂＢに対して作られたー郡 の抗体でプローブされた。レーンＩにおいて、ｒｅｓ遺伝子生成物は、他の保存 されたキナーゼ部分に位置したｆｅｓ配列に対して作られた抗体により容易に検 出された。ゲルの過暴露は、レーンＡ−Ｈで用いられる抗体によるｒｅｓ遺伝子 生成物への結合を示すが、結合活性はレーンＩに用いた抗体より著しく小である 。他のコントロールとして、レーンＪ及びＫにおける２つの抗体はそれぞれｅｒ ｂＢ関連蛋白を認識した。

第２６図において、同一抗体がＥＧＦ受容体（それはｅｒｂＢプロトオンコジー ンによりコードされる）を含むセルラインからの抽出物をプローブするのに同時 に用いられた。この蛋白は、ｅｒｂＢ抗体並びにｆｅｓ形質転換セルライン中に も見られるＰ　ｌ　３０ｅｒｂＢにより容易に検出される（第２５図）。レーン ＤＳＦ、Ｇに用いたｆｅｓ抗体は、レーンＥに検出されなかった付加的蛋白Ｐ　 ３０　ｆｅｓを検出した。エリサ評価は、本抗体への交叉反応性パターンが、し かしながら、レーンＤに用いた抗体と類似し、レーンＦ及びＧに用いた抗体と同 一であることを示した。

これらの同じ抗体は第２７図に用いられ、妊娠糖尿病患者からの濃縮尿試料をプ ローブした。約７０Ｋｄの蛋白がレーンＡ−Ｃに用いた３つの抗体により検出さ れ、一方５５Ｋｄの蛋白がレーンＤ−Ｈに検出された。即ち、これらのｆｅｓ蛋 白の交叉反応性パターンは、恐らく同一蛋白を認識するであろう抗体を確識する のに有用である。

反応性パターンにおけるわずかな相違は、単一蛋白上の幾つかの癌遺伝子関連決 定基の存在を示すのに用いることができる。これは、５５Ｋｄ蛋白を検出し、少 くとも３つの異なるｒｅｓ関連エピトープを認識する５つの抗体により示される 。Ｐ　７０　ｆｅｓ、Ｐ　５５　ｆｅｓ及びＰ３０ｆｅｓを検出する抗体の能力 は、又、ｆｅｓ癌遺伝子生成物のＡＴＰ結合ドメインのコンフォーメイションに おける翻訳後修飾相違を招くかも知れない。

腫瘍、例えばＮＩＴ寄託機関に寄託のセルライン誘導される乙ののプロフィ−リ ングは、又、抗体認識用標的を提供する。第２８−３１図において、種々の腫瘍 抽出物がｆｅｓ又はｅｒｂＢ抗体でプローブされた。レーンＡ−Ｄは、キナ−・ ゼ遺伝子の部位に結合しているＡＴＰの部分に向けられた抗体でプローブされた 。レーンＥ−Ｈは、同一結合部位の異なる部分に向けられた抗体でプローブされ 几。レーンＩ及びＪはｖ−ｅｒｂＢ（１７３−Ｉ　Ｃ１１及び１７３−４Ａｌｌ ）のアミノ終末に向けられた抗体でプローブされ、一方レーンＫ及びＬは異なる キナーゼドメインに向けられた抗体でプローブされた。

これらのブロービングは最小量の材料（０，５ｇの組織が６４抗体でプローブさ れた）を必要とし、広域スペクトラムの反応性パターンを作った。

第２８図において、子宮内膜癌抽出物は低レベルのＰ　６０　ｆｅｓ（レーンＡ −Ｄ）及びＰ２Ｏ（レーンＥ−Ｈ）を有することを示すが、一方Ｐ　２００ｅｒ ｂＢ（レーン１．Ｊ）は容易に検出される。Ｐ　２００ｅｒｂＢは胎児心臓中に 高レベルで既に検出されている（データ示さず）２このＰ　２２０ｅｒｂＢの表 現は、時間と組織に関して不適当なようにみえろ。

第２９図において、転移孔腫瘍抽出物は、同一抗体でプローブされた。本腫瘍中 には、Ｐ　７０　ｆｅｓがＰ　６０　ｆｅｓの不存在下容品に検出される。ｅｒ ｂＢのアミノ終末に向けられた抗体はＰ　３０　ｅｒｂＢ及びＰ３５ｅｒｂＢ及 びＰ　４０　ｅｒｂＢを検出し、一方ウイルス性蛋白のカルボキシル部分に向け られた抗体はＰ　ｌ　３０ｅｒｂＢを検出する。

第３０図において、他の乳癌抽出物は他の反応性パターンを生成した。Ｐ　７０ 　ｆｅｓに加えて、Ｐ　８０　ｒｅｓに弱い活性が検出された。これらの蛋白の 両方は、このグループは少くとも３つの異なるエピトープで認識したけれども４ つの全ての抗体で構成された。ｅｒｂＢ二重じま、Ｐ　Ｉ　３０ｅｒｂＢも、ま た弱く検出された（レーンに、Ｌ）。

第３１図において、卵巣癌は他の反応性パターンを生じた。Ｐ２ＯｒｅｓはＰ　 ３５　ｆｅｓがそうであったように（レーンＥ・−Ｈ）弱く検出され（レーンＡ −Ｄ）、一方Ｐ　７０　ｒｅｓはＰ　３５　ｆｅｓＢがそうであったように（レ ーンＩ　、Ｊ）容易に検出された（レーンＡ−Ｄ）。即ち、各腫瘍は独特の反応 性パターンを示し、記された各パターンは少くとも２つの抗体により検出された 。レーンＥ−Ｈにおける蛋白は少くとも３つのｆｅｓ関連エピトープを含んだ□ 蛋白は恐ら＜ｒｅｓ癌遺伝子によりコードされなかったが。

第３２−３９図において幾つかの付加的癌遺伝子関連蛋白が抗体の他のパネルで 検出された。各図面のレーンＡにおいて、保存キナーゼ遺伝子のｒｏｓ配列に対 する抗体が用いられ、一方レーンＢにおいて異なるキナーゼドメイン■に対する 抗体が用いられた。レーンＣ−Ｇにおいて、βＴＧＦのアミノ終末に対する５つ の抗体がプローブとして用いられた。Ｈ−ｒａｓ配列の独特のカルボキシル部分 に対する３つの抗体がレーンＨ−Ｊにおいて用いられ、一方ｅｒｂＡのホルモン 結合ドメイン中の保存部分に対する４つの抗体がレーンに−Ｎにおいて用いられ た。

第３２図において、乳癌抽出物は零ンリーズの抗体でプローブされた。レーンＡ 及び已において、１５０Ｋｄ蛋白はキナーゼドメイン示唆広範キナーゼ類似性の ２つの異なる保存部分に向けられた「Ｏ５及びｒｅｓ抗体で検出された。ｒｏｓ 抗体も１２０及び４０Ｋｄの蛋白を検出した。レーンＣ−Ｇにおいて、２５Ｋｄ 蛋白は全βＴＧＦにより検出された。これらの抗体はイムノプロットに基づく少 くとも３っの異なるエピトープを認識する（レーンＣ中４５Ｋｄでの付加釣橋じ ま参照）。レーンＨ−Ｊにおいて、５つの異なるｒａｓ関連蛋白が検出された。

これらのｒａｓ関連蛋白に対する結合活性の割合は、これらの抗体の各々が独特 の決定基を検出することを示唆する。レーンＨにおける抗体（１４，６−３Ｅ４ ）はＰ　２００ｒａｓ、Ｐ　４８ｒａｓ及びＰ２７ｒａｓを選択的に検出した。

対照的にレーンＪに用いた抗体（１４６−１７Ａ５）はＰ　２１　ｒａｓを選択 的に検出する。この爆露において、これらの相違はＰ　２７　ｒａｓとＰ　２１ 　ｒａｓの強度を比較することにより最も容易に見られる。Ｐ２７はレー・ンＪ において唯−弱く検出されＰ２＋はレーンＨにおいて唯−弱く検出されたけれど も、ゲルの過暴露は全ての５　ｒａｓ関連蛋白が全ての３抗体により検出された ことを示す。

第３３図においてプローブされた卵巣癌は、Ｐ　１５０　ｒａｓ／　ｒｅｓは検 出されなかったが５０ＫｄβＴＧＦ蛋白がレーンＧに現れるのを除き第８図は類 似する。第３４図においてプローブされた転移結腸癌もまた、４５及び５０Ｋｄ βＴＧＦ蛋白が検出されないのを除き類似する。第３５図における卵巣抽出物も また、Ｐ　４５　ｒａｓ及びＰ５２ｆｅｓが他のｒｏｓ関連蛋白に相対的に高濃 度に現れｒｏｓ関連蛋白は見られなかったのを除き類似する。

第３６図においてプローブされたリンパ腫抽出物は、相対的に高濃度のＰ２７の ために独特である。第３７図においてプローブされた乳癌抽出物は他の独特の反 応性パターンを生成した。小さい反応性はｒｏｓＪｅｓ又はｒａｓ関連蛋白に検 出されたけれども、容易に検出されたＰ２４βＴＧＦはＰ　２２　ｅｒｂＡ及び Ｐ　５５　ｅｒｂＡにある。Ｐ２２ｅｒｂＡは全ての４抗体により認識され、一 方Ｐ　５５　ｅｒｂＡはレーンＮにおいて用いられた抗体によってのみ容易に検 出された。過暴露は他の３　ｅｒｂＡ抗体による本蛋白に対する結合を示した。

Ｐ５５ｅｒｂＡ及びＰ　２２　ｅｒｂＡの異なる活性は、これらの蛋白の両方が ２つのｅｒｂＡ関連エピトープを有することを示す。さらに、抗体は、グルココ ルチコイド又はエストロゲン受容体の同種の部分と交叉反応せず、そして抗体は 核染色パターンを生じる（データ示さず）、即ち、第３２−３７図においてプロ ーブされた抽出物と対照に、乳腫瘍は上昇レベルのＰ　２２　ｅｒｂＡを有する 。Ｐ　２２　ｅｒｂＡ蛋白は又、第３８図の直腸腫瘍抽出物中に見られる。Ｐ５ ５ｅｒｂＡは過暴露され几ゲル中でさえ検出されなかったけれども。第３９図に おいて、転移肺抽出物はＰ　５２　ｆｅｓ及びｒａｓプローブに対する独特の活 性パターンを存した。Ｐ　４８　ｒａｓ及びＰ　２００　ｒａｓは容易に検出さ れたけれども、非常に小さな活性がＰ　２７　ｒａｓ又はＰ　２１　ｒａｓに対 して見られた。この結果は、幾つかの胎児性組織のプロフィールに似ていた（以 下参照）。

これらの組織が発展するので、２００　ｒａｓ濃度は低下し、一方Ｐ２７　ｆｅ ｓａ度は増加した。

相当の多様性が腫瘍試料に見られるけれども、注目すべき類似性が正常組織に見 出された。これらの類似性は作られるべき別個の器官への発達的プロフィールを 許す。第４０［ｆｆｌにおいて、ラット線条体の発達的プロフィールは７抗体で 造られた。レーンＡにおいて、Ｐ　２　＋　ｒａｓ及びＰ　２５　ｒａｓは１８ 日令胎児で検出された。２日までにＰ１５０ｒａｓはＰ　２１　ｒａｓに加えて かろうじて検出され、Ｐ　２５　ｒａｓは容易に検出され、連続的パネルに存在 する。レーンＢにおいて、Ｐ　５２　ｒａｓは胎児発達の１８日に容易に見られ た。ゲルの暴露はＰ２００　ｒａｓを明らかにした。１８日までに、Ｐ　２７　 ｒａｓｉ！容易に見られた（Ｐ　２００　ｒａｓはｓ露されたゲル中でもはや検 出されなかった）。

Ｐ２７ｒａｓの濃度は７０日までに最高であった。Ｐ　２１　ｒａｓはまた７０ 日に容易に検出可能であった。Ｐ　２１　ｒａｓを示した暴露は全５回の地点で 存在したけれども。レーンＣにおいて、Ｐ　Ｉ　５０ｍｙｃは、また、２日でか ろうじて検出されるが１８日までに容易に見られた成熟動物特異蛋白であっｆこ 。レーンＤにおいて、Ｐ１２０ｍ）・ｂは、胎児パネルにのみ検出された胎児特 異蛋白であった。レーンＥにおいて、Ｐｌｏｏｉｎｔ−１，Ｐ７０ｉｎｔ−１， Ｐ４５ｉｎｔ−１，Ｐ９０ｓｉｓ及びＰ５６ｓｉｓは、発達的に調節されるよう にはみえない。レーンＧにおいて、Ｐ６０ｓｉｓは、胎児パネル中で最高であっ た。即ち、第４−１５図において記載された腫瘍抽出物と対照的に、正常組織の 癌遺伝子関連蛋白プロフィールは、もっとより均一で、きちんと調節される。

即ち、第２５から４０図は、既知試料が反応性のパターンを作るために種々の抗 体でプローブできることを示す。上記実施例は、異なる試料中の同−蛋白内のみ でなく、種々の蛋白内の、種々の抗体の交叉反応性を示す。

Ａ、既知試料の分類 腫瘍抽出物又は他の体試料は、また生成される種々の遺伝子生成物に従って特徴 づけられうる。最近、種々の腫瘍抽出物Ｘ抗体結合が、イムノプロット技術を用 いて記録された、種々の癌遺伝子生成物の存在及びレベルを決定した。これらの データは、第４１及び４２図に示された。腫瘍抽出物は、ＮＩＨ寄託機関に寄託 されるセルラインから誘導され、試料は上述したようにニトロセルロース上で電 気泳動しプロットした。種々の癌遺伝子ファミリーからの癌遺伝子によりコード されたポリペプチドに対する抗体が、試料をプローブするのに用いられた。

反応性は、癌遺伝子生成物の表現の存在及びレベルが記録された。

第４１図において、Ｐ　５２　ｒａｓは全ての卵巣抽出物中で検出されたが、最 高レベルが最少又は緩和として表示された腫瘍に見出された。

Ｐ６０ｓｒｃ及びＰ４８ｓｒｃは、発達した部門において最高頻度で卵巣腫瘍中 に検出された。Ｐ　ｌ　２５　ｒｏｓ及びＰ１５ｒａｓは、乳抽出物以外はとん どの腫瘍において検出され、表現は、アデノーマ中に濃縮され、これらの癌は最 少又は緩和として分類された。Ｐ　１５０　ｒｏｓ表現は、乳腫瘍のわずか半分 に見出されたＰ　１２０　ｒｏｓ、米蛋白は子宮内膜抽出物を除いて最も多くの 他の腫瘍において検出されたけれども、と対照的に乳腫瘍中に濃縮された。Ｐ　 ２２　ｅｒｂＡは、それらの組織しゆうに分散したが、発達したとして表示され た抽出物のいずれにも見出されなかった。

活性の付加的分離は、幾つかのキナーゼ関連蛋白を表示する第４２図に見られる 。この表において、卵巣及び子宮内膜抽出物中の高レベルのＰ　７０　ｆｅｓは 、著しい。同様に、卵巣及び原油出物に対すルＰ　１３０ｅｒｂＢの制限は、宵 意であるかも知れない。

即ち、腫瘍抽出物は、癌遺伝子又は癌遺伝子関連生成物Ｊこ関して特徴づけられ ることができる。特異的抗体を用いて、特異的腫瘍型に対し共通の蛋白が検出で きる。反応性のこれらのパターンは、未知試料のパターンがそれに対して比較さ れうる標準として用いることができる。

Ｂ１体液中のマーカー パネル評価はまた、単−個体中のモニター蛋白生成物に用いうる。

この方式１こおいて、治療の効果はスクリーニング、例えば尿試料により非侵入 的にモニターされうる。このアプローチは、抗体のパネルの活性パターンのプロ フィールを得るために患者からのもとの試料のスクリーニングを含む。治療が進 むにつれて、つづく試料は比較用の標準として同一のもとの試料を用いてモニタ ーされる。第４３図は、化学療法を受けている妊娠栄養膜疾病敬老からの連続的 尿試料を示す。多数の癌遺伝子関連蛋白の同調外形（ａｓｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕ ｓ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）が明白である。これらのデータは、治療後患者をモ ニターするために治療有効性に関して臨床データとさろに相関することができる 。

Ｃ１癌遺伝子関連蛋白の検出 癌遺伝子によりコードされたポリペプチドに対する抗体は、保存ポリペプチド又 はその蛋白をも含む他の蛋白を認識しうる。即ち、抗体のパネルは、ポリペプチ ドの明確な部分に対する多重抗体おのおので試料をプローブすることにより試料 中の癌遺伝子関連蛋白を検出するのに用いうる。異なる抗体で反応性のパターン を決定することにより、異なる癌遺伝子関連蛋白が確認できる。

Ｈ−ｒａｓ特異性抗体により検出されたＰ　２１　ｒａｓは、広反応性抗体によ り検出されたＰ　２　＋　ｒａｓのサブセットを表現する。’Ｈ−ｒａｓ特異性 抗体により検出されたＢ２１を含んでいる全試料は、抗体＋４２−２４ＥＯ５に より検出されたＰ２＋を含んだが逆になかった。Ｈ−ｒａｓ特異性抗体により検 出された他の蛋白は、保存ｒａｓ部分が存在しないか又は少くとも＋４２−２４ Ｅ５結合を排除するために変ったことを示している１４２−２４ＥＯ５により検 出さ、ｈなかった。

しかしながら、３つのＨ−ｒａｓ特異性抗体による結合の一致は、同一蛋白が全 ての３つの抗体により検出されたことを示す。Ｐ２Ｏ０ｒａｓ、Ｐ　４８　ｒａ ｓ及びＰ　２７　ｒａｓに対する抗体の結合の同様の割合は、３つの抗体により 検出されたエピトープにおけるいくらかの構造類似性を示唆する。この類似性は 、多くの技術を用いて提出できる。

一つの試みは、標識抗原を消化し、消化物を二次元ペプチド遺伝地図作製に置く ことである。もしより大きな分子が溶液中でよく認識されないなら、付随する試 みか可能である。例えば、免疫関連蛋白の異なる結合を含んでいる試料は、部分 消化を受けさせ、イムノプロットさせうる。もし前駆体産物関連性かあるならば 、抗体で検出される最小サイズ蛋白が同一であるべきである（加えらｉ−たプロ テアーゼのない対照インキュベーションは内因性プロプアーゼの試料差異をコン トロールする）。別に、部分消化（抗原部位を暴露するため）は免疫親和性に精 製され、次いでイムノプロット又はペプチド遺伝地図作製されうる。異なる試料 （即ち尿及び組織）中の異なる抗体又は同一抗体により検出された類似サイズ蛋 白の同一性は、類似の試みを用いて試験されうるし、あるいは等重点は、２次元 ゲル及びイムノプロット検出を用いて決定できた。この試み（よまた、ＳＤＳポ リアクリルアミドゲル上を類似速度で移動している多重形の同定に有用である。

■、材料及び方法 Ａ、ウィルス及び細胞系統の生長 非感染のミンク肺細胞系統（ＣＣＬ６４）、ネコ肉腫ウィルスのスダニーーセイ レン株（ＳＴ−ＦｅＳＶ）及びネコ白血病ウィルスＢ（ＦｅＬＶ−Ｂ）で生産的 に形質転換された、ＭＳＴＦと呼ばれる同じ系統、ならびにガードナー−アルス ティン　ネコ肉腫ウィルス（ＧＡ−ＦｅＳＶ）で非生産的に感染された、６４Ｆ ３Ｃ１７と呼ばミーる同じ系統をセンら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニー ニスニー、８０、＋２４６−１２５０（１９８３）に記載されるように培養した 。トリ骨髄芽球症ウィルスで非生産的に感染された非生産的トリ骨髄芽球細胞系 統をドイスベルクら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスサル肉腫ウィル ス（ＳＳＶ）で非生産的感染された、Ｎ　Ｐ　Ｖ　／　Ｓ　ｉＳＶ及びＮＰＶＩ ／５ｉＳＶと呼ばれる非生産的マーモセットセルラインをデバレら、ブロク、ナ トル、アカド、サイ、ニーニスニー、１肉腫ウイルス（Ｆ　Ｓ　Ｖ）で感染され たトリ繊維芽非生産的形質転換セルラインは、ビー、セフトン・オブ・ザ・セル ラ・インスティチュート、う、ジョラ、カリホルニア、からの贈与であっｆこ。

非感染マウスＮ　Ｔ　Ｈ３Ｔ　３繊維芽細胞及びハーベイマウス肉腫ウィルスで 生産的に感染されたマウスＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞をトダロら、ジェに培養した 。ヒトＴ２４ぼうこう肉腫細胞をブベニックら、インド９ジエイ、キャンサー、 Ｉ　１，７６５−７７３（＋　９７３）ｉ記載のように培養した。

Ｂ、ペプチドの合成 ポリペプチドは、マーグリン及びメリフィールド、エイ、シブ。バイオケミ、主 ９，８４１−８６６（１９７０）記載のように固相法を用いて合成し、アミノ酸 分析により確認したユ配列情報：ｉ、ウィルス蛋白のアミノ酸配列又はヌクレオ チド配列比に基づく予言から引き出される。配列情報源は、その配列及びその癌 遺伝子に関する脚注に表示された。

免疫化接種物で用いられた３５個より少い残基を持つポリペプチドの場合、シス ティン残基が、ポリペプチドの対応する隔置白配列がそのような残基を含まない ところのポリペプチド各々のアミノ末端又はカルボジル末端に加えられる。Ｃｙ Ｓ残基は、下記のように蛋白担体へのカップリングを助けるために用いられた。

上述の固相法で有用な合成ポリペプチドを作る際に、アミノ酸残基はカルボキン 末端の残基からのエステル結合を介して架橋樹脂（固相）に結合された。ポリペ プチドがＣｙｓ残基を介して担体に結合された場合、このＣｙｓ残基は、樹脂に エステル結合されたカルボキシ末端残基として便利に用いられた。

付加されるアミノ酸各々のアルファアミノ基は典型的に、成長するポリペプチド 鎖にアミノ酸が付加される前に四級ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基で保護 された。ｔ−Ｂ　ＯＣ基は次に、成長するポリペプチド鎖への次のアミノ酸の付 加前に標準的技法により除去された。

反応性アミノ酸側鎖もまた、ポリペプチドの合成の間、保護された。通常の側鎖 保護基が、下記のような残留するアミノ酸残基のために用いられた：チロシンの ために０−（ｐ−ブロムベンジルオキシカルボニル）；スレオニン、セリン、ア スパラギン酸及びグルタミン酸のために０−ベンジル；システィンのためにＳ− メトキシベンジル、ヒスチジンのためにジニトロフェニル；リジンのために２− クロルベンゾキシカルボニル、及びアルギニンのためにトンル。

保護されたアミノ酸は適当な溶媒から再結晶されて、薄層クロマトグラフィーに より単一のスポットを与えた。カップリングは典型的に、当初のＮ−末端アミノ 酸のミリ当量数に対して１００倍モル濃過剰の保護されたアミノ酸及びジシクロ へキシルカルボイミドの両者を用いて実施された。両反応剤の２倍モル濃度過剰 ら用いられうる。アスパラギンの場合、等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリ アゾールが保護さ２−たアミノ酸に加えられ、ジメチルホルムアミドが溶媒とし て用いられた。総てのカップリング反応は、１ジシン、アナル、ケム、アクタ、 立冬、２４８−２４９（１９７２）のピクリン酸テストにより９９％を越えて完 了した。

望むポリペプチドの調製後、得ｆこ保護されたポリペプチドの一部（約１ｇ）を ２ｍ１２のアニソールで処理し、ドライアイス温度で約２０ｍＱの無水フッ化水 素を反応容器内で凝縮させた。得た混合物を約４℃で約１時間撹拌し保護基を解 離しポリペプチドを樹脂から除いた。

Ｎ、流で４℃の温度でフッ化水素を気化した後、残渣を無水ジエチルエーテルで 三度抽出してアニソールを除去し、残渣を減圧で乾燥した。

減圧乾燥した物を５％酢酸水溶液で抽出して（３度５０−）、遊離のポリペプチ ドを樹脂から分離した。抽出物含有溶液を凍結乾燥し、酸化されていない合成ポ リペプチドを得た。

Ｃ３担体蛋白への合成ポリペプチドのカップリング酸化されていない合成ポリペ プチドが、グリーンら、セル、影影、４７７及び４７８（１９８２）記載のよう にカップリング剤としてｍ−マレイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシスクシンイ ドエステルを用いてポリペプチドのシイティン残基（Ｃｙｓ：Ｃ）を介して担体 蛋白キイホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップリングされた。

Ｃｙｓ残基が配列中の末端残基である場合、さらに追加的なシスティン残基は付 加されなかった。

簡単に述べると、各ポリペプチドのための一般的手順として、ｌ０ｍＭのリン酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、２）の０．２５ｍｆ２中の４３Ｉ９のＫＬ、Ｈを、 ジメチルホルムアルデヒド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）に溶解された０、７ｘ２のＭＢＳと 反応させ、得られる混合物を室温で３０分間撹拌した。

ＫＬ）（が約３０％以上のＤＭＦ濃度で不溶なのでＭＢＳ溶液はＤＭＦの局所的 濃度が高すぎないことを保証するために一滴ずつ加えられた。反応生成物である Ｋ　Ｌ　Ｈ−Ｍ　Ｂを、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡 したセファデックスＧ−２５（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、ビスヵタ ウェイ、ＮＪ）で作られたクロマトグラフィカラムを通過させ、遊離ＭＢＳを除 去した。２８０ｎｍでモニターされるカラム溶離物のピーク分画からのＫＬＨ回 収は、約８０％であると推定された。

そのように作られたＫＬＨ−ＭＢを次に、１ｍＣの緩衝液に溶解された５ｊ）９ のポリペプチドと反応させた。得られた反応組成物のｐ）ｌ値を７〜７．５に調 節し、反応組成物を室温で３時間撹拌した。

Ｄ９免疫化及び融合 １、ｆｅｓ関連ポリペプチド アミノ酸残基配列において５Ｔ−ＦｅＳＶ　Ｖ−匡癌蛋白の一部に対応するよう なポリペプチドをＫＬＨにカップリングし、上述及びナイマンら、モノクローナ ル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ、カッツ編、（ポカ、 ラドン、フロリダ、ＣＲＣブレス社、１９８２）、＋１１１）２＋−５１，に記 載されるように１２９ＧＴＸ′″マウスを免疫化するために用いた。この免疫化 したマウスからのヒ臓細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ｌ　５００を 用いてＳＰ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させｆ二（ジェイ、ティベーカー ・ケムコ、フィルスバーブ、ニュージャーシイ）、融合のためのＰＥＧ溶液は、 融合効率を高めるｉｓめに使用前少なくとも一ヶ月前に作られた。ＳＰ２１０− Ａｇ１４細胞はそれ自身の１ｇ分子を作らず、それによりアイソタイプ分析及び 続く精製を容易にし、そのような細胞はまたレトロウィルスを作らない。融合さ れた細胞は次に、ｌＯ％胎児牛血清、１．Ｏｘ１．Ｏ−”Ｍのピポキサンチン、 １ｘｉｏ−＠Ｍのメソトレキシテート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘｔａＬｅ）、及び１ ．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含むデュルベッコの高グルコース＠量必須媒体（ ）ａ−・ラボラトリーズ・インク・イングルウッド、カリホルニア）の４００− 中に再懸濁した。次に細胞を、ナイマンら、ブロク。

ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、＋　９８２（前出）、記載のように３０ μＱのプレート中に塗り、生長させた。

２、也及びｍｙｂ関連ポリペプチド そのアミノ酸残基か、蛋白質ｐ２８ｓｉｓを形質転換するサル肉腫ウィルスの予 測された配列の位置１３９−１５５及びトリ骨髄芽球症ウィルスの予測された配 列の残基２−１８に対応するポリペプチド（ｃ）及び（ｄ）を合成し、上述した ようにＫＬＨキャリヤーにカップリングした。このように調製した接合体を、１ ２９ＧＩＸ”マウス当り一回注射当り約５０μｇのポリペプチド量で投与しｆ二 。

第Ｏ（ゼロ）日に、各接合体を完全フロインドアジュバントと混合し腹膜内注射 した。第１９日に、明ばん１ｍ１２当り５ｘｇの濃度となるように各接合体を明 ぽんと混合した。リン酸塩で緩衝した食塩水中のポリペプチド（ｃ）の効果促進 注射は、第６２日に静脈内に投与された。オリゴクローナル抗体を含む血清は、 第６７日に目高刺穿により採られた。第４１日におけるポリペプチド（ｄ）の第 二の明ばん含有免疫化後に、ポリペプチド（ｄ）の効果促進を第１４３日に同様 に与えて第１４８においてオリゴクローナル抗体を同様に作るようにした。その ようにした得た血清を、第４図について説明されるように、その受容体の抗原性 についてテストした。

同様の手段において、ポリペプチド、例えば下に表示されたアミノ酸残基配列が 合成された。

ａｂｌ　ＬＭＲＡＣＷＱＷＮＰＳＤＲＰＳＦｆｍｓ　ＥＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＲ ＲＰＴＦｓｒｃ　ＬＭＣＱＣＷＲＫＤＰＥＥＲＰＴＦＬＧＱＧＣＦＧＥＶＷＭＧ ＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲＲＲＳ ｆｇｒ　ＡＭＥＱＴＷＲＬＤＰＥＥＲＰＴＥ免疫は、ｓｉｓ及びＢｂアミノ酸残 基に記載されたと類似の手段で実施された。

３、ｒａｓ及びｅｒｂＢ関連ポリペプチドキルステンネズミ肉腫ウィルスのｒａ ｓ癌遺伝子の予測された配列からのｒａｓポリペプチドの残基９６−１１８及び ニワトリ赤芽球肉腫ウィルスからのｅｒｂＢポリペプチドの残基３６６−３８１ に対するアミノ酸残基配列中に対応するものが、合成され、上述したＫＬＨキャ リヤーにカップリングした。こうして調製された接合体は、１２９ＧＩＸ“マウ ス当り一回注射当り約５０μｇのポリペプチド量で投与した。

第０（ゼロ）日に、各接合体を完全フロインドアジュバントと混合し静脈内注射 した。第５日に、オリゴクローナル抗体含有血清を軌道穿刺によりとった。こう して得た血清は、第４図において記載されるようにその受容体の抗原性が試験さ れる。

Ｅ、抗体結合評価 抗ポリペプチド抗体を作るハイブリドーマを、第４図の説明で及びナイマンら、 モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ（前出） に記載のように酵素結合免疫吸着剤評価（ＥＬＳＩＡ）法で検出した。簡単に言 えば、約５０μモルのポリペプチドをマイクロ滴定プレート上で乾燥し、メタノ ールで固定し、ハイブリドーマ組織培養上清でインキュベートした。完全に洗っ た後に、ハイブリドーマ抗体結合を、ラビット抗マウスカッパ鎖抗体（シントン ・パイオネティクス　インク、ケンシントン、メリーランド）を用い次にグルコ ースオキシダーゼ接合ヤギ抗ラビット抗血清により検出した。接合は、ナイマン ら、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ（前 出）記載のようにグルコース及び西洋わさびペルオキシダーゼの存在下で２，２ °−アジノージ〔３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホネート（６））（ＡＢ ＴＳ）染料（ベーリンガーーマンハイム、インクアナポリス、インクアナ）によ り可視化された。アイソタイプは、前述したように、種々のラビット抗マウスラ ムン又は重鎖血清を抗マウスカッパ鎖に置き代えることにより決定された。

Ｆ、電気泳動移動及びニトロセルロース上での免疫学的検出第５図の説明及びナ イマンら、ヴアイロロジイ、１２３，１８７−２０５（１９８２）に記載される ように、細胞抽出物をポリアクリルアミド電気泳動に付し、蛋白をニトロセルロ ース（シュライヒャー・アンド・シュエル、インク０．キーン、ニューハンプシ ャー）に移した。

１／１０００希釈されたペルオキシダーゼラベルしｒニラビット抗マウスＴｇＧ 血清（ダブ。インク９．バーリンガム、カリホルニア）を、ナイマン及びエルダ ー、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ（前 出）に記載のように、２５℃で１時間移動物とともにインキュベートし、続いて 洗った。結合した抗体は、１０ｍＭのトリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメ チルｌ−１，３−プロパンジオール）、ｐＨ７，４，０，００９％Ｈ，０１，０ ，００２５％　３．３′−ジメトキシベンジジンジヒドロクロライド（イースト マンーコダック、コ１．ロチェスター、ニューヨーク）中でのインキュベージジ ンにより可視化された。

Ｃ３精製されたＰＤＧＦの調製 旧式の（ｏｕｔｄａｔｅｄ）血小板の１６単位は、サン・ジエゴ、ブラッド・バ ンク、サンジエゴ、カリホルニア、から得た。ここで用いた精製したＰＤＧＦは 、アントニデスら、ブロク、ナトル、アカド、サイ。

ニーニスニー、Ｌ且、＋８０９−１８１３（１９７９）記載の手順の初めの二つ の段階に従って得られた。

簡単に言えば、血小板は、４℃で２０分間、２８，０００重力（Ｇ）の遠心分離 により集められた血小板は、（ａ）Ｏ、１５ＭのＮａＣｌ２及び１％のグルコー スを含むｐＨ７，４の１７ｍＭのトリス−ＨｃＱの９容積及び、（ｂ）１００ｍ （！当り０．８ｇのクエン酸−水和物、２．２ｇの無水デキストロース及び２． ６ｇのクエン酸ナトリウムニ水和物ｌ容積を含む混合物の４００ｄ中に再懸濁す ることにより洗い、更に４℃で１０分間２８，０ＯＯＧで遠心分離した。このよ うに洗った血小板を次に、０．００８ＭのＮａＣＣ及び０．０１Ｍのリン酸塩イ オンをｐＨ７，４で含む水溶液（ＮａＣＱ−リン酸塩イオン溶液）の１６ｍＣに 再懸濁し、細胞を溶解（Ｉｙｓｅ）するために１０分間沸騰した。

フェニルメチル　スルホニル　フッ化物及びトレイシイロールシグマ・ケミカル ・コ、、セントルイス、シズリー）、プロテアーゼ禁止剤を各々１ｍＭ及び３％ の濃度で、分解した細胞に加えた。分解した細胞混合物を再び遠心分離して、ベ レットと上清を得た。

上清を、ＮａＣＱ−リン酸塩イオン溶液中で予め平衡化したＣＭセファデックス Ｃ−５０（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、ビスカタウェーイ、ニュージ ャーシイ）ビーズの８ｍ１２と混合した。上述のＮ　ａ　Ｃρ−リン酸塩イオン 溶液のカラム容積の６倍量で洗ったクロマトグラフィカラム（＋５Ｘ１．５ｃｍ ）中に、ビーズ及び液体を注いだ。ＩＭのＮ　ａ　Ｃρのカラム容積の２倍量で カラムを溶離することにより、ＰＤＧＦ（最初の溶離物）が得られたトリジロー ルを溶離物に加えて３％の最終濃度とし、溶離物を上述のＮａＣＣ−リン酸塩イ オン溶液に対して透析した。

上述で作られた溶解した細胞ベレットを、４℃で２４時間ＩＭＮａＣｄ溶液で抽 出し、遠心分離した。上滑を、上述のＮａＣＱ−リン酸塩イオン溶液に対して透 析し、上述のセファデックスｊこ混合しカラムを作った。このカラムを洗い、上 述のように溶離して、上述のように透析された第二の溶離物を得た。この手順で 作られたベレットを同じく処理して、前述のように再び透析された第三の溶離物 を与えた。

三つの透析された溶離物をまとめ、アミコン限外濾過装置（アミコン、レキシン トン、マサチューセッツ）及び１０にダルトン除外のフィルターを用いて数ｍｆ ｔ容積に濃縮した。そのようにｆ＃製しｎＰＤＧＦを次に、第５図について述べ たように処理した。

約２．５単位の血小板からの精製ＰＤＧＦ抽出物が、０．５％ドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）及び５％２−メルカプトエタノールを含む最小容量の溶液と混 合された。得られた混合物は２分間煮沸され、次いで５−１７％ポリアクリルア ミドゲルを通じて電気泳動した。蛋白は、その後電気泳動でニトロセルロースに 移動された。（ナイマン及びエルダー、前掲）それは、その後ストリップに切断 され、ウェスターンプロット手段に付された。

こうして調製されたニトロセルロースストリップは、次いでリン酸緩衝食塩水中 、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリオキシエチレン−９−オク チルフェニルエーテル（トリトン（商標）Ｘ−１００）を含む溶液で処理し、非 特異性蛋白結合を阻止した。

４ｍ１２のマウス抗血清希釈１　：２００を、次いでニトロセルロースストリッ プとインキュベートした。

ＰＢＳ中０．１％トリトン（商標）Ｘ−１００の溶液で３回洗浄後、ニトロセル ロースストリップを１分当り１０’カウントの１２５１標識スタフイロコツカス ・アウレウス蛋白又はペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス血清（タロ）のＩｌｌ 　ｏｏｏ希択のいずれかとインキュベートし、再びＰＢＳ中０．１％トリトン（ 商標）Ｘ　ｌ　００で洗浄した。

ペルオキシダーゼ接合物は、７．４のｐＨ価を有するｔｏｌＮρトリス緩衝液中 ０．０００９％Ｈ＊Ｏｔ、Ｏ，ＯＱ　２５％３．３゛−ジメトキシベンジジン・ 二塩化水素（イーストマンーコダック、コ、）含有溶液で発達させた。ＩＩＪ標 識ストリップを、マイナス７０℃で４８時間クロネックスハイープラス（イー・ アイ・シュポン・ド・ネモウス・アンド・コ、）増感紙を用いるＸＲＰ−１フイ ルム（イーストマンーコダック・コ、）上の暴露により発達させた。

Ｈ１尿評価 図の説明で述べ１こように供与者（虫者）からの尿を集め、集めたまま又はアミ コン限外濾過装置を用いて４０倍に濃縮して用いｆ二。この液を、５ｉｓｊｅｓ 及びＳａＳ癌遺伝子によりコードされる、又はこれに関連する蛋白質についての 評価で体液試料一定量として用いｆ二。

濃縮尿試料は下記の方法で調製された。尿を４℃で１０分間、６０００　ｒｐｍ で明澄化した。上清を次に、１０，０００ダルトン除外のアミコンフィルターを 用いて濃縮した。この濃縮した尿を次に透析して、蛋白分画を分離した。

濃縮尿をル−ン当り２５μｇで５〜１７％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し て収集尿１ｍＱからの等量の蛋白を提供し、次にニトロセルロース上に電気泳動 した。次にニトロセルロース　フィルターを、たとえば３％ウソ血清アルブミン 、０．１％トリトン（商標）ｘ−ｔｏｏ及びＰＢＳ中のマウス抗血清のＩ／２０ ０希釈を用いてプローブした。次にニトロセルロース　フィルターを３度洗い、 ＩＯ”ｃｐｍの”Ｊｔｆｉ識プロティンＡでインキュベートしｆ二。

結合は、第６図前出について述べたように一７０℃で補力スクリーンを用いて可 視化された。

■、癌蛋白及び形質転換細胞 ＮＲＫ及びＳＳＶ形質転換ＮＲＫ細胞は、センター・フォー・キャンサー・リサ ーチ、ナショナル・インステイチューツ・オブ・ヘルス、バセスダ、ＭＤのニス ・ニー・アーロンソン及びケイ・シー・ロビングにより提供された。細胞は、１ ０％の胎児牛血清、２ｆｆ１Ｍのし一グルタミン、１００１　Ｕ／ｉｆｆのペニ シリン及び１００μ９／スＱのストレプトマイシンを補われたデュルベツコの微 量必須媒体中で生長された。

Ｎ　ＲＫ及びＳＳＶ形質転換ＮＲＫの平行培養物を２時間の間隔で３度洗い、次 に媒体中で血清なしで、ｌ　５ｘＱ／Ｔ　７５ｃｃフラスコで１８時間インキュ ベートした。このようにコンディションした媒体を遠心分離し、−７０°Ｃで凍 結貯蔵した。

コンディションした媒体を解凍し、１Ｍ酢酸中で透析して５００倍に濃縮し、次 に凍結真空乾燥した。１０％の２−メルカプトエタノールでの可溶化及び還元の 後に、濃縮したコンディションした媒体５０μＣを５〜１７％ドデシル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドゲル中に電気泳動した。分泌された蛋白を次に電気泳 動的にニトロセルロースに移しそして結合した。非特異的結合は、ｐＨ７，４の リン酸塩緩衝した食塩水中の３％ウシ血清アルブミン及び０．１％ポリオキシエ チレン　オクチル　フェニルを含む溶液で細胞抽出物をブレインキュベートして ブロックされた。

免疫学的評価の実施の前に、ＰＤＧＦ−２（１−１８）又はＰＤＧＦ−２（７３ −８９０前述）で誘発されたマウス抗血清の２０μρを、適当なポリペプチドの １００μ９で１時間３７℃でブレインキュベートした。オリゴクローナル抗体含 有／ポリペプチド反応混合物を次に、上述のブレインキュベーション溶液で１＋ ５００希釈した。

そのように調製した希釈した溶液を次に４℃で、ニトロセルロース結合したコン ディションした媒体と接触させ、この接触を１５分間維持（インキュベート）し た。この時間は、抗体（受容体）とニトロセルロース上に結合した蛋白の免疫反 応のために十分を時間である。

洗ったニトロセルロースを次に１　＋５００希釈されＬ親和性精製ラビット抗マ ウスＩｇＧ１抗体（リントン）と２５℃で接触させた。接触は、抗マウスＩｇＧ １抗体が、コンディションされた媒体のニトロセルロース結合した分泌蛋白質に 結合された抗血清からの抗体と免疫反応するのに十分な２時間の間、維持された 。ニトロセルロースを次に再び洗った。

免疫反応（結合）は、ナイマン、ネイチャー、３０７，１８０−１８３（１９８ ４）に記載のように１２５１標識スタフイロコツカス　アウレウスプロティンＡ の１０＠カウント／分で可視化された。

Ｊ、新生児及び妊婦の尿試料中の隔置白用いられたモノクローナル受容体は、前 述したように調製された。

各新生児からのｌＲＣの尿を十分な２−メルカプトエタノールと混合し、１０容 量％溶液とした。得られる溶液を２分間煮沸した。冷却の上、得られる減少した 溶液の一定量を５−１７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。得られる ゲルの蛋白はニトロセルロースに移動され、標準的手段に付された。各尿試料に ついてのニトロセルロースプロットは、各々の抗体プローブで免疫反応性が個々 にスクリーニングされ、かかるウェスタンプロットの標準的手段に付された。オ ートラジオグラフィーは、４時間−７０℃でクロネックス増感紙を用いた。免疫 反応の相対的強度は、その後に決定された。

妊娠の（期待の）母からの尿試料は電気泳動の前に濃縮された。ここに、妊娠（ 最終月経周期を基にして）１６−２０週の期間に取った系列尿収集物からの蛋白 は、２容量（尿容量を基にして）のアセトンと混合することにより尿試料から最 初に沈澱させられて、４℃で保持した。沈設した蛋白を集めてＰＢＳの元の試料 容量のｌ／２０を用いて再び懸濁しｆ二。宿されている胎児の性は、羊水穿刺又 は出生後、視覚検査のいずれかにより決定した。

ザ・ユナイテッド・スティソ・ガヴアメントは、パブリック・ヘルス・サーヴイ ス・コントラクトＮｏｔ−ＣＰ−４１００９、パブリック・ヘルス・サーヴイス ・グランツＣＡ３８１６０及びＣＡ２５８０３に従って本発明に権利を有する。

上述は、本発明を例示することを意図するものであって、限定するものではない 。多数の変化及び修正が、本発明の真の精神及び新規な概念から離れることなく 行われることができる。

ＢＣＤＥ ＡＢＣＤ ＦＩＧ、　３゜ 〜ゐ口０）５に二５５さ ＡＢＣＤＥＦ　ＧＨＩＪＫＬ ＦＩＧ、　６゜ ＡＢＣＯＥ　ＦＧＨＩＪ　ＫＬＭＮＯ ＡＢＣＤＥＦＧＨ ＡＢＣＤ　Ｅ　Ｆ ＦＩＧ、　１０゜ ＦＩＧ、　／／。

ＦＩＧ、　／２．　ｔｘ　−ｆｅｓ　２ＢＣＤ イん−ｒａｓ　９７−１１８ ＣＥＬＬ　ＥＸＴＲＡＣＴ　上清 ＡＢＣＤ　ＥＦＧＨ ＦＩＧ、　／３゜ ＦＩＧ、　／４゜ ５σ／７ Ａ　坑−ｒａｓ ｐ５５ｒａＳ−ロクーーー ｐ２１ｒａＳ　、。

Ｂ　ａｎｔｉ−ｆｅｓ 保存されγニキナーゼ部分　１ 工　５５７−５６８　ＬＧＱＧＣＦＧＥ■躬Ｇ旦匹３１０−３２１　ＬＧＱＧＣ ＦＧＥＶＷＬＧｂ恨２０゜ Ｌに存されたキナーゼ部分２ ｆ臣７０Ｂ　−７２２ＦＰＩＫＷＴＡＰＥＡＡＬＹＧＲＦ／θ２／。

保存されたキナーゼ部分　３ ＦＩＧ、２２゜ 姻 ｆｅｓ　ｅｒｂ　Ｂ Ｆ／Ｇ、　２６゜ ｆｅｓ　ｅｒｂ　Ｂ ＡＢＣＤＥ　ＦＧ　Ｈ璽　」に ｆｅｓ　ｅｒｂ　Ｂ ＦＩＧ、　２８゜ ＡＢＣＤＥＦ　Ｇ　ＨＩＪＫ　Ｌ ＡＢＣＤ　Ｅ　Ｆ　Ｇ　ＨＩＪＫＬ ＦＩＧ、　３０゜ ｆｅｓ　ｅｒｂ　Ｂ ＦＩＧ、　３／。

Ｆ／Ｇ、３２゜ ８℃　ｇ％７Ｑｌ：　ｒａ！ｉ　ｅｒｂ　ＡＦＩＧ、　３３゜ ２；　ロＴＧＦ　ｒａｓ　ｅｒｂ　Ａ ＦＩＧ、　３４゜ ８℃　ＢＴＧＦ　ｒａｓ　ｅｒｂ　Ａ Ｆθ３５゜ ＦＩＧ、　３６゜ ０：　ｌ’５ＴＧＦ　ｒａｓ　ｅｒｂＡＦＩＧ、　３７゜ ＦＩＧ、　３８゜ ＦＩＧ、　３９゜ Ｄ７０　１ＹＲ Ｆ／Ｇ、　４０゜ ρ〜！ ＝ｃｏ−〜 ”　”　”　（’Ｖ　００　（）　Ｉ＋＋）　ｅ）〜〜０（＞（１００ｃｌ　− ００１（＋００ｅ＋００−（：）００（＋１、＜　ＩｎＣ％ＪＣ＋＋Ｉ−ｃｖＯ Ｍ〜Ｍ口ＱｏＱマ　１−１ぐ〜−ｏ〜約一つ。〜−２りお　の 臼へ〜ｅ＋　−０〜〜〜口００．０〜　〜〜つ〜〜〜〜１〜〜〜〜〜−〇〜ｏ　 琢００（＞ｅｌｅ１０ロロＱロロロ６　ｏ〜００〜へＯｏ口〜〜四〜〜ぞ３５ の　８゜。。。。。。。。。。。。　ロ。ｏＯ〜〜（１００口。０〜〜８゜。。

。。−０−０゜。。。　ロ。〜〜００口。−〇〇〇〇。

ｆ７に、４３．　ＦＥＳ　ＦＥＳ 第１５表 ｏＯロ　ロー　〇〇　〇　〇　〇 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）最初の生物学的試料を少なくとも２つの異なる受容体分子と接触させ て反応性の最初パターンを作り、そして（ｂ）既知生物学的試料により作られた 反応性、該第二パターンは癌遺伝子又は癌遺伝子関連配列の表現の指示である、 の第二パターンに対する反応性の該最初のパターンを含むことよりなる最初の生 物学的試料を特徴づける方法。
2. ２．（ａ）該最初の生物学的試料の多数の一定量、該一定量のリガンドは電気泳 動的に分離されそして固体支持体に移されている、をそれぞれの数の一連の異な るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の各々は癌遺伝子によりコードさ れる、又は関連するポリペプチドの部分に結合する、と接触させて一定量及び群 中に含まれるリガンド中の反応性の最初のパターンを作り、そして（ｂ）既知生 物学的試料により作られた反応性の第二のパターン、反応性の該第二のパターン は反応性の最初のパターンを作るのに用いられたモノクローナル抗体の使用によ り作られ、そして該第二パターンは癌遺伝子又は癌遺伝子関連配列の表現の指示 である、に対する反応性の該最初のパターンよりなることより構成される最初の 生物学的試料を特徴づける方法。
3. ３．該最初の生物学的試料が、腫瘍から誘発され、そして該特徴づけが、癌の存 在又は過酷さに関している、請求項２の方法。
4. ４．該最初の生物学的試料が腫瘍から誘導体され、そして該特徴づけが発達上の 段階に関している請求項２の方法。
5. ５．該最初の生物学的試料が尿であり、そして該特徴づけが癌の存在又は過酷さ に関している請求項２の方法。
6. ６．該最初の生物学的試料が尿であり、そして該特徴づけが発達上の段階に関し ている請求項２の方法。
7. ７．反応性の最初のパターンが、自動スキャナーの使用による反応性の該第二パ ターンと比較される請求項２の方法。
8. ８．既知生物学的試料を少なくとも２つの異なるモノクローナル抗体及びそのよ うに使用された該モノクローナル抗体のコンテナーと接触させることにより作ら れた反応性のパターンよりなるキット。
9. ９．反応性の該パターンが、自動スキャナーにより解釈された請求項８のキット 。
10. １０．反応性の該パターンと、未知生物学的試料と該キット内に含まれる少なく とも２つのモノクローナル抗体とを接触させることにより作られる反応性のパタ ーンとの比較に使用するためのコンピュータープログラムよりさらになる請求項 ９のキット。