JPH04500122A - 蛋白リガンドに対するポリペプチド誘発モノクローナル受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白リガンドに対するポリペプチド誘発モノクローナル受容体関連出願に対する 相互参照 本出願は、１９８８年８月１２日出願された、出願係属中の出願シリアルＮｏ、 ２３２，３９５の一部継続出願であり、該出願は、１９８７年１１月９日に出願 された、出願係属中の出願シリアルＮｏ。

１１８．８２３の一部継続出願であり、該出願は、１９８７年４月１６日に出願 された、シリアルＮｏ、０３９，５３４の一部継続出願であり、該出願は、１９ ８５年５月２１日に出願された、出願係属中の出願シリアルＮｏ、７３６，５４ ５の一部継続出願であり、該出願は、１９８４年８月１７日出願の出願係属中の ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８４１０１３０４の一部係属出願で、その米国国内段階 は１９８５年２月１５日に入り、シリアルＮｏ、７１３．４１０で、該出願は、 １９８３年８月１７日に出願され、放棄された出願係属中の米国出願シリアルＮ ｏ、５２４．０８４の一部継続出願である。

癌遺伝子への関心は過去１０年にどんどん起こってきた。ＲＮＡ腫瘍ウィルスは 、５０年以上の間、ニワトリに新形成を実験的に誘発する原因物質として関連付 けられて来たが、ウィルスで誘発され、た新形成の機構が現れはじめたのは１９ ７０年代半ばまではなかった［ビショップ（１９８３）アン、レブ、ビオケム、 ５２．３０１〜５４］。そのような機構の一つによれば、複製適格鳥類ウィルス および欠４ＪＩＩ乳類ウィルスは、ウィルスに形質転換可能性をもたらす細胞遺 伝子を獲得する。

技術分野 本発明は、免疫学的受容体及びリガンドに関し、より詳しくは、そのアミノ酸残 基配列がレトロウィルスの癌蛋白リガンドの配列に対応するポリペプチドに対し て生じたモノクローナル受容体に関する。

背景技術 レトロウィルスは、ゲノム物質としてＤＮＡでなくＲＮＡの一本鎖を含むウィル スである。これらウィルスの各々の一本鎖ＲＮＡゲノムは、ウィルスが感受性宿 主を感染した後に二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａを生じさせる。ウィルスゲノムのこのＤＮＡ レプリカは次に、成功裡に感染された細胞の染色体中に永久的に入り込み、この 宿主染色体中で複製する。

以下において及び請求の範囲で述べられるレトロウィルスはさらに、複製欠陥レ トロウィルスであると定義することができる。すなわち、これらウィルスは、ウ ィルスのＲＮＡゲノムが感染宿主の染色体中に導入されつるＤＮＡへと翻訳され るのを可能にするのに通常必要な逆転写酵素をコードする遺伝子を自身で含まな い。また、以下で述べるレトロウィルスは典型的には、その感染において複製能 力ある、いわゆるヘルパーウィルスにより補助されなければならない。この第二 のウィルスは、両ウィルスからのゲノム物質を成功裡に感染された宿生細胞中に 組み込んでこの細胞を形質転換する逆転写酵素をコードする遺伝子を含む。

理解の容易のために以下で及び請求の範囲において、複製欠陥レトロウィルスは 単にレトロウィルスとして述べられているが、これらが複製欠陥的であり、感染 の成功及び宿主細胞の形質転換のためにヘルパーウィルスの助けを必要とすると いうことが理解されよう。レトロウィルスという言葉のこの用法は当該分野で知 られており、更に説明することなくそのまま当該分野で用いられてきた。

レトロウィルス類のあるものは、宿主に接種された後短期間に固体腫瘍の形成を ひき起す能力により判断して高度に発癌性である。

これらウィルスはまた、実験室で育てられ培養される細胞において“癌的”変化 を起すことができる。そのような変化は、“形質転換”と呼ばれ、発癌ウィルス の信頼できるインビトロの応用生物学的評価を与える。このようなウィルスのい くつかが、鶏、七面鳥、マウス、ラット、ネコ及びサルから分離されている。

これら高度に発癌性のウィルスのゲノム上にある単一の遺伝子つまり癌遺伝子が 、ウィルスの腫瘍発生能力の原因となっている。いくつかのウィルスの場合、こ れら癌遺伝子の蛋白生成物（以下では癌蛋白又はオンコブロチインと云う）は、 ウィルス誘発腫瘍を持つ動物からの血清がこれら癌蛋白に対する抗体を含むとい う事実を利用して免疫学的に同定されてきた。

急速に増加している各種証拠は、レトロウィルスの癌遺伝子が総てのを椎動物の 正常細胞遺伝情報中の特定の遺伝子部位に密接に関係し、かつこれから誘導され ることを示している。

ｓｉｓ癌遺伝子の遺伝子生成物と血小板由来成長因子鎖の間の類似性［ドウリト ル等、（１９８３）サイエンス２２１．２７５〜２７７゜ウォーターフィールド 等、（１９８３）ネイチャー３０４．３５〜３９］は、癌遺伝子による悪性形質 転換と成長因子による正常細胞分裂の促進との間に最も強固な結びっけを与える 。この癌遺伝子生成物と成長因子と細胞受容体の間の同一性は、ｅｒｂ　Ｂの正 常相同物であることが判った表皮成長因子細胞受容体の配列分析で一層確証され た［ドウンワード等、（１９８４）ネイチャー３０７．５２１〜５２７、ウルリ ッチ等、（１９８４）ネイチャー３０９．４１８〜４２５］。さらに、ｆｍｓ抗 体とコロニー促進因子−１受容体の［シラー等、（１９８５）セル、６６５〜６ ７６つ、同様に蛋白キナーゼ類似性とインシュリン受容体の［ウルリッヒ等（１ ９８５）ネイチャー３１３．７５６〜７６１コおよび多くの配列化オンコブロチ インのキナ−ゼ活性を示した成虫因子受容体［ヤードン等（１９８６）ネイチャ ー３２３．２２６〜２３２］の免疫交叉反応性は、幾つかの成虫因子のシグナル トランスダクションに重要であろう。

レトロウィルスにより獲得され、またはトランスフェクション実施により同定さ れた癌遺伝子の配列化は、キナーゼ家族数の数を太き（越えた。［ハンター等、 （１９８５）アン、シブ。ビオヘム、５４．８９７〜９３０］この配列分析は、 キナーゼ関連蛋白数が大きくて家族数は配列同一性および全体の構類似性に基づ くサブグループに分けられることを示唆した。キナーゼ家族は、好都合には、ド メインを結合している細胞外の（ホルモン／成長・因子）を有しまたは有しない 遺伝子生成物に分けられる。

ｓｒｃおよびｙｅｓキナーゼ蛋白間の非常な類似性は、ここ数年の間現れてきて いる。［キタムラ等、（１９８２）ネイチャー２９７．２０５〜２０８コ最近、 付加遺伝子のシーフェンシングは、この同一性をｆｇｒｓ　［す−７ハｏ等、（ １９８４）サイエンス２２２．６３〜６６］Ｉｃｋ、　［マーンニ等、（１９８ ６）ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー８３．５４５９〜５４６３コ およびｉｙｎ　［ヤマナシ等（１９８７）モル、アンド・セル・パイオル、Ｌ　 ２３７〜２４３コに拡大した。これら６つの全ての遺伝子は、はぼ同じ大きさ５ ５−６５ｋｄの蛋白を暗号に書き出し、遺伝子は、それらが同一先祖のプロト− 癌遺伝子から進化したことを示しているイントロン／エクソン領域に分けられる 。しかしながら、各遺伝子は、別々のクロモシーム上に位置し、異なる組織内の 異なる蛋白を表現する。

多くの付加キナーゼ家族数もまた、サブグループに置かれ得る。

ｗａｓ　［パン・ベヴエラン等（１９８１）ネイチャー２９８．２５８〜２６２ ］は、ｐｉｎ−１［セルテン等（１９８６）セル４６．６０３〜６１１］に深く 関連し、モロニー白血病ウィルスの好ましい統合部位の−っである。ａＭ［レッ ディ等（１９８３）ブロク、ナトル、アセト。

サイ、ニーニスニー８０．３６２３〜３６２７コは、訂ｇ［クルー等（１９８６ ）サイエンス２３４．１５４５〜１５４７コに深く関連している。ｆｅｓ［ハム ブ等（１９８２）セル３０．７７５〜７８５コおよびｆｐｓ［ンブヤ等（１９８ ２）セル３０，７８７〜７９５］は、同一遺伝子の哺乳類およびニワトリの片わ れである。同様に、ｒａｆ［ストレイヴ等（１９８４）ネイチャー３０９．８５ 〜８８コおよびｍｉＡ［マーク等（１９８４）サイエンス２２４．２８５〜２８ ９］は、同一遺伝子の哺乳類およびニワトリの類似体である。これらは、Ａ　− ｒｏｆ／ｐｋｓ［ワレイヘル等（１９８６）モル、アンド・セル・パイオル、６ ．２６５５〜２６６２、マーク等（１９８６）ブロク、ナトル　アカド、サイ、 ニーニスニー８３．６３１２〜６３１６］に深く関連する。

ウィルスの片われを有しないサブグループは、蛋白キナーゼＣ１ホルボールエス テル用受容体を暗号に書き出す遺伝子を含む。このサブグループよりなる少なく とも３つの深く関連した遺伝子がある。［コウセンス等（１９８６）サイエンス ２３３．８５９〜８６６、クノフ等（１９８６）セル４６．４９１〜５０２コ。

さらに、遺伝子の一つは、二者択一のエキソン使用による二つの蛋白を暗号に書 き出す［オーツ等（１９８７）ネイチャー３２５．１６１〜１６１〕。他のより わずかに関連する細胞質キナーゼは、ｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存蛋白キナ ーゼ［ショージ等（１９８１）ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー７ ８．８４８〜８５１．タカオ等（１９８４）バイオケミストリー２３．４２０７ 〜４２１８］、同様に、ミオシンＬ鎖キナーゼ［タカオ等（１９８５）バイオケ ミストリー２４．６０２８〜６０３７］を含む。幾つかのトランスメンブランキ ナーゼもまた、過去数年間に配列決定された。

ヒト表皮成長因子受容体（ＨＥＲ）に深く関連する遺伝子もまた、ヒト（ＨＥＲ −２）［コウセンス等（１９８５）サイエンス２３０．１１３２〜１１３９コお よびラット（ｎｅｕ）　［バーブマン等（１９８６）ネイチャー３１９．２２６ 〜２３０］を見出された。ｒｏｓ［ネッカメイヤー等（１９８５）ジェイ、ヴイ ロル、５３．８７９〜８８４］に結合する成長因子は、その配列はインシニリン 受容体（ＨＩ　Ｒ）［ウルリッヒ等（１９８５）ネイチャー３１３．７５６〜７ ６１コに最も深く関連しているにもかかわらず、知られていない。コロニー促進 因子１受容体、ＦＭＳ［ハムプ等（１９８４）ブロク、ナトル、アカド、サイ、 ニーニスニー８１．８５〜８９コは、ｋｉｔおよび血小板誘発成長因子、ＰＤＧ Ｅ−Ｒ［ヤードン等（１９８６）ネイチャー３２３、２２６〜２３２］用受容体 とサブグループを形成する。加えて、ｔｒｋ［７−チンーザンカ等（１９８６） ネイチャー３１９．７４３〜７４８コおよびｍｅｔ　−８［ディージ等（１９８ ５）ネイチャー３１８．３８５］癌遺伝子の配列は、対応成長因子が知られてい ないにもかからず、発表された。

広くはないが同様の進展は、ｒａｓ癌遺伝子家族により表現される蛋白を結合し ているヌクレオチドにも見られる。配列データは、ｂａＳ［レディ等（１９８５ ）ジエイ　ヴイロル、５３．９８４〜９８７］がＨ−ｒａｓ［ダー等（１９８２ ）サイエンス２１７．９３４〜９３７］のマウス形であること、およびＨ−なら びにに−ｒａｓ生成物がカルボキシル部分で原則的に異なることを示す［ツチダ 等（１９８２）サイエンス２１７．９３７〜９３９］。二者択一のエキランを経 てに−ｒａｓは、２蛋白［４Ａおよび４Ｂ］を暗号に書き出すことができる［マ ツフグラス等（１，９８３）ネイチャー３０１．５０１〜５０６コ。

第三のメンバー、Ｎ　−ｒａｓもまた、この部位中のＨ−およびＫ　−ｒａｓか ら分かれる［タパロウスキイ等（１９８３）セル３４．５８１〜５８６〕。他の 密接に関連する遺伝子は、Ｒ−ｒａｓて［ロウ等（１９８７）セル４８．１３７ 〜１４６］、この遺伝子は３つのｒａｓ遺伝子、これらは同一先祖の遺伝子から 進化している、と密接に関連しているが、Ｒ−ｒａｓは異なるイントロン／エク ソンボーダーを有する。他の遺伝子、ｒｈｏ７［７ヅル等（１９８５）セル４１ ．３１〜４０〕は、ｒａｓと類似の部位が分散する。さらに、第三のグループ、 ｒａｌも、同様の類似部位を有する［チャーディン等（１９８６）エムボ・ジエ イ、５．２２０３〜２２０８コ。そのうえ、酵母遺伝子ｙｐｔ［ガルウィツ等（ １９８３）ネイチャー３０６．７０４〜７０７］は、ｒａｓと類似の部位を有し 、この遺伝子は、ｒａｓと非常に類似の２つの酵母遺伝子と明らかに異なる。即 ち、これらはＲ−ＲＡＳにより類似する。

他の遺伝子、これらもｒａｓと類似する、はＧ蛋白［イト−等（１９８６）ブロ ク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー８３．３７７６〜３７８０Ｆ同様にト ランスダクンヨンおよび伸長因子、Ｔｕ［ロクリー等（１９８５）サイエンス２ ２８．９６〜９９コを含む。Ｇ蛋白は、（Ｇｓ）を促進しくＧｉ）アデニレート シクラーゼを阻害するサブユニットから構成される。他の関連蛋白（Ｇｏ）は、 未知の機能を有する。これらの蛋白は、密接に関連した配列を有する、種々の異 なる形態に存在する。

核蛋白ｍｙｂ　［ルシュｏつ等（１９８２）サイエンス２１６．１４２１〜１４ ２３コ、ｌｌ１ｙｃ［コルビイ等（１９８３）ネイチャー３０１．７２２〜７２ ５］およびｆｏｓ　［ヴアン・ストラーテン等（１９８３）ブロク、ナトル、ア カド、サイ、ニーニスニー８０．３１８３〜３１８７コは、配列よりも細胞位置 でより関連している、他の科の癌遺伝子よりなる。しかしながら、これらの癌遺 伝子に関連する付加遺伝子が同定された。Ｎ−ｍｙｃ［スタントン（１９８６） ブロク、ナトル、アヵド、サイ、ニーニスニー８３．１７７２〜１７７６コおよ びレ−ＪＩＣ［ナラ等（１９８５）ネイチャー３１８．６９〜７３コ配列は、発 表され、そして発表された関連配列は同定された。さらに、配列は、ｆ。

Ｓとわずかに関連する。関連ｆｏｓ（ｒ−ｆｏｓ）［コクラン等（１９８４）サ イエンス２２６．１０８０〜１０８２コ配列が、発表され、未発表のデータは、 ｊｕｎ癌遺伝子が制限するようにホスホリラーゼ阻止因子が類似性を制限するこ とを示す。

他のグループの核癌遺伝子関連蛋白は、ステロイドおよび甲状腺ホルモン受容体 を含む。ｅｒｂ　Ａに関連する唯一の配列が発表された［サブ等（１９８６）ネ イチャー３２４．６３５〜６４０．ワインバーガー等（１９８６）ネイチャー３ ２４．６４１〜６４６］けれども、ハイブリッド形成研究は、ついに２つの関連 配列がヒトゲノムに存在することを示す［ワインバーガー等（１９８６）ネイチ ャー３２４．６４１〜６４６コ。ステロイド受容体配列は、ｅｒｂＡ（甲状腺ホ ルモン受容体）が幾つかの受容体（エストロゲン、グムコエルチェイド、プロゲ ステロン、アルデステロン）を含む玉料の部分であることを示す［グリーン等（ １９８６）サイエンス２３１．１１５０〜１１５３、ホルンバーブ等ネイチャー ３１８．６３５〜６４１およびコンリイ等（１９８６）サイエンス２３３．７６ ７〜７７０コ。

成長因子グループにおいて、わずかにＰＤＧＦ−１ｆｉＪｌ［ドールトル等（１ ９８３）サイエンス２２１．２７５〜２７７およびウオータ一フイールド等（１ ９８３）ネイチャー３０４．３５〜３９］が５ｉｓ（ＰＤＧＦ−２）に類似の配 列を有する。しかしながら、他の成長因子［グレゴリイ（１９７５）ネイチャー ２５７．３２５〜３２７、マーガーヅ等（１９８３）ブロク、ナトル、アカド、 サイ、ニーニスニー８０，４６８４〜４６８８コ（ＥＧＦおよびＴＧＦ）は、ｅ ｒｂ　Ｂプロトオンコジーンの生成物に結合し、Ｃ３Ｆ−１［カワサキ等（１９ ８５）サイエンス２３０．２９１〜２９６］は、ｆｍｓプロトオンコジーンに結 合する。さらに、ＴＧＦ［プリンク等（１９８５）ネイチャー３１６．７０１〜 ７０５］は、ミューラー阻害物質［ケイト等（１９８６）セル４５．６８５〜６ ９８］と類似の理由で他のサブグループおよび種々の形の阻害中に見出される３ つの鎖［メイラン等（１９８５）ネイチャー３１８．６５９〜６６３およびヴエ イル等（１９８６）ネイチャー３２１．７７６〜７７９］を形成する。

最後に、ＭＭＴ〜７の２つの関連続合部位を表現している配列が発表された［ヴ アン・オーサン等（１９８４）セル３９．２３３〜２４０およびムーア等（１９ ８６）エムボ・シエイ　５．９１９〜９２４］。

二のように過去数年、多くの関連、発表配列が劇的に増えて来た。これらの配列 は、限られた数の、細胞分裂および分化を制御する通路が存在すること、しかし 多くの異なる要素がこの制御に関係しているらしいことを示唆する。

レトロウィルスによる細胞遺伝子のごく一部のトランスダクションの例は、ｅｒ ｂ　Ｂ癌遺伝子である。ｅｒｂＢ癌遺伝子は、既に記載されたように、ＥＣＧ受 容体の一部と高度に類似する［ウルリッチ等ネイチャー３０９．４１８（１９８ ４）］。全体の受容体遺伝子の配列分析は、全細胞内ドメイン、トランスメンブ ランドメイン、および細胞外ドメインの部分を証明する。

特定の核酸検知手段を用いる分子的ハイブリッド化研究、及び続（ウィルス癌遺 伝子及びその細胞関連物の遺伝子組換え技術による遺伝子クローニングは、レト ロウィルス癌遺伝子（ｖ−ｏｎｃ）と総ての正常を椎動物細胞に見られる細胞癌 遺伝子（ｃ−ｏｎｃ）の間の密接な関連を明らかにした。

このように十分分離された幾つかのレトロウィルスの分子的分析は、１ダ一ス以 上の異なる癌遺伝子を明らかにした。その多くの場合、対応する細胞レトロウィ ルス癌遺伝子またはオンコブロチインが分離された。たとえばヒトＥＪまたはＴ ２４膀胱癌遺伝子は、バービイ（Ｈａｒｖｅｙ）　マウス肉腫ウィルス（ｒａｓ Ｍａ）の及びＢＡＬＢ肉腫ウィルス（ｂａｓ）の形質転換遺伝子の相同体である と同定された（パラダら、ネイチャー、２９７．４７４〜４７８（１９８２）； デルら、ブロク　ナトル　アカド　サイ　ニーニスニー、７９．３６２７〜３６ ３４（１９８２）；及びサントスら、ネイチャー、２９８．３４３〜３４７（１ ９８２））。また、ヒト癌腫細胞系統ＬＸ−１の癌遺伝子は、マウス肉腫ウィル ス（ｒａｓＫｉ）のキルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）系統の形質転換遺伝子に相同 であると見い出された（デルら、前出）。さらに、トリ起源のｆｐｓと呼ばれる Ｃ−０ｎＣに対して同じＶ　−ＯｎＣが、限られた数のトリレトロウィルス分離 物のうち、少なくとも二度表現される：ネコ種においてｆｅｓと呼ばれるその哺 乳類同族物がネコ肉腫ウィルスの二つの異なる系統で見い出された。

ウィルス癌遺伝子によりコードされる蛋白及び宿主細胞内の対応する相同蛋白を 持つ蛋白は共に以下では癌蛋白と呼ばれるが、しかし細胞癌蛋白は典型的には正 常細胞中に少量で存在し、すなわち、新生状態にのみ伴う必要はない。また、関 連する癌遺伝子によりコードされる癌蛋白は異なる分子量を持つことができ、た とえば各々ｖ−ｆｅｓＳＴ及びｖ−ｆｅｓＧＡによりコードされるｐ８５及びｐ １０８の癌蛋白、及び正常なミンク細胞のｃ−ｆｅｓ遺伝子によりコードされる と考えられる１００〜１０５にダルトンの蛋白である［センら、ブロク、ナトル 、アカド、サイ、ニーニスニー、８０．１２４６〜１２５０（１９８３）］。癌 蛋白という言葉は本明細書で、その遺伝子及びアミノ酸残基配列が少なくとも部 分的に相同である蛋白に対して一般に用いられる。

癌蛋白は一般に、細胞を感染するウィルス粒子中には存在せず、感染及び形質細 胞中で精々最小に発現され、新生細胞中ではより多く発現される。すなわち、癌 蛋白は典型的には、ウィルスから得られない。また細胞からの癌蛋白の分離は、 存在量が少ないこと、正常細胞中に見られる蛋白の複雑な混合物及び形質転換さ れた細胞中にさえ存在するそのような蛋白の比較的少量の故に、困難である。

ｖ−ｏｎｃ及びＣ−Ｏｎｅ遺伝子によりコードされる癌遺伝子は、相同であるが 、にも拘わらず通常同一でないアミノ酸残基の大きな配列を含む。また各々が表 面上同じ癌遺伝子を含む異なるウィルス系統の遺伝子によりコードされる癌蛋白 に、上述に及び第１２番目のアミノ酸残基の位置で異なるｒａｓ遺伝子の四つの 刊行物に記載された配列により例示されるように、そのアミノ酸残基配列におい て僅かな変化を持つことが見い出された。すなわち、癌蛋白が手中にある時でさ え、それらを区別することは困難であろう。

モノクローナル及びポリクローナル抗体又はこれら抗体のイディオタイプ含有蛋 白のような免疫学的に誘発された受容体分子は、それらが結合する蛋白リカンド を精製する際において、蛋白リガンドの存在及び量を評価するだめの診断剤とし て、及び相同の蛋白リガンド間を区別するために有用である。

多量の癌蛋白を得ることの困難性は、ｖ−ｆｅｓ及びｖ−ｆｐｓコードされる癌 蛋白に対する細胞誘発モノクローナル抗体全体がベロネセらにより報告されてい る（ジェイ　バイロル、４３．８９６〜９０４（１９８２））が、これら癌蛋白 に対する受容体の調製を一般的に妨げている。また、蛋白全体がそのような受容 体の製造を誘発する免疫原として利用できるとしても、免疫原として大きな蛋白 分子を使用すると、大きな蛋白分枝の多数のエピトープに対するポリクローナル 抗体を含む抗血清ができる。

蛋白全体又は大きな蛋白断片を免疫原として用いるハイブリドーマ及びモノクロ ーナル抗体技術は、そのような免疫原に対する免疫学的応答をせばめるのに有用 であった。しかし従来行われたそのような技術は、極めて時間を要し、免疫原を 認識する有用な抗体を分泌する比較的少数のハイブリドーマのみを与える。また 、成功である場合でも、そのような技術は、受容体分子がそれに対して生じられ るところのエピトープの化学的同一性を予測できない。従って免疫原を認識する 受容体が作られた後でも、蛋白リガンドの特定の化学的に同定されるエピトープ 部分に対する受容体を獲得することは、究局的に作られる有用なハイブリドーマ の数をさらに減少する、でたらめな操作である。

アルンハイターらは、５６のアミノ酸残基を含みかつアミノ酸残基配列において 完全なインターフェロン分子のカルボキン末端部分に対応するポリペプチドに対 して生じたモノクローナル抗体の製造を報告した（ネイチャー、２９４．２７８ 〜２８０（１９８１））。この５６−ｍｅｒポリペプチドは、全分子の配列の約 ３分の１に対比した。

アルンハイターらは、１１のモノクローナル抗体の製造を報告した。しかしこれ ら１１のモノクローナル抗体のうち僅か１つのみが、ポリペプチド免疫原及び完 全なインターフェロン分子の双方に結合した。また、この結合は、合成ポリペプ チドからの抗体と競合するのに要する完全なインターフェロンの３０００倍過剰 により判定すると、あまり強くなかった。他のモノクローナル抗体のどれも、完 全な分子に結合しなかった。

また、これらモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの製造は、三匹の免 疫化されたマウスからのヒ臓を必要とする。望むインターフェロン結合性モノク ローナル抗体の低収量、及びこれらハいう事実は、これら研究者が彼らの仕事に おいて比較的不成功であったことを示している。

レルナーらは、免疫原として短いものから中間の長さまでの合成アミノ酸残基配 列を用いて病原体に対するワクチンの使用により動物の保護を得ることに成功し た。サツトクリフエら、サイエンス、２１９．４９５〜４９７（１９８３）を参 照されたい。

しかし、本発明まではハイブリドーマ及びそれの分泌するモノクローナル受容体 の調製の成功は、オリゴクローナル受容体を含むワクチンの調製の成功とは別で あることを理解しなければならない。

すなわち、高収率のモノクローナル抗体調製のために、多量の親和な（ａｖｉｄ ）抗体を分泌するようにＢ細胞を刺激する必要である。一方、合成ワクチンにつ いて、オリゴクローナル抗体のより巾広いスペクトルはより少量でかつより乏し い親和性のものが作られるであろう。また、病原体に対する動物の保護は典型的 には、細胞応答及び液性応答が各々動物において誘発されうるようにＴ細胞及び Ｂ細胞活性化の双方を必要とする。

完全な蛋白を認識し動物宿主を保護する抗体を製造する際における合成ポリペプ チド含有ワクチンの成功のポピユラーな説明は、免疫応答の多様性がまれな事象 すなわちポリペプチドが生得分子におけるその対応する配列の配座（コンホメー ション）を採用することの観察を可能にする確率モデルを含む。中程度の長さの ポリペプチドはしばしば生得の構造に一致しうるという概念は、理論的及び実験 的研究に反する。むしろそのようなポリペプチドは、動的平衡にある多数の遷移 的配座状態の総体（アンサンプル）として存在すると考えられる。この配座のア ンサンプルのいくつかによるＴ細胞活性化及びいくつかに対して生じる抗体のＢ 細胞生産は、ワクチン接種による保護を与えるのに十分であると考えられてきた 。

発明の要約 本発明は、（ａ）レトロウィルス遺伝子によりコードされる蛋白リガンド、及び （ｂ）レトロウィルスの遺伝子によりコードされる蛋白の一部のアミノ酸残基配 列に対応するアミノ酸残基配列を持つ、約７〜約４０の残基、好ましくは約１０ 〜約３０のアミノ酸残基の中庸な長さのポリペプチドの両者に結合するモノクロ ーナル受容体分子を考慮している。この受容体分子は、ポリペプチドを含む免疫 原に対して生じる（これにより誘発される）。最も好ましくは、受容体分子は、 免疫グロブリンのＩｇＧ又は１ｇＭクラスのようなモノクローナル受容体である 。

本発明の特定の好ましいモノクローナル受容体分子は、下記に列挙する遺伝子に よりコードされる蛋白に対して、及びこれら癌遺伝子に位置して列挙するポリペ プチドに結合する。

５ＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ； ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ。

ＬＭＥＱ（ＪＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ：及びＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶ ：　及ヒＦＩＶＴＩＦＩｍＶＲＲＰＰＫＧＫＦＩＲＫＣ：ＰＤＧＦ−Ｉ　５ＩＥ ＥＡＶＰＡＥＣＫＴＲ。

ＥＧＦ　ＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣ；ａｂｌ　ＬＭＲＡＣＷＱＷＮ ＰＳＤＲＰＳＦ　：ＬＧＧＧＱＹＧＥＶＹＥＧ　：及び ＬＩＦＥＩＡＴＹＧＭＳＰＹＰＧＩＤＬＳＱＶＹ：ｆｍｓ　ＦＭＱＡＣＷＡＬＦ ＰＴＲＲＰＴＦ　：及びＬＧＴＧＡＦＧＬＶＶＥＡ ＳＲＣＬＭＣＱＣＷＲＫＤＰＥＥＲＰＴＦ；ＬＧＱＧＣＦＧＥＩＭＧ　；及び ＣＧ５５ＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲＲＲＳ　。

ｙｅｓ　ＬＭＫＬＣＷＫＫＤＰＤＥＲＰＴＣ；及びＬ置ＶＴＫＧＲＶＰＹＰＧＭ ＶＮＲＥｖＬ。

ｆｑｒ　Ｌ置ＴＴＫＧＲＶＰＹＰＧＭＧＮＧＥＶＬ；ｂａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＫ ＧＶＧＫ　：１ｎｔ−Ｉ　ＬＨＮＮＥＡＧＲＴＴｖＦＳ　：ｍｉｌ／ｒａｆ　Ｌ ＶＡＤＣＬＫＫＶＲＥＥＲＰＬＦ；及びＩＧＳＧＳＦＧＴＶＹＲＧ。

ｒｏｓ　ＬＧＳＧＡＦＧＥＶＹＥＧ　；ＶＷＥＴＬＴＬＧＱＱＰＹＰＧＬＳＮＩ ＥＶＬ、及びＬｉ１ＴＲＣＷＡＱＤＰＨＮＲＰＴＦ。

本発明はまた、蛋白分子リガンドに対するモノクローナル受容体分子を作る方法 に関する。この方法において、中庸な長さく約７〜約４０の残基）の、好ましく は合成的に作られた、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチ ドの接合体が提供される。このポリペプチドのアミノ酸残基配列は、蛋白リガン ドのアミノ酸残基配列の一部に対応する。この免疫原ポリペプチドは、キーホー ル　リンペット　ヘモシアニンの担体に接合体として結合されてマウスを免疫化 するのに用いられるとき、三回後の免疫化の後に少なくとも約１：４００希釈の ポリペプチドに対する免疫化されたマウス血清の５０パ一セント結合滴定量（ｂ ｉｎｄｉｎｇ　ｔｉｔｅｒ）を与えるのに十分なほど免疫原的かつ抗原的である 。ここで三回の免疫化の各々は、接合体中に少なくとも１０マイクログラムのポ リペプチドを含み、第一回の免疫化では完全なフロイントのアジュバントを、第 二回及び第三回の免疫化ではアジュバントとして明ばんを用いる。

哺乳動物は、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチドの接合 体で過免疫遇され、少なくとも約１・４００希釈のポリペプチドに対して５０パ 一セント結合滴定量を示す過免疫血清を与える。この血清の受容体分子はまた、 ポリペプチドがアミノ酸基配列において対応するところの蛋白分子リガンドに結 合する。

過免疫化された哺乳動物は、少なくとも約１：４００の希釈の５０パ一セント結 合滴定量を与える免疫化を行った後、少な（とも約３０日間維持される。その後 、静脈内注射によるような効能促進免疫化を動物に付与する。

効能促進された哺乳動物のヒ臓細胞（スプレフサイト）のような抗体生産細胞が 、ハイブリドーマ細胞を作るために、効能促進投与の日から約３〜約５日の間に 骨髄腫細胞と融合される。このように作られたハイブリドーマ細胞は、蛋白分子 リガンド（この一部に免疫原ポリペプチドがアミノ酸残基配列において対応する ）に結合するモノクローナル受容体分子の生産について評価される。好ましくは ハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチドに結合するモノクローナル受容体分子 の生産について評価される。

蛋白分子リガンドに結合するモノクローナル受容体分子を生産するハイブリドー マ細胞は次に、その細胞の追加量を作るために培養される。好ましい実施におい ては、培養されたこれらハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチドに結合するモ ノクローナル受容体を作るものである。

本発明の別の実施態様は、癌蛋白リガンドの存在を評価するためのキットのよう な診断系を与える。この系は、本発明のモノクローナル受容体分子を含む第一包 装を少なくとも含む。これら受容体の所定量を癌蛋白リガンドの存在を評価され るべき水性組成物の所定量と混合すると、癌蛋白が、受容体分子により結合され たポリペプチドのアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を含む場合には 、免疫反応により受容体−リガントコンプレックスを形成する。

コンプレックスの存在は、好ましくは系の第二包装に含まれるところのラベルに より同定されうる。好ましい癌蛋白リガンド含有水性組成物は、細胞抽出物、羊 水、尿および濃縮尿を含む。尿または尿濃縮物は、非硬人的手段により容易に得 られ、簡単に濃縮されて本明細書で述べる診断テストの実施を可能にする。細胞 抽出物及び形質転換された細胞によりコンディションされ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｅｄ）メディウムもまた、癌蛋白リガンドを含む適当な水性組成物である。

評価方法は、本発明のもう一つの考慮される実施態様である。ここで癌態様リガ ンドの存在を評価されるべき体試料、例えば血清、細胞抽出物、羊水、尿または 濃縮尿は、抗癌蛋受容体分子含有液状溶液に混合される。形成された混合物は、 コンプレックス（免疫コンプレックス：反応生成物または免疫反応物）が癌蛋白 リガンドと受容体分子（抗原−抗体コンプレックス）の間を形成するのに十分な 時間維持される、コンプレックスの存在は、その後決定される。

得られた、または濃縮形の尿が評価されるべき組成物であるのに対し、いかなる 基源、例えばポリクローナル、オリゴクローナル又はモノクローナルの抗癌蛋白 受容体も本発明に用いられる。本発明のモノクローナル抗体は、評価されるべき 他の試料に有用である。

免疫反応物の存在の決定は、典型的にはラジオアイソトープ又は酵素でラベルさ れた抗体又は形成免疫コンプレックスの受容体に結合するスタフィロコッカスア ウレウスプロティンＡを用いて行われる本発明の特に新規な側面は、体試料とし ての尿の使用である。ここに記載される評価は、記載された如き濃縮尿を用いて 実施されつる。癌遺伝子関連蛋白は、これまでの尿試料中で同定されていない本 発明の評価側面は、特異的被評価試料の免疫反応性様式を与える多数の癌蛋白関 連ポリペプチドリガンドを用いることにより行なうことができる。得られる様式 は、診断を与える既知症状を有する個体から得られる様式と比較する。

子宮内の雌胎児の存在確認方法も意図される。ここに妊娠した母親から得た、煮 沸し、少量化し、好ましくは濃縮した尿試料を、右から左に、そしてＮ末端から Ｃ末端に記載された、（ｉ）ＬＭＥＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦおよび（ｉｆ） ＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣからなる群から選ばれた式を 有するポリペプチドと免疫反応した受容体分子と混合する。尿試料は、妊娠して 約１６から約２０週間の間に採取される。混合物を、受容体分子が尿試料中に存 在する癌蛋白リガンドと免疫反応するのに十分な期間保持する。特殊免疫反応体 の存在は、その後評価される。免疫反応体は、受容体分子および癌蛋白リガンド の間に形成され、上記ポリペプチドと免疫反応する受容体分子に対し約４０キロ ダルトンの５−１７パーセントポリアクリルアミドゲル中に、および上記ポリペ プチド（ヨ）と免疫反応する受容体に対し約５５キロダルトンの相対分子質量を 示す。これらの受容体分子のいずれかと免疫反応体の存在は、子宮内に雌胎児が 存在することを示す。受容体分子は、好ましくはモノクローナルである。

本発明の別の実施態様においては、モノクローナル受容体分子が、癌蛋白リガン ドを結合し精製するのに有用な親和性吸着剤の活性な結合性部分を形成する。こ こで受容体は、癌蛋白に対して化学的に不活性な固体支持体たとえば寒天又は架 橋寒天に結合される。このようにして調製された親和性吸着剤は次に、蛋白リガ ンドを含む水性組成物に混合されて、蛋白リガンドが、受容体に結合されたポリ ペプチドのアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ場合に、可逆的 受容体−リガントコンプレックスを形成する。このように形成されたコンプレッ クスは次に解離されて、純粋な形の蛋白リガンドを与える。

本発明は、いくつかの利益及び利点を与える。

本発明の一つの利益は、既知のアミノ酸残基配列のポリペプチドに含まれるエピ トープに結合するモノクローナル受容体分子である本発明の別の利益は、レトロ ウィルスによりコードされる蛋白リガンドの既知のアミノ酸残基配列に含まれる エピトープに結合するモノクローナル受容体分子が作られることができ、ここで これら蛋白リガンドは受容体分子の生産を誘発することを必要とされないことで ある。

本発明の利点の一つは、中庸な長さの免疫原ポリペプチド、及び蛋白リガンド分 子のアミノ酸残基配列にポリペプチドが部分的に対応するところの蛋白リガンド 分子の両者に結合するモノクローナル受容体の高収量生産法である。

本発明の別の利点は、癌蛋白の存在を評価できるモノクローナル受容体分子を含 むキットのような診断系の提供である。

本発明の別の利点は、非侵入的手段で得られた体試料を用いて達成できる診断法 の提供である。

本発明の別の利点は、種々の分子量の蛋白を検出でき、生体内で発現される正確 な癌遺伝子の差別的かつ高精度の評価を可能にすることである。

本発明の別の利点は、胎児発育、または新形成を含む他の成長状態の予知を可能 にし、非侵入評価で、母親または個体の尿を用いる診断方法の提供にある。

本発明のさらに別の利益及び利点は、下記の記述及び請求の範囲から当業者にと って明らかであろう。

図面の簡単な説明 本開示の一部を成す図面において： 第１図は、５Ｔ−ＦｅＳＶ　〜Ｔ−ｆｅｓ癌蛋白の存在を検出するだめの免疫学 的評価を例示するオートラジオグラフの写真である。ネコ肉腫ウィルス（ＳＴ− ＦｅＳＶ）及びネコ白血病ウィルスＢ（ＦｅＬＶ−Ｂ）のシニデルー；ｚ（Ｓｎ ｙｄｅｒ−Ｔｈｅｉｌｅｎ）系統で感染された生産的に形質転換したミンク細胞 系統であるＭＳＴＦ細胞の約１０５からの細胞抽出物（センら、ブロク　ナトル 　アカド　サイ　ニーニスニー、８０．１２４６〜１２５０（１９８３））を５ 〜１７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次にニトロセルロースシート に移した。移した蛋白を次に、３１０ＦＯ３（レーン１）又は５２２００６（レ ーン２）と呼ばれるハイブリドーマ組織培養物又はネガテブ対照として用いられ た抗インフルエンザ赤血球凝集素ハイブリドーマからの上澄みと反応させた。ポ リアクリルアミドゲル分離及び続くニトロセルロースへの移転及び可視化のこの 手順は、以下ではウェスターンプロット法と呼ばれる。蛋白可視化は、後記の材 料及び方法の部で説明するようにして達成された。

第２図は、第１図と同様にウェスターンプロットによるｐ８５（８５キロダルト ン：８５にダルトン）と示されるＦｅＳＶ融合蛋白の存在を検出するだめの免疫 学的評価を例示するオートラジオグラフの写真である。約２♂１０６のＭＳＴＦ 細胞の細胞抽出物を５〜１７％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次にニ トロセルロース片に電気泳動的に移した。このニトロセルロース片を８１０ＦＯ ３（レーンＡ）：Ｐ４３Ｄ１９（レーンＢ）、Ｐ４２Ｃ１０（レーンＣ）、Ｐ４ ４Ｅ１１（レーンＤ）と呼ばれるハイブリドーマからの１＝５０希釈されたハイ ブリドーマ培養物上澄みの各５ｍｌで又はネガテブ対照として抗うウシェル（Ｒ ａｕｓｃｈｅｒ）ｇｐ　７０蛋白受容体生産ハイブリドーマであるＲ２０６ＢＯ ８（レーンＥＸナイマン及びエルダー、ブロク　ナトル　アカド　サイ　ニーニ スニー、７７．４５２４〜４５２８（１９８０））でインキュベートした。

結合は、後に材料及び方法の部で述べるようにパーオキシダーゼラベルしたラビ ット抗マウスＩｇＧの添加により可視化された。第２図の左側のマーカー“ｐ８ ５−”は、ｆｅｓ遺伝子によりコードされる８５にダルトンの５Ｔ−ＦｅＳＶポ リプロティンの移動位置を示す。

レーンＥの蛋白から判るように、この手法は、本発明のモノクローナル受容体に より特異的に結合されない蛋白分子の可視化を可能にする。レーンＥで可視化さ れた非特異的に結合された蛋白をレーンＡ−Ｄで可視化された蛋白から引くと、 特異的にのみ結合された蛋白がｖ−ｆｅｓによりコードされるｐ８５癌蛋白であ ることを示す。

第３図は、ｐ８５と示される３５ｐラベルされたＦｅ５Ｖ融合蛋白の存在の免疫 沈澱評価を例示するオートラジオグラフの写真である。

ＣＣＬ６４ミンク細胞（ＭＳＴＦ細胞；レーンＢ及びＤ）、又はＦｅＬＶ−Ｂ及 びＦｅ５Ｖで感染されたこれら（ＭＳＴＦ細胞：レーンＡ及びＣ）を各々、１マ イクロキユーリーの３２Ｐで２時間ラベルした。

ラベルした細胞抽出物を次に、３μｌのヤギ抗ＦｅＬＶ　ｐ１５抗体（レーンＡ 及びＢ）又は５０μｌの培養されたハイブリドーマ５ＩＯＦ０３からの上澄み（ レーンＣ及びＤ）でインキュベートした。このように調節した免疫コンプレック スを、蛋白Ａを発現するスタフィロコッカス　アウレウス　バクテリアを用いて 集めた。このように集めた沈澱したコンプレックスを洗い、次にその成分部分に 解離した。その後の蛋白を、５〜１７％ポリアクリルアミドゲルを用いて還元変 性電気泳動下で分析した。第３図の左のマーカー“ｐ３５−”及び“ｐｒ３５− ”は、ｆｅｓ遺伝子でコードされる８５にダルトンの５Ｔ−ＦｅＳＶ融合蛋白、 及び６５にダルトンのＦｅＬＶギャグ前駆体蛋白の移動位置を示す。

第４図は、アミノ酸残基配列において、（ｉ　）ｐ２８ｓｉｓと呼ばれるサル肉 腫ウィルス形質転換蛋白の予告される配列の位置１３９〜１５５（デバレら、ブ ロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、８０．７３１〜７３５（１９８３ ）に対応する合成ポリペプチド（以下ではポリペプチド（Ｃ）またはナンバー１ １３及びＰＤＧＦ２（７３〜８９）と呼ばれる）、及び（ｕ）トリ赤芽球ウィル ス癌蛋白の予告されるアミノ酸残基配列の残基２〜１８に対応する合成ポリペプ チド（ルシュロウら、サイエンス、２１６．１４２１−１４２３（１９８２）） （以下ではポリペプチド（ｄ）またはナンバー１３１と呼ばれる）に対して生じ たオリゴクローナル抗体の免疫反応性を示すグラフである。キイホール　リンベ ット　ヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合した合成ポリペプチドは、材料及び方法の 部で一般に述べるようにマウスを免疫化するのに用いられた。

このように調製されたオリゴクローナル抗体含有血清の特異性をテストするため に、非接合ポリペプチドの２５０ナノグラム又はＫＬＨの５００ナノグラムをマ イクロ滴定溝の底で乾燥し、ナイマン及びエルダー、モノクローナル　アンチボ ディーズ　アンド　ティセル　プロダクツ、カッツ編集、シーアルシー　プレス 、ボカラトン、フロリダ、ｐｐ２３〜５１（１９８２）に記載されるようにメタ ノールで固定した。溜りの残留部分を、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３ ７℃で４時間のインキュベーション時間を用いて非特異的蛋白吸着に対してブロ ックした。

マイクロ滴定プレートの各々の溜りに、１０％胎児牛血清で補われた組織培養媒 体を用いて１：４００の希釈から出発して二倍希釈の免疫化マウス血清の各２５ μｊを滴下し、ＢＳＡブロックした。

蒸留水で１０回洗った後、１％ＢＳＡで１：＋ＯＯ希釈された、リン酸塩緩衝さ れた食塩水（ＰＢＳ）中のラビット抗マウス　カッパ抗体（シントン　バイオニ クス　インク、ケンシントン、メリーランド）の２５μｌを加え、３７℃で２時 間インキュベートした。蒸留水で更に１０回洗った後、グルコースオキシダーゼ に接合され、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１：５００希釈されたヤギ抗ラビットＩｇ Ｇの２５μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。

このように結合されたグルコースオキシダーゼの量は、１．２％のグルコースの 存在下で１００μｇ／ｍｌのＡＢＴＳ染料（ベーリンガー・マンハイム）及びｐ Ｈ６，０の持つ０．１モル濃度リン酸塩緩衝液中の１０Ｐｇ１０１のホースラブ イーシュパーオキシダーゼを含む溶液５０μｌを加えることにより決定される。

このように調製された溶液の光学的密度は、ティターチク　マイクロスキャナー 、（フローラボラトリーズ　インク、イングルウッド、カルナルニア）を用いて ４１４ｎｍで読んだ。

ｓｉｓ及びｍｙｂに関係するポリペプチドに対して生じた血清中のオリゴクーロ ナル抗体により示される結合は、各々白抜き及び塗りつぶしたシンボルで示され る。抗体抗原は、ｓｉｓ関係ポリペプチド（Ｃ）（０，Ｏ）；　ｍｙｂ関係ポリ ペプチド（ｄ）（、）、及びＫＬＨ（、）である。

第５図は、合成ポリペプチド（Ｃ）及び（ｄ）により誘発されたオリゴクローナ ル抗体（受容体）を含むマウス抗血清をプローブとして用いて、非還元の及び還 元された血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の存在を検出するための免疫学的評価 を示すオートラジオグラフの写真である。ＰＤＧＦ抽出物は、材料及び方法の部 で述べるように古式の血小板から精製された。

約２．５単位の血小板からの精製したＰＤＧＦ抽出物は、０．５％ドデシル硫酸 ナトリウム（ＳＤＳ）及び５％の２−メルカプトエタノールを含む溶液の極小量 と混合された。得た混合物を２分間沸騰し、次に５〜１７％ポリアクリルアミド ゲルで電気泳動した。次に蛋白を電気泳動的にニトロセルロースに移し［ナイマ ン及びエルダー、ヴアイロロンー、１２３．１８７〜２０５（１９８２）コ、ウ ェスターン　プロット法に続いて、次に細片を切断した。

このようにして調製したニトロセルロース片を次に、非得意的蛋白結合を禁止す るためにＰＢＳ中に３％ＢＳＡ、０．１％ポリオキシエチレン（９）オクチルフ ェニルエーテル（トリトン（商標）Ｘ−１００、ローム　アンド　ハースカンパ ニー、フィラデルフィア）を含む溶液で処理した。１・２００希釈されたマウス 抗血清の４ｍｌを次にニトロセルロース片でインキュベートした。

ＰＢＳ中０．１％　トリトン（商標）Ｘ−１００の溶液で３度洗った後、ニトロ セルロース片を１２５１でラベルしたスタフィロコッカス　アウレウス蛋白Ａ（ レーン２及び３）の１分当り１０６カウントで又はパーオキシダーゼを接合され たヤギ抗マウス血清（タボインク、バーリンガム、カリフォルニア）の１：１０ ００希釈でインキュベートし、そして再びＰＢＳ中０．１％トリトン（商標）Ｘ −１００で洗９た。パーオキシダーゼ接合体は、７．４のｐＨ値を持つトリス緩 衝液ＩＱｍｌ中に０．０００９％Ｈ，Ｏ□、０．００２５％３，３°−ジメトキ シベンチジンジヒドロクロライド（イーストマンーコダック社、ロチニスター、 ニューヨーク）を含む溶液で現像された。１２５Ｉラベルされた片を、クロネッ クス　ハイ−プラス（イー　アイ、デュポン・ド・ネモアス・アンド・コ９．ウ ィルミントン、プラウエア）を用いてＸＲＰ−１フイルム（イートマンーコダッ ク社、ロチニスター、ニューヨーク）上に露出し、−７０℃で４８時間スクリー ンを補力して現像した。

レーン１はアミドブラックで染色された全蛋白を含む。精製された血小板抽出物 は、ｓｉｓ関係ポリペプチド（Ｃ）（レーン２及び４）又はネガテブ対照として ｍｙｂ関係ポリペプチド（ｄ）（レーン３及び５）に対して生じた抗血清でプロ ーブされて示される。ＢＳＡ、オバルブミン、キモトリプシノゲン又はβ−ラク トグロブリンに基づく外部分子量基準は左方に示される。

第６図は、前述したのと同様のウェスターン　プロット法を用いてＰＤＧＦの存 在のための免疫学的評価を例示するためのオートラジオグラフの写真である。Ｐ ＤＧＦは、ナイマン、ネイチャー、３０７．１８０−１８３（１９８４）に記述 される手順に従って、電気泳動的蛋白分離の前に１０％２−メルカプトエタノー ルの存在（レーンＡ−Ｆ）又は不存在（レーンＧ−Ｌ）下で沸騰された。ＰＤＧ Ｆ−１のアミン末端の１２のアミノ酸残基（ＰＤＧＦ−１（１−１２）と呼ぶ） により誘発された二つのオリゴクローナル抗体含有抗血清をレーンＡ及びＧ１及 びレーンＢ及びＨで用いた。ＰＤＧＦ−２の中央部からのポリペプチド［ＰＤＧ Ｆ−２（７３−８９）及びポリペプチド（ｃ）と呼ぶ］（これはｐ２８ｓｉｓの 位置１３９−１５５のアミノ酸残基配列に対応する）で誘発された二つのオリゴ クローナル抗体含有抗血清をレーンＤ及びＪル−ンＥ及びＫで用いた。ＰＤＧＦ −２のアミノ末端の１７の残基［ＰＤＧＦ−２（１−１８）と呼ぶ］で及びカル ボキシ末端から３６−１６残基に位置するＰＤＧＦ−２の２０の残基［ＰＤＧＦ −２（１２６−１４５）と呼ぶ］、これはｐ２８ｓｉｓの位置１９１−２１０の 配列に対応する、により誘発されたオリゴクローナル抗体含有抗血清を、各々レ ーンＣ及び１、及びレーンＦ及びして用いた。蛋白に結合している抗体は、ナイ マン（前出）、及び後述の材料及び方法の部ぶ述べるようにラビット抗マウスＩ ｇＧ＋を用い、次１１！■でラベルされたスタフィロコッカスアウレウスプロテ ィンＡの１．０’ｃｐｍにより可視化された。

第７図は、ウニスターンプロット手段を用いる３つのセルライン中の７０．００ ０ダルトン蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。

ＳＳｖ形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーンＡ−Ｅ）、ＴＲＤＩ細胞（自然 形質転換されたＢａ１ｂ／３Ｔ３セルライン）（レーンＦ−Ｊ）およびＭＳＴＦ 細胞［ＦｅＬＶ−ＢおよびＦｅ５Ｖのスナイダーサイレン株で増殖性感染された ミンク肺ライン（ＣＣＬ６４）ｌ］（レーンに一〇）の各々からのレーン当り約 １０６細胞からの抽出物を、ニトロセルロースシートに移し、ウニスターンプロ ット法に付した。ＰＤＧＦ−１（１−１２）により誘発されたオリゴクローナル 抗体含有抗血清は、レーンＡ−ＣＳＦ−Ｈおよびに−Ｍに用いられた。ＰＤＧＦ −２（７３−８９）により誘発されたオリゴクローナル抗体含有抗血清は、レー ンＤＸＥ、Ｌ　Ｊ。

Ｎおよび○に用いられた。抗血清は、転移された細胞抽出物で免疫反応する前に 、１００マイクログラムのポリペプチドＰＤＧＦ−１（１−１２）（レーンＡ、 Ｄ、Ｆ、Ｌ　ＫおよびＮ）、ＰＤＧＦ−２（１−１８ＸレーンＢ、ＧおよびＬ） およびＰＤＧＦ−２（７３−８９）（レーンＣ，Ｅ、Ｈ，Ｊ、ＭおよびＯ）とイ ンキュベートした。蛋白は、第６図に記載されるように視覚化された。

第８図は、５ＳＶ−変形正常ラット腎臓および正常ラット腎臓（ＮＲＫ）細胞に よりそれぞれコンディションされた培養培地中、ｐ２Ｑｓｉｓの存在の免疫学的 評価を示すオートラジオグラフの写真である。　２５ミリリツトルの非濃縮培地 に均等の、５Ｓｖ−変形細胞（レーンＡ、ＣＳＥおよびＧ）またはＮＲＫ細胞（ レーンＢ、Ｄ、ＲおよびＨ）によりコンディションされた、濃縮培地からの蛋白 は、ニトロセルロースに移され、次いでウェスターンプロット法を行なった。） （レーンＡ−Ｄ）およびＰＤＧＦ−２（７３−８９ＸレーンＥ−Ｈ）により誘発 されたオリゴクローナル抗体含有抗血清と混合される。血清は、転移された蛋白 と免疫反応する前に、１００ミリグラムのポリペプチドＰＤＧＦ−２（７３−８ ９ＸレーンＡ、ＢＳＧおよびＨ）およびＰＤＧＦ−２（１−１８ＸレーンＣ，Ｄ ＳＥおよびＦ）とインキュベートされた。免疫反応は、第６図に記載されるよう に視覚化された。第８図の左側のマーカーｐ２０ｓｉｓは、ｐ２０ｓｉｓの位置 を示す。

第９図は、ヒト癌患者からの尿中のｓｉｓ及びｆｅｓ抗血清により誘発された又 はこれと関係する蛋白の存在の免疫学的評価を例示するためのオートラジオグラ フの写真である。この評価における液状の体試料は、材料及び方法の部ぶ述べる ようにして得られた尿濃縮物であった。濃縮された尿は、５〜１７％ポリアクリ ルアミドゲルで電気泳動され、次にニトロセルロース上で電気泳動された。

三人の供与者からの尿を２００倍濃縮し、透析し、そして各濃縮物の２０μｌを 電気泳動し、その中の蛋白を前述のようにニトロセルロースに移した。これら三 人の供与者は、直腸癌（レーンＡ１Ｄ、Ｇ及びＪ）、肝臓癌（レーンＢ、Ｅ、Ｈ 及びＫ）、及びエライン肉腫 （Ｅｗｉｎｇ’ｓ　ｓａｒｃｏｍａ）（レーンＣ，Ｆ、Ｉ及びＬ）を持っていた 。免疫化ポリペプチドでブレインキュベートされたｓｉｓ関係ポリペプチドＰＤ ＧＦ−２（７３−８９）により誘発されたオリゴクローナル受容体含有抗血清を レーンＤ−Ｆで用い、一方、ｖ−ｆｅｓＳＴ癌蛋白の位置７４４−７５９に位置 する配列に対応するｆｅｓ関係ポリペプチドでブレインキュベートされた同じ抗 血清をレーンＡ−Ｃで用いた。同様に、免疫化ポリペプチドでブレインキュベー トされた上記ｆｅｓ関係ポリペプチドにより誘発されたオリゴクローナル受容体 含有抗血清をレーンＧ〜１で用い、一方、上述のｓｉｓ関係ポリペプチドでブレ インキュベートされた同じ抗血清をレーンＪ−Ｌで用いた。オリゴクローナル受 容体と蛋白の間の免疫反応（結合している）は、第６図について記述のように可 視化された。尿濃縮物中で検出されたｓｉｓ及びｆｅｓ関係蛋白の位置は、左及 び右端に各々マーカー”Ｓｉｓ”及び“ｆｅｓ”により示される。

第１０図は、尿中のｒａｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグ ラフの写真である。

尿は、２５０倍（レーンＡおよびＢ）、３５倍（レーンＣ）、７０倍（レーンＤ ）、７５倍（レーンＥ）および３２５倍（レーンＦ）に濃縮した。尿を透析し、 ２０ミクロリツトルの各濃縮物を電気泳動し、その中の蛋白を前述のようにニト ロセルロースに移した。供与者は、正常（レーンＡＳＢおよびＦ）または以下の コンディション、３８週妊娠（レーンＣ）、リンパ腫（レーンＤ）および結腸癌 （レーンＥ）の一つを有するとして診断された。同一正常患者は、１４日間隔で 集収され、且つレーンＡ、ＢおよびＦで用いられた尿試料を提供した。

全尿試料を、ポリペプチドｆｅｓＳＴ（レーンＡ）の残基７４４−７５９、ポリ ペプチドｒａｓＨａ（レーンＢ）の残基９６−１１８またはポリペプチドｃ−ｓ ｉｓ（レーンＣ−Ｆ）の残基１３８−１５４でブレインキュベートしたｐ２１ｒ ａｓ（ポリペプチド１４２）残基９６−１１８で誘発された１０ミクロリツトル の抗ｒａｓｌｌｉ水を用いて評価した。

オリゴクローナルおよび蛋白間の免疫反応し結合している）は、第６図について 述べたように可視化された。尿濃縮物中に検出されたｒａｓ関連蛋白の位置は、 マーカーｒａｓによる左辺繰上に示される。

ｒａｓ癌遺伝子に関連していることが検出された蛋白は、ｒａｓ関連ポリペプチ ド１４２まで上げられたＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８６７９と名付けられたハイブリド ーマにより分泌されたモノクローナル抗体により検出される。この約５５にダル トンの蛋白は、レーンＡ中に検出され、その活性は、免疫ペプチド（レーンＢ） とのブレインキュベーションによりブロックされた。同一正常個体から集収され た尿は、２週間後間−蛋白を含む（レーンＦ）。この蛋白は、妊娠患者（レーン Ｃ）および癌患者（レーンＤおよびＥ）の尿から集収された。

第１１図は、ウニスターンプロット手段を用いる３つのセルライン中の２３にダ ルトン蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。図面 のレーンは、それぞれ、ミンク肺ライン肉腫ウィルス（ＭＳＴＦ）細胞（レーン Ａ−Ｆ）のスナイダーシーレン株により形質転換されたミンク肺セルラインまた は非感染ＭＳＴＦセルラインＣＣＬ（レーンＧ−Ｌ）からのレーン当り約１０６ 細胞からの抽出物を含む。各細胞抽出物は、ポリアクリルアミドゲルからニトロ セルロースシート上に移され、次いでウェスターンプロット手段に付される。

抽出物は、ｖ−ｒａｓＨＡ　（ｒａｓ　−２、レーンＡ、Ｇ）の残基５−１６に 対応するポリペプチド１４１又は、ｐ２１　ｒａｓ（ｒａｓ　−１、レーンＢ、 Ｈ）の残基９６−１１８に対応するポリペプチド１４２とブレインキュベートし たｐ２１（ｒａｓ−１、レーンＡ、Ｂ、Ｇ、Ｈ）の残基９６−１１８に対応する ポリペプチド１４２に上げられた抗血清を用いて評価した。

同じ細胞抽出物を、ｐ８５−ｆｅｓ（ｆｅｓ−１、レーンＣＳＤ、Ｌ　Ｊ）の残 基７４４−７５９又はｐ８５−ｆｅｓ（ｆｅｓ　−２、レー：／Ｅ、Ｆ。

Ｋ、Ｌ）の残基７４４−７５９に対応するポリペプチド１２１に上げられた抗血 清で評価される。抗血清は、転移された細胞抽出物と免疫反応する前にｆｅｓ− １ポリペプチド（レーンＤ、Ｊ）、ｆｅｓ−２ポリペプチド７４４−７５９（レ ーンＦ、Ｌ）又はｒａｓ−１ポリペプチド（レーンＣ，Ｅ、Ｌ　Ｋ）とブレイン キュベートされる。蛋白は、第６図について記載したように視覚化された。

第１２図は、自然形質転換マウス３Ｔ３セルラインＴＲＤ−１（レーンＡ、Ｂ） 又はヒトＴ−２４膀胱癌ライン（レーンＣ，Ｄ）からの上清中の分泌蛋白の存在 の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。上清は、分泌ｆｅｓ関 連蛋白の存在が評価されたセルラインは、血清の非存在下に成育され、生成の４ ８時間後集収された。３５マイクロリツトルの、１５００：Ｉ　Ｔ−２４セルラ イン上涜濃縮物または１０００：Ｉ　ＴＲＤ−１細胞濃縮物を、ポリアクリルア ミドゲル中で電気泳動し、次いでニトロセルロースに移した。

ｐ　８５　ｆｅｓ（ｆｅｓ−２）の残基７４４−７５９に対応するｖ−ｆｅｓＳ Ｔ合成ポリペプチドに対するマウス抗血清を評価に用いた。抗血清はｖ−ｆｅｓ ＳＴ（ｆｅＳ　１、レーンＡおよびＢ）の残基５１９−５３０に対応する合成ポ リペプチド又は抗血清にまで上げられるｆｅｓ−２ポリペプチドとブレインキュ ベートされた。

抗血清は、次いで転移された細胞上清と免疫反応される。蛋白は、第６図につい て記載したようにして視覚化される。

第１３図は、ウェスターンプロット手段を用いる細胞抽出物中のｒａｓ関連蛋白 の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。

約１０の自然形質転換マウスを３Ｔ３細胞の細胞抽出物をレーンＡ−Ｄに用いた 。３５ミクロリツトルの、マウス３Ｔ３　ＴＲＤ−１細胞からの４８時間上清の １５００倍Ｓ縮物をレーンＥＨに用いた。上清の蛋白は、ポリアクリルアミドゲ ルで電気泳動に付し、次いでニトロセルロース上に移される。ｖ−ｆｅｓＨＡの 残基９８−１１８に対応するポリペプチド１４２に対するオリゴクローナル抗体 含有抗血清は、非関連ｆｅｓポリペプチド（レーンＡＸＣ，Ｅ、Ｇ）又は免疫（ レーンＢＳＤ、Ｆ、Ｈ）に用いられるｒａｓポリペプチドとブレインキュベート される。蛋白は、第６図において記載したようにして視覚化された。

第１４図は、ウェスターンプロット手段を用いる細胞抽出物中のｒａｓ、　ｓｉ ｓまたはｆｅｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真 である。図面のレーンは、それぞれネコ肉腫ウィルス（Ｍ　Ｓ　Ｔ　Ｆ細胞）の スナイダーシーレン株で形質転換したミンク肺細胞のレーン当り約１０６細胞か らの抽出物を含む。

抽出物を、ｐ２１ｒａｓ（ポリペプチド１４２、レーン２）の残基９６−１１８ 、ＰＤＧＦ−２（ポリペプチド１１２、レーン１）の残基１−１８およびｖ−ｆ ｅｓ（ポリペプチド１２７、レーン３）の残基７４４−７５９に対応するポリペ プチドまで上げられた抗血清を用いて評価された。蛋白は、第６図について記載 されたようにして視覚化された。

第１５図は、上で記載したと同様のウニスターンプロット手段を用いる尿中のｓ ｉｓ、　ｆｅｓおよびｒａｓ癌遺伝子により暗号に書き出されるか、又は関連す る種々の蛋白の存在の免疫学的評価を示すオートラジオグラフの写真である。本 評価における溶液体試料は、材料および方法の部に記載したようにして得られた 尿濃縮物であった。濃縮した尿は、５−１７％ポリアクリルアミドゲルに電気泳 動し、次いでニトロセルロース上で電気泳動した。

８人の供与者からの尿を４０倍に濃縮し、透析し、そして２５ミクロリツトル（ 濃縮しない尿の１ｍｌと同等）を電気泳動し、その中の蛋白を前に記載したよう にニトロセルロースに移した。これらの供与者は、多発性骨髄（レーン１、パネ ルＡおよびＢ）胃癌（レーン２、パネルＡおよびＢル−ン１、パネルＣおよびＤ ）３５週妊娠（レーン３、パネルＡおよびＢ）リンパ腫（レーン４、ベイン（ｐ ａｎｅ）ＡおよびＢ）、胃癌（レーン１、ベインＣおよびＤ）、３６週妊娠（レ ーン２、パネルＣおよびＤ）、乳癌（レーン３、ペインＣおよびＤ）３９週妊娠 （レーン４、パネルＣエンド（ｅｎｄ）Ｄ）および乳癌（パネルＥ）を有する。

５ｉｓ（パネルＡおよびＢ）ｒａｓ（パネルＣおよびＤ）又はｆｅｓ関連ポ】） 。

ペプチド（パネルＥ）により誘発されたモノクローナル又はオリゴクローナル受 容体含有抗血清は、免疫ポリペプチドを評価するため各試料をプローブするのに 用いられた。２０ミクロリツトルの腹水（ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢにより誘 発され、以下に記載された、およびＰＤＧＦ−２の配列中、位置１−１８に対応 するｓｉｓ関連ポリペプチド１１２まで上げられたハイブリドーマにより誘発さ れた、それぞれペインＣおよびＤｌおよびＡおよびＢ）又はマウス血漿（ｆｅｓ 癌蛋白の配列中、位置７４４−７５９に対応するポリペプチドまで上げられた、 パネルＥ）は、１００ミクログラムの免疫ｒａｓポリペプチド１４２（パネルＡ ＳＤ、およびパネルＥのレーン２）、ｓｉｓポリペプチド１１２（パネルＢおよ びＣ）またはｆｅｓポリペプチド（パネルＥル−ン３）と、ｅｒｂＢ（パネルＥ ル−ン３）により暗号に書き出された位置３６６−３８１に対応するポリペプチ ド１７１と、またはａｂｌ（パネルＥル−ン４）の位置５９０−６０５に対応す るポリペプチド３１２と３７℃で３０分間ブレインキュベートされプレインキニ ベーションに続いて、試料は、ＰＢＳ中、７．４のｐＨ（［で３パーセントＢＳ Ａ、ｏＪ１バーセントドυトン（商標）Ｘ一様にして評価した。結合は、第６図 で記載したようにして視覚化した。

第１６図は、尿中、ｒａｓ、　ｓｉｓおよびｆｅｓ関連蛋白の存在の免疫学的評 価を示すオートラジオグラフの写真である。

尿は、１ケ月の間隔で、活性乳癌を有するとして既に診断された供与者から集取 した（レーン１．７．２．５．８．３．６．９、パネルＡ）。尿を集め、透析し 、１ｍＩ非濃縮尿の相等量をパネルＡの各レーンに適用した。

パネルＢにおいて、パネルＡ、レーン３．６又は９に用いた同一試料の一部を、 下記等量の非濃縮尿に適用したｃ　１ｏｏｏミクロリツトルルーン１）、５００ ミクロリツトル（レーン２）、２５０ミクロリツトル（レーン３）、１２５ミク ロリツトル（レーン４）、６０ミクロリツトル（レーン５）、３０ミクロリツト ル（レーン６）、１５ミクロリツトルルーン７）、７５ミクロリツトル（レーン ８）。

試料は、ｒａｓ（位置９６−１１８、ポリペプチド１４２、パネルＡ、レーン１ −３、パネルＢ）、ｆｅｓ（位置７４４−７５９、ポリペプチド１２７、パネル Ａル−ン４−６）又はｓｉｓポリペプチド（ＰＤＧＦ−２位置１−１８、ポリペ プチド１１２、パネル、へ、レーン７−９）で、合成ペプチドとブレインキュベ ーションを行なわない以外は第１５図に記載したと同様にして調製しプローブし た。

第１７図は、尿中のｒａｓおよびｆｅｓ関連蛋白の存在の免疫学的評価を示すオ ートラジオグラフの写真である。評価される尿試料の供与者は、再発の乳癌（レ ーン１．２）を有すると診断されたが又は正常個体（レーン３−８）であった。

ｒａｓ関連蛋白（パネルＡ）およびｆｅｓ関連蛋白（パネルＢ）の評価は、第１ ６図に記載したようにして実施した。評価される試料は、乳癌（レーン３）から の臨床解除にある患者、３ケ月後、乳癌が再見さｉた（レーン２）ときの同一患 者および正常女性（レーン３−５）がらの尿で、試料は、３日置きに集取し、正 常女性は１２時間置きに採集しくレーン６−７）および正常男性（レーン８）で あった。

第１８図は、癌を有する供与者からの尿試料中のｒａｓ、　ｆｅｓおよびＳｉｓ 関連蛋白の検出を示すオートラジオグラフの写真である。乳癌（レーン１）、前 立腺癌（レーン２）、前立腺小結！ｒｉ（レーン３）又はリンパ腫（レーン４） の供与者からの尿を、採集し、第１６図で記載したと同様に、５ｉｓ（パネルＡ ）、ｒａｓ（パネルＢ）又はｆｅｓ（パネルＣ）に対 する抗血清を用いてプローブした。レーン１．２中にあるｐ　５６　ｓよりわず かに遅く移動する横じまは、これらの試料中における過剰量のアルブミンを示す 。増加レベルのｐ”ｓｉｓおよびｐ”ｓｉｓは、パネルＡル−ン１．２中の増加 したアルブミンレベルと関連するけれども、乳又は前立腺癌を有する供与者から の他の尿試料は、上昇したアルブミンレベル（データ提示せず）の不存在下にお ける増加レベルのｓｉｓ関連蛋白を含む、パネルＢ、レーン１−３中の最も遅い 移動横じまは、ｐ　Ｉ　ＯＯｒａｓを確認する。一方、パネルＢレーン１−４中 のＬ鎖よりわずかに速い横じまは、ｐ”ｒａｓを確認する。

第１９図は、妊娠供与者からの尿中の癌遺伝子関連蛋白の検出を示すオートラジ オグラフの写真である。

妊娠の最終月の間１週間間隔で採集した同一固体からの４つの尿試料を、ｓｉｓ 関連ポリペプチド１１２（ＰＤＧＦ−２位置１−１８、パネルＡ）、ｒａｓポリ ペプチド１４２（位置９６−１１８、パネルＢ）又はｆｅｓポリペプチド１２７ （位置７４４−７５９、パネルＣ）に対する抗血清でプローブした。パネルＣの 過剰暴露は、ｐ”ｆｅｓレーン３および４）およびｐ”ｆｅｓ（レーン４）の存 在を示す。Ｌ鎖横じまよりわずかに速く移動するか又はゲルの底の（パネルＣル −ン２−４）の蛋白は、ｔｅｓペプチドに対するマウス抗血清で検出された。加 えて、１５０．０００ダルトンの蛋白も、ｆｅｓペプチドに対するマウス抗血清 で検出された。尿試料は１週間間隔で採集した。

第２０．２１および２２図は、プロティンキナーゼ活性を有する癌蛋白の３つの 保存された部分のアミノ酸配列を示す表である。これらの部分は、第２０．２１ および２２中、保存されたキナーゼ部分として、それぞれ命名される、プロティ ンキナーゼ活性を有する癌蛋白をプログラムしている癌遺伝子は、左手カラムに 普通の記号により示した。中央のカラムは、Ｎ末端から、保存されたアミノ酸残 基配列の癌蛋白ポリペプチド配列中の位置を確認−する。右手カラムは、左から 右に、およびＮ末端からＣ末端の方向に、これらの保存された部分のアミノ酸残 基配列を示す。アミノ酸残基配列も、本発明のモノクローナル受容体の生成を誘 発するだめの免疫源として有用なポリペプチドの配列である。

第２３図は、５１コントロール（正常供与者）の尿試料および種々の悪性を伴う 供与者からの尿試料中の癌遺伝子関連蛋白の検出の度数を示す表である。尿中の 癌遺伝子関連蛋白の量は、イムノプロット法を用いて評価し、４つのカテゴリー 、検出不可能、検出可能、５から１５倍上昇および１５倍上昇より大の一つに置 いた。

ｐ”ｒａｓは、新生腫瘍疾病を持っている供与者からの全試料の約７０パーセン トに検出された。しかしながら、同様の度数は、明らかに正常な個体に見出され た。ｐ２Ｉｒａｓの最もきわだった上昇は、子宮および胃癌、同様にミニローマ および奇胎（ｍｏｌａｒ）妊娠の供与者からの試料に検出され、その全ては、試 料の少くとも３０パーセントに、この蛋白の１５倍上昇よりも大であった。

第２４図は、妊娠供与者からの２６０尿試料中の癌遺伝子関連蛋白の種々のレベ ルの検出を反映するデータの表である。試料は、妊娠の３ケ月期に従ってグラフ 分けした。多重尿採集物は、多（の供与者から得られた。評価は、以下の材料お よび方法の部に記載した手法および方法に従って実施された。乳癌を有する供与 者のザブセットを持つので、以下に論するが、非常に高レベルのｐ”ｒａｓが、 妊娠の経過中ずっと、妊娠供与者のグループに検出された。ｓｉｓおよびｆｅｓ 関連蛋白は、妊娠の進行とともに増加した。

ｐＨｒａｓのレベルは、妊娠の幾つかの過程で劇的に変化した。対象的に、ｐ５ ５ｒａｓのレベルは、正常又は乳癌供与者からの多重試料に検出し、ｒａｓ関連 蛋白の濃度は、幾らかの供与者では、１週間に１５倍以上大きく増加した。

３つのｓｉｓ関連蛋白の濃度は、妊娠の最終月はずっとほとんど同じであった。

ｐ３５ｆｅｓは、妊娠の最終２週間に検出され、一方ｐ”ｆｅｓは、最終の週だ けに検出された。

分娩後６週間採集した尿試料は、これらのｓｉｓ関連蛋白の上昇した濃度を含有 し続けたが、ｒａｓおよびｆｅｓ関連蛋白は正常にもどった（データ提示せず） 。

第２５図は、ｆｅｓにより形質転換したミンク肺細胞イムノプロットを示す。ミ ンク細胞抽出物は、ｆｅｓ　（レベルＡ−１）又はｅｒｂＢ（レベル、Ｊ、Ｋ） に対する種々の抗体でプローブした。

第２６図は、ヒト類表皮癌細胞のイムノプロットを示す。ヒト類表皮癌セルライ ンの抽出物は、第１図に用いたと同じ抗体でプローブした。

第２７図は、妊娠糖尿病患者からの濃縮尿試料のイムノプロットを示す。妊娠糖 尿病患者からの濃縮尿試料は、第１図に用いた抗体第２８図は、子宮内膜腫瘍抽 出物のイムノプロットを示す。子宮内膜腫瘍の抽出物、（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番 号０７１−７８１４７３−１）、は、ｆｅｓ（レーンＡ−Ｈ）又はｅｒｂＢ（レ ーンＩ−Ｌ）に対する抗体でプローブした。レーンＡ−Ｄ中の抗体は、エリサ評 価においてレーンＥ−Ｈのそれらとは異なる反応性パターンを与える。レーンＩ およびＪは、ｖ　−ｅｒｂ　Ｂの領域に向けられ、そしてレーンにおよびＬは、 同じ癌遺伝子に対し異なる反応性パターンを生ずる。

第２９図は、胸肉腫抽出物のイムノプロットを示す。乳肉腫（ＮＩＨ受は入れ番 号１２１−９６０−１）は、リンパ節まで転移（ｍｅｔａｓｔｅｒｉｚｅ）　Ｌ ／たが、その抽出物は、第４図に用いた抗体でプローブされた。

第３０図は、乳肉腫、（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号３ｌ−１４４５９）のイムノプ ロットを示し、その抽出物は、第４図に用いた抗体でプローブした。

第３１図は、子宮肉腫、（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号３ｌ−１３５３０）のイムノ プロットを示し、その抽出物は、第４図に用いた抗体でプローブした。

第３２図は、胸肉腫（ＮＩＨ受は入れ番号１２１−９６０−１）、それはリンパ 節まで転移（ｍｅｔａｓｔｅｓｉｚｅ）　Ｌ／たが、のイムノプロットを示す。

この転移性乳肉腫抽出物は、ｒｏｓ（レーンＡ）、ｆｅｓ（レーンＢ）、ＢＴＧ Ｆ（レーンＣ−Ｇ）、ｒａｓ（レーンＨ−Ｊ）およびｅｒｂＢ（レーンに−Ｎ） に対する抗体でプローブした。

第３３図は、ＮＩＨ肉腫３１−１８２６５から誘導された転移性子宮癌のイムノ プロットを示す。この癌は網まで転移し、第８図に用いた抗体でプローブでした 。

第３４図は、転移性結腸癌（Ｎ２Ｈ受は入れ番号３ｌ−１８１５２）、これはリ ンパ節まで転移した、のイミノプロットを示す。本抽出物は、第８図に用いた抗 体でプローブした。

第３５図は、転移性子宮癌（Ｎ２Ｈ受は入れ番号０３１−１０１２８−１）のイ ムノプロットを示す。子宮癌、それは網まで転移したが、この本抽出物は、第８ 図に用いた抗体でプローブした。

第３６図は、膵臓からのリンパ腫（Ｎ２Ｈ受は入れ番号０２１−５００７３−１ ）のイムノプロットを示す。本抽出物は、第８図に用いた抗体でプローブした。

第３７図は、乳癌抽出物（Ｎ　Ｉ　Ｈ受は入れ番号０３１−１２３９−１）のイ ムノプロットを示す。本抽出物は、第８図に用いた抗体でプローブした。

第３８図は、直腸肉腫抽出物（Ｎ２Ｈ受は入れ番号０３１−１２３９−１）のイ ムノプロットを示す。本抽出物は第８図に用いた抗体でプローブした。

第３９図は、転移性肺癌（Ｎ２Ｈ受は入れ番号０４１−７８２９７−１）のイム ノプロットを示す。本肺癌、これはリンパ節まで転移した、この抽出物は、第８ 図に用いた抗体でプローブした。

第４０図は、ラット線条体のイムノプロットを示す。ラット線条体の抽出物は、 １８日令胎児から取り、２日令、１８日令、７０日令および１年令ラットを、Ｈ ／Ｎ−ＲＡＳ（レーンＡ）、Ｈ−ＲＡＳ（レーンＢ）、ＭＭＣ（レーンＣ）、ｖ −ｍｙｂ（レーンＤ）、１ｎｔ−１（レーンＥ）および２つの異なるｓｉｓ誘発 抗体（レーンＦおよびＧ）でプローブした。

第４１図および４２図は、ＮＩＨ寄託機関に寄託のセルラインから誘導された肉 腫抽出物の反応性パターンを示す表である。抽出物は、種々の抗体でプローブし 、反応結果のパターンは、癌遺伝子生成物の存在およびレベルで点を与えた。得 点は、イムノプロット技法を用いて導かれる横じまの強さを基準にした。

第４３図は、化学療法を受けている妊娠栄養膜患者の尿中癌遺伝子関連蛋白の同 期出現（ａｓｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）を示す。化学療 法を受けている妊娠栄養膜患者からの連続的尿試料は、ｓｉｓ残基（レーンＡ） Ｈ／Ｎ−ＲＡＳ残基（レーンＣ）、ＭＹＣ残基（レーンＤおよびＥ）、ｓｒｃ残 基（レーンＦおよびＧ）および１ｎｔ−１残基（レーンＨ）に何けられた抗体で プローブした。

第４４（Ａ）図。正常、健康な対照の血清のイムノプロット。１００ｒｒｌの血 清の試料を、以下の腫瘍遺伝子により予言されたペプチド配列に対する抗体でプ ローブした：　５ｉｓ（レーン１）、ｆｅｓ（レーン２．３及び１５）、β−Ｔ ＧＦ（レーン４及び５）、１ｎｔ−１（レーン６及び１２）、ｍｙｂ（レーン７ ）、５ｒｃ（レーン８）、ｃ　ｍｙｂ（レーン９．１３及び１４）、ｍｏｓ（Ｌ ／　−ン１０　）、及び）（−ｒａｓ（レーン１１及び１６）。

第４４（Ｂ）図。多発性発癌物質暴露（ＰＣＢ、アスベスト、喫煙）を伴うが、 臨床上、検出可能な悪性疾病のない個人の血清のイムノプロット。１００μｔの 血清の試料を、第１（Ａ）図に定義した腫瘍遺伝子により予言されたペプチド配 列に対する抗体でプローブした。

正常、健康な対照には見られない、レーン１１及び１６における顕著なより低い 帯に注意されたい。これらの帯は、ノ１−ヴエイ（Ｈａｒｖｅｙ）　ｒａｓ腫瘍 遺伝子−コード化Ｐ２１に対応する。

第４５図。発癌物質に多発性暴露で、（ａ）結腸ポリープの臨床上の発現前１８ カ月で、（ｂ）ポリープ除去後６週間の患者の血清のイムノプロット。（ｂ）に は見られない、（ａ）におけるｒａｓコード化Ｐ化工２１蛋白の存在に注意され たい。

発明の詳細な説明 本発明は、癌蛋白全部リガンドに対するモノクローナル受容体分子、かかる受容 体を誘発又は生じさせる一般的方法、及びこれら受容体を用いる製品及び方法に 関する。本明細書でしばしば用いる言葉を以下で定義する： 受容体−受容体に、リガンドに結合する生物学的に活性な分子である。本発明の 受容体分子は、完全な全体の抗体又はほぼ完全な抗体又は抗体のイディオタイプ 含有ポリアミド部分である。受容体分子の生物学的活性は、少くとも生物学的ｐ Ｈ値及びイオン強度で水性媒体中で混合されると抗原性リガンドに受容体が結合 することにより証明される。好ましくは受容体はまた、約５〜約９のｐＨ値範囲 及び蒸留水のイオン強度ないしＩＭの塩化ナトリウムのイオン強度のようなイオ ン強度で抗原リガンドに結合する。

抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド部分（抗体結合部位）は、イディオタイ プを含み、リガンドに結合し、がっ抗体のＦａｂ及び（ａｂ゛）２部分を含む抗 体分子の部分で、当業界で周知であり、はぼ完全な抗体への各々パパインとペブ ンンの周知法での反応により作られる。たとえばチオフィロポラスとディキラン への米国特許Ｎｏ、４゜３４２．５６６を参照されたい。完全な抗体が好ましく 、本発明で考えられる受容体分子の例として用いられる。

モノクローナル受容体−モノクローナル受容体（Ｍａｂ）は、唯一種の受容体分 子のみを分泌するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンにより作られた 受容体である。ハイブリドーマ細胞は、抗体生産細胞と骨髄腫又は他の自己永続 する細胞系統から融合される。そのような受容体は最初にコーラ−及びミルステ ィン、ネイチャー又５６．４９５−４９７（１９７５）により記述され、この記 述は引用することによりここに含められる。

オリゴクローナル受容体−オリゴクローナル受容体は、中庸な長さ、たとえば約 ７〜約４０、より好ましくは約１０〜約３０のアミノ酸残基のポリペプチド上の 一以上のエピトープにより誘発されこれにより結合する受容体である。オリゴク ローナル受容体は通常、−以上の細胞により生産された受容体の混合物である。

そのように作られたオリゴクローナル受容体は通常、蛋白鎖（単数又は複数）の 長さ全体に亘りエビ−ドブ領域を持ちうる全蛋白分子に対して生じたポリクロー ナル受容体よりも、その結合においてよりエピ−ドブ特異性である。ここで有用 なポリペプチドで免疫化された動物は、オリゴクローナル受容体（抗体）を含む 血清を作る。

リガンド−リガンドは、本発明の受容体がそれに結合するところの蛋白又はポリ ペプチドである。

対応する（又は相当する）一対応する又は相当するという言葉がアミノ酸残基配 列と関係して用いられるとき、第一のポリペプチド又は蛋白のアミノ酸残基配列 が第二のポリペプチド又は蛋白に含まれるアミノ酸残基配列に十分に類似してお り、従って第一のもの（たとえば抗原合成ポリペプチド）に対して生じた受容体 が第二のもの（たとえば癌蛋白）と水性組成物中で混合されたとき免疫学的に結 合するものであることを意味する。かかるポリペプチドおよび／又は蛋白は、ま た、同種エピトープを含んでおり、それゆえ少くとも約６から約８、例えば７の 残基の同種配列を共通にしているということができる。

対応する第−及び第二のポリペプチド又は蛋白のエピトープ含有アミノ酸残基配 列は、最も好ましくは同一である。しかし、エピトープ内におけるアミノ酸残基 の変更、好ましくは保守的変更、及び残基の削除又は付加を行うことができ、第 一のポリペプチド又は蛋白に対する受容体と第二のものとの周知のような架橋反 応をなお可能とする。アミノ酸残基における保守的変更は周知であり、リジン（ Ｌｙｓ：ｋ）とアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）の間、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ） とグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）の間、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）とイソロイシン（ Ｉ　ｌｅ；　Ｉ　）の間などの残基の交換が含まれる。

本発明で有用なポリペプチドは、蛋白のアミノ酸残基配列の一部に対応するアミ ノ酸残基配列を持つとしばしば記述される。そのようなポリペプチドは好ましく は、担体にポリペプチドを結合する又はリンクするために用いられるＣｙｓ残基 のような末端残基に加えて同定的に対応するアミノ酸残基のみを含む。蛋白中の 残基に対応しない追加的アミノ酸残基がポリペプチド末端に存在してもよく、し かしそのような残基の使用は、本発明では考慮はされるが通常無駄であり、かつ 好ましくない。

同様に、蛋白は、ポリペプチドのアミノ酸残基配列がその一部に対応するところ のアミノ酸残基配列を持つと記述される。この云い方は、ポリペプチドと蛋白の 間め上述と同じ関係を示すことを意図している。

個々のアミノ酸残基のフルネームは、周知の三文字略記と同様に、ときに用いら れる。アミノ酸残基のための一文字記号が最もしばしば用いられる。下記の対応 表は、ここで挙げられる各アミノ酸残基のフルネーム、ならびに略記及び記号を 示す。

アミノ酸　三文字略記　−文字記号 アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ アスパラギン＋アスパラギン酸　Ａｓｘ　Ｂグルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グルタミン＋グルタミン酸　Ｃ１ｘ　Ｚグリシジ　Ｇ１ｙＧ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ スレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリブトフォン　Ｔｒｐ　Ｗ （ニー・エル・レーニンガー、バイオケミストリー；ワースパブリッシャーエヌ 、ワイ７．エヌ、ワイ、１９７０年）１、モノクローナル受容体の製造 上述したように本発明は、中庸な長さたとえば約７〜約４０の残基、好ましくは 約１０〜３０の残基の免疫原性ポリペプチドに結合し、ならびにそのアミノ酸残 基配列の一部がこのポリペプチドのアミノ酸残基配列に対応するところの蛋白分 子リガンドと接合するモノクローナル受容体分子を考慮する。本発明のモノクロ ーナル受容体は、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたこのポリペプチドの 接合体の使用により生じる又は誘発される；ここで免疫原ポリペプチドは、蛋白 分子リガンドのアミノ酸残基配列の一部に対応する中庸な長さのアミノ酸残基配 列を含む。

モノクローナル抗体のエピトープ局在化は技術的問題を持つ。全バクテリア遺伝 子生産物に対するモノクローナル抗体は、自然の又は変性した二つの異るタイプ の免疫原により作ることができる。自然の蛋白の使用は、精製及び続くエピトー プ遺伝地図作製全部に関して最も重大な技術的問題を持つ。自然蛋白を用いるこ との主な利点は、目標蛋白の生理学的機能をブロックするモノクローナル抗体の 生産である。

バクテリアで作られた癌遺伝子生産物は、より高度の生体で合成された遺伝子生 産物と典型的に、構造的にでなく同一である。この差異の直接の証拠は、ｓｉｓ 遺伝子生産物の分析により与えられる。

哺乳動物細胞においで、ｐ２８ｓｉｓはｐ２Ｑｓｉｓへと急速に解離される対照 的にバクテリアｐ２８ＳｉＳは解離されず、また二量体を形成もしない。バクテ リア又はトリ細胞で作られた他の癌遺伝子生産物の間の差異の間接的証拠は、大 腸菌生産蛋白生産物に対して生じたモノクローナル抗体は形質転換されたトリ細 胞で合成された蛋白に対してよりも免疫原にはるかにより効果的に結合する（免 疫原は変性されているにもかかわらず）という観察により与えられる。

種々の癌遺伝子の配列が、付加的モノクローナル受容体の出現および分離のため の付加的ペプチド合成に有用でありうるプロトオンコジーン配列の付加的部分を 確認するための基礎を提供できるように思われる。

従って、変性蛋白の精製は技術的に比較的容易であるが、得られる抗血清はバク テリア遺伝子生産物に特有の１残（コンホメーション）を認識するかも知れない 。この観察は、エピトープ地図作成研究のための重大な技術的困難性を持つ。

抗体のエピトープを定義するためのアプローチは、部分的蛋白分解により作られ た蛋白フラグメント又はサブゲノムフラグメントの発現を利用する。蛋白フラグ メントを用いるエピトープの地図作成はナイマンとブロク、ナトル、アクト、サ イ、ニーニスニー７７．４５２４（１９８０）：により最初に示されるが、いく つかの消化物がモノクローナル抗体の大きなパネルにより評価される場合でさえ 結合部位のおおよその決定ができるだけであった。すなわち、蛋白フラグメント を用いても免疫化は結合部位の定義を制限する。また興味を持たれた領域がモノ クローナル抗体を誘発するという保証はない一方、本発明で行われるような既知 アミノ酸残基配列の適当なポリペプチドによる免疫化は、良く定義された領域、 すなわち免疫化ポリペプチドの配列に対応する領域と免疫反応する抗体（受容体 ）の生産を保証する。

エピトープの地図作成は、一つのアミノ酸によるエピトープの変化はかなり異な る反応性を生むかも知れないことを示唆し、一方、他の研究は、エピトープ内に おいて−又は二以上のアミノ酸残基が異る場合に交叉反応性が得られることを示 す。さらに、マウスの同じ系統の同じ合成ポリペプチドによる免疫化は、血清中 で検出される異る反応性を生むかも知れない。

合成ポリペプチドで作られたハイブリドーマはまた、認識が配座的に大いに独立 であるので、種々の反応条件下で完全な全体蛋白と反応するモノクローナル受容 体を作る。従って、ウェスターンプロット、ドツトプロット、固定細胞および固 定組織及び細胞抽出物、羊水のような体液、及び濃縮した又はそのままの尿を自 然の蛋白と同様に評価できる。また、エピトーク中の既知の正確に定義されたア ミノ酸残基は、単一のアミノ酸変化を区別できる抗体の単離を可能にし、従って 関係する蛋白の保存された領域における限られた変化の重要性を決定する手段を 与える。

合成ポリペプチドに対するモノクローナル抗体はまた、蛋白相互作用の部位を地 図化する手段を提供する。ｐｐ６０ｓｒｃに伴われた分子の差別共沈澱が報告さ れており、そのような相互作用に関与するｓｒｃ蛋白の領域の同定を示唆してい る。

すなわち、免疫化するポリペプチドの配列により定義される領域を伴う免疫原合 成免疫反応を伴うモノクローナル抗体（受容体）の往産の誘発は、対応する免疫 涼感蛋白の単離の分離又はその癌蛋白のエピトープ部位の同定のために複雑な手 段を必要としないことを保証し、配座（コンホメーション）に独立に癌遺伝子生 成物を認識する受容体を作る。これら総ては、そのような受容体の利用を種々の 研究に広げるものである。

動物宿主保護はワクチンにおける作用剤として免疫原ポリペプチドを用いること により可能であることが示されたが、ハイブリドーマ抗体（Ｍａｂｓ）を高収率 で作るためにそのような免疫原ポリペプチドを用いる可能性は、従来ありそうだ とは考えられていなかったことを先に述べた。各Ｍａｂは唯一つの特異性を生む 単一細胞から誘導されるので、完全な蛋白分子をも認識する抗ポリペプチド抗体 を作るクローンの数対クローンを認識するポリペプチドの総数の比はポリペプチ ドの真の配座頻度の合理的推定を与えることができる。

ここで述べる結果は前述の確立モデルとは逆であり、ここで用いられた中庸な長 さのポリペプチドの頻度は自然の蛋白と類似の配座を仮定して、従来予想された ものよりはるかに高い、ハイブリドーマのＭａｂがこれに対して生じた合成ポリ ペプチド及び完全な分子の双方を認識するところのハイブリドーマを作る頻度は 、確率モデルにより予想されるよりも約４のオーダー（約１０．０００倍）大き い従来の研究者は、これらポリペプチドを認識する抗体をつくるために免疫原ポ リペプチドを数１０年間用いてきた。加えて、モノクローナル抗体の製造に関す る先に引用したコーラ−とミルスティンの文献は１９７５年に刊行された。この 年、１９７５年以後、アルンハイターら、ネイチャー（ロンドン）２９４．２７ ８−２８０（１９８１）は、ポリペプチド免疫原を用いてモノクローナル抗体を 作る試みを記述した。先に述べたように、アルンハイターらの結果は、三匹の免 疫化したマウスのヒ臓の使用を必要とし、大きな５６−ｍａｒポリペプチド、な らびに蛋白の配列にポリペプチドが対応するところの蛋白を認識する唯一つのＩ ｇＣタイプモノクローナル抗体を得た点で失敗と見られるべきである。

免疫原、及び蛋白リガンドのアミノ酸配列に免疫原ポリペプチドが部分的に対応 するところの蛋白リガンドの両者を認識する免疫原ポリペプチドから作られたモ ノクローナル受容体の製造に関する報文が比較的少ないのは、少なくとも二つの 要因によると考えられる。第一に、少しの、もしあれば、モノクローナル抗体し か作られないと予測する確率モデルに従う。支配的であった考え方がある。第二 に、アルンハイターらのような研究者はモノクローナル受容体の製造に適当な方 法を持っていなかったことがある。なぜならポリペプチドに対して生じた本発明 のモノクローナル受容体は、完全蛋白に対して作られたモノクローナル抗体から 別なやり方で作られるがらである。

すなわち、免疫原ポリペプチド、及び蛋白リガンドのアミノ酸残基配列にこのポ リペプチドが部分的に対応するところの蛋白りカントの両者を認識する１ｇクラ スモノクローナル受容体を成功裡に作るために、以下に概要を述べる段階で逐行 しなければならない。

免疫原ポリペプチド単独か又は担体に結合（リンク）されたポリペプチドの接合 体が作られる。このポリペプチドは、約７〜約４０、好ましくは約１０〜約３０ のアミノ酸残基配列のような中庸長さのアミノ酸残基を持つ。免疫原ポリペプチ ドのアミノ酸残基配列は、癌蛋白のような蛋白分子リガンドのアミノ酸残基配列 の一部に対応する。免疫原ポリペプチドはりガントとして単独で用いうるが、キ イホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体、ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなアルブミン、赤面細胞たと えばヒツジ赤血球、張線トキソイド及びエデスチン（ｅｄｓｔｉｎ）、ならびに ポリアミノ酸たとえばポリ（Ｄ−リジン＝Ｄ−グルタミン酸）、などに結合され た接合体としてポリペプチドを用いることが好ましい。

ポリペプチドの免疫原性及び抗原性は、ポリペプチドをキイホールリンペットヘ モシアニン担体に結合して接合体とし、次にそのように得た接合体を用いてマウ スを免疫化することによりテストできる。免疫化するポリペプチド又は接合体は 、生理学的に許容しつる希釈剤たとえば生理学的食塩水、リン酸塩緩衝食塩水ま たは当業界で周知の他のものの中に溶解又は分散される。後述する補剤（アジュ バント）も免疫化に用いる接合物に含められる。

有用なポリペプチドは、１ケ月に３回の免疫化の後に、少くとも１：４００希釈 のポリペプチドに対する免疫化されたマウスのオリゴクローナル受容体含有抗血 清の５０パ一セント結合滴定量（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｉ　ｔｅｒ）を与えるのに 十分なほど免疫原的及び抗原的である。ここで各免疫化は、接合体中に少（とも 約１ｏ１．１ｇ１好ましくは少（とも約５０１．ｔｇのポリペプチドを含み、第 一回の免疫化には完全フロインドアジュバントを、後には明ばんアジュバントを 用いる。

このテストは免疫原として所与のポリペプチドの使用前に行われる必要はないが 、しかしポリペプチドが望むモノクローナル受容体を作るのに有用かどうか見る 予備スクリーニング手法としてそうすることが好ましい。予備スクリーニングと して用いられるかどうかに拘らず、免疫原としてここで有用なポリペプチドは上 述の免疫化剤を用いて上述の滴定量を与える。

免疫原ポリペプチドの供与後に、マウス、ラビット、ヤギ、ウマのような哺乳動 物は、免疫原ポリペプチド又は担体に結合されたポリペプチドの接合体により過 免疫化され、受容体分子が少くとも１：４００希釈のポリペプチドに対して５０ パ一セント結合滴定量を示すところ過免疫血清を与える。すなわち、ポリペプチ ドの免疫原性を予備テストしたいのと同じ動物たとえばマウスを、Ｍａｂを生ず るために用いることができる。

予備テストで用いられるのと同じ動物をＭａｂ誘発のために用いることが特に好 ましい。この好ましさは、上述の５０パ一セント結合滴定量が一度達成されると 、偶然の実験室での不幸な事故たとえば細胞培養物の汚染又はこれらの培養物の 破壊を除いて、抗体生産細胞の源としてこの動物のヒ臓を用いて望む特異生のハ イブリドーマ分泌モノクローナル抗体を作ることがほとんど保証されることによ る。

過免疫状態を与えるのに必要な免疫化規制（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｇ ｉｍｅｎ）は、知られているようになかんず（動物タイプ、動物体重、ポリペプ チド及び担体（もし用いられるなら）、アジュバント（用いられるなら）の免疫 原性及び量、及び所定の時間に投与される免疫化の数の関数であることが述べら れてる。少くとも１：４００希釈の５０パ一セント結合滴定量を得るための上述 の免疫化剤は、テストマウスにおいて過免疫状態を作り、他の動物において過免 疫状態を誘発するだめの比例的基礎として用いることができる。三回の免疫化は 過免疫状態を作るために必ずしも必要でないが、しかし有用なポリペプチドにと って１ケ月間でのそのような三回の免疫化がその状態を作るために十分であり、 さもなければポリペプチドは本発明のハイブリドーマ及びそのモノクローナル抗 体の高収率生産のために十分に免疫原的でないことが更に述べられる。

過免疫化された動物においてそのように作られた血清オリゴクローナル受容体分 子はまた、免疫原ポリペプチドがアミノ酸残基配列においてその一部に対応する ところの蛋白分子リガンドに結合する。結合評価は、後述の材料及び方法の部で 述べられる。蛋白分子リガンドの純粋サンプルをこれら評価で用いる必要がなく 、むしろ細胞抽出物又は組織調製物たとえば蛋白リガンドを含む顕微鏡スライド を用いうることが述べられる。

過免疫化された動物は維持される；すなわち更に免疫化を与えることなく、少く とも１：４００希釈の５０パ一セント結合滴定量を作る免疫化の投与の後生くと も約３０日間生き続けさせられる。言いかえれば動物は最初に過免疫状態を与え るよう免疫化され、次に過免疫が後退するのを許す。

結合作用の低減はマウスにおいて典型的には１〜約５ケ月かかる。結合滴定量の この低減は、免疫原が再び導入されたときに、準備された（ｐｒｉｍｅｄ）芽細 胞が激しい反応を始めることができるようになる期間に対応すると考えられる。

免疫原ポリペプチド又はその接合体を用いて、静脈内注射によるこのような促進 免疫化が維持期間の完了後、たとえば最後の付与の少くとも３０日後に動物に与 えられる。促進された動物のヒ臓細胞又はリンパ細胞のような抗体生産細胞は、 次にハイブリドーマ細胞を作るために、効果促進投与の日から約３〜約５日以内 に同じ動物タイプ（種）からの骨髄腫細胞系統と融合される。効果促進は、芽細 胞の成熟をこれら細胞がほぼ最適の量のポリペプチドに対するオリゴクローナル 抗体を分泌する点まで刺激すると考えられる。

他の細胞系統も用いうるが、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１ ）、ヒボキサンチン−チミジン（ＨＡＴ）感受性、骨髄腫セルラインがマウスヒ 臓細胞との融合に用いるのに好ましい。

融合のためのこのＨＡＴ系統を用いる詳細は、後記の材料及び方法の部に記載さ れる。ハイブリドーマ細胞は次に、非生産性細胞による過成長を低めるため及び インビトロ条件で容易に成長する細胞の選択法を与えるためにフィーダ一層又は マクロファージの存在しない又は必要としない限界希釈でクローン化される。し かしそのようなフィーダ一層を用いてもよい。

このように作られたハイブリドーマ細胞を次に、蛋白分子リガンドに結合するモ ノクローナル受容体分子の生産（分泌）について評価する。このリガンドは、免 疫原ポリペプチドがアミノ酸残基配列において対応するところの蛋白の一部であ る。その後、蛋白リガンドに結合するモノクローナル受容体分子を作るハイブリ ドーマ細胞をさらに培養して、これらハイブリドーマ細胞の追加量及び蛋白分子 リガンドに結合するこれら細胞により分泌されるモノクローナル受容体を作る。

典型的にはそのような培養は、限界希釈で、たとえば培養物を育てる溜り当り平 均約１個の細胞で行われる。

好ましいやり方では、作られたハイブリドーマ細胞はまた、ポリペプチド免疫原 ならびに蛋白リガンドに結合するモノクローナル受容体分子の生産についても評 価される。その後、免疫原ポリペプチドと蛋白リガンドの両者に結合するモノク ローナル受容体分子を作るハイブリドーマ細胞が、好ましくは培養されたところ のこれら細胞である。

蛋白分子リガンドのサンプルが限られている場合、免疫原ポリペプチドに結合す るモノクローナル受容体の分泌についてハイブリドーマを最初にスクリーンする ことが便利である。このポリペプチドへのポジティブな結合を示すハイブリドー マクローンは次に典型的には貯蔵のために凍結される。その後それらは解凍され 、そして多数のモノクローナル受容体が多数の異なるハイブリドーマ細胞から作 られるのではなくて真にモノクローナルな抗体が作られることを確実にするため に、限界希釈によりサブクローンされる。この限界希釈のサブクローン培養は再 び、典型的に、食作用体又はマクロファージなしで（これらは必要でないので） 行われる。

最終的に作られたハイブリドーマ細胞は、周知のようなこのような細胞のための 通常のインビトロ組織培養技術に従って培養できる。より好ましくは、ハイブリ ドーマ細胞は、同様周知の技術を用いて動物中で培養され、モノクローナル受容 体はそのようにして発生した腹水から得られる。腹水の発生のために用いられる 動物は典型的には、スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファンデー ション、ラジョラ、カリホルニアのマウス舎で飼育された１２９ＸＢＡＬＢ／ｃ マウスである。しかしマウス以外の動物がハイブリドーマの調製のために用いら れる場合、その動物種が腹水の生産のために用いられる。

先述したように、骨髄腫細胞系統が受容体と同じ種からであることが好ましい。

従ってマウス−マウスハイブリッド〔シュルマンら、ネイチャー、呈ユ旦、２６ ９（１９７８））　、又はラット−ラットハイブリッド〔ガルファら、ネイチャ ー、２７７．１３１（１９７９）〕のような融合ハイブリッドが典型的に用いら れる。しかし、いくつかのラット−マウスハイブリッドもまた、ハイブリドーマ 形成において成功裡に用いられた〔ゴディング、「プロダクションオブ　モノク ローナル　アンチボデイーズ　バイ　セル　フュージョン」、アンチボディ　ア ズ　ア　ツール中の記事、マルカロニスら編、ジョーン　ワイリー　アンド　サ ンズ社、ｐ２７３（１９８２）〕。本発明で用いるのに適した骨髄腫としては、 ＭＰＣ−１１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６７）、Ｐ　３　ｘ　６３−Ａｇ８．６５３ （ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）、Ｓｐ−２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１ ５８１）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８０．１（ＡＴＣＣＳＲＬ　１５９７）、Ｙ３−Ａｇ １．２．３．（コレクチオン　ナショナーレ　デ　カルチコレ　デ　ミクロオル ガニズムス、パリ、フランス、に寄託、Ｎｏ、ｌ−０７８）、及びＰ３ｘ６３Ａ ｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ　９）が挙げられる。骨髄腫系統Ｓｐ−２１０−Ａｇ１４ およびＰ３ｘ６３−Ａｇ８゜６５３が本発明で用いるのに好ましい。

すなわち本発明の方法に従い、癌蛋白のような蛋白分子の既知の所定のエピトー プに結合する又は免疫反応するモノクローナル受容体を比較的高収量で作ること が今や可能となった。加えて、免疫化ポリペプチドに対して少くとも約１：４０ ０の５０パ一セント結合滴定量を示すオリゴクローナル抗体を含む過免疫血清を ひとたび当業者が作ったなら、この者は前述の段階を逐行し、過免疫化動物から ヒ臓を取り出し、その抗体生産細胞を同じ動物タイプ又は系統からの骨髄腫系統 の細胞と融合し、そしてこの融合から作られたー又は二辺上のハイブリドーマが 免疫化ポリペプチド及び対応する蛋白たとえば癌蛋白に結合するモノクローナル 受容体を分泌することが実質上保証される。このような結果は、従来は不可能で あった。

上述の方法は、実質上任意の蛋白分子リガンドに対するモノクローナル受容体を 分泌するハイブリドーマを作るのに有用である。このようなハイブリドーマ及び そのモノクローナル受容体の例は、そのアミノ酸残基配列が癌遺伝子でコードさ れる癌蛋白のアミノ酸残基配列に対応する中庸な長さの免疫原ポリペプチドに対 して生ぜられたものである。癌遺伝子及び有用な免疫原ポリペプチドの例は下記 に示され、ポリペプチドがそれに対応するところの癌蛋白配列におけるアミノ末 端からの数字位置がカッコ内に付されている。ここで、これらポリペプチドのア ミノ酸残基配列は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に考え られ、下記の表１に示される式より成る群から選ばれる式により表わされる。

第１表 １１４　ｖ−ｓｉｓ　ＲＶＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＨＲＫＣ１１０ｃｍｓ ｉｓ　Ｌ〜’５ＡＲＱＧＤＰＩＰＥＥＬＶＥ　（１−１６）１１１　ＰＤＧＦ− Ｉ　５ＩＥＥＡＶＰＡＶＣＫＴ（１−１２）１１２　ＰＤＧＦ−２ＳＬＧＳＬＴ ＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴ１１３　ＰＤＧＦ−２ＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫ ＡＴＶ１１４　ＰＤＧＦ−２ＲＶＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＨＲＫＣＴ １２１　ｖ−ｆｅｓ　Ｉ　ＧＲＧＮＦＧＥＶＦ　５Ｇ（５１９−５３０）Ｔ １２５ｖ−ｆｅｓ　５ｎｖｌｌＳＦＧＩＬＬＷＥＴＦＳＬＧＡＳＰＹＰＮＬＳＮ ＱＱＴＲＴ １２６　ｖ−ｆｅｓ　５ＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ（７１１−７２２）Ｔ １２８Ｖ−慢　ＣＷＡＹＥＰＧＱＲ，ＰＳＦ（７４８−７５９）Ｔ １２９　ｖ−ｆｅｓ　ＬＷＥＴＦＳＬＧＡＳＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ１３１　ｖ −ｍｙｂ　ＲＲＫＶＥＱＥＧＹＰＱＥＳＳＫＡＧ（２−１８）ａ １４１　ｖ−ｒａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＲＧＶＧＫ（５−１６）ａ １４６　ｖ−ｒａｓ　ＶＴＬＶＲＥＩＲＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣ（ １５７−１８１）ｉ １４７　ｖ−ｒａｓ　ＶＴＬｖＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＦ、ＥＫＴＰＧＣ（ １５７−１８０）１４８　ｖ−ｒａｓ　ＹＲＥＱＬＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬ ＶＧＮＫＣｕ １４４　ｖ−ｒａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（５−１６）１４５　Ｎ−ＲＡ Ｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ（５−１６）２３１　Ｎ−ＲＡＳ　ＤＧＥＴＣＬ ＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ２３７Ｎ−ＲＡＳ　ＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＭＫＫＬ ＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣ（１５７−１８１）２３３　Ｈ−ＲＡＳ　ＹＫＲＭＫＫＬ ＮＳＳＤＤＧＴＱＧＣ２３４　Ｋ−ＲＡＳ　ＡＧＰＥＡＱＲＬＰＧＬＬＫ（−１ ３ｔｏ−１）２３５に−ＲＡＳ　ＣＧＤＳＬＡＡＲＱＧＡＧＲＲ（１８０ｔｏ− １６７）１４９　ｖ−ｂａｓ　ＫＬＶＶＶＧＡＫＧＶＧＫ（５−１６）１５０　 ＭＹＣＡＰＳＥＩ）ＩＷＫＫＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰ１５１　ＭＹＣＣＤＥＥＥ ＮＦＹＱＱＱＱＱＳＥＬ（２５−４０）１５２　ＭＹＣＰＡＰＳＥＤＩＷＫＫＦ ＥＬ（４３−５５）１５３　ＭＹＣＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲ３ＧＬＣ（５６−７ ０）１５４ＭＹＣＣＤＰＤＤＥＴＦＩＫＮＩＩＩＱＤＣ（１，１７−１３３） １５５　ＭＹＣＣ３ＴＳＳＬＹＬＱＤＬＳＡＡＡＳＥＣ１５６ＭＹＣＣＡＳＱＤ ＳＳＡＦＳＰＳＳＤＳＬＬＳＳＴＥＳＳＰ（２０８−２３１）１＋７　ＭＹＣＣ ＴＳＰＲＳＳＤＴＥＥＮＶＫＲＲＴ１５８　ＭＹＣ５ＶＱＡＥＥＱＫＬＩＳＥＥ ＤＬＬＲＫＲＲ１５９　ＭＹＣＬＲＫＲＲＥＱＬＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＣ１６０ ＭＹＣ１１１ＱＤＣＭＷＳＧＦＳＡＡ（１２８−１４１）１８２　Ｎ−ＭＹＣＰ ＰＧＥＤＩＷＫＫＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰ１８３　Ｎ−ＭＹＣＶＩＬＱＤＣＭＷ ＳＧＦＳＡＲ（１１０−１２３）１８４　Ｎ−ＭＹＣ５ＬＱＡＥＥＨＱＬＬＬＥ ＫＥＫＬＱＡＲＱ１８５　Ｎ−ＭＹＣＬＱＡＲＱＱＱＬＬＫＫＩ　ＥＨＡＲＴＣ １９２　Ｌ−ＭＹＣＡＰＳＥＤＩＷＫＫＦＥＬＶＰＳＰＰＴＳＰ１９３　Ｌ−Ｍ ＹＣＩ　ＩＲＲＤＣＭＷＳＧＦＳＡＲ（１１０−１２３）１６１　ｖ−ｍｏｓ　 ＬＲＲＥＬＳＰＳＶＤＳＲ（４２５３）１６２　ｖ−ｍｏｓ　ＲＱＡＳＰＰＨＩ ＧＧＴＹ（２６０−２７１）１５３ｖ−ｍｏｓ　ＴＴＲＥＶＰＹＳＧＥＰＱ（３ ０１３１２）１６４　ｖ−ｍｏｓ　Ｉ　ＩＱＳＣＷＥＡＲＧＬＱＲＰＳＡ１６５ 　ｖ−ｍｏｓ　ＬＧＳＧＧＦＧＳＶＹＫＡ（１００−１１１）１６８　ｖ−ｍｏ ｓ　ＴＬＷＱＭＴＴＲＥＶＰＹＳＧＰＱＹＶＱＹＡ７６１　ｖ−ｍｏｓ　ＴＬＷ ＱＭＴＴＲＥＶＰＹＳＧＥＰＱ￥〜’ＱＹ１６６　ｃ−ｍｏｓ　Ｉ　ＩＱＳＣＷ ＥＡＲＡＬＱＲＰＧＡ１６７　ＭＯＳ　ＶＩＱＲＣＷＲＰＳＡＡＱＲＰＳＡ７６ ２ＭＯＳ　ＴＬＷＱＭＴＴＫＱＡＰＹＳＧＥＲＱＨＩＬＹ１７１ｖ−ｅｒｂ　Ｂ 　ＩＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＦ１７２　ｖ−ｅｒｂ　Ｂ　ＬＧＳＧＡＦＧ ＴＩＹＫＧ（１３８−１４９）１７３ｖ−ｅｒｂ　Ｂ　ＥＮＤＴＬＶＲＫＹＡＤ ＡＮＡＶＣＱ（２３−３９）１７４ｖ−ｅｒｂ　Ｂ　ＶＷＥＬＭＴＦＧＳＫＰＹ ＤＧＩＰ、ＡＳＥＩＳ１７５　ｎｅｕ　ＩＭＶＫＣＷＭＩＤＳＥＣＲＰＲＦ１７ ８　ｎｅｕ　〜’ＷＥＬＭＴＦＧＡＫＰＹＤＧ　Ｉ　ＰＡＲＥ　Ｉ　Ｐ１７９　 ｎｅｕ　ＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧ（７３１−７４２）１７６ＨＥＲ−Ｉ　ＲＲ ＲＨＩＶＲＫＲＴＬＲＲＬＬＱＥＲＥ１７７ＨＥＲ−Ｉ　ＶＷＥＬＭＴＦＧＳＫ ＰＹＤＧＩＰＡＳＥＩＳ１０７　ｖ−ｓｒｃ　ＬＬＮＰＥＮＰＲＧ丁ＦＬＶＲＥ ＳＥＴＴＫＧ２０８ｖ−ｓｒｃ　ＴＦＶＡＬＹＤＹＥＳＲＴＥＴＤＬＳＦＫＫＧ ＥＲＬ（８５−１０８）Ｃ 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１２　ＰＫＣＬＹＥＭＬＡＧＱＡＰＦＥＧＥＤＥＤＥＬＦ７１３　ＰＫＣＬＩＴ ＫＨＰＧＫＲＬＧＣＧＣＰＥＧＥ７２２　ＰＫＣＬＹＥＭＬＡＧＱＰＰＦＤＧＥ ＤＥＥＥＬＦ７２３　ＰＫＣＦＬＴＫＨＰＡＫＲＬＧＳＧＰＤＧＥ７７１　ｐｉ ＋ｃ−Ｉ　ＬＧＳＧＧＦＧＳＶＹＳＧ（４４−５５）８４３　ｓｙｎ　ＬＭＩＨ ＣＷＫＫＤＰＥＥＲＰＴＦ８６１　Ｇｓ　ＲＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧＫ（４２−５ ３）８６２　Ｇｓ　ＲＷＬＲＴＩＳＶＩＬＦＬＮＫ（２７９−２９３）８７１　 Ｇｉ　ＫＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧＫ（３５４６）８７２　Ｇｉ　ＫＷＦＴＤＴＳＩ ＩＬＦＬＮＫ（２５８２７１）８８２　Ｇｏ　ＫＦＦＩＤＴＳＩＩＬＦＬＮＫ（ ２１４−２２７）８９２　Ｔ　ＲＹＦＡＴＴＳ　ＩＶＬＦＬＮＫ（２５３−２６ ６）８９４　Ｔ’　ＫＦＦＡＡＴＳ　ＩＶＬＦＬＮＫ（２５７−２７０）９０１ 　ＰＢＫ　ＬＧＲＧＶＳＳＶｖＲＲＣ（２５−３６）９０２　ＰＢＫ　ＭＹＴＬ ＬＡＧＳＰＰＦＷＨＲＫＱＭＬＭＬ９０３　ＰＢＫ　ＬＶＳＲＦＬＶＶＱＰＱＫ ＲＹＴＡＥＥ９１１　ＣＧＫ　ＬＧＶＧＧＦＧＲＶＥＬＶ（３６５−３７６）９ １２　ＣＧＫ　ＭＹＥＬＬＴＧＳＰＰＦＳＧＰＤＰＭＫＴＹ９１３　ＣＧＫ　Ｌ ＩＫＫＬＣＲＤＮＰＳＥＲＬＧＮＬＫ９２１　ＭＬＣＫ　ＬＧＧＧＫＦＧＡＶＣ ＴＣＴ（６７−７９）９２１　ＭＬＣＫ　ＴＹＭＬＬＳＧＬＳＰＦＬＧＤＤＤＴ ＥＴＬ９２３　ＭＬＣＫ　ＦＶＳＮＬＩＶＫＥＱＣＡＲＭＳＡＡＱＣ３９２ｃｍ １ｓｋ　ＬＴＥＩＶＴＨＧＲＩＰＹＰＧＭＴＮＰＥＶＩ４００　ＭＥＴ　ＭＬＫ ＣＷＨＰＫＡＧＭＲＰ（Ｎｏｔｅ　２）２９０　ｖ−ｆｍｓ　ＬＧＴＧＡＦＧＬ ＶＶＥＡ（１０９３−１１０４）３２９１　ｖ−ｆｍｓ　ＬＷＥＩＦＳＬＧＬＮ ＰＹＰＧＩＬＶＮＳＫＦ（１，３３６−１３５６）２９２　Ｖ−ｆｍｓ　ＦＭＱ ＡＣＷＡＬＥＰＴＲＲＰＴＦ（１３７９−１３９４）” ２９３　Ｖ−ｆｍｓ　ＬＧＴＧＡＦＧＫＶＶＥＡ（１０７８−１０８９）２９５ 　ＦＭＳ　ＩＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＨＲＰＴＦ２９６　ＦＭＳ　ＬＥＡＧＶＳＬ ＶＲＶＲＧＲＰＬＭＲ２９７　ＦＭＳ　ＬＹＶＫＤＰＡＲＰＷＮＶＬＡＱＥ（９ ９−１１４）２９８　ＦＭＳ　ＶＰＡＥＬＶＲＩＲＧＥＡＡＱＩＶＣ３１Ｑ　ｖ −ａｂｌ　ＬＧＧＧＱＹＧＥＶＹＥＧ（３６７３８９）３１１　ｖ−ａｂｌ　Ｌ 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ＡＥＰＴＣ４６１ｖ−ｅｒｂ　Ａ　ＫＳＦＦＲＲＴＩＱＫＮＬＨＰＴＳＣ４６２ ｖ−ｅｒｂ　Ａ　ＶＤＦＡＫＮＬＰＭＦＳＥＬＰＣＥＤＱ４６３ｖ−ｅｒｂＡ　 ＥＬＰＰＲＲＣＲＡＬＱＩＬＧＳＩＬＰＦＶ４７０　ＨＧＲＫＶＦＦＫＲＡＶＥ ＧＱＨＮＹＬＣＡＧＲ４７１　ＨＧＲＮＶＭＷＬＫＰＥＳＴＳＨＴＬＩ４７２　 ＨＧＲＴＮＱＩＰＫＹＳＮＧＮＩＫＫＬＬＦＨＱＫ４７３　ＨＧＲＶＫＷＡＫＡ ＩＰＧＦＲＮＬＨＬＤＤＱ８００　ＥＲＫＡＦＦＫＲ３ＩＱＧＨＮＫＹＭＣＰＡ ８０１　ＥＲＩＮＷＡＫＲＶＰＧＦＶＤＬＴＬＨＤＯ４７７　ｃＰＲＫＶＦＦＫ ＲＡＭＥＧＱＨＮＹＬＣＡＧＲ（ノート　２） １０００　Ｂｅｔａ−丁ＧＦ　ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣ直上記癌遺伝子 および配列の引用文献 ｖ−ｓｉｓ−デヴアーら、ブロク、ナルト、アカド、サイ、ニーニスニー、ヱ旦 、３１７９−３１８２（１９８２）。

ｃ−ｓｉｓ−ジョンソンら、ニムボジエイ、３：９２１−９２８（１９８４）。

ＰＤＧＦ−１−ドウリトルら、サイエンス、２２１，２７５−２７７（１９８３ ）。

ＰＤＧＦ−２−ドウリトルら、サイエンス、２２１，２７５−２７７（１９８３ ）。

ｖ−ｍｙｂ−ラシ、０つら、サイエンス、２１６．１４２１−１４２３（１９８ ２）。

Ｈａ　＋ ｖ−ｒａｓ　−ダーリ、サイエンス、２１７．９３４−９３７（１９８２）。

８２）。

８２）。

Ｋ−ＲＡＳ−マツフグラスら、ネイチャー、３０４，５０１（１９８３）。

８６）。

８３）。

ｖ−ｍｏｓ−ヴアナ・ベヴアレンら、ネイチャー、２８９，２５８−２６２（１ ９８１）。

ｃ−ｍｏｓ−ヴアン・ベヴアレンら、セル、２７．９７（１９８１）。

ＭＯＳ−ワトランら、ブロク、ナトル、アウト、サイニーニスニーｎｅｗ−バー グマンら、ネイチャー、３１９．２２６（１９８６）。

ＨＥＲ−１−ウルリックら、ネイチャー、３０９，４１８（１９８４）。

Ｖ−５ｒＣ−タケヤら、ジェイ・ヴアイロル、４４．１２（１９８２）。

８（１９８０）。

５ＲＣ−パーカーら、モル、セル、パイオル、５，８３１（１９８５）ｖ−ｆｇ ｒ−ナハＯら、サイエンス、λ旦旦、６３（１９８４）。

遵匹−１−オーヤンら、エムボ、ジエイ、４．２９０５（１９８５）■−±−キ タムラら、ネイチャー、旦旦ユ、２０５（１９８２）。

ｖ−ｍｉｌ−ストレイヴら、ネイチャー、旦旦旦、８５（１９８４）。

Ａ−ＲＡＦ−フレイヘルに、モル、セル、パイオル、８．２６５５（１９８６） 。

ＲＫＳ−マークら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー。

８３、６３１２（１９８６）。

ｖ−ｔｅｌ−ステフエンズら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、 ８０．６２２９（１９８３）。

ｖ−ｆｍｓ−ハムブら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー。

８１．８５（１９８４）。

ＦＭＳ〜コウセンスら、ネイチャー、３２０，２７７（１９８６）。

ｙ−ａｂｌＩ−レディら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ユーエスエ二、８０ ．３６２３（１９８３）。

ｃ−ａｂＩＩ−ベンーネリクら、セル、４４：５７７（１９８６）。

Ｃ−ａｂｌ　Ｉ［−ベンーネリクら、上記。

ｃ−ａｂｌｍ−ベンーネリクら、上記。

ｃ−ａｂｌｒＶ−ベンーネリクら、上記。

ＢＰＫ　Ｃ−ジョンら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、７８． ８４８（１９８１）。

ＢＰＫ　Ｒ−ショジら、バイオヘム、２２．３７０２（１９８３）。

ＣＤＣ２８−ロリンツら、ネイチャー、３０７，１８３（１９８４）ｖ−ｆｐｓ −シブヤら、旦、３０．７８７（１９８２）。

Ｃ−伽−ハングら、２１４１モル、パイオル、１旦１，１７５（１９８５）。

ｖ−ｒｏｓ−ネックメイヤーら、ニス、ヴアイロル、５３，８７９（１９８５） 。

ＨＩＲ−ウルリッヒら、ネイチャー、３１３．７５６（１９８５）。

ＴＲＫ−マーチンーツァンカら、ネイチャー、３１９，７４３（１巴−１−セル テンら、車止、旦、６０３（１９８６）。

晃−センバら、ブロク、ナトルアカドサイニーニスニー、８３、５４５９（１９ ８６）。

Ｇｓ−イト−ら、プロクナトル、アカドサイユーエスエー、８３．３７７６（１ ９８６）。

Ｇニーイト−ら、上記。

Ｇｏ−イト−ら、上記。

ＰＢＫ−ライマンら、バイオヘム、２３．４１８５（１９８４）。

ｃ　−ｆｏｓ−ヴアン・ストラーテンら、ブロク、ナトル、アカドサイ。

９８６）。

ＣＲＲ−コニーリイら、サイエンス、　２３３．７６７（１９８６）。

ベーターＴＧＦ　デサンクら、ネイチャー、３１６，７０１（１９８５）。

２ポリペプチドの数の位置は、報告された配列が不完全なので、利用できなかっ た。

３これらのポリペプチドは、報告された配列と比較して、削除、付加又は置換さ れたアミノ酸残基を含む。

上記の４つの工遺伝子によりコードされる相同のポリペプチドは、左から右へか つアミノ末端からカルボキシ末端の方向に式％式％） により示される一つのアミノ酸残基配列として簡便に記述できる。

ここでカッコ内のアミノ酸残基は、式中の直前のアミノ酸残基Ｒの名代替物であ る。

本発明のモノクローナル受容体の製造を誘発するために有用な更に別のポリペプ チドは、その癌遺伝子、癌蛋白配列における位置及びポリペプチドアミノ酸残基 配列を第２０．２１および２２図に示すポリペプチドである。これらポリペプチ ドは、蛋白キナーゼ癌蛋白（その癌遺伝子のいくつかは先に述べた）の周知の族 の中の配列保存領域に対応する。

■、モノクローナル受容体 本発明は多数のモノクローナル受容体を考慮しているが、比較的少数のような受 容体についてのみ、完全なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の形で、群の代表とし て本明細書で詳しく述べる。ポリペプチドの免疫原性及び抗体性のための前述し たテストを、異なる癌蛋白に結合（免疫反応）する別のモノクローナル受容体に 対応するポリペプチドについて下記に述べる。

Ａ、受容体の例 ここに記載される手段を用いて、受容体が癌遺伝子関連ポリペプチドに対して生 じた。

本発明のモノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約に 従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・オブ・ロックビル、Ｍ Ｄに寄託された。これらのＡＴＣＣ受理番号（ＡＴＣＣＮｏ、）、実験室引用番 号（ＲｅｆＮｏ、）、ＡＴＣＣで受領のデータ（ＡＴＣＣＲＥＣＥＩＰＴ）及び 第１表のポリペプチドに交叉対照された免疫化ポリペプチドの数（ＰＯＬＹＰＥ Ｐ　Ｎｏ、）は、以下、第２表に提示される。

！ス青 ＨＢ８５９４　Ｐ４３ＤＯ９０８１０２／８４　１２５ＨＢ８５９５　５２２Ｃ Ｏ６０８１０２／８４　１２５ＨＢ８５９６　５１０ＦＯ３０８１０２／８４　 １２５ＨＢ８６７９　１／２４−２４ＥＯ５１２／１２／８４　１４２ＨＢ８８ ００　１８−９Ｂ１００５１０９／８５　１１２ＨＢ８８８８　１３３−ＩＥＩ Ｏ０８／１５／８５　１３３ＨＢ８８９４　１７３−ＩＣＩＩ　０８／２７／８ ５　１７３ＨＢ８８９５　２０２−１１ＡＢ　０８／２７／８５　２０２ＨＢ８ ８９６　１７３−８Ｄ２０８／２７／８５　１７３ＨＢ８８９７　１３３−６Ｃ １００８／２７／８５　１３３ＨＢ８８９８　２０３−７Ｄ１０　０８／２７／ ８５　２０３ＨＢ８８９９　２０３−６Ｆ５０８／２７／８５　２０３ＨＢ８９ ００　２０２−９Ｄ１０　０８／２７／８５　２０２ＨＢ８９２４　１３２−７ Ｃ９０８／２９／８５　１３２ＨＢ８９２５　１１４−５０Ｄ４　０８／２９／ ８５　１１４ＨＢ８９２６　１１４−５０Ｇ２　０８／２９／８５　１１４ＨＢ ８９２７　１３２−ＩＣ８０８／２９／８５　１３２ＨＢ８９４８　１２１−Ｉ Ｆ９１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９４９　１２１−３Ｈ５１２１０３／８５ 　１２１ＨＢ８９５０　１２１−４Ｆ８１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９５１ 　１２１−５ＥＳ　１２／２３／８５　１２１ＨＢ８９５２　１２１−９Ｇ１０ 　１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９５３　１２１−９Ｅ５　１２１０３／８７ 　１２１ＨＢ８９５４　１２１−１５Ｂ１０　１２１０３／８５　１２１ＨＢ８ ９５５　１２１−１９Ｂ１０　１２１０３／８５　１２１ＨＢ８９５６　１２１ −８Ｄ８　１２１０４／８５　１２１ＨＢ８９６５　１２７−２４Ｃ７１２／１ １／８５　１２７ＨＢ８９６６　１２７−２４Ｅ１１　１２／１１／８５　１２ ７ＨＢ８９６７　１２７−３８Ｇ２　１２／１１／８５　１２７ＨＢ８９６８　 １２７−５０Ｄ４　１２／１１／８５　１２７ＨＢ８９６９　１２７−５０ＤＩ ２　１２／１１／８５　１２７ＨＢ８９７０　１２７−５３Ｆ８　１２／１１／ ８５　１２７ＨＢ８９７１　１２７−６０Ｆ３　１２／１１／８５　１２７１２ ７−４２Ｃ１１１２７ ＨＢ８９７６　１５５−１１Ｃ７１２／１７／８５　１５５ＨＢ８９９６　１５ ２−６Ｄ１１　０１／２８／８６　１５２ＨＢ８９９７　１４６−３Ｅ４　０１ ／２８／８６　１４６ＨＢ８９９８　１４６−１７Ａ３　０１／２８／８６　１ ４６ＨＢ８９９９　１４６−８Ｄ１１　０１／２８／８６　１４６ＨＢ９０００ 　１５５−９Ｆ６　０１／２８／８６　１５５ＨＢ９００１　１５５−８Ｇ１　 ０１／２８／８６　１５５ＨＢ９００２　３１０−５Ｆ５　０１／２８／８６　 ３１０ＨＢ９００３　１３１−９４Ｈ４０１／２８／８６　１３１ＨＢ９００４ 　１７２−１２Ｇ７　０１／２８／８６　１７２ＨＢ９００５　１７２−１２Ａ ４　０１／２８／８６　１７２ＨＢ９０４０　１６４−３Ｆ３０３／１９／８６ 　１６４ＨＢ９０５２　２２２−３５Ｃ８０３／２７／８６　２２２ＨＢ９０５ ３　３１０−２９Ｆ７　０３／２７／８６　３１０ＨＢ９０７７　１３３−１０ Ｆ６　０４／１７／８６　１３３ＨＢ９０９７　１７１−１０ＥＳ　０５１０８ ／８６　１７１ＨＢ９１１７　１７１−１１Ｂ９　０５／２９／８６　１７１Ｈ Ｂ９１３３　２９０４Ｅ１００６／２６／８６　２９０ＨＢ９１４４　２４０− １３ＤＩ０　０７／１０／８６　２４０ＨＢ９２０８　３１２−１３ＥＯ８０９ ／２４／８６　３１２ＨＢ９２２７　３６１−３１ＣＯ５１０／１５／８６　３ １６ＨＢ９２６０　２５０−９ＧＯ６１１１０６／８６　２５０ＨＢ９２７８　 １４７−６７Ｃ６１１／２０／８６　１４７ＨＢ９２７９　１６５−３４Ｅ４　 １１／２０／８６　１６５ＨＢ９２８０　３６０−２７ＥＤ６　１１／２０／８ ６　３６０１ハイブリドーマＰ４４Ｅ１１は、ミエローマセルラインＰ３Ｘ６３ −Ａｇ８．６５３を用いて生成された。他の全てのハイブリドーマは、材料及び 方法の部に述べたように、ミニローマセルライン５Ｐ２−０を用いて生成された 。

５つの例示的、モノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマが、後記のｖ− ｆｅｓ関係の３０−ｍａｒ免疫原的合成ポリペプチド（ポリペプチドａとしても 引用されるポリペプチド番号１２５）に対して生じ、各々はまた下記のカルボキ シ末端１２−ｍａｒポリペプチドＳペプチド（ポリペプチドｂとしても引用され るポリペプチド番号１２６）に結合し、また５Ｔ−ＦｅＳＶのｖ−ｆｅｓ遺伝子 によりコードされるｐ８５（８５にダルトン）とされる癌蛋白に結合する。これ らのハイブリドーマは、引用番号、５１０Ｆ０３．５２２ＣＯ６、Ｐ４３Ｄ０９ 、Ｐ４２Ｃ１０及びＰ４４Ｅ１１が与えられた。左から右へかつアミン末端から カルボキシ末端の方向の合成ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）のアミノ酸残基配列 は次の式で表わされる。

ポリペプチドａ　５ＤＶＷＳＦＧＩＬＬＩＥＴＦＳＬＧＡＳＰ−ＹＰＮＬＳＮＱ Ｑ丁Ｒ；ポリペプチドｂ　５ＰＹＰＮＬＳＮＱＱＴＲ第２表のＡＴＣＣに寄託さ れた７つのハイブリドーマは、ｖ　−ｆｅｓ関連ポリペプチド番号１２５に対し て生じ、第１表に示され、ポリペプチドに対して生じた１９のハイブリドーマ中 による。これら７つのハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル受容体も 、ｐ８５遺伝子蛋白に結合する。

５２２ＣＯ６及び５１０ＦＯ３を命名されたハイブリドーマにより分泌される本 発明のモノクローナル受容体は、特にモノクローナル受容体が好ましい。共に好 ましいモノクローナル受容体は、カッパＬ鎖を有し、免疫化ポリペプチドと、ま た、免疫化ポリペプチドの配列と対応するアミノ酸残基配列を有するｆｅｓ関連 癌蛋白と免疫反応するＩｇＧＩモノクローナル受容体である。

ハイブリドーマは、下に示すｒａｓ　２３−　ｍｅｒ免疫原性、合成ポリペプチ ド番号１４２　（ｒａｓ）を用いて生成された。

ＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣモノクローナル抗体は、ハイ ブリドーマが免疫原性ポリペプチドに、またハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）配列のｒ ａｓ遺伝子によりコードされる５５にダルトン蛋白に結合することによって分泌 した。モノクローナル抗体は、試験された全てのｒａｓ生成セルライン中の２３ にダルトン蛋白、およびより高分子量の蛋白を認識する。

５１０Ｆ０３．５２２Ｃ０６、Ｐ４３ＤＯ９、Ｐ４４Ｅ１１および１／２４／Ｅ Ｏ５と命名されたハイブリドーマは、力、、／（Ｌ鎖、ｉｇＧＩモノクローナル 受容体を分泌する。

最後に命名された、５つのハイブリドーマは、３つの異なる細胞融合により生成 された。そのＭａｂｓが、免疫原性ポリペプチド、同様に、最初の調製用の対応 癌蛋白分子リガンドを認識する）１イブリドーマの製造効率は１００パーセント であった。即ち、２つのＭａｂｓ（Ｓ１０ＦＯ３及び５２２ＣＯ６からの）は、 ポリペプチドを認識するものを生成し、これら２つのＭａｂｓは、また癌蛋白を 認識した。第二及び第三の調製については、同様に計算された効率（よ、約２０ パーセントであった。

他のハイブリドーマは、下記に示した、ｅｒｂ　−Ｂ関連、１６−ｍｅｒ免疫原 性合成ポリペプチド番号１７１を用いて生成した。合成ポリペプチドのアミノ酸 残基配列は、左から右に、及びＮ末端からＣ末端の方向に、式 ＩＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＥにより示される。

このハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体も、ｆｅｓ。

ｆｍｓ、　ａｌｂ、　ｓｒｃ及びｆｇｒ癌遺伝子によりコードされる癌蛋白に関 連するポリペプチドに結合する。

第１図は、ｐ８５癌蛋白リガンドのだめの外部標準及びネカチブ対照としてのイ ンフルエンザへマグルチニン認識性Ｍａｂを用いて、ハイブリドーマ５１０ＦＯ ３（ＡＴＣＣＨＢ　８５９６）及び５２２ＣＯ６（ＡＴＣＣＨＢ　８５９５）に より分泌されたモノクローナル受容体によりｐ８５癌蛋白リガンドの免疫学的検 出を例示する第２図は、同様にノゾブリドーマ８１０ＦＯ３からのＭａｂならび にハイブリドーマＰ４３ＤＯ９（ＡＴＣＣＨＢ　８５９４）及びＰ４４Ｅ１１（ ＡＴＣＣＨＢ　８５９３）、及びまたハイブリドーマＰ４２Ｃ１０からのＭａｂ を用いての同様の結果を例示する。ｇｐ７０ローシェルウィルス着白に対するモ ノクローナル抗体〔ナイマン及びエルダー、モノクローナル　アンチボディーズ ・アンド・ティ・セル・プロダクツ前出〕がネカチブ対照として用いられた。

第３図は、本発明のモノクローナル受容体の特異性を更に例示する。そこで、Ｃ ＣＬ６４ミンク細胞（レーンＢ及びＣ）、及びＦｅＬＶ−Ｂ及びＦｅ５Ｖにより 感染されたＭＳＴＦ細胞（レーンＡ及びＢ）は３２ｐにより放射活性にラベルさ れた。次にラベルされた細胞から抽出物を、Ｖ−ｆｅｓ遺伝子の聾部分によりコ ードされかっｐｒ６５と言われる蛋白前駆体として表わされるｐ１５蛋白に対す るヤギ抗血清（レーンＡ及びＢ）、又はハイブリドーマ３１０ＦＯ３がらの組織 培養上清（レーンＣ及びＤ）でインキュベートした。

図から見られるように、ハイブリドーマ８１０ＦＯ３がらの本発明のＭａｂはｐ ８５蛋白リガンドにのみ結合し、一方、ヤギ抗−ｐ１５血清は感染された細胞か らのｐｒ６５及びｐ８５融合癌蛋白の両者に結合した（レーンＡ）。非感染細胞 からの蛋白は結合されない（レーンＢ及びＤ）。これら結果、及び第１３図に関 する評価の類似の検討より、本発明のＭａｂは、アミノ酸残基配列の一部が各Ｍ ａｂを分泌するハイブリドーマを作るために用いられた免疫原ポリペプチドの配 列に対応するところの癌蛋白にのみ結合することを確認する。

図示されていない同様の結果において、上述の５つのハイブリドーマからのＭａ ｂはまた、ＧＡ−ＦｅＳＶにより形質転換された細胞において表現された１０８ にダルトンの癌蛋白リガンドにも結合した。ＧＡ−ＦｅＳＶ株によりコードされ る癌蛋白リガンドはアミノ酸残基配列において、免疫原的に有用なポリペプチド の領域において５Ｔ−ＦｅＳＶ株によりコードされる癌蛋白リガンドと本質的に 同じである。ハンペら、セル、１旦、７７７−７８５（１９８２）参照。

上述の５つのＭａｂのどれも、トリ肉腫ウィルスのフジナミ株のＶ−チ場遺伝子 によりコードされる癌蛋白に結合しなかった。予測されるｖ−ｆｐｓ癌蛋白、そ の配列は、シブヤら、セル、３０．７８７（白に対する強い相同性を含み、かつ 上述の１２−ｍｅｒ（ポリペプチド（ｂ））に対応する領域において第−及び第 四の残基の置換の点でのみこの１２−ｍａｒポリペプチドのアミノ末端と異なる ；すなわち、シーｆ朋関連ポリペプチド及び癌蛋白のアミノ末端セリン（Ｓ）は 、ｖ−ｆｐｓ関連癌蛋白においてバリン（Ｖ）により置換され、アミノ末端から 第二番目のプロリン（Ｐ）残基はアラニン（Ａ）残基で置換される。

える。結合におけるこの差はまた、後記する親和性吸着剤の一部として本発明の Ｍａｂを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより二つの蛋白の混合物を精 製する際においても有用である。

ｖ−ｆｐｓ関連癌蛋白に対する本発明のモノクローナル抗体の上述の非結合はま た、従来得られたオリゴクローナル受容体に比べてモノクローナル受容体の特異 性における改善を目立たせる。すなわちセン、ブロク、ナトル、アカド、サイ、 ニーニスニー、８０．１２４６−１２５０（１９８３）は、ラビットオリゴクロ ーナル抗体を作るためにＫＬＨに接合された前述のポリペプチド（ｂ）を用いた 。これナミ肉腫ウィルス）により形質転換された細胞中で表現された癌蛋白に結 合した。従って、本発明のモノクローナル受容体から得られる特異性は、オリゴ クローナル受容体で得られたものより、大いに改善される（両者が同じ免疫原ポ リペプチドに対して生じられた場合でさえ）ことが判る。

、王、±、旭、ｂａｓ、　１ｎｔ−１、用、ｅｒｂ−Ａ、　ｅｒｂ−Ｂ、　ｍｈ ｔ、　ＥＰＤＧＦＩ、ＰＤＧＦ−２，ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファによりコードさ れる癌蛋白の配列に対応する免疫原ポリペプチドに、及びまたこれら遺伝子を含 むレトロウィルスにより形質転換された細胞中で表現された癌蛋白に結合するモ ノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマが作られる。本発明の特異的モノ クローナル受容体は、上述の癌遺伝子によりコードされる免疫原ポリペプチドに 結合する。

これら癌遺伝子のいくつかは、下記第３表に命名され、本発明の好ましいモノク ローナル受容体がそれに結合する癌遺伝子、配列および第１表のポリペプチド番 号に関連したポリペプチド番号の隣りに示されている。

少くとも１つのモノクローナル受容体（Ｍａｂ）の結合又は各ポリペプチドに対 し作られたオリゴクローナル抗血清（血清）に関する。ウェスターンプロット評 価でのデータは、又、第３表中、ポリペプチド番号の隣りに示される。

第３表 癌蛋白に結合している受容体 ポリペブ　癌蛋白３に結合　癌蛋白４に結合１２２　ＮＴ　ＮＴ １２３　ＮＴ　＋ １２４　ＮＴ　ＮＴ １４４　ＮＴ　ＮＴ １４５　ＮＴ　＋ １４６　＋　ＮＴ ｂａｓ　１４９　＋　ＮＴ シｒｃ　１５１　ＮＴ　＋ １５４　ＮＴ　ＮＴ １５５　＋　＋ １５６　ＮＴ　ＮＴ １６２　ＮＴ　＋ １６３　ＮＴ　＋ Σ工　２０１　＋　ＮＴ ２Ｏ２＋　十 ２０３　＋　ＮＴ 並　２１１　ＮＴ　ＮＴ ２１３　＋　ＮＴ ｉｎｔ−’　２２１　ＮＴ　ＮＴ ２２２　＋　ＮＴ ２９２　＋　ＮＴ ３１２　＋　ＮＴ 工　３６０　＋　ＮＴ ３６１　＋　ＮＴ ４１６　＋　ＮＴ ＴＧＦ−アルファ４２１　十　ＮＴ １ウェスターンプロット評価における癌蛋白への受容体分子の結合。プラス称号 （＋）は、結合が見られることを示す。ＮＴ＝試験せず ２ボリペブ、Ｎｏ、＝第１表からのポリペプチド番号３モノクローナル受容体分 子の癌蛋白への結合４オリゴクローナル抗ポリペプチド血清の癌蛋白への結合オ リゴクローナル受容体の生産を誘発するのに有用な、そして結局モノクローナル 受容体の生産に有用なポリペプチドは好ましくは、本明細書で述べるように担体 分子に結合され、ここではＫＬＨに結合されたポリペプチドが例示的ポリペプチ ド−担体接合体として終始用いられた。約３５より少ないアミノ酸残基を含むポ リペプチドについて、オリゴクローナル及びモノクローナル受容体の生産を誘発 するために担体を用いることが好ましい。約３５〜約４０のアミノ酸残基を含む ポリペプチドを、担体と結合せずに単独で、受容体生産を誘発するために用いる ことができる。しかしこれらの受容体生産のために担体を用いることがやはり好 ましい。すなわち、受容体は、ポリペプチド単独又は担体と結合されたポリペプ チドにより誘発されつる、又はこれらに対して生じられる。

Ｂ、免疫結合研究 数度述べたように、オリゴクローナル抗体、及びモノクローナル抗体を分泌する ハイブリドーマを生じるのに用いられるポリペプチドは、自体、免疫原的かつ抗 原的であり、これらの特性はハイブリドーマ調製のために有用なポリペプチドを 同定するための判断基準を与える。以下の検討は、ｒａｓＳｓｉｓ、　ｅｒｂ− Ｂ及びす癌遺伝子によりコードされる癌蛋白に対するモノクローナル受容体（抗 体）を分泌するハイブリドーマの調製において用いられるポリペプチドにより誘 発された又はこれに対して生じられたオリゴクローナル抗体（受容体）含有抗血 清についての研究に関係する。後に記述するように、ｓｉｓ関連ポリペプチドは 、このポリペプチドに対してのみならず対応する癌蛋白、ヒト血小板由来成長因 子（ＰＤＧＦ）に対しても結合するオリゴクローナル受容体の生産を誘発する。

このように作られたオリゴクローナル抗体は、免疫化ポリペプチドに対する前述 した５０パ一セント結合滴定量を示し、これにより本発明のモノクローナル抗体 （受容体）はまた抗体生産ヒ臓細胞と適当な骨髄腫系統の細胞との融合により作 られうることを示した。

血小板から単離されたＰＤＧＦは、アミノ末端において約６０％相同である二つ の鎖より成る。これら鎮の一つ（ＰＤＧＦ−２）は、ＤＧＦ−２分子はｐ２８Ｓ ｉＳと大きな相同性を持つより大きな前駆体から発生する。ｐ２８ｓｉｓとＰＤ ＧＦ−２の間の相同性は、ｐ２８ｓｉｓのアミノ酸残基６７及びＰＤＧＦ−２の アミノ末端で始まり、最近、ヒトｃ−ｓｉｓクローンの単離及び配列化によりｐ ２８ｓｉｓの予測されたカルボキシ末端にまで広げられた。ジョセフスら、サイ エンス、ｐ２８ｓｉｓは迅速に解離されて、ＰＤＧＦ−２と同じアミノ末端をた ぶん持つｐ２０ｓｉｓを発生する。ｐ２０ｓｉｓ及びＰＤＧＦ−２をコードする 領域内に、三つの領域内に置かれうる八つのアミノ酸変化がある。アミノ末端近 くの二つの変化は保存的であり、五つの変化は分子の中心近くに集まっており、 一つの変化はカルボキシル末端部分に位置する。

二つの例示的なポリペプチドが作られた。ポリペプチド（Ｃ）としても引用され るポリペプチド番号１１３と呼ばれる第一のものは、ｐ２８ｓｉｓと呼ばれるサ ル肉腫ウィルス形質転換蛋白の予測された配列の残基１３９〜１５５にアミノ酸 残基配列において対応する。デバルら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニ スニー、８０．７３１−７３５（１９８３）。ポリペプチド（Ｃ）の配列はまた 、前述したヒト血小板由来生長因子のＦＤＣＦ−２と呼ぶ蛋白鎖のアミノ末端か ら位置７３〜８９の配列に対応する。ポリペプチド（ｄ）と呼ぶ第二白の予測さ れた配列の残基２〜１８にアミノ酸残基配列において対応する。ラシュロウら、 サイエンス、２１６．１４２１−１４２３（１９８２）。ポリペプチド（ｃ）及 び（ｄ）のアミノ酸残基配列を、左から右へかつアミノ末端からカルボ末端の方 向に、下記に示す：ポリペプチド（ｃ）　ＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰ　Ｉ　ＦＫＫＡ ＴＶ；ポリペプチド（ｄ）　ＲＲＫＶＥＱＥＧＹＰＱＥＳＳＫＡＧ０ポリペプチ ドの各々は合成され、そしてそれらのカルボキシ末端（上式で示さず）のＣｙｓ 残基を用いてＫＬＨに結合され、得られた各接合体は次に材料及び方法の部で一 般的に述べるようにマウスを免疫化するために用いられた。第４図の検査から判 るように、ポリペプチド（Ｃ）に対して生じた血清は、ポリペプチドならびにＫ ＬＨに結合するオリゴクローナル受容体を含み、ポリペプチド（ｄ）に対して生 じた血清は、ポリペプチド（ｄ）及びポリペプチド（ｄ）並びにＫＬＨに結合す るオリゴクローナル受容体を含んでいた。どの血清も、それらを生ずるために用 いられなかったポリペプチドと交叉反応し結合する受容体を含んでいなかった。

旧式の（ｏｕｔｄａｔｅｄ）ヒト血小板からの抽出物が、ＰＤＧＦの部分的に精 製されたサンプルを得るために用いられた。すでに述べたように、ＰＤＧＦは約 ３０にダルトンの見がけ分子量を持ち、同じ見かけ分子量の二つの高分子量ポリ ペプチド（ＰＤＧＦ−１及び−２と呼ばれる）に還元的に解離されうる癌蛋白で ある。

第５図は、この図の説明でより詳しく説明されるようにポリペプチド（Ｃ）及び （ｄ）に対して生じたオリゴクローナル受容体含有抗血清を用いた。ＰＤＧＦの ウエスタンーンプロット分析の結果を示す：ポリペプチド（ｄ）に対して生じた 抗血清はネガテブ対照として用いられる。第５図の検査から判るように、少関連 ポリペプチドであるポリペプチド（Ｃ）に対して生じたオリゴクローナル受容体 含有血清は、三つの蛋白部分に結合する（レーン２）。これらの部分の一つは約 ３０にダルトンの見かけ分子量を持ち、二つは各々約１６〜１８にダルトンであ る。レーン４はまた、抗ｓｉｓ関連ポリペプチド血清に含まれるオリゴクローナ ル受容体による結合を示す。予期されるブチド（ｄ）に対して生じたオリゴクロ ーナル受容体により示される（レーン　及び５）。

ＰＤＧＦ−１及び−２のアミノ酸残基配列がｐ２８ＳｉＳの配列とコリニア−（ ｃｏｌｉｎｅａｒ）であると仮定して、ポリペプチド（Ｃ）のアミノ酸残基配列 はＰＤＧＦ−１及び−２の各々位置６７〜８３、及び７３−８９に対応する。Ｐ ＤＧＦ−２の残基７３〜８０のアミノ酸残基配列は決定されており　〔ドウリト ルら、サイエンス、２２１．２７５−２７７（１９８３））　、これら残基の総 てはポリペプチド（ｃ）の最初の（アミノ末端の）８つの残基と同じである。加 えて、ｐ２８ｓｉｓ癌蛋白の残基１４７〜１５５に対応し、かつＰＤＧＦからの ポリペプチドは配列化されており　〔ウォーターフィールド、ネイチャー、３０ ４．３５−３９（１９８３））　、現在までに同定された９つの残基の総てはポ リペプチド（ｃ）の対応する残基と同じである。すなわち、ポリペプチド（Ｃ） の１７の残基のうち１６個は、ヒト由来のＦＤＣＦ及びレトロウィルス形質転換 された細胞系統由来のｐ２８ｓｉｓの両者における残基と同じであり、かつ配列 において同じである。

上の結果は、本発明のモノクローナル受容体を分泌するハイブリドーマの調製に つながる免疫化のために有用なさらに二つのポリペプチドの免疫原性及び抗原性 を例示する。これらの結果はまた、ポリペプチド（Ｃ）に対して生じたオリゴク ローナル受容体が癌蛋白すなわちＰＤＧＦｌＰＤＧＦ−１、及びＰＤＧＦ−２に も結合するこ二つのＰＤＧＦ配列の種々の領域を表わすさらに別の合成ポリペプ チドが作られた。ＰＤＧＦ−１及びＰＤＧＦ−２のアミノ末端ならびにＰＤＧＦ −２の中央及びカルボキシル末端部分が合成され、免疫原担体キイホールリンペ ットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合され、そして前述した５０パ一セント結合滴 定量を示すオリゴクローナル受容体含有抗血清の生産を誘発するためにマウスに 注射された。

ＦＤＣＦ−２の独特の領域を表わすポリペプチドは、この配列の最初の１８のア ミノ酸を含み、ＰＤＧＦ−２（１−１８８ポリペプチド番号１１２）と呼ばれる 。ここでカッコ付きの数字は、アミン末端から番号を付された対応する分子のア ミノ酸残基を示す。ＰＤＧＦ−１の独特の領域は、ポリペプチド番号１１１とし ても引用されるポリペプチドＰＤＧＦ−１（１−１２）により表わされ、これは この配列の最初の１２のアミノ酸を含む。これら１２のアミノ酸の６つはＰＤＧ Ｆ−２と共通であり、しかし上述したように３つだけが連続している。第三のポ リペプチド、ＰＤＧＦ、−２（７３−８９）は、本明細書でポリペプチド（Ｃ） 及びポリペプチド番号１１３とも言われる。それは、ｐ２８ｓｉｓの予測された アミノ酸残基１３９〜１５５を表わし、カップリング目的のためにそのカルボキ シル末端に追加的システィンを含む。このポリペプチドはＫＬＨにカップリング された場合、血小板抽出物中の精製されたＰＤＧＦの小さくされたサブユニット 、ＭＷ３１０００．３００００．２１０００、及び１８０００−１４０００の蛋 白、及びＳＳＶ感染されたマー上セット細胞中の５６にダルトンの蛋白を認識す る抗体の生産を誘発した。第四ノポリペプチド、ＰＤＧＦ−２（１２６−１４５ ）はまた、Ｖ−排配列（ポリペプチド１１４としても引用されるｐ２８ｓｉｓの 残基１９１−２１０）により予測される。これらポリペプチドのアミノ酸配列は 、上記に示しである。

これら合成ポリペプチド接合体に対して生じたオリゴクローナル受容体含有抗血 清の特異性を分析するために、ＰＤＧＦをこれら抗血清で調べた。精製したＰＤ ＧＦは減少され（ｒｅｄｕｃｅｄ）、ポリアクリルアミドゲル中に電気泳動され 、そしてウェスターンプロット法を用いてニトロセルロース上に移された（第６ 図、レーンＡ−Ｆ）。

レーンＡ及びＢにおいて、ＰＤＧＦ−１（１−１２）に対する二つの抗血清は、 約１８．　ＯＯＯダルトンの蛋白と免疫反応した。精製したＰＤＧＦの配列分析 は、ＰＤＧＦ−１鎖の多くがこの位置に移動することを示す〔アントナイデスら 、サイエンス、２２０．９６３−９６５（１９８３））。これら抗血清の反応性 の弱さは、ＰＤＧＦ−１のアミノ末端が抗体結合にとって容易に接近できないこ とを示唆する。

対照的に、ＰＤＧＦ−２（１１８Ｘレ−：ｚＣ）の７ミ／末端に対する抗血清は 、約１８０００及び１４０００ダルトンに移動する蛋白を容易に検出し、ＰＤＧ Ｆ−２の配列分析（アントナイデスら、前出）と一致する。　゛ ＰＤＧＦ−２（７３−８９）により誘発された抗血清は、レーンＣで見られる同 じ活性（レーンＤＳＥ）を与える。対照的に、ＰＤＧＦ−２（１２６−１４５） に対する抗血清は精製されたＰＤＧＦに対する検出しつる活性を持たなかった。

ＰＤＧＦ−２（１２６−１４５）ポリペプチドの配列は、位置１４５でｃ−ＰＤ ＧＦと異る（ジョセフら、前出）ので、このアミノ酸残基配列変化がエピトープ 部位内に含まれることは可能である。これは、ポリペプチドが２０個のアミノ酸 残基長さでありかつ変化がポリペプチドをＫＬＨ抗体蛋白にカップリングさせる ために用いられたカルボキシ末端位置にのみ存在するので、ありそうもない。す なわち活性の欠損は、癌ポリペプチド特異的抗体の発生によるのでない。なぜな らこの抗血清は細胞由来のＰＤＧＦ類似分子と反応するからである。精製された 調整物中の検出されたＰＤＧＦの１４０００〜１８０００ダルトンのサイズは、 この物質の多くが、ｐ２８ｓｉｓの予測された配列のカルボキシ末端を欠くこと を示唆し、これはこの抗血清により認識されるＰＤＧＦ抗原部位の総て又は一部 を除去する。

ＰＤＧＦ類似蛋白がまた他の形質転換された細胞系統において合成されるかどう か決定するために、抽出物を作り、ＰＤＧＦ関連ポリペプチドに対する種々のオ リゴクローナル受容体含有抗血清で免疫化した。第７図において、ＳＳ■形質転 換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＰＤＧＦ−１（１−１２ＸレーンＡ−Ｃ，Ｆ−Ｈ 及びに−Ｍ）及びＰＤＧＦ−２（７３−８９ＸレーンＤ、Ｅ、Ｉ、Ｊ、Ｎ及びＯ ）で誘発されたオリゴクローナル受容体含有抗血清でテストした。ＰＤＧＦ−２ （７３−８９Ｘ第６図、レーンＤ及びＥ）に対する二つの血清のうち、第６図、 レーンＤで用いられた血清は、精製されたＰＤＧＦとのいく分弱い活性を示した 。しかし、第７図のレーンＤに見られる様に約７０．０００ダルトンの蛋白との 強い反応性が観察され、これは免疫化ポリペプチド、ＰＤＧＦ−２（７３−８９ ８レーンＥ）でのプレインキュベーションによりブロックされた（レーンＥ）が 、ＰＤＧＦ−１（１−１２）での抗血清の予備インキュベーションによりブロッ クされなかった。

このように、二つの抗血清によるこれら癌蛋白との特異的反応性は、これはＰＤ ＧＦの小さな領域との偶然の交叉反応性であること、しかしこの分子は少（とも ＰＤＧＦ−１のアミノ末端及びＰＤＧＦ−２の中心領域と相同な配列を含むこと を示す。

ｐ２８ｓｉｓとｐ２０ｓｉｓの量は、この抗ＰＤＧＦ−２（７３−８９）血清で の検出のレベルより低かった。同様の結果が別の抗血清により得られたが、過露 出が時折、２０．０００ダルトン帯が特異的に検出されたことを示した（データ は示さず）。

これら抗血清による二つの他の無関係の形質転換された細胞の抽出物の分析は、 同様の結果を与えた。ＴＲＤ１細胞系統は、自発的に形質転換されたＢａ１ｂ／ ３Ｔ３された系統である。〔ボーエン−ボーべら、ブロク、ナトルアカド、サイ ニーニスニー、８１．２３９６−２４００（１９８４））。この系統はまた、７ ０．０００ダルトンの蛋白ならびにより免疫学的に関係する約１００，０００ダ ルトン（第７図、レーンＧ−１）の蛋白を表現する。第三の細胞系統ＭＳＴＦ、 及びＦｅＬＶ−ＢとＦｅ５Ｖのシンダーセイレン株で生産的に感染されたミンク 肺系統（ＣＣＬ６４）はまた、同じサイズの蛋白を表現する（第７図、レーンに −０）。

７０．０００ダルトンの癌蛋白に加えて、ＰＤＧＦ−１（１−１２）に対するオ リゴクローナル受容体含有抗血清は約５３．０００ダルトンの蛋白を検出した（ データは示さず）。これら蛋白は、血清の不存在下で１ケ月の間成長した細胞の 抽出物中で検出されかつＴＲＤ１細胞系統によりコンディションされた無血清媒 体中で見い出されるので、血清汚染物ではない。研究された総ての細胞系統は、 これら二つのＰＤＧＦ類似蛋白を含む（図面の簡単な説明における第１１図の考 察も参照）。

癌遺伝子的に形質転換されない細胞（正常な二倍体ラット平滑筋及びヒト肺繊維 芽細胞）を含む種々の細胞におけるＰＤＧＦ類似分子の表現は、他のプロセスが 形質転換に関係することを示す。細胞系統の総てが、ＰＤＧＦ−１（１−１２） で誘発されたオリゴクローナル受容体含有抗血清で検出された７０．０００及び ５３，０００ダルトン蛋白を含んでいたが、細胞はＰＤＧＦ−２領域の配列によ り予測される決定基に対して向けられた抗血清により検出される他の蛋白のサイ ズ及び強度に関して全く相同である（データは示さず）。

これら相違の性質は現在未知である。

同様に、以下で（ｅ−ｈ）と示す四つの免疫原ポリペプチドの各々は、オリゴク ローナル受容体の生産を誘発するために用いられるこれらの免疫原ポリペプチド に、ならびにｒａｓ癌遺伝子によりコードされる二つの癌蛋白の各々の結合する ところのオリゴクローナル受容体を誘発するために用いられる。これら四つのｒ ａｓ関連ポリペプチドの配列を、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端 の方向に、下記式 ％式％） 組合わせた式 ポリペプチド（ｅ−ｈ） ＫＬｍＧＡＶＧＡＲ（Ｓ、　Ｖ、　Ｇ）ＧＶＧＫ。

により示される。

ここでカッコ内のアミノ酸残基は各々、式中の直前のアミノ酸残基配列残基に対 する代替物である。このように作られたオリゴクローナル受容体は、約１ケ月の 間の後述のような二回の免疫化後に、１：４００を越える希釈の５０パ一セント 結合滴定量を持つ。さらに、ポリペプチド（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）により誘発 されたｒａｓ関連オリゴクローナル受容体の各々は、（ａ）ヒ）Ｔ２４ぼうこう 肉腫細胞及びまた（ｂ）ハーベイマウス肉腫ウィルス感染マウス３Ｔ３細胞がら の分解された（ｌｙｓｅｄ）細胞抽出物中に存在する癌蛋白に結合することが見 られた（データは示さず）。

第１２図に見られるように、下記（ｋ及び１）に示した二つの免疫源性ポリペプ チドの各々は、それらの生成物を誘発する免疫源性ポリペプチド並びにｖｆｅｓ ＳＴ癌遺伝子によりコードされる２つの癌蛋白の各々に結合するオリゴクローナ ル受容体を誘発しうる。２つのＶ−ｆｅｓ関連ポリペプチドの配列は、左から右 へ、及びＮ末端からＣ末端の方向に式、 ポリペプチドｋ　ＬＭＥＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＰ（ポリペプチド１２７） ポリペプチドｌ　ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ（ポリペプチド１２１） により示される。

ポリペプチド（ｋ）及び（１）により誘発されるオリゴクローナル受容体は、ヒ トＴ２４膀胱癌の細胞及び自然形質転換マウス３Ｔ３セルライン（レーンＡ及び Ｃ）からの上清中に存在する癌蛋白に結合するのが見られる。

ポリペプチド１２１に対し作られたハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ　８９５２．Ｈ Ｂ　８９５４及びＨＢ　８９５５により分泌されるモノクローナル受容体は、胸 、直腸、胃及び子宮の腫瘍から得られた１又はそれ以上の蛋白と免疫反応するこ とが認められた。ポリペプチド１２７（ハイブリドーマ１２７−４２Ｃ１］、） に対して作られたモノクローナル受容体の、妊娠した母親の尿試料中の蛋白と反 応性は、以下に検討される。

第１３図に示されるように、ｒａｓ遺伝子に関連する蛋白は、ｖ−ｒａｓＨａ（ ポリペプチド１４２）の位１ｔ９６−１１８に対応するｒａｓ合成ポリペプチド に対して作られたモノクローナル抗体（ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ　８６７９ からの）により検出された。蛋白は、レーンＡ中に検出され、免疫化ポリペプチ ド（レーンＢ）とのブレインキ二ベーションにより阻止される。即ち、免疫化ポ リペプチドとのプレインキュベーションは、強く反応性態蛋白を阻止した。

１）に、又はｒａｓ関連ポリペプチド（ｅ　−ｈ　）に、又は下記の親和性吸着 剤において開示される他の癌蛋白関係ポリペプチドに対して生じたものは、さも なければＰＤＧＦのような純粋な形で得るのが困難な自然に発生する蛋白状物質 を作るための簡便かつ面倒が比較的少ない手段を提供する。すなわち、後述する 純粋なＰＤＧＦを得るために長い手順を経る必要よりも、単に細胞を溶解し、遠 心分離し、結合した抗ポリペプチド（Ｃ）受容体を含むアフィニティ吸着剤に上 澄みを注ぎ、形成された可逆的リガンド複合体を解離した後に精製した蛋白を溶 離することができる。いくつかの別の蛋白状物質が親和性吸着剤カラムに非特異 的に結合されうるが、さもなければ精製された形で得るのが困難な精製蛋白の単 離がそのような吸着剤を用いて大いに向上される。

上述した保存配列に対する抗血清は、広範囲の種々の形質転換セルライン中の蛋 白と反応する。抗血清は、正常コントロール中よりも、癌患者及び妊婦の尿中に ５からフィティ（ｆｉｔｙ）倍も濃縮されている癌遺伝子関連蛋白を容易に検出 する。表現の独特のパターンが、種々の悪性において及び妊娠の異なる妊娠期間 段階中に検出された。

抗ペプチド抗体は、配列癌遺伝子に免疫学的に関連する蛋白を検出するのに特に 適している〔ウォングら、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、ニーニスニー、７８．７４１２−７４１６（１９８１））。それらは配列 であるので、特殊な抗ペプチド抗体が、蛋白の高保存部位に指示することができ 、類似の作用を有しつる、確認している関連分子の可能性を最大にする。抗ペプ チド抗体による蛋白の免疫認識は、抗原フンフォメーションに大きく依存する必 要がないので、その大半が折りたたみ蛋白に特異な決定基に向けられる抗蛋白抗 体により検出されない蛋白を認識することができる。最後に、抗ペプチド抗体の 結合は、体液又は分泌物中に生じるかも知れない標的抗原の変調又は断片形に比 較的反応しない。

第１及び第３表中、抗体を作るのに用いられた合成ペプチドは、列挙され、他の 癌遺伝子の関連配列と共に表示される。例示的なｒａＳポリペプチド１４２は、 ｖ−ｒａｓＨａ又はｖ−ｒａｓＫｉによりコードされるｐ２１により自動リン酸 化されたスレオニン残基から下流の３７−５９アミノ酸に位置するｖ−ｒａｓＨ ａ配列である。配列はＨ−ＲＡＳと同一であり、Ｋ−ＲＡＳとは一個の保存アミ ノ酸変化で異なる。ケイボンら、ネイチャー３０４．５０７（１９８３）。ｓｉ ｓモノクローナル抗体を作るのに用いられるＰＤＧＦの配列は、ＩＩＪｌ（ポリ ペプチド１１２）のＮ末端に位置し、血小板誘発成長因子の他の鎖（ＰＤＧＦ− １）の最初の１２アミノ酸に類似している。ｆｅｓペプチド（ポリペプチド１２ ７）は、ｖ−ｆｅｓ−ｓｔ（ｖ−ｆｅｓ−ＧＡの位置９２７−９４２）の８５， ０００ダルトン融合蛋白の残基７４４−７５９を構成し、主要チロシンリン酸化 部位から下流の７９−９４アミノ酸である。本研究に用いられたポリペプチドは 、それらが個々の癌遺伝子ファミリーの高保存部分を表現するので選択された。

これらの保存配列に対する抗血清は、広範囲の種々の形質転換セルラインの蛋白 と反応する。３つの抗血清の、ネコ肉腫ウィルスにより形質転換されたミンク原 糸の蛋白との反応性は、第１４図に示される。ｓｉｓペプチドに対する抗体は、 ＳＳＶ形質転換ＮＲＫ細胞中の２０，０００ダルトン蛋白並びにミンク原糸（レ ーン１）中の約５６、　ＯＯＯダルトン（ｐ５６ｓｉｓ）のｓｉｓ関連蛋白を検 出する。ｓａｓペプチドに対する抗体は、約２１，０００ダルトン（ｐ２１　ｒ ａｓ）の主要蛋白及び細胞抽出物中の約３０．０００ダルトンの第二次の蛋白を 検出す。ｆｅｓ蛋白に対する抗血清は、８５．０００ダルトンｇａｓ−ｆｅｓ融 合蛋白（ｐｐ８５−ｇｏｇ−ｆｅｓ）並びに４０，０００ダルトン蛋白（ｐ　４ 　（１ｆｅｓ、レーン３）を検出する。

第１５図において、これらの抗血清の種々の患者からの尿蛋白との反応性を示す 。ｓｉｓ抗血清は、尿濃縮物（パネル４）中５６，０００．３１，０００及び２ ５．０００ダルトンの蛋白を検出する。

３つの全ての蛋白と結合している抗体は、ｓｉｓペプチド（パネルＢ）との予め のインキュベーションにより阻止されるが、ｒａｓペプチド（パネルＡ）とのイ ンキュベーションによってはされない。検出された蛋白の濃縮物は、正常担体よ り５０倍高い（下記参照）。検討された全尿は、３つｓｉｓ関連蛋白を含んだが 、リンパ腫の患者からの試料は例外で、これらには、５６，０００ダルトン蛋白 がなかった（レーン４）。

多発性骨髄腫及び胃癌の供与者からの尿中のｐ５５ｓｉｓ（パネルＡ。

レーン１及び２）の幾らか速い可動性は、これら試料中の過剰のアルブミンに基 づき、そこでは、レーン１中の低分子量蛋白のひずみは、過剰量の抗体り鎖に基 づく。

パネルＣにおいて、尿試料中に検出された種々のｒａｓ関連蛋白が提示される。

蛋白は、約１００，０００及び５５，０００ダルトンで、そして検出された（パ ネルＣ，レーン２−４）。再び、抗血清の特異性は、ｒａｓペプチド（パネルＤ ）とのブレインキュベーションにより活性を阻止することによって示されたが、 ｓｉｓペプチド（パネルＣ）とのブレインキュベーションではされれなかった。

５５．０００ダルトンｒａｓ関連蛋白は、５６，０００ダルトンｓｉｓ関連蛋白 とは異なり（下記参照）、各試料において異なる反応性パターンを示す。蛋白は 、パネルＣ。レーン１（胃癌）では検出可能ではないが、一方、はとんど等しい 強さの４つの横じまがレーン２（３８週妊娠）中に見られる。

強い反応性の二重じまは、乳癌の患者（供与者）からの尿がプローブされたとき 、レーン３に可視化される。約３５，０００ダルトンでの二次的横じまは、５５ ，０００ダルトン蛋白の高濃縮物と結合する、レーン４において、単一の５５． ０００ダルトン横じまが検出された。

約２１，０００ダルトンの蛋白がパネルＣの全４レーンに検出された。これらの より小さな蛋白は、パネルＣル−ン１中の蛋白の可動性がすこし遅いけれども、 類似の濃縮物で存在した。この変化した可動性は、ｒａｓコード化蛋白の電気泳 動可動性上、アミノ酸残基位置１２での変化の効果により、有意である。２５， ０００ダルトンで検出された結合は、抗体り鎖と共移動することに基づき、判断 するのが困難である。

パネルＥにおいて、３５．０００及び４０，０００ダルトンｆｅｓ関連蛋白が示 される。結合は、免疫化しているｆｅｓペプチド（パネルＥ５レーン１）とのブ レインキュベーションにより阻止されるが、ｒａｓペプチド又はｅｒｂ　Ｂ又は ａｂｌ蛋白（パネルＥ、レーン２−４）中の類似配列を表現しているペプチドと のインキュベーションによってはされなかった。

要約すると、上述した３の抗血清は、尿中８の異なる蛋白、３ｓｉＳ関連蛋白（ ｐ５６　ｓｉｓ、　ｐ３１　ｓｉｓ及びｐ２５ｓｉｓ）、３　ｒａｓ関連蛋白（ ｐｉ　００ｒａｓ、　ｐ５５ｒａｓ及びｐ２１　ｒａｓ）、及び２　ｆｅｓ関連 蛋白（ｐ４０ｆｅＳ、ｐ３５　ｆｅｓ）を特異的に検討した。

第２３図において、５１コントロール（正常；診断された腫瘍疾患がない）の尿 試料、又は種々の悪性を有する患者（供与者）からの２６０尿試料中の癌遺伝子 関連蛋白の検出の頻度が表示される。妊娠からの２６０尿試料中の同様の頻度が 第２４図に示される。尿中の癌遺伝子関連蛋白の量は、イムノプロットを用いて 評価され、４つのカテゴリー、検出不可能、検出可能、５−１５倍上昇、１５倍 上昇より大の一つに置かれた。

１０試料以上が試験された悪性の型は、個々に表示される。残っている型は、複 合体として表示される。

ｐ２１ｒａｓは、全腫瘍試料の約７０％に検出された。しかしながら、同様の頻 度は外見上は正常固体中に見られた、乳癌患者の尿中に見出される上昇レベルの ｒａｓ及びｆｅｓ関連蛋白と対称的に、膀胱及び前立腺癌患者は、上昇レベルの ５６．０００ダルトンｓｉｓ関連蛋白をしばしば分泌する。この蛋白は、上述し たｒａｓ及びｆｅｓ関連蛋白の非存在下に検出された（第１５図、レーン１．２ 、パネルＡ−Ｃ）。５６．０００ダルトンｓｉｓ関連蛋白に加えて、これらの患 者は、上昇レベルの３１，０００及び／又は２５．０００ｓｉｓ関連蛋白をしば しば有した。さらに対称的に、良性の前立腺小結節患者からの尿は、上昇レベル のこれらの癌遺伝子関連蛋白を含まなかった（第８図、レーン３、パネルＡ−Ｃ ）。

高レベルの同様の蛋白は、また、肺及び頚癌並びに非ホジキンリン腫の患者から の尿中にしばしば見出された（第２３図参照）。これら後者の患者では、上昇し た３１．０−００及び／又は２５．００Ｑｓｉｓ関連蛋白が、５６．０００ダル トン蛋白の非存在下に見られた（第５図、レーン４、パネルＡ−Ｂ）。

即ち、癌患者からの尿試料中には、３つの異常なパターンが観察された。乳癌患 者のサブセットは、ｐ４０ｆｅｓ及び／又はｐ３５ｆｅｓと共に上昇レベルのＩ ）５５ｒａｓを有した。膀胱及び前立腺癌患者は、ｐ５５ｒａｓ、　ｐ４０ｆｅ ｓ及びｐ３５ｆｅｓの非存在下、増加した量の３つの全ｓｉｓ関連蛋白を排泄す る。最後に、肺癌及びリンパ腫患者のサブセットは、上昇レベルの低分子量サイ ズのｓｉｓ関連蛋白の２を排泄した。第１５−１８図並びに第２３図から見られ うるように、表現のパターンは、上レベルの単一癌遺伝子関連蛋白の排泄よりも 疾病段階とよく相関する。明白に正常な個人では、上昇レベルのこれらの蛋白が ほとんど検出されない。

ここに記載された蛋白は、種々の抗ペプチド抗血清の高特異的反応性に基づく癌 遺伝子蛋白に免疫学的に関連している。しかしながら記載した８つの蛋白の、わ ずか２つ（ｐ２１　ｒａｓ、　ｐ３１５ｉｓ）が癌遺伝子コード化全蛋白を表現 する。

ｐ２１ｒａｓ蛋白は、ＧＴＰ結合活性を有する。即ち、ｐ２１ｒａｓは、細胞分 裂と密接に関連しており、それゆえ蛋白がほとんどの尿試料中に容易に検出され ることは驚くに足りない。

同様に、Ｈ−ｒａｓ又はＫ　−ｒａｓに特異的な、上昇レベルの転写（Ｔｒａｎ ｓｃｒｉｐｔ）が、ここに見られるように広く種々の悪性に検出された。もっと さらに、ｒａｓ関連生成物に対する抗血清も、腫瘍組織中に、上昇した表現を検 出した。ここに、本蛋白の最も著しい上昇が、悪性の尿中に見られた。

血小板誘発成長因子（ＰＤＧＦ）の鎖の一つである、ｐ３１ｓｉｓ蛋白も、また 検出された。ＰＤＧＦ−１鎖は、血小板から分離されたとき、わずかに１８，０ ００ダルトンで、ヒトｃ−ｓｉｓ配列とｖ−ｓｉｓとの比較は、１８，０００ダ ルトン蛋白を示し、より大きな前駆体蛋白を始める。確かに、部分的精製血小板 抽出物の分析は、約３１゜ＯＯＯダルトンの蛋白を明らかにする。ＰＤＧＦは、 力強い分裂誘発活性を有し、組織傷害の部位で血小板から遊離されるので、ＦＤ ＧＦの生理的作用の一つは、創傷治癒であると思われる。加えてＰＤＧＦ様物質 は、多くの形質転換セルラインから分泌され、分泌は、平滑筋細胞中に、発生的 に調節されるように見える。即ち、ｐ３ｓｉｓはｐ２１ｒａＳと同様、生理的に 重要であり、それが正常及び異常段階で尿中に存在するのは驚くに足りない。

予期された分子サイズの癌遺伝子コード化蛋白に加えて、付加的蛋白が本研究で 検出された。それらの存在は、それらが幾つかの癌で並びに妊娠中、特異的に存 在することから、偽交差反応性に基づくものではない。さらに、抗体とこれらの 蛋白の反応は、適当な合成免疫源で特異的に阻止された。免疫源として用いられ る蛋白が癌遺伝ファミリー中の保存配列を表現するので、これら付加的蛋白は、 これらの遺伝子ファミリーの数を表現する。これら遺伝子の表現は、新形成又は 妊娠中、相関調製を受けるであろう。これら蛋白の超厚と関係なく、それらが新 形成及び妊娠の間、特異的に表現されるという事実は、それらを重要なマーカー にする。

■０診断系及び方法 診断系、好ましくはキット形の、は、本発明の更に別の実施態様である。この系 は、免疫反応の形成により癌蛋白の存在を評価するのに有用である。この系は、 本発明の生物学的に活性なモノクローナル受容体分子を含む少くとも一つのパッ ケージを含む。すなわち受容体は、（ａ）レトロウィルスの遺伝子によりコード される癌蛋白リガンドのアミノ酸残基配列の一部に対応する、アミノ酸残基配列 中に約７〜約４０、好ましくは約１０〜約３０のアミノ酸残基を含むポリペプチ ド、及び（ｂ）レトロウィルス遺伝子によりコードされる癌蛋白に結合する。

所定の量のモノクローナル受容体分子が癌蛋白リガンドを含む水性組成物の所定 量と混合されたとき、免疫反応が起り、受容体とりガント抗体と抗原の間のコン プレックスを作る。癌蛋白を含む水性組成物の例としては、細胞分解物、血清、 血しょう、尿及び羊水が挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、一つ以上の癌遺伝子関連翻訳生成物に対する抗血清によるスクリーニン グに有用であることは、特に価値がある。即ち、ここに述べる評価方法は、単一 供与者から得た一部の体液試料アンチコツｈ　（ａｎｔｉｑｕｏｔｓ）上で実施 することができ、悪性状態、妊娠状態などに関して正確な情報を産生ずる。

受容体とりガントの間の混合は水性組成物中で行われる。しかし、受容体又はリ ガンドが、この混合前に実質的に乾燥しており、水不含であることができる。す なわち、ハイブリドーマ上清、腹水又は緩衝液中の受容体の溶液を水性細胞抽出 物と混合して、二つの水性組成物からの反応物を混合することができる：受容体 はミクロタイタープレートの藍上にコーティングされ、そしてリガンドを含む細 胞抽出物又は血清と混合されることができる；又はリガンドはミクロタイタープ レート壁、アクリルアミドゲル中などから移動後ニトロセルロースシートにコー ティングすることができ、又は組織切片、及びハイブリドーマ上清、腹水、又は 混合された受容体を含む緩衝溶液中に存在することができる。

本発明の例示的診断系及び方法の使用を図の説明において例示する。そこでは、 ニトロセルロース上にコーティングされ、次に本発明の受容体−と混合される癌 蛋白リガンドが第１．２．５−８及び１１−１４図と関係して述べられ、一方、 免疫学的コンプレックスを形成するためにハイブリドーマ上清でインキュベート された細胞抽出物は、第３図に関して説明される。尿試料からの癌蛋白は、第９ ．１０図及び１５−１９図で説明される。

受容体は、「指示基」又は「ラベル」とともに用いられる。指示群又はラベルは 、免疫反応が起り免疫学的複合体が形成されたかどうか決定する、及びある例で はそのような反応の程度を決定するための手段として受容体と組合せて用いられ る。

指示基は、放射性元素の場合におけるような単一原子たとえばヨウ素１２５又は １３１、水素３又は硫黄３５又は炭素１４、又はＮＭＲ活性元素たとえばフッ素 １９又は窒素１５であることができる。指示基はまた、フルオレセイン、ローダ ミンＢのような蛍光染料又は酵素たとえば西洋わさび　ベルオキシダーゼ（ＨＲ Ｐ）又はグルコースオキダーゼなどのような分子であることもできる。

指示基は、抗体が１２５１でラベルされる場合のように受容体に結合されること ができる。指示基はまた、ＨＲＰに結合された受容体がマウスにおいて生じる、 又は１２５Ｉのような放射性元素がスタフィロコッカス　アウレウスから得られ たプロティンＡに結合されるような受容体分子と反応する別の分子の総て又は一 部又は原子であることもできる。

指示基がＨＲＰ又はグルコースオキダーゼのような酵素である場合、免疫反応が 起こり受容体−リガントコンプレックスが形成された事実を可視化するために、 さらに追加の剤が必要である。

ＨＲＰのためのそのような追加的剤としては、過酸化水素、及び酸化染料前駆体 たとえばジアミノベンジジンが挙げられる。グルコースオキダーゼのために有用 な追加剤としては、ＡＢＴＳ染料、グルコース及びＨＲＰが挙げられる。

指示基又はラベルという言葉はここで、受容体に結合された又は別々に用いられ る単−原子及び分子を包含して用いられる。これら原子は又は分子が単独で用い られるか又は追加的剤との関係で用いられるかにはよらない。そのような指示基 又はラベルは免疫化学において自体周知であり、それらが他の点では新規な受容 体、方法及び／又は系とともに用いられる限りにおいてのみ本発明の一部を成指 示基又はラベルに好ましくは、受容体とともに供給され、−緒に又は別々に包装 されうる。過酸化水素及びジアミノベンジジンのような追加的剤はまた、ＨＲＰ のような指示基が用いられる場合、系に含めることができる。そのような物質は 、多くの指示基と同様に市販で容易に入手でき、診断系と共に供給される必要が ない。また、過酸化水素のようなある剤は、常時分解し、又はさもなければい（ つかの放射性元素のように短寿命であり、最終ユーザーによってより良く供給さ れる。

本診断系はまた、商標イムロン■として売られている（ダイナチック、アルキサ ンドリア、ＶＡ）９６個のウェルのミクロタイタープレートである固体マトリッ クスを含むことができる。ミクロタイターストリップ又はプレートは、明るいプ ラスチック物質、好ましくはポリビニルクロライド又はポリスチレンから成る。

本発明の診断系及び方法で用いられる代りの固体マトリックスとしては、アボッ ト　ラボラトリーズ、ノースジカゴ、ＩＬ、から入手できる直径約１ミクロンか ら約５ミリメーターのポリスチレンビーズ、任意のサイズのポリスチレンチュー ブ、ステラツク、パドル、そのポリスチレン粒子が約１ミクロンのサイズであり 、ラテックスから遠心分離できるところのポリスチレンラテックスが挙げられる 。

固体マトリックスはまた、種々の物質、たとえば架橋デキストランたとえばセフ ァデックスＧ−２５、−５０、−１００、−２００など〔ファーマシア・ファイ ン・ケミカルズ、ピスカタウエイ、ＮＪ、から入手できる〕、アガロース及び架 橋アガロースたとえばセファロース−６Ｂ、ＣＬ−６Ｂ、４Ｂ、ＣＬ４６など（ ファーマシア・ファイン・ケミカルズより入手できる）から作ることもできる診 断系はさらに、評価結果を比較するための標準、及び乾燥した又は液体の形の種 々の緩衝剤（とくにミクロタイタープレート壁を洗うため、サンプルを希釈する ため、ラベルされた反応剤を希釈するためなどのための）を含むことができる。

温血動物からの体試料中の癌蛋白リガンドの存在の評価方法は、本発明の他の局 面を構成する。一般的評価方法に従って、本発明のモノクローナル受容体は、癌 蛋白リガンドの存在を評価されるべき試料を含む水性組成物に混合される。好ま しくは、モノクローナル受容体及び体試料は、予め定められた量で用いられる。

こうして調製された混合物は、受容体とリガンドの間で免疫反応が起こり、免疫 コンプレックス（反応生成物又は免疫反応物）を形成するのに十分な時間の期間 、保持される。免疫コンプレックスの存在が、次いで決定され、その存在は、評 価試料中に癌蛋白リガンドの存在を示す。免疫コンプレックスの存在は、前述の 標識を用い、又は抗体−抗原コンプレックスの存在を決定するだめの免疫化学で よく知られた他の手段により決定される。

特異的評価方法も考慮される。これらの特異的方法の各は、上記３つのステップ が用いられるが、これら評価方法の細部は、互いに少し異なる。

評価されるべき試料が、固相マトリックス、例えばミクロタイタープレートテス トウェル又はニトロセルロースシートに固定され、固体支持体を形成する固相評 価は、特に好ましい。かかる場合、評価される試料の混合及びモノクローナル受 容体が固液相混合物を形成する。固及び液相は、前述の保持期間後、分離され、 液体−受容体コンプレックスの存在が、固体支持体に結合する受容体の存在によ り決定される。結合した受容体の相対量は、多（の評価で決定でき、これによっ て、評価される試料中に存在した癌蛋白リガンドの量の決定を提供する。

本発明の受容体分子もまた固体マトリックスに固定でき、固体支持体を形成する 。この場合、評価される試料は、添加されて固液相混合物を形成し、混合物は前 述したように保持され、評価された試料中の免疫コンプレックス及び癌蛋白の存 在は、予め決定した量の標識化リガンド、例えば固定受容体分子により結合され るポリペプチド又は癌蛋白の混合体によって決定される。即ち、受容体及び癌蛋 白間で形成したコンプレックスの存在は、標識化リガンド結合の量を提供し、該 結合量は、試料が評価されている該蛋白の遊離の場合に提示される既知の対照量 よりも少ない。試料中の癌蛋白の相対量は、過剰の受容体を用いること及び標識 化リガンドの減少した結合を測定することによって決定できる。

ポリペプチド又は本発明の受容体分子により結合される癌蛋白リガンドも、固体 マトリックスに添付でき、固体支持体抗原を形成する。既知の過剰量の本発明の 受容体分子は、評価されるべき試料と混合され固体混合物を形成する。こうして 形成された固体混合物は、免疫コンプレックス反応生成物を形成するのに十分な 期間保持され、その後固体支持体と混合され、固−液相混合物を形成する。混合 物は、存在する過剰の未反応受容体分子が免疫反応して固相支持抗原とコンプレ ックスを形成するのに十分な期間、保持される。形成されるコンプレックスの量 は、固及び液相の分離後、既に記載された手段を用いて決定される。この方法は 、試料中の癌蛋白の存在に関しての、モして又、予め決定された量の受容体及び 固相リガンドが用いられる場合は、その相対に関して決定を提供できる。

■、特異的評価 液体体試料は、−以上の癌遺伝子コード化蛋白に対する抗血清でスクリーンでき る、スクリーニングは、本発明の評価方法に従って系統的に成し遂げうる。−以 上の抗血清での試料のスクリーニングは、評価される試料中に存在する癌蛋白の パターンを提供する。

乳癌患者において、ｐ５５ｒａｓ及びｐ４０ｆｅｓは、膀胱及び前立腺癌患者に みられるｐ５６ｓｉｓ（第１８図）に比べ上昇していることが見られる（第１６ 及び１７図）。又、膀胱及び前立腺癌患者は、しばしば３１にダルトン又は２５ にダルトンｓｉｓ関連蛋白の上昇レベルを証明する。対照的に、良性の前立腺小 結節の供与者は、これら上昇レベルの蛋白を証明しなかった。

高レベルの小蛋白もまた、肺及び頚癌並びに非ホジキンリンパ腫患者に見られた （第２３図参照）。これらの患者では、上昇した３１にダルトン及び／又は２５ にダルトンｓｉｓ関連蛋白が、５６にダルトンの不存在下に見られた（第１５図 、レーン４．パネルＡ−Ｂ）。

即ち、癌患者からの尿試料中に、３つの異常なパターンが観察された。乳癌患者 のサブセットは、ｔ）４０ｆｅｓ及び／又はｐ３５ｆｅｓと接合した上昇レベル のｐ５５ｒａｓを有する。対照的に、膀胱及び前立腺癌の患者は、ｐ５５ｒａｓ 、ｐ４０ｆｅｓ及びｐ３５ｆｅｓの不存在下に増加した量の３つの全ｓｉｓ関連 蛋白を分泌する。最後に、肺癌及びリンパ腫患者のサブセットは、上昇レベルの 低分子量サイズのｓｉｓ関連蛋白のみを分泌する。図面かられかるように、表現 のパターンは、高レベルの単一癌遺伝子関連蛋白の分泌よりもよく疾病状態と相 関する。明らかな正常な担体では、上昇レベルのこれらの蛋白は、はとんど検出 されない。

尿中の癌遺伝子関連蛋白の発見は予期されなかったし、他者によりこれまで報告 されていない。この発見は、本発明のもっと別の方法側面のための基礎を提供す る。

この方法に従って、尿又は尿濃縮物試料は、前述のように、癌蛋白と免疫反応す る受容体と水性組成物に混合される。混合物は、免疫コンプレックスが形成する のに十分な期間、保持され、免疫コンプレックスは、前述のように一般的評価方 法及び前述の特異的方法との関連で決定される。

この方法で、癌蛋白と免疫反応に知られているいかなる受容体も使用できる。即 ち、受容体分子は、ポリクローナル、オリゴクローナル又はモノクローナル起源 であることができ、全体又は融合癌蛋白、又はここに記載されるようなポリペプ チドに対して作ることができる。

プロッティング技術、例えば図面のウェスターンプロットの技術及び試料が固体 支持体としてニトロセルロースマトリックスに添付され、そこで液体水性組成物 中の受容体分子がニトロセルロースに固定される、いわゆるスロットプロットが 分析用に好ましい技術である。しかしながら、他の技術、例えばミクロタイター プレートウェルを固体マトリックスとして用いる固相エルサ及びラジオイムノア ッセイ（ＲＩ　Ａ）、及びディツプスティック法もまた有用である。

■、子宮内、胎児性決定 ５部位置径の（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）モノクローナル抗体プローブ及び 単一オリゴクローナル血清プローブが、新生児及び妊婦からの尿中の１ベータＴ ＧＦ、ＥＧＦ、１ｎｔ−１，ｆｅｓ、ｒａｓ及びｍｙｂに関連する癌蛋白を検出 するのに用いられる。ベータＴＧＦ関連癌蛋白リガンドのサブミツトは、新生離 床試料中にもっばら見られた。これら試料のサブミツトは、ｆｅｓ及びｒａｓ関 連蛋白を含み、それらは、既に説明したが、乳癌患者からの尿中に上昇した。雄 及び雌新生児又は妊婦からの尿試料は、付加的癌遺伝子蛋白を含んだ。２つの蛋 白（ｐ５５ｒａｓ及ｐ４Ｑｆｅｓは、１６−１８週の雌胎児を宿している妊婦か らの尿試料中に上昇していた。抗体プローブを作るのに用いられたハイブリドー マ及び合成ポリペプチドは、第４表に表示される。試料は、以下に説明されるよ うなウェスターンプロット技術を用いてスクリーニングされた。

第４表 部位置径の抗体１／ 癌遺伝子／ 成長因子　ハイブリドーマ　ポリペプチド数ベータＴＧＦ　（オリゴナール）　 １０００ＥＧＦ　４３２−２５ＧＯ７４３２ ｉｎｔ−１２２２−３５ＣＯ８ ２２２−３３ＡＯ５２２２ ｆｅｓ／ＦＥＳ　１２７−４２Ｃ１１１２７ｓｒｃ　２０３　０７Ｄ１０　２０ ３ Ｈ−ＲＡＳ／Ｎ−ＲＡＳ　１４２−２４　Ｅ　０５　１４２ｃｍｎｙｃルー訂Ｃ １５２−０６Ｄ１１　１５２ｖ−ｍｙｂ　１３３−１０　Ｆ　０６　１３３２／ 各尿試料は、材料及び方法の部で説明したように減少され、煮沸されそしてポリ アクリルアミドゲルに適用した。ニトロセルロースに移転後、個々の試料は、６ つの各抗血清でプローブされた。２５個体についての結果は、第５表に表示され 、表中、相対密度値は光学的に決定された。

１／　癌遺伝子成長因子、ハイブリドーマ名称及びポリペプチド数は、第１及び ２表に表示した通りである。

２／　本ポリペプチドは、ニワトリ配列中に見られる３つの隣接ヒスチジンの一 つが欠けている。

第５表 ＩＢＡ　０　０　１　０　１　０　０　１　０　１　０　１　０　０　０　２　 ０　０　５　０　０ＶＡＬ　Ｏ０００００００００００００００００１００ＣＩ Ｎ　０００　０．２００　１０１１０１Ｏ０１１０１００ＩＭＥ　２２２　１０ ０１　１３２０１０００２２０５３０ＳＴＲ２２２００００２４２０１０００１ ３０４０１ＷＯＬ　３０３　００００　２５３００００００３０５２０ＳＥＲ２ １２２３０２０２２０３１１２３１０３０１ＣＡＲ３２３０１１００５２０００ １２３２０４０２ＴＯＴＡＬ６５７　２６２３　６６８０４４４３７６１１２２ ５ＰＯＳ、　２ （計） ＨＯＬ　０　０　０　０　１　１　０　０　０　１　１　１　０　０　０　１　 ０　１　０　０　０ＳＡＮ　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０ 　０　０　０　０　０　０　０　０　２ＧＥＡ　０　００　０　０　０　０　０ 　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　０　１ＧＡＲ００００１００ ００１０１００００００００１ＰＥＡ　０００　０　１　００　０００００００ ００００００２ＳＵＮ　０００　００００　０００００００００００００１ＢＡ ＲＯ０００００００００００００００００００１ＢＡＴ　ＯＯ００２２０００１ ００１１０１００００２蓋＾［００００２０００００００００００００００３Ｓ ＩＭ０００　２２００　００００２００２０００００３ＢＯＯ００９０００００ ００００００００００００１び２表に表示した通りである。

第６表 材料尿中の蛋白レベルＩ ＩＭＦ　０３００３０　２００２　４３　２　００ＧＯＵ　０２００２１　００ ０２　２２　３　３３ＡＢＢ　１１１１０３　１４０１　０３　０　０１ＧＯＯ ３３００１３２００３３３５３２ＶＩＣ２２０００００００１３３０ＮＴＮＴ” ＲＡＳ　２３３３０２　０４０１　２２　５　４１ＰＥＲ１１００４３２２０４ ００２４２ＭＥＺ　１１１２１２　０３１２　１３　４　４１Ｍ５丁　０１２２ ００　０４２１　００　３　３１ＢＬＡ　１１１１　２１　２２０２　３３　１ 　ＮＴＮＴＴＥＲ２２２２３１２３０２１３３ＮＴＮＴＮＩＭ２２１１　３３　 １３０２　４３　４　ＮＴＮＴＳＴＲ２１０００３１００１３３０ＮＴＮＴ計　 １０１３７７　９１１　８８２１４　８８　１１　７ＰＯ３，！ （雌胎児） ＤＵＱ　００００　２２　０００２　２２　３ＢＯＯ０００００１０００１０２ ０ １１Ａｃ　０　１　０　３　０　３　１　０　０　３　３　２　２ＥＳＰ　０１ ０３０３　１００３　３２　２ＬＯＲ１１０１０００００００２２ ＢＥＬ　３２０２０２　１００２　４０１１ＡＩ？　１２００　１３　０００３ 　２３ｆＡＴ　０２００１２　１００２　２２ＴＯＴＡＬ　４　６　０　３　４ 　７　４　０　０　７　５　７ＰＯ３，！ （雄胎児） １、第５表の注１及び２参照 ’ＮＴ−試験せず。

幾つかの癌遺伝子又は成長因子関連蛋白は容易に検出されたけれども、どの試料 も検出可能レベルのＥＧＦに関連する蛋白は含んでいなかった。しかしながら、 全試料は、ベータＴＧＦに向けられたオリゴクロナール抗血清と反応性の蛋白を 含んでいた。さらに、雌試料のみは、検出可能レベルのＰ２４／Ｐ２３ベータＴ ＧＦ（Ｐｉ２ベータＴＧＦの存在又は不存在下）を含んでおり、これに対し維新 生先からの尿試料はＰ１２ベータＴＧＦのみを有した。

癌遺伝子関連蛋白の性結合表現はまた第５表に示される。雌試料のサブセットは 、容易に検出可能レベルのＰ　３５　ｆｅｓ、　Ｐ　３　ｇ　ｆｅｓ、　Ｐ４Ｑ ｆｅｓ及びＰｌｏｏｒａｓを含有し、Ｐ　５５ｒａｓ、　Ｐ　３５ｆｅｓ、　Ｐ 　４０ｆｅｓ及びＰ　５５　ｒａｓは、前述のように、乳癌患者並びに妊娠のサ ブセットからの尿中に上昇レベルで既に検出された。

胎児尿中に癌遺伝子関連蛋白のパターンは、かなり不均質を示した。幾つかの蛋 白は性関連手法で一様に検出されたけれどもこれらの蛋白をさらに特徴づけるた めに、濃縮材料法の連続的収集物がプローブされた。

２２の妊娠した母親から連続的に収集された（１６−２０週の間）ものもまた、 前述の６抗体プローブを用いるウェスターンプロット分析によりスクリーニング された。スクリーニングの結果は、第６表に示される。見られるように、新生児 尿中に検出されたほとんどの蛋白が、正常尿中にも見出される。はとんどの蛋白 の濃縮物は１６−２０週の間、一定に保ち、異常ではあるが、パターンは各固体 について見出された。パターンにおける差異は、１６−２０週の期間に均一に検 出される蛋白を比較することによりもっとも容易に認識された。

同一個体からの試料中に相異的に一定であった蛋白に加えて、他の蛋白の濃縮物 は、劇的に変化した。例えば、Ｐ２４／Ｐ２３ベータＴＧＦは、はとんどの個体 からの尿中に検出された。対照的に、Ｐ４０ｆｅｓ及びＰ５５ｒａｓは、雌胎児 を宿している母親からの尿中にのみ検出された。しかしながら、雌胎児を有する 全ての患者からの毎週の尿収集物は検出可能レベルのこれらの蛋白を含まながっ た。

１ケ月収集期間の間、表示されたほとんどの蛋白は、胎児の性に関係なく約半数 の患者に検出された。これら均一に検出される蛋白とは対照的に、Ｐ　４０　ｆ ｅｓ及びＰ　５５　ｒａｓは、雌胎児を宿している患者に特異的に検出された。

８患者からの尿は、検出可能レベルのＰ５５ｒａｓを含み、これら８患者の７か らの尿は、また検出可能レベルのＰ　４０　ｆｅｓを含有した。全材料及び新生 児患者からの尿中に性結合蛋白の検出が欠けていることは、表現の短期間に基づ く。蛋白を示す、１６−２０週の材料床の毎日の収集物は、１週よりも少なく検 出された。

短期間の検出は、表現のホルモン調節に基づくようである。インシュリンを受け ている糖尿病の妊娠患者の最初の評価は、延長期間を越えて（少くとも６週）こ れらの蛋白の存在を明らかにする。さらに、蛋白の検出能力は、胎児の性によら なかった。同様に、より若い又はより古い雄胎児をもつ正常患者からの収集物は 、Ｐ　５５　ｒａｓの存在を表わす。即ち、性結合蛋白は、外側の因子又は蛋白 遺伝子の一時的表現により誘発された材料蛋白であろう。

妊娠（期待の）母からの尿試料についての上記の結果は、宿されている胎児の性 を予言する手段を提供する。前に述べたように、雄胎児を宿している妊婦は、Ｐ ４０ｆｅｓ又はＰ　５５　ｒａｓ蛋白を表現しなかったが、一方雌胎児を宿して いる妊婦は、妊娠の１６−２０週の期間、、これらの蛋白の一つ又は両方を表現 した。雌胎児を宿しているこれら妊婦の幾らかは、その期間中、これらの蛋白の 一方を表現しなかった。

雄胎児を宿している妊婦は、間違った陽性がなかったので、最初の１６−２０週 の妊娠期にある妊娠の尿に明白なＰ　４０　ｆｅｓ及び／又はＰ　５５　ｒａｓ 癌蛋白リガンドを見出すことは、子宮内に雌胎児の存在を確かめるための陽性の 、非可逆性評価を提供する。１６−２０週の期間の妊婦の尿試料中に表現された Ｐ　４０　ｆｅｓ及び／又はＰ５５ｒａｓ癌蛋白リガンドが存在しないことは、 約５０−６０パーセント（各、１４例中７及び１４例中８）妊婦が雄胎児を宿し ていることが予言できる。

本方法に従って、妊娠の初めの約１６から２０週における妊婦からの尿の試料が 提供され、好ましくは２−メルカプトエタノールで希釈され、煮沸され、最も好 ましくは濃縮される。試料は、（ｉ）ＬＭＥＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ（第１ 表のポリペプチド１２）及び （ｉｉ）ＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＹＬＶＧＮＫＣ（第１表のポリペプ チド１４２） からなる群から選ばれた、左から右に及びＮ末端からＣ末端の方向の、式を有す るポリペプチドと免疫反応する受容体分子と混合される。得られる混合物は、受 容体分子が尿中の癌蛋白リガンドと免疫反応するのに十分な期間保持される。免 疫反応の存在は、これら受容体分子と、（ｉ）受容体分子が上記ポリペプチド（ ｉ）と免疫反応する約４０にダルトンの、又は（ｉｉ）受容体分子の上記ポリペ プチド（ｉｉ）と免疫反応する約５５にダルトンの５−１７バーセントポリアク リルアミドゲル中に相対分子質量を有する癌蛋白リガンドとの間で決定される。

子宮内に雌胎児の存在。

好ましい実施では、用いられる受容体分子はモノクローナルである。最も好まし くは、モノクローナル受容体分子はそれぞれ引用番号１２７−４２Ｃ１１及び１ ４２−２４ＥＯ５（Ｈ８６７９）を有するハイブリドーマにより分泌される。

■、親和性吸着剤 その中で本発明のモノクローナル受容体分子が活性な結合部分を成している親和 性吸着剤が、本発明のさらに別の態様である。

この態様において、本発明のモノクローナル受容体分子は、この吸着剤により精 製されるべき癌蛋白質リガンドに対し化学的に不活性な固体支持体に結合される 。ここで化学的に不活性という言葉は、固体支持体と癌蛋白質リガンドの間の化 学反応が起らないことを意味するものとして用いられる。しかし、固体支持体と 癌蛋白質の間の物理的相互作用たとえば非特異的結合は、好ましくは最小にされ るべきてはあるが、起ることができ、かつ実際に起る。

固体支持体は、種々の物質、たとえば架橋デキストランたとえばセファデックス Ｇ−２５、−５０、−１００、−２００など（ファーマシア　ファイン　ケミカ ルズ、ビスカタウエイ、ニュー７ヤージイ、より入手できる）、アガロース及び 架橋アガロースたとえばセファロース６ＢＳＣＬ６Ｂ、４Ｂ、ＣＬ４Ｂなど（や はりファーマシア　ファイン　ケミカルズより入手できる）、又はバイオ−ゲル Ａ−０，５Ｍ５Ａ−１，５ＭＳＡ−５０Ｍなど（バイオ−ラド　ラボラトリーズ 、リッチセンド。スルホルニア、より入手できる）、又はポリアクリルアミドビ ーズたとえばパイオーゲルＰ−２、Ｐ−３０、Ｐ−１００、Ｐ−３００など（パ イオーラド　ラボラトリーズより入手できる）から成ることができる。ポリアク リルアミドビーズは、これら支持体のうち最低の非特異的結合の傾向を持つが、 しかしまた典型的に、その結合容量を制限する低い多孔性を持つ。アガロース及 び架橋アガロース物質がここで好ましく、固体支持体として例示的に用いられる であろう。

アガロース支持体は典型的には、臭化ジシアンを用いて結合のために活性化され る。活性化された支持体は次に洗われ、活性化皮・特休を乾燥することなく受容 体分子と結合される。支持体と結合した受容体は次に洗われ、用いられる。支持 体上の未反応反応性基は、もし望むならアミンたとえばエタノールアミン又はト リスと反応させられることができる（これら反応性基は迅速に崩壊するけれど） 。

親和性吸着剤は、ビーカー又はフラスコの中でのようにゆるんだ状態で用いるこ とができ、又はそれはカラムに詰めることができる。使用前に、親和性吸着剤は 、非特異的に結合した蛋白又は支持体に不安定に結合された受容体を除去するた めに、態量白質精製のために用いられた緩衝液又は他の水性媒体中で洗うのが好 ましい。

親和性吸着剤の結合した受容体が結合するところのポリペプチドのアミノ酸残基 配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ癌蛋白リガンドを含む水性組成物たとえ ば血清又は細胞抽出物が用意され、次にそして次に親和性吸着剤と混合される。

この混合物は、結合した受容体と癌蛋白リガンドとの間の可逆的な結合受容体− リガンドコンブレダクースモ形成−するｔ 結合受容体−リガントコンプレックスは次に、コンプレックス化されなかった水 性組成物の残部から分離され、それにより親和性吸着剤に結合された精製形の癌 蛋白を得る。混合がビー力又はフラスコで行われる場合、この分離は濾過及び洗 浄により行われることができる。吸着剤がカラム中にある場合、分離は、非コン プレックス化水性媒体の溶離、及び好ましくは続（洗浄段階により行われうる精 製蛋白が親和性吸着剤を含まないことが望まれる場合、これは典型的に種々の手 順で得ることができる。これら手順のどれにおいても、可逆的な結合受容体−リ ガントコンプレックスは、支持体に結合された受容体と癌蛋白リガンドの成分部 分に解離され、次にこのリガンドが結合受容体から分離されて、親和性吸着剤不 含の精製癌蛋白を与える。

可逆的コンプレックスの解離は、種々の方法で行ないうる。約２．５のｐＨ値の ０．２モルのグリシン塩酸塩が典型的に用いられる。

あるいは、結合れさたリガンドは、可逆的コンプレックスを受容体を生じるため に用いられた免疫原ポリペプチドの過剰量と混合することにより、結合受容体か ら競争して離されることができる。そのような競争は、リガンドの起りうる変性 を避ける親和性吸着剤との混合物の分離。混合物は、結合受容体と癌蛋白リガン ドとの間の可逆的、結合受容体−リガントコンプレックスを形成する。

リガンド受容体−リガントコンプレックスは、次いで未コンプレックス化水性組 成物の残余から分離され、それにより親和性吸着剤に結合した精製された形で癌 蛋白を得る。混合がビーカー又はフラスコ内で起きる場合、本分離は濾過又は洗 浄によりなされる。吸着剤がカラム中にある場合、分離は未コンプレックス化水 性媒体の溶出により、好ましくは再度、次いで水洗段階により行なわれる。

精製蛋白が親和性吸着剤から遊離で所望される場合、典型的には種々の手段によ り得られる。これらの手段のいずれにおいても、可逆性結合受容体−リガントコ ンプレックスが支持−結合受容体及び癌蛋白リガンドの成分部分に溶解され、次 いで結合受容体からりガントが分離され、親和性吸着剤から遊離の精製症蛋白を 提供する。

可逆的コンプレックスの解離は、多くの方式で有効であろう。０．２Ｍグリシン 塩化水素溶液のｐＨ値約２．５が典型的に利用される。別に、結合したリガンド が、可逆性コンプレックスと、受容体を作るのに用いられた過剰の免疫原性ポリ ペプチドとの混合による結合受容体から離れて競合できる。かかる競合は、リガ ンドの可能な変性を避ける。解離された癌蛋白リガンドの親和性吸着剤からの分 離は上述のようにして得られる。

親和性吸着剤の調整及びその使用は、巾広く古い。しかし本発明の受容体分子を 含むそのような物質及び使用は従来入手できなかった。抗原が支持体に結合され ている親和性吸着剤の詳しい記述、そのＳＩｌ製法及び使用は、アンチボディ・ アズ・ア・ツール、マルカロニス及びワール編、ジョーン・ワイリイ・アンド・ サンズ、ニューヨーク、第６４−６７及び７６−９６頁（１９８２）に見られる 。

■、パネル評価 抗体のパネルは、未知試料中に形成される抗体／抗原コンプレックスの組合せと 既知体試料から得られる組合せとを比較することによりいかなる生物学的試料を 事実上特徴付けるのにも用いることができる。組織、尿又は他の体液は、癌遺伝 子及び癌遺伝子関連配列の表現に関して特徴づけされつる。この表現は、かくし て組織又は胎児の発展段階又は癌の存在又は厳しさを示すために解釈される。

パネル評価は一つ以上の抗体で試料をスクリーニングすることを含む。試料は各 抗体と反応され、抗体及び試料中に見い出されるリガンドとの間のコンプレック スが検出される。コンプレックスのパターン、これは、未知のものの中のリガン ドと反応する抗体の組合せで、既知試料中の抗体との反応のパターンと比較され る。組合せがより類似すると、すなわち既知及び未知試料のいずれでも同一リガ ントと反応する同一抗体の合致が高いほど、試料はより類似する。すなわち、未 知試料は発展の同一段階にあるか又は既知試料として同一疾病状態を有する可能 性が高い。

評価は、上で述べたようにリガンドで、又は固体基質の使用により、実施できる 。ここに、一部の生物学的体試料がゲル中に電気泳動され、ニトロセルロース上 に移され、それは次いでストリップに切断される。このウニスターンプロットの 試みは同一試料はパネル抗体でプローブされうることを認める。ニトロセルロー スの基の固まりを作り直すことにより、特異的及び非特異的横じまの同一性が容 易に決定できる。細胞又は組織抽出物については、約０．５ｕの蛋白がゲルごと に置かれた。尿試料については、１２ｍ１の尿の当量が加えられ、他の体液（血 清、血漿、羊水、卵胞液、腹水、唾液）については、１００μｌが置かれた。各 試料を幾つかの抗体でプローブすることに加えて、２４以上の試料が同一抗体で プローブされた。この試みは、異なる抗原濃度に基づく異なる結合活性を生じ、 二次的試薬又はインキュベーション条件に基づく変異性を生じない。

結合はまた、プローブしている試料により半定量でき、試料は連続的に希釈され て検出可能レベル以上の濃度に相対的増加を得る。

固体支持の使用は、自動スキャナーを用いる試分析手段を提供する。これらのス キャナーは、ニトロセルロース上に情報をディテガイズ（ｄｉｔｉｇｉｚｅ）す るのをプログラム化でき、さらに試料を比較するのをプログラム化できる。この 方式で、抗体の多重性を用いるパネル評価が、自動的に実施できる。これは、例 えば共通の性質を決定するため多数の既知試料を特徴付け、並びに既知に対して 多数の未知の試料を特徴付けるのに用いることができる。この技術は又、得点記 録がデジタル化された情報の使用により実施されるような反応性パターンのより 正確な得点記録を生じる。

試料は、又、抗体のカクテルの使用によると、種々の抗体で同時にプローブ出来 る。この試みは反応性のパターンを作るより有効な手段を提供するが、分析する のが困難であろうコンプレックスパターンを作るかも知れない。

ここに、ニトロセルロースの分けられたストリップ、各々は試料の一定量が走行 しているレーンを含んでいる、は、上に記載したようにイムノプロット評価を用 いて別々にプローブされた。

予め、既知起源の試料が、それに対して未知試料が比較されうるプロフィールを 得るためにプローブされた。種々の試みがそのようなプロフィールを誘導するの に用いられた。一つの試みで、同一蛋白を認識する幾つかの抗体が確識された。

この試みはプロフィール同定の正確さを増加する。第二の試みは抗体の同一パネ ルで異なる腫瘍をプロフィールすることであった。これはそれに対して未知試料 が比較されうる種々のパターンを作った。第三の試みは異なる器官用の進展した プロフィールを開発するために正常組織をプロフィールすることであった。これ ら全ての試みは、それに対して未知試料のパターンが比較できる既知試料用の反 応性のパターンを用いるためにとられた。

異なる特異性を有するハイブリドーマを用いる例は、キナーゼ遺伝子のドメイン を結合しているＡＴＰに対する種々の反応性パターンを生じるｆｅｓ抗体により 提供される。交叉活性の同じパターンは、種々の生物学的検体を分類し試験する 抗体を認める。第２５図において、ｆｅｓ癌遺伝子生成物を含むセルラインは、 ｆｅｓ配列の２つの部分並びに他の癌遺伝子、ｅｒｂ　Ｂに対して作られたー郡 の抗体でプローブされた。レーン■において、ｆｅｓ遺伝子生成物は、他の保存 されたキナーゼ部分に位置したｆｅｓ配列に対して作られた抗体により容易に検 出された。ゲルの過暴露は、レーンＡ−Ｈで用いられる抗体によるｆｅｓ遺伝子 生成物への結合を示すが、結合活性はレーンＩに用いた抗体より著しく小である 。他のコントロールとして、レーンＪ及びＫにおける２つの抗体はそれぞれｅｒ ｂ　Ｂ関連蛋白を認識した。

第２６図において、同一抗体がＥＧＦ受容体（それはｅｒｂ　Ｂプロトオンコジ ーンによりコードされる）を含むセルラインからの抽出物をプローブするのに同 時に用いられた。この蛋白は、ｅｒｂ　Ｂ抗体並びにｆｅｓ形質形質転換セルラ イト中見られるＰ　１３０ｅｒｂＢにより容易に検出される（第２５図）。レー ンＤ、ＦＳＧに用いたｆｅｓ抗体は、レーンＥに検出されなかった付加的蛋白Ｐ 　３０　ｆｅｓを検出した。

エリサ評価は、本抗体への交叉反応性パターンが、しかしながら、レーンＤに用 いた抗体と類似し、レーンＦ及びＧに用いた抗体と同一であることを示した。

これらの同じ抗体は第２７図に用いられ、妊娠糖尿病患者からの濃縮尿試料をプ ローブした。約７０Ｋｄの蛋白がレーンＡ−Ｃに用いた３つの抗体により検出さ れ、一方５５Ｋｄの蛋白がレーンＤ−Ｈに検出された。即ち、これらのｆｅｓ蛋 白の交叉反応性パターンは、恐らく同一蛋白を認識するであろう抗体を確識する のに有用である。反応性パターンにおけるわずかな相違は、単−蛋白上の幾つか の癌遺伝子関連決定基の存在を示すのに用いることができる。これは、５５Ｋｄ 蛋白を検出し、少くとも３つの異なるｆｅｓ関連エピトープを認識する５つの抗 体により示される。Ｐ　７　Ｑｆｅｓ、　Ｐ　５５ｆｅｓ及びＰ ３０ｆｅｓを検出する抗体の能力は、又、ｆｅｓ癌遺伝子生成物のＡＴＰ結合ド メインのコンフォーメイションにおける翻訳後修飾相違を招くかも知れない。

腫瘍、例えばＮＩＴ寄託機関に寄託のセルライン誘導されるもののプロフィ−リ ングは、又、抗体認識用標的を提供する。第２８−３１図において、種々の腫瘍 抽出物がｆｅｓ又はｅｒｂ　Ｂ抗体でプローブされた。レーンＡ−Ｄは、キナー ゼ遺伝子の部位に結合しているＡＴＰの部分に向けられた抗体でプローブされた 。レーンＥ−Ｈは、同一結合部位の異なる部分に向けられた抗体でプローブされ た。レーンＩ及びＪはｖ−ｅｒｂＢ（１７３１Ｃ１１及び１７３−４Ａ１１）の アミノ終末に向けられた抗体でプローブされ、一方レーンＫ及びＬは異なるキナ ーゼドメインに向けられた抗体でプローブされた。

これらのブロービングは最小量の材料（０，５ｇの組織が６４抗体でプローブさ れた）を必要とし、広域スペクトラムの反応性パターンを作った。

第２８図において、子宮内膜癌抽出物は低レベルのＰ　６０　ｆｅｓ（レーンＡ −Ｄ）及びＰ２Ｏ（レーンＥ−Ｈ）を有することを示すが、−万Ｐ２Ｏ０ｅｒｂ Ｂ（レーンＬＪ）は容易に検出される。Ｐ　２００ｅｒｂＢは胎児心臓中に高レ ベルで既に検出されている（データ示さず）。このＰ　２２０ｅｒｂＢの表現は 、時間と組織に関して不適当なようにみえる。

第２９図において、転移孔腫瘍抽出物は、同一抗体でプローブされた。本腫瘍中 には、Ｐ　７０　ｆｅｓがＰ　６０　ｆｅｓの不存在下容易に検出される。ｅｒ ｂ　Ｂのアミノ終末に向けられた抗体はＰ３ＱｅｒｂＢ及びＰ３５ｅｒｂＢ及び Ｐ４０ｅｒｂＢを検出し、一方ウィルス性蛋白のカルボキシル部分に向けられた 抗体はＰ　１３０ｅｒｂＢを検出する。

第３０図において、他の乳癌抽出物は他の反応性パターンを生成した。Ｐ　７　 Ｑ　ｆｅｓに加えて、Ｐ　８０　ｆｅｓに弱い活性が検出された。これらの蛋白 の両方は、このグループは少くとも３つの異なるエピトープで認識したけれども ４つの全ての抗体で構成された。ｅｒｂ　Ｂ二重じま、Ｐ　１３０ｅｒｂＢも、 また弱く検出された（レーンに、Ｌ）。

第３１図において、卵巣癌は他の反応性パターンを生じた。Ｐ２ＯｆｅｓはＰ　 ３５　ｆｅｓがそうであったように（レーンＥ−Ｈ）弱く検出され（レーンＡ− Ｄ）、一方Ｐ　７０　ｆｅｓはＰ３５ｆｅｓＢがそうであったように（レーンＩ 、Ｊ）容易に検出された（レーンＡ−Ｄ）。即ち、各腫瘍は独特の反応性パター ンを示し、記された各パターンは少くとも２つの抗体により検出された。レーン Ｅ−Ｈにおける蛋白は少くとも３つのｆｅｓ関連エピトープを含んだ。蛋白は恐 ら＜　ｆｅｓ癌遺伝子によりコードされなかったが。

第３２−３９図において幾つかの付加的癌遺伝子関連蛋白が抗体の他のパネルで 検出された。各図面のレーンＡにおいて、保存キナーゼ遺伝子のｒｏｓ配列に対 する抗体が用いられ、一方レーンＢにおいて異なるキナーゼドメイン■に対する 抗体が用いられた。レーンＣ−Ｇにおいて、βＴＧＦのアミノ終末に対する５つ の抗体がプローブとして用いられた。Ｈ−ｒａｓ配列の独特のカルボキシル部分 に対する３つの抗体がレーンＨ−Ｊにおいて用いられ、一方ｅｒｂＡのホルモン 結合ドメイン中の保存部分に対する４つの抗体がレーンに−Ｎにおいて用いられ た。

第３２図において、乳癌抽出物は本シリーズの抗体でプローブされた。レーンＡ 及びＢにおいて、１５０Ｋｄ蛋白はキナーゼドメイン示唆広範キナーゼ類似性の ２つの異なる保存部分に向けられたｒ。

Ｓ及びｆｅｓ抗体で検出された。ｒｏｓ抗体も１２０及び４０Ｋｄの蛋白を検出 した。レーンＣ−Ｇにおいて、２５Ｋｄ蛋白は全βＴＧＦにより検出された。こ れらの抗体はイムノプロットに基づく少くとも３つの異なるエピトープを認識す る（レーンＣ中４５Ｋｄでの付加的横じま参照）。レーンＨ−Ｊにおいて、５つ の異なるｒａｓ関連蛋白が検出された。これらのｒａｓ関連蛋白に対する結合活 性の割合は、これらの抗体の各々が独特の決定基を検出することを示唆する。レ ーンＨにおける抗体（１４６−３Ｅ４）はＰ　２００ｒａｓ、　Ｐ　４８ｒａｓ 及びＰ２７ｒａｓを選択的に検出した。対照的にレーンＪに用いた抗体（１４６ −１７Ａ５）はＰ　２１　ｒａｓを選択的に検出する。この爆露において、これ らの相違はＰ２７ｒａｓとＰ　２１　ｒａｓの強度を比較することにより最も容 易に見られる。Ｐ２７はレーンＪにおいて唯−弱く検出されＰ２１はレーンＨに おいて唯−弱く検出されたけれども、ゲルの過暴露は全ての５　ｒａｓ関連蛋白 が全ての３抗体により検出されたことを示す。

第３３図においてプローブされた卵巣癌は、Ｐ　１５０　ｒａｓ／　ｆｅｓは検 出されなかったが５０ＫｄβＴＧＦ蛋白がレーンＧに現れるのを除き第８図は類 似する。第３４図においてプローブされた転移結腸癌もまた、４５及び５０Ｋｄ βＴＧＦ蛋白が検出されないのを除き類似する。第３５図における卵巣抽出物も また、Ｐ４５ｒａｓ及びＰ５２ｆｅｓが他のｒｏｓ関連蛋白に相対的に高濃度に 現れｒｏｓ関連蛋白は見られなかったのを除き類似する。

第３６図においてプローブされたリンパ腫抽出物は、相対的に高濃度のＰ２７の ために独特である。第３７図においてプローブされた乳癌抽出物は他の独特の反 応性パターンを生成した。小さい反応性はｒｏｓ、　ｆｅｓ又１計ａＳ関連蛋白 に検出されたけれども、容易に検出されたＰ２４βＴＧＦはＰ　２２ｅｒｂＡ及 びＰ５５ｅｒｂＡにある。Ｐ２２ｅｒｂＡは全ての４抗体により認識され、一方 Ｐ　５５ｅｒｂＡはレーンＮにおいて用いられた抗体によってのみ容易に検出さ れた。過暴露は他の３ｅｒｂＡ抗体による本蛋白に対する結合を示した。Ｐ５５ ｅｒｂＡ及びＰ　２２ｅｒｂＡの異なる活性は、これらの蛋白の両方が２つのｅ ｒｂＡ関連エピトープを有することを示す。さらに、抗体は、グルココルチコイ ド又はエストロゲン受容体の同種の部分と交叉反応せず、そして抗体は核染色パ ターンを生じる（データ示さず）。即ち、第３２−３７図においてプローブされ た抽出物と対照に、乳腫瘍は上昇レベルのＰ　２２ｅｒｂＡを有する。　Ｐ　２ ２ｅｒｂＡ蛋白は又、第３８図の直腸腫瘍抽出物中に見られる。Ｐ５５ｅｒｂＡ は過暴露されたゲル中でさえ検出されなかったけれども。第３９図において、転 移肺抽出物はＰ　５２　ｆｅｓ及びｒａｓプローブに対する独特の活性パターン を有した。Ｐ　４８　ｒａｓ及びＰ２Ｏ０ｒａｓは容易に検出されたけれども、 非常に小さな活性がＰ２７ｒａｓ又はＰ　２１　ｒａｓに対して見られた。この 結果は、幾つかの胎児性組織のプロフィールに似ていた（以下参照）。

これらの組織が発展するので、２００ｒａｓ濃度は低下し、一方Ｐ２７　ｒａｓ 濃度は増加した。

相当の多様性が腫瘍試料に見られるけれども、注目すべき類似性が正常組織に見 出された。これらの類似性は作られるべき別個の器官への発達的プロフィールを 許す。第４０図において、ラット線条体の発達的プロフィールは７抗体で造られ た。レーンＡにおいて、Ｐ　２１　ｒａｓ及びＰ　２５　ｒａｓは１８日令胎児 で検出された。２日までにｐ１５ＱｒａｓはＰ　２１　ｒａ５に加えてかろうじ て検出され、Ｐ　２５　ｒａｓは容易に検出され、連続的パネルに存在する。レ ーンＢにおいて、ｐ　５２　ｒａｓは胎児発達の１８日に容易に見られた。ゲル の暴露はＰ２００　ｒａｓを明らかにした。１８日までに、Ｐ２７ｒａｓは容易 に見られた（Ｐ２Ｏ０ｒａｓは！露されたゲル中でもはや検出されなかった）。

Ｐ　２７　ｒａ５の濃度は７０日までに最高であった。Ｐ　２１　ｒａｓはまた ７０日に容易に検出可能であった。Ｐ　２１　ｒａｓを示した暴露は全５回の地 点で存在したけれども。レーンＣにおいて、Ｐ１５０ｍｙｃは、また、２日でか ろうじて検出されるが１８日までに容易に見られた成熟動物特異蛋白であった。

レーンＤにおいて、Ｐ１２０ｍｙｂは、胎児パネルにのみ検出された胎児特異蛋 白であった。レーンＥにおいて、Ｐｌｏｏｉｎｔ−１，Ｐ７０ｉｎｔ　−１，Ｐ ４５ｉｎｔ−１，Ｐ９０ｓｉＳ及びｐ５５ｓｉｓは、発達的に調節されるように はみえない。レーンＧにおいて、Ｐ６０ｓｉｓは、胎児パネル中で最高であった 。即ち、第４−１５図において記載された腫瘍抽出物と対照的に、正常組織の癌 遺伝子関連蛋白プロフィールは、もっとより均一で、きちんと調節される。

即ち、第２５から４０図は、既知試料が反応性のパターンを作るために種々の抗 体でプローブできることを示す。上記実施例は、異なる試料中の同−蛋白内のみ でなく、種々の蛋白内の、種々の抗体の交叉反応性を示す。

Ａ、既知試料の分類 腫瘍抽出物又は他の体試料は、また生成される種々の遺伝子生成物に従づて特徴 づけられうる。最近、種々の腫瘍抽出物Ｘ抗体結合が、イムノプロット技術を用 いて記録された、種々の癌遺伝子生成物の存在及びレベルを決定した。これらの データは、第４１及び４２図に示された。腫瘍抽出物は、ＮＩＨ寄託機関に寄託 されるセルラインから誘導され、試料は上述したようにニトロセルロース上で電 気泳動しプロットした。種々の癌遺伝子ファミリーからの癌遺伝子によりコード されたポリペプチドに対する抗体が、試料をプローブするのに用いられた。

反応性は、癌遺伝子生成物の表現の存在及びレベルが記録された。第４１図にお いて、Ｐ　５２　ｒａｓは全ての卵巣抽出物中で検出されたが、最高レベルが最 少又は緩和として表示された腫瘍に見出された。Ｐ　５　Ｑ　ｓｒｃ及びＰ　４ ８ｓｒｃは、発達した部門において最高頻度で卵巣腫瘍中に検出された。Ｐ１２ ５ｒｏｓ及びＰ１５ｒａｓは、乳抽出物以外はとんどの腫瘍において検出され、 表現は、アデノーマ中に濃縮され、これらの癌は最少又は緩和として分類された 。Ｐ１５０ｒ。

Ｓ表現は、乳腫瘍のわずか半分に見出されたＰ　１２０ｒｏｓ、本蛋白は子宮内 膜抽出物を除いて最も多くの他の腫瘍において検出されたけれども、と対照的に 乳腫瘍中に濃縮された。Ｐ　２２ｅｒｂＡは、それらの組織しゆうに分散したが 、発達したとして表示された抽出物のいずれにも見出されなかった。

活性の付加的分離は、幾つかのキナーゼ関連蛋白を表示する第４２図に見られる 。この表において、卵巣及び子宮内膜抽出物中の高レベルのＰ　７０　ｆｅｓは 、著しい。同様に、卵巣及び原油出物に対するＰ　１３０ｅｒｂＢの制限は、有 意であるかも知れない。

即ち、腫瘍抽出物は、癌遺伝子又は癌遺伝子関連生成物に関して特徴づけられる ことができる。特異的抗体を用いて、特異的腫瘍型に対し共通の蛋白が検出でき る。反応性のこれらのパターンは、未知試料のパターンがそれに対して比較され うる標準として用いることができる。

Ｂ１体液中のマーカー パネル評価はまた、単一個体中のモニター蛋白生成物に用いうる。この方式にお いて、治療の効果はスクリーニング、例えば尿試料により非硬人的にモニターさ れうる。このアプローチは、抗体のパネルの活性パターンのプロフィールを得る ために患者からのもとの試料のスクリーニングを含む。治療が進むにつれて、つ づく試料は比較用の標準として同一のもとの試料を用いてモニターされる。第４ ３図は、化学療法を受けている妊娠栄養膜疾病患者からの連続的尿試料を示す。

多数の癌遺伝子関連蛋白の同調外形（ａｓｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓａｐｐｅａｒ ａｎｃｅ）が明白である。これらのデータは、治療後患者をモニターするために 治療有効性に関して臨床データとさらに相関することができる。

Ｃ１癌遺伝子関連蛋白の検出 癌遺伝子によりコードされたポリペプチドに対する抗体は、保存ポリペプチド又 はその蛋白をも含む他の蛋白を認識しうる。即ち、抗体のパネルは、ポリペプチ ドの明確な部分に対する多重抗体おのおので試料をプローブすることにより試料 中の癌遺伝子関連蛋白を検出するのに用いうる。異なる抗体で反応性のパターン を決定することにより、異なる癌遺伝子関連蛋白が確認できる。

Ｈ−ｒａｓ特異性抗体により検出されたｐ　２１　ｒａｓは、二反応性抗体によ り検出されたＰ　２１　ｒａｓのサブセットを表現する。Ｈ−ｒａｓ特異性抗体 により検出されたＰ２１を含んでいる全試料は、抗体１４２−２４ＥＯ５により 検出されたＰ２１を含んだが逆になかった。Ｈ−ｒａｓ特異性抗体により検出さ れた他の蛋白は、保存ｒａｓ部分が存在しないか又は少くとも１４２−２４Ｅ５ 結合を排除するために変ったことを示している１４２−２４ＥＯ５により検出さ れなかった。

しかしながら、３つのＨ−ｒａｓ特異性抗体による結合の一致は、同一蛋白が全 ての３つの抗体により検出されたことを示す。Ｐ２Ｏ０ｒａｓ、　Ｐ　４８ｒａ ｓ及びＰ　２７　ｒａｓに対する抗体の結合の同様の割合は、３つの抗体により 検出されたエピトープにおけるい（らかの構造類似性を示唆する。この類似性は 、多くの技術を用いて提出できる。

一つの試みは、標識抗原を消化し、消化物を二次元ペプチド遺伝地図作製に置く ことである。もしより大きな分子が溶液中でよく認識されないなら、付随する試 みが可能である。例えば、免疫関連蛋白の異なる結合を含んでいる試料は、部分 消化を受けさせ、イムノプロットさせつる。もし前駆体産物関連性があるならば 、抗体で検出される最小サイズ蛋白が同一であるべきである（加えられたプロテ アーゼのない対照インキュベーションは内因性プロプアーゼの試料差異をコント ロールする）。別に、部分消化（抗原部位を暴露するため）は免疫親和性に精製 され、次いでイムノプロット又はペプチド遺伝地図作製されうる。異なる試料（ 即ち尿及び組織）中の異なる抗体又は同一抗体により検出された類似サイズ蛋白 の同一性は、類似の試みを用いて試験されうるし、あるいは等電点は、２次元ゲ ル及びイムノプロット検出を用いて決定できた。この試みはまた、ＳＤＳポリア クリルアミドゲル上を類似速度で移動している多重形の同定に有用である。

■　無症候個人での血清スクリーニング以下に示すのは、環境発癌物質に暴露さ れていることが知られている、２つの異なる群の労働者についての研究である。

労働者は誰も腫瘍疾病の臨床上の症候を示さなかった。両研究とも、発癌物質に 最高に暴露された個人も、また癌蛋白の異常表現を示すということを示す。第一 の実施例では、ＰＣＢ、アスベスト及び喫煙を含む幾つかの発癌物質への既知の 暴露を伴う１個人も、５０倍上昇したレベルのＨ−ｒａｓ蛋白２１を示した。こ のスクリーニングの１８ケ月後、この個人は結腸直腸のアデノーマが発達した。

アデノーマの除去によって、Ｈ−ｒａｓＰ２１の血清レベルは正常に回復した。

第二の実施例では、多環式芳香族炭化水素発癌物質に暴露される鋳物工場労働者 は、ｆｅｓ腫瘍遺伝子−関連蛋白の異常に高い表現が認められた。異常な表現は 、発癌物質に最高に暴露される作業場の幾らかの労働者にのみ見出された。暴露 されない個人は、癌蛋白は検出不可能なレベルであった。これらの研究は、癌予 知に関する本方法及びモノクローナル抗体の有用性を示し、又、環境発癌物質へ の暴露を示す重要な指標を示す。）（−ｒａｓＰ２１指標は、結腸直腸のアデノ ーマの予知に思いもよらず有用である。ｆｅｓ腫瘍遺伝子関連蛋白は、多環式芳 香族炭化水素暴露の指示物として有用である。

実施例１：　ＰＣＢに暴露された労働者の血清スクリーニングポリ塩化ビフェニ ル（ＰＣＢ）に暴露されている可能性のある１６名の地方自治体労働者の一群か らの血清を、腫瘍遺伝子によりコード化されたポリペプチドに対して作ったモノ クローナル抗体を用いてスクリーニングした。ここに示される結果は、発癌物質 への暴露の最悪の履歴を持つ個人もＨ−ｒａｓＰ　２１の最も異常な表現を示し たことを示す。血清スクリーニング１８ケ月後、この個人は結腸直腸のアデノー マが発達した。アデノーマの外科的除去により、Ｈ−ｒａｓの表現は正常に戻っ た。

方法 １、個人の背景スクリーン 性転換遺伝子を含んでいるＰＣＢの清掃に当っていた１６名の地方自治体労働者 を、医学上及び職業上の履歴について評価し、又、肉体的に及び臨床的に試験し た。約６００．ＯＯＯｐｐｍＰＣＢを含む性転換遺伝子油及び数ケ月継続した清 掃。全ての対象は、４２の平均年令で、２７−６５の年令範囲の白人の男性であ った。

労働者は、他の基源からのＰＣＢへの暴露並びに他の発癌物質、例えばアスベス ト及び喫煙への暴露に問題があり、肉体的に、特に皮膚試験に言及して試験した 。実験室試験は血清トリグリセリド、血清ＰＣＢレベルに、及び肝機能験査（Ｓ ＧＯＴ、５ＧＰＴＳＬＤＨ１アルカリホスフアターゼ及びビリルビン：対象は験 査の２週間前からエタノール消費をやめるよう、又、験査当臼、経口摂取をしな いよう要求された）。験査は、きまり切った方法により実施した全１６名の対象 は、この仕事の期間、ＰＣＢ含有性転換遺伝子油との幾らかの皮膚接触を述べ、 さらに、２名は過去２０年にわたってＰＣＢ含有性転換遺伝子油に潜在的暴露さ れていた（患者９及び１０）。７名の労働者は過去に他の発癌性材料をあつかっ ていたことを述べた；これは絶縁材処理からの主としてアスベスト暴露で、１名 はさらに塩素化水素溶媒及び電離放射線に有意な作業暴露を受けていた（患者１ ４）。１２名の労働者は、今も喫煙者であるか最近まで喫煙者（過去５年以内） であり、４名は全く喫煙しなかった。２名の個人は暴露のすぐ後に腕、脚及び足 に痙癒状傷害のあったことを述べた（患者４及び８）が、肉体的試験は、いずれ の労働者にもＰＣＢ暴露に密着した異常が見られなかった。

全ての事例で、肝機能験査は正常限界的にあった。３つの事例でのみ、血清はト リグリセリドが高かった。１名（患者８）は非常に高い血清トリグリセリドレベ ルををし、伝えられるところによればＰＣＢ暴露の前の過去には正常とされてい た；しかしながら彼の血清ＰＣＢレベルは非常に低かった。他の２名の高トリグ リセリド血症個人においては、トリグリセリドレベルに関する過去の状態は知ら れておらず、そして彼等の血清ＰＣＢレベルも比較的低かった。さらに最高血清 ＰＣＢレベルを有する個人は正常トリグリセリドレベルを有した。これらのデー タを基に、比較的低い血清ＰＣＢレベルと血清トリグリセリドとの相関関係、高 いＰＣＢ暴露に気がついた関連についての結論を出すことは不可能である。

判った限りでは、全般的な血清ＰＣＢレベルは、用いた保護測定（手段）の妥当 性を非常に少ししか証明しなかった。

一般に、ＩＱｐｐｂ以下のレベルには、そのようなレベルは、非職業的に暴露さ れた正常な対照にしばしば確認されるので心配で見られない。しかし、この測定 、唯１名の個人、患者６は、本当に上昇した血清ＰＣＢレベルを有すると考えら れる。

患者６、非常に異常なｒａｓ表現を有することを示す個人も、又、既知の発癌物 質暴露に最も高い偶発性があった。、密書６は５７オの白人の男性であった。血 清スクリーニングの時に、彼は腫瘍疾病の明白な症候を示さなかった。この個人 は２５年間ビル保全で、アスベスト絶縁材の吹き付けと除去を含む作業、クロル デンを含む種々の殺虫剤の使用、及びＰＣＢを含む性転換遺伝子油の清掃を行な っていた。彼は又、長年の間、１日１箱の巻きたばこを喫っていた。

彼の肉体的試験は弱い高血圧のみが注目に値した。

２、血清スクリーニング ナイマン等、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８２ニア９２４−７９２８（１９８５）、これを 引用して明細書記載の一部とする、の尿イムノブロッティング技術を採用して、 血清をスクリーニングするのに用いた。

アッセイ−には、対象の血清を調製し、以下に記載するようにポリペプチドに対 して作ったモノクローナル抗体でプローブした。

アッセイ−には、１００μｌの血清を４００リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７，４，２ ５μｍ２−メルカプトエタノールに及び脱イオン水中４７５μｌの試料緩衝液（ ６，２５％ドデシル硫酸ナトリウム、６．２５％グリセロール）と混合し、沸騰 水浴に５分装置いた。次いで試料を５−１７％ポリアクリルアミドゲルに載せ、 電気泳動で分離し、ニトロセルロースに移転した。３％ウシ血清アルブミン及び ０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳでブロッキング後、ニトロセルロース を、予言した腫瘍遺伝子（１：２０００希釈腹水）配列を表現する合成ペプチド に対して作られたモノクローナル抗体と４℃で一晩インキュベートした。３回洗 浄後、ニトロセルロースをウサギ抗−ｖウスＩ　ｇＦ（１：５００）と６０分間 、室温でインキュベートした。３回以上洗浄後、ニトロセルロースを１２ＡＩ− 標識プロチインＡ（１０’ｃｐｍ／ｍＡ）とインキュベートした。結合を増感ス クリーンで視覚化した。

用いた一次抗体は、以下の腫瘍遺伝子の蛋白配列に対して作られた（第４４（Ａ ）及び（Ｂ）図参照）：５ｉｓ（レーン１、ハイブリッド１１２−０９Ｂ１０（ ＡＴＣＣＨＢ８８００）、配列ＳＬＧＳＬＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣ）；ｆｅｓ（ レーン２、ハイブリッド１２７−４２Ｃ１１（ＡＴＣＣＨＢ５６１）及びレーン ３、ハイブリッド１２５−５０ＤＯ４（ＡＴＣＣＨＢ８９６８）、配列ＬＭＥＱ ＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦル−ン１５、ノゾブリッド１２１−１４ｃｏ９（ＡＴ ｃＣＨＢ９８７５）、配列ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ（Ｃ））；ｆｅｓ　（レー ン２、ハイブリッド１２７−４２Ｃ１１（ＡＴＣＣＨＢ　９５６１）及ヒレーン ３、ハイブリッド１２５−５０Ｄｏ４（ＡＴＣＣＨＢ８９６８）、配列ＬＭＥＱ ＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ；レーン１５、ハイブリッド１２１−１４ＣＯ９（Ａ ＴＣＣＨＢ９８７５）、配列ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ（Ｃ））；β−ＴＧＦ　 （レーン４、ハイブリッド１００−３０ＣＯ５（ＡＴＣＣＨＢ９７８７）及びレ ーン５、ノゾブリッド１００−３４ＥＯ６（ＡＴＣＣＨＢ９７８８）、配列ＡＬ ＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣ）；１ｎｔ−１（レーン６、ハイブリッド２２２− ３５ＣＯ８（ＡＴＣＣＨＢ９０５２）及びレーン１２、ハイブリッド２２２−３ ７Ｆ０４（ＡＴＣＣＨＢ９７８６）、配列ＬＨＮＮＥＡＧＲＴＴＶＦＳ（Ｃ）） ； ｍｙｂ　（レーン７、ハイブリッド１３３−１０ＦＯ６（ＡＴＣＣＨＢ９０７７ ）、配列ＬＧＥＨＨＣＴＰＳＰＰＶＤＨＧ）；ｓｒｃ　（レーン８、ハイブリッ ド２０３−０７Ｄ１０（ＡＴＣＣＨＢ８８９８）、配列（Ｃ）ＧＳＳＫＳＫＰＫ ＤＰＳＱＲＲＨ８）；ｃ−ｍｙｃ（レーン９、ハイブリッド１５５−１１ＣＯ７ （ＡＴＣＣＨＢ　８９７６）、レーン１３、ハイブリッド１５５−０８ＧＯＩ（ ＡＴＣＣＨＢ９００１）、及びレーン１４、ハイブリッド１５５−０９ＦＯ６（ ＡＴＣＣＨＢ９０００）、配列ＣＳＴＳＳＬＹＬＱＤＬＳＡＡＡＳＥＣ）； ｍｏｓ　（レーン１０、ハイブリッド１６５−３５ＦＯ２（ＡＴＣＣＨＢ９７８ ４）、配列ＬＧＳＧＧＦＧＳＶＹＫＡ（Ｃ））；Ｈ−ｒａｓ　（レーン１１、ハ イブリッド１４２−２４ＥＯ５（ＡＴＣＣＨＢ８６７９）、配列ＹＲＥＱＩＫＲ ＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬｖＧＮＫＣ及びレーン１６、ハイブリッド１４６−０３ ＥＯ４（ＡＴＣＣＨＢ８９９７）、配列ＹＴＬＶＲＥＩＲＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰ ＤＥＳＧＰＧＣ）。

結果及び検討 結果は以下の表７に示す。最もきわたった結果は患者６に関するものである。患 者６は試験した１６名の労働者の発癌物質に対し最悪の暴露を有した。この個人 は最高の血清ＰＣＢレベルを示し、又、アスベスト暴露及び喫煙に陽性であった 。表７に見ることができるように、この個人はｆｅｓ及びｒａｓの両マーカーの 異常表現を示した、ｒａｓマーカー表現は正常範囲よりはるが上であった。以下 の述べる追跡研究で、この個人は発達した癌を有することが判り、癌組織の外科 的除去により、ｒａｓ表現は正常に復した。

他の労働者に関する結果も又、幾つかの様式の表現を示した。喫煙者の半分（患 者３−９）は、結合様式に関して異常なｆｅｓ腫瘍遺伝子を示し、一方、非喫煙 者は全てこの様式を示さなかった。１名の喫煙者は又、ｓｉｓ腫瘍遺伝子関連蛋 白に関し異常な様式を示した。

しかしこれは未知の意味のものである。以下の実施例２も、多環式芳香族炭化水 素発癌物質に暴露したことが知られた個人にのみｆｅｓ腫瘍遺伝子関連蛋白の異 常な表現を示すことは注目すべきであり、これらの個人も又、喫煙者であった。

他の腫瘍遺伝子又は腫瘍遺伝子関連蛋白に関する様式は、ｒａｓを除き正常であ った。患者６は別として、２名の他の個人は検出可能レベルのｒａｓＰ２１を有 した。

これらの事例は共に、帯が比較的弱く、ＰＣＢへの暴露に何の関連も見られなか った。１人の患者（１０）は、陽性の喫煙層を伴う６゜５のＰＣＢレベルを有し 、且つ、他の発癌物質暴露（アスベスト）の陽性履歴を有した。他の個人（患者 １１）は０．３のＰＣＢレベルを有するが他の既知暴露層はなかった。

患者６はＨ−ｒａｓＰ２１表現に関し特に異常であった。第４４Ｂ図のレーン１ １及び１６で、Ｐ２１に関する帯は非常に顕著であることが認められる。正常な 、暴露されない個人ではＰ２１表現を示さない第４４Ａ図のレーン１１及び１６ 参照。Ｐ２１の同一性がｒａｓＰ２１（レーン１１）の保存部分及びＨ−ｒａｓ 特異的Ｃ末端部分に向けられた抗体の使用により確認されたこと、及び必要なら ば保存部分及び蛋白特異的部分に向けられた抗体又は他のレセプターを使用する ことが、蛋白マーカーの同一性を確認するのに一般に適用可能な方法であること は、注目に値する。しかしながら蛋白の同一性は、重要ではなく、誘導される重 要な情報は、どちらかといえば蛋白そのものの組成よりも蛋白の相対的な存在又 は不存在である。即ち、患者６、既知発癌性物質への最も極端な暴露を伴う個人 も、又、Ｈ−ｒａｓＰ２１を最も異常に表現している個人であることが見出され た。

これらのデータは、ｒａｓ腫瘍遺伝子が個人が発癌物質に暴露したかどうかを検 出するためのスクリーニング用マーカーとして有用であることを示す。以下に示 す追跡データは、この方法及び用いたレセプターが癌予知のための有用な手法で あることを示す。

患者６に関する追跡研究 高レベルのｒａｓ蛋白を示す血清スクリーニングのほぼ１８ケ月後、患者６は癌 の臨床上の症候を示した。患者６は直腸出血を起こし、結腸鏡検査は、下行結腸 の２ｃｍ管状管状子デノーマを明らかにした。このアデノーマを外科的に除去し た。患者６を、アデノーマ除去、約６週間後に再スクリーンした。このスクリー ンは、ｒａｓ腫瘍遺伝子蛋白が正常様式にもどったことを示した。これらの様式 は第４５図に示す。レーンＡは、臨床上の症候を示す１８ケ月前のｒａｓＰ２１ 表現を示す。レーンＢは、アデノーマ除去６ケ月後、ｒａｓの帯が見られないこ とを示す。

これらのデータは、）（−ｒａｓＰ２１表現が、結腸癌の増殖及び発癌物質の暴 露と相関することを示す。癌の臨床上の症候の発達の１８ケ月はど前のこの異常 なＨ−ｒａｓ表現の検出は、癌用予知手段としてこのマーカーの価値を示す。

どのような特異的発癌物質又は発癌物質の混合物に結腸直腸癌が原因しているか は明らかでない。患者６は、喫煙からベンゾピレン以外、ｒａｓ遺伝子を活性化 することが知られている発癌物質への実証された暴露は全くなかった。ｒａｓ（ ベンゾピレン、ジメチルベンズアスラセン、Ｎ−ニトロソ化合物及び電離放射線 ）及びヒト結腸癌でのｒａｓの表現及び前癌性結腸ポリープを活性化する発癌物 質について、プラントーラウフ及びピンクス、オキュベイショナル・メディシン 、２：２７−３８（１９８７）及びスバンジドス及びケル、ブリティッシュ・ジ ャーナル・オブ・キャンサー、４９：６８１−６８８（１９８４）参照。この両 者を引用して明細書記載の一部とする。ワイリー等、セミナース・イン・オキュ ペイショナル・メディシン、２：２９１−３０９（１９８７）。アスベストは、 それ自体で又は他の環境発癌物質との組合せで、ｒａｓ腫瘍遺伝子を活性化した のかは明らかでない。しかしながら、（ａ）Ｈ−ｒａｓＰ　２１は、腫瘍疾病の 臨床上の症候の表現よりかなり前に表現して、強力な予知手段であり、（ｂ）今 記載した方法は正確且つ非侵入スクリーニングを提供し、その結果は腫瘍疾病の 臨床上の症候の初期を予言するのに有用であり、そして（Ｃ）ここに記載したレ セプター、即ち抗体又はその断片又核酸の形であれ、Ｈ−ｒａｓＰ２１に向けら れたものは、これらの予知マーカーを検出するのに有用であることは明らかであ る。

患者６によりＰ２１の過表現についての説明は、ｒａｓ遺伝子の活性化に導いた 染色体の異常を起こすアスベストに暴露することでありうる。本実施例では、特 異的病理の機構は明確には判らないが、環境活性化因子が知られている人にとっ て、他の腫瘍遺伝子は、本スクリーン用のマーカーとして選択しうる。しかしな がら、アスベストの染色体異常誘発効果がｒａｓ遺伝子の活性にそれ自身を明示 できることは可能である。アスベスト繊維が培養において細胞に染色体異常誘発 性であることを示す。ジャーランド等、ミューティジョン・リサーチ、１６９： １４１−１４８（１９８６）及びケルシイ等、ブリティッシュ・ジャーナル・オ ブ・キャンサー、５４：１０７−１１４（１９８６）参照。例えば、ｍ’／Ｃ遺 伝子は、転写が促進される部位へのプロトオンコジーンの転位の結果として活性 化されることが示された。エリクラン等、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８０：８２０−８２ ４（１９８３）。又、類似のシナリオはアスベスト原因のｒａｓ活性化に思いを 巡しうる。より最近の研究は、アスベスト繊維が、腫瘍遺伝子及びプロモーター 配列を含む外因性ＤＮＡ切片を培養中の霊長類細胞に移入し、細胞トランスフォ ーメーションを起こしうろことを示した。アップル等、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８５ニ ア６７０−７６７４（１９８８）、そしてこれはｒａｓ活性化の機構でありうる 。

ウィルス転写プロモーターに結合するｒａｓプロトオンコジーンの培養中の細胞 への導入によって、遺伝子の表現が増大し、移入された細胞の悪性トランスフォ ーメーションを起こすことが知られている。チャン等、ネイチャー、２７９：４ ７９−４８３（１９８２）。

即ち、この個人では、アスベスト繊維への長期間の暴露で彼の結腸上皮のｒａｓ プロトオンコジーンの増大した表現を生じた可能性がある。これは、彼の血清中 のプロトオンコジーンコード化Ｐ２１蛋白の量が増大したことにより明らかにな った。最後に、プロトオンコジーン過表現は、結腸異常増殖、この事例では、悪 性長育への進行の１８ケ月前、臨床的に確認された管状絨毛アデノーマを起こす 。

アデノーマが外科的に除かれると、ｒａｓコード化Ｐ２１蛋白の起源が除かれ、 Ｐ２１蛋白はもはや患者の血清から検出されなかった。

即ち、本研究は全員が既知の環境発癌物質、ＰＣＢに暴露された個人のグループ を基にしたが、結果は、予想に反してアスベスト暴露から起こる腫瘍疾病を予言 するのに有用かも知れないマーカーを生成した。

実施例２　鋳物工場労働者の血清腫瘍遺伝子蛋白この研究では、普通の職業上の 発癌物質、ベンゾピレンに既知一定量暴露を伴うよく定義された職業群の鉄鋳物 工場労働者を、腫瘍遺伝子関連マーカーがこの発癌物質への暴露と結びついてい るかどうかを決定するために、アッセーした。ベンゾピレン（ＢＰ）及び関連多 環式芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）は、喫煙者、コークス炉労働者及び鋳物工場労 働者の肺癌の大きなリスクと結びついていた（レドモンド等・アニマルズ・オン ・ザ・ニュー・ヨーク・アカデミイ・オン・サイエンスズ、２７１：１２（１９ ７６）；ＩＡＲＣ，ポリヌクレア・アロマチック・コンパウンダ、モノグラフズ ・オン・ジ・工ヴアリュエーション・オン・ザ・カルシノゲニツク・リスク・オ ン・ケミカルズ・ツー・ヒューマンズ、３４巻、３部、ライオン；ＩＡＲＣ（１ ９８４）；ＩＡＲＣ，トバコ・スモーキング、モノグラフス・オン・ジ・工ヴア リュエーション・オン・ザ・カルシノゲニツク・リスク・オン・ケミカルズ・ツ ー・ヒューマンズ、３８巻、ライオン、ＩＡＲＣ（１９８６）。このようなＰＡ Ｈｓは、インビボ及びインビトロのいずれでも腫瘍遺伝子を活性化しうろことを 示した。

ボールメイン及びプラグネル、ネイチャー３０３ニア２（１９８３）；マーシャ ル等、ネイチャー３１０：５８６（１９８４）。さらに、詳しい職業上の履歴が この群に取られているだけでなく、彼等の暴露は、ＢＰの作業場空気レベルに関 してよく定義されていた。明らかな服用量関連増大が、これら労働者の末梢白血 球中のＰＡＨ−ＤＮＡ付加体のレベルに見られ、ペララ等、キャンサー・リサー チ、４８：２２８８（１９８８ｂ）、これは３２Ｐ後標識法によるＤＮＡ付加体 の測定と一致する。フィリップス等、ミューティジョン・リサーチ２０４：５３ Ｈ１９８８）：ヘミンキ等、ジャーナル・オン・ワーク・エンヴイロンメント・ アンド・ヘルス１４・５５（１９８８）。

それゆえ、この群は、職業上の暴露に関連する腫瘍遺伝子の研究用のモデル固体 群を示す。

材料及び方法 フィンランドの鉄鋳物工場に雇われた、本研究群の労働者は既に記載されている （ヘミンキ等、１９８８、上記：ペレラ等、１９８８ｂ、上記）。簡単にいえば 、鋳物工場労働者は、作業場に詳しい２名の工業衛生技師により、詳しい工業衛 生状態サンプリングデータ及び作業報告を基にＢＰへの暴露のレベルに従って群 に分けられた。

この分類は過去５−１０年間の暴露の見本と考えられる。というのはこのプラン トの個人は同一作業を続ける傾向があり、一般に長期間の従業員であるからであ る。０．０２μｇ／ｍ　Ｓより大きい８時間ＴＷＡ暴露の伴う労働者は高暴露群 に分類され、０．０５と０．２μｇ／ｍ　３の間のＴＷＡ暴露を伴う労働者は中 間暴露群に分類された。２−３μｇ／ｒｒ、３の高さのピークＢＰレベルは、鋳 物工場の鋳造及び払い落しく５ｈａｋｅｏｕｔ）場所の幾らかの個人に起きるこ とが知られていた。煙草消費を含む臨床上の情報は、全労働者について集められ た。

比較のための非暴露対照は、ＰＡＨ！露又は癌に関係しない、起こりうる職業病 の評価のためにジ・インスティチュート・オブ・オキュペイショナル・ヘルスに 照会した患者から補充した。対照個体群は、鋳物工場労働者よりも低い平均煙草 消責であったが、年令及び性分類については類似した（ベレラ等、１９８８６、 上記）。

この研究の目的のため、反復末梢血液試料を、８名の暴露労働者（高暴露群中３ 及び中間暴露群中５）及び１０名の非暴露対照（合計２８試料）を用意した。２ 又は３の血液試料を、異なる時間に労働者から収集した。全労働者について、試 料を、１ケ月の長さの休暇に入って直ちに及び仕事に復して６週間後に用意した 。中間暴露群の労働者の２名については、以後の１２ケ月の間追加血液試料を集 めた。単一末梢血液試料を、非暴露対照について集めた。血液試料（３０−５０ ｍｎ）をヘパリン添加したプラスチック管に集め、コード化及び遠心分離する。

バフィーコート、赤血球及び血漿を集めて、分析の時まで一７０℃で凍結保存し た。ＲＡＭ−ＤＮＡ付加体を既に報告されたと同一のこれら労働者について決定 した（ペレラ等、１９８８ｂ、上記）。血清腫瘍遺伝子についてアッセーした試 料のサブセットにおけるＤＮＡ付加体の値は表８に示される。欠けている値は、 ＤＮＡの不適切な量が幾つかの試料にみられたことを示す。

これらの試料を、既に記載されたイムノブロッティング技術（ナイマン等、１９ ８５上記：プラントーラウフ及びナイマン、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ ・インダストリアル・メディシン、４５：６８９（１９８８））により９つの異 なる腫瘍遺伝子（ｓｉｓ、　ｆｅｓ。

Ｂ−ＴＧＦ、　１ｎｔ−１、ｍｙｂＳｓｒｃ、　ｍｙｃ、　ｍｏｓ、及びｒａｓ ）によってコ・−ド化した蛋白生成物の存在について盲検した。要約すると、１ ００μｌの血清を４００μｔのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，５，２５ｔ の２−メルカプトエタノール、４７５μｌの、脱イオン化水中の試料緩衝液（６ ２５％ドデシル硫酸ナトリウム、６．２５％グリセロール）と混合し、沸騰水浴 に５分間室いた。次いで試料を５−１７％ポリアクリルアミドゲルに負荷して電 気泳動により分離し、ニトロセルロースに移した。３％ウシ血清アルブミン及び 領１九トリトンＸ−１００を含むＰＢＳでブロッキング後、ニトロセルロースを １晩４℃で予言した腫瘍遺伝子配列（腹水希釈１：２０００）を表現する合成ペ プチドに対して向けられたモノクローナル抗体とインキュベートする。徹底的洗 浄後、ニトロセルロース上の腫瘍遺伝子蛋白−抗体帯の位置を二次抗−マウスＩ ｇＧ抗体及びアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ錯体（ヴエクタスタイン； ヴエクター・ラボラトリイズ、バーリンゲイム、クリフォルニア）を用いて比色 的に決定した。陽性の結果の人体の定量は、正常からの差異が検出されなくなる まで試料を何回か希釈することにより達成した。蛋白表現での５倍増強を陽性の 結果と考える。用いた一次抗体は以下の腫瘍遺伝子蛋白配列に対し向けられた。

ｓｉｓ　（ハイブリッド１１２−０９Ｂ１０）ＡＴＣＣＨＢ８８００）、配列Ｓ ＬＧＳＬＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣ）ｆｅｓ（ハイブリッド１２７−４２Ｃ１１） （、ＡＴＣＣＨＢ５６１）及び１２７−５０ＤＯ４（ＡＴＣＣＨＢ８９６８）、 配列ＬＭＥ　ＱＣＷＡＹＥＰＧＱＲＰＳＦ、及びハイブリッド１２１−１４ＣＯ ９（ＡＴＣＣＨＢ９８７５）、配列ＩＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧ（Ｃ））Ｂ−ＴＧ Ｆ　（ハイブリッド１００−３０ＣＯ５（ＡＴＣＣＨＢ９７８７）及びハイブリ ッド１００−３４ＥＯ６（ＡＴＣＣＨＢ９７８８）、配列ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳ ＴＥＫＮＣ）ｉｎｔ−１（ハイブリッド２２２−３５ＣＯ８（ＡＴＣＣＨＢ９０ ５２）及びハイブリッド２２２−３７ＦＯ４（ＡＴＣＣＨＢ９７８６）、配列Ｌ ＨＮＮＥＡＧＲＴＴＶＦＳ（Ｃ））ｍｙｌ）　（ハイブリッド１３３−１０ＦＯ ６（ＡＴＣＣ）（Ｂ２Ｏ３３）、配列ＬＧＥＨＨＣＴＰＳＰＰＶＤＨＧ）ｓｒｃ 　（ハイブリッド２０３−０７Ｄ１０ＸＡＴＣＣＨＢ８８９８）、配列（Ｃ）Ｇ ＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲＲＨ３）ＩＩｌｙｃ（ハイブリッド１５５−１１ＣＯ ７（ＡＴＣＣＨＢ８９７６）、１５５−０８ＧＯ１（ＡＴＣＣＨＢ９００１）、 及び１５５−０９ＦＯ６（ＡＴＣＣＨＢ９０００）、配列Ｃ３ＴＳＳＬＹＬＱＤ ＬＳＡＡＡＳＥＣ） ｗａｓ　（ハイブリッド１６５−３５ＦＯ２（ＡＴＣＣＨＢ９７８４）、配列Ｌ ＧＳＧＧＦＧＳＶＹＫＡ（Ｃ））ｒａｓ　（／’イブリッド１４２−２４ＥＯ５ （ＡＴＣＣＨＢ８６７９）、配列ＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰＭＶＬＶＧＭ ＫＣ，及Ｕハイブリッド１４３−０３ＥＯ４（ＡＴＣＣＨＢ８９９７）、配列Ｖ ＴＬＶＲＥＩＲＱＨＫＬＲＫＬＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣ）このイムのプロッティン グ系では、これらの抗体は特異的、感受性且つ再生しうる結果を与えることが判 った。抗体の特異性は、腫瘍遺伝子に対する特異的ペプチドとのブレインキュベ ーションによる活性の阻止及び他の腫瘍遺伝子のペプチドによる活性の阻止の失 敗によって示された（ナイマン等、１９８５）。アッセー系は、ナノグラム範囲 で蛋白を検出することができ、同一試料について繰り返した場合、再生しうる結 果が得られることが判った。

結果及び検討 表８に示されるように、結果は、２名の異なる労働者（患者２及び７）（彼等は ＰＡＨｓに高（２）又は中間（７）暴露であることが知られていた）は、ｆｅｓ 腫瘍遺伝子関連蛋白生成物の増加レベルに陽性であった。試験の結果、陽性であ ったこれら個人の各々からの血清試料を、休暇後及び仕事の６週間後に取った。

どの試料にも、７つの腫瘍遺伝子の蛋白についての陽性の帯はなかった（ｓｉｓ 、　Ｂ　−Ｔ　Ｇ　Ｆ　。

１ｎｔ−１、ｍｙｂ、　ｓｒｃ、　ｍｙｃ、　ｍｏｓ）。患者５からの１試料だ けが、ｒａｓ腫瘍遺伝子関連蛋白生成物に陽性であることが判った。しかしなが ら、この事例では、異なる時間に取った同一労働者からの２つの他の試料は陰性 であった。非暴露対照における血清腫瘍遺伝子蛋白についての全ての結果は陰性 であった。

この研究で、腫瘍遺伝子関連蛋白の高血清レベルについての陽性結果だけが、中 間又は高暴露群の個人で得られたことは注目に値する。さらに表８に示され、又 既報のように（ペレラ等、１９８８６、上記）、これらの個人も、低暴露又は非 暴露個人に比べて高レベルのＰＡＨ−ＤＮＡ付加体を有する。

陽性腫瘍遺伝子蛋白を伴う２名の個人は、又、１日当り約１箱の巻きたばこの喫 煙者であるが（患者２および５）ＰＡＨｓの彼等の身体負担量への主要な貢献は 仕事場の暴露によることのようである。

例えば、０．２ｕｇ／ｍ３の暴露は、１日当たり５ないし７箱の巻きたばこを喫 煙することからのＢＰ用量にほぼ等しい。

これらの労働者における特異的腫瘍遺伝子表現についての陽性結果は、鋳物工場 労働者が肺癌の発達に対し高いリスクを負うことが知られている（ＩＡＲＣ，１ ９８４、上記）ので興味あるものである。ＰＡＨｓがｒａｓ遺伝子に活性である ことが知られており（ボーマイン及びプラグネル、１９８３、上記、マーシャル 等、ネイチャー３１０：５８６（１９８４）、又、ｒａｓ遺伝子活性が、ヒト肺 癌、特に非小型細胞多様体（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ　ｖａｒｉｅｔｙ） にしばしば見られる（スラモン著、サイエンス２２４：２５６（１９８４）；ロ ートンヒユーズ著、二ニー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３１ ７：９２９（１９８７）；クルズロック著、キャンサー・リサーチ４６：１５３ ０（１９８６）ので、ｒａｓ蛋白について分離陽性結果を持つ労働者は注目に値 する。

例えば、肺癌の最近の研究では（ロートンヒユーズ著、１９８７、上記）、５０ ％のアデノカルシノーマ患者（１０の５）は、ｒａｓ遺伝子の一つの型（ｋ−ｒ ａｓ）の活性形を有し、そしてこの腫瘍遺伝子活性が、肺癌の発達の比較的早い 事件を示し、且つ巻きたばこ喫煙に関係することに気付いた。非小型細胞肺癌患 者での血清腫瘍遺伝子蛋白レベルの我々自身の研究において、１８名中１５名の 患者はｒａｓ遺伝子生成物の増加した表現を有し、これらのうち１２名は巻きた ばこ喫煙者であることが判った。−肺癌患者においてはｒａｓ腫瘍蛋白生成物の 増強した尿レベルをも示した（ナインマン著、１９８５、上記）。１６名の、既 知の発癌物質暴露を伴う、臨床的に健康な危険のなくなった労働者の血清につい ての我々のスクリーニングにおいて、１名の個人はｒａｓ遺伝子蛋白の特に異常 な増加表現があった（上記）。この個人も、アスベスト及び巻きたばこ喫煙を含 む発癌物質への暴露の悪い履歴があった。即ち、ｒａｓ遺伝子活性化が特に環境 発癌物質、例えばＰＡＨｓへの暴露によって起こる肺の発癌に有意な役割を演じ る可能性がある。しかしながら、上で述べたように最近の研究では、高血清ｒａ ｓ蛋白を有する個人（患者５）は、３つの試料のうち、わずか一つだけに陽性で あることが判った。肺又は他の癌の発達についてのこの個人のリスクに関するこ の孤立した結果の意味はまた明らかでない。

しかしながら、注目されるように、２名の労働者（患者２及び７）はｆｅｓ腫瘍 遺伝子関連蛋白生成物について一貫した高血清レベルであった。これら労働者の 一名は、過去１５年間ＰＡＨｓへの高暴露、巻きたばこ喫煙の、チンマーマン工 程における原料扱い工（ｃａｓｔｅｒ）であり、父、母いずれも肺癌により死亡 した。もう−名の労働者は過去９年間ＰＡＨｓへの中間暴露を伴うＣｏｒｅ　− ５ｅｔｔｅｒであった。これら両者は、又、職業的皮膚炎を有し、且つ局所性ス テロイドによる長期間処理を受けていた。ステロイドへの局所暴露がＰＡＨｓの 代謝活性に影響したのか、或いは皮膚炎が発癌物質の皮膚吸収を増強したのかは 明らかでない。ｒａｓのように、ｆｅｓはヒト肺癌にしばしば表現していること が判った。一研究において、研究した４の肺癌のすべてがｆｅｓ遺伝子の増加し た表現に関し陽性であった（スレイモン著、１９８４、上記）。肺癌患者での血 清腫瘍遺伝子蛋白の我々の先の研究において、１８名中１１名の個人はｆｅｓ生 成物に関し陽性で、これらのうち８名は巻きたばこ喫煙者であることがわかった ｆｅｓ　腫瘍遺伝子生成物の高原レベルも、肺癌患者に見られた（ナイマン等、 １９８５　上記）。加えて、臨床的に健康な危険が減った労働者の我々の研究で 、非常な巻きたばこ喫煙者のみ（１２名中６名）が、彼等の血清中、ｆｅｓ遺伝 子生成物に関し陽性であることが判った。さらに、哺乳動物の発達の間、ｆｅｓ 遺伝子の蛋白生成物は、非常に限られた組織−特異的形式（ｆａｓｈｉｏｎ）（ パイメンチル、オンコジーンズ、ボガ・レイトン、ＣＲＣブレス（１９８６）） において表現し；例えば、６ないし１８日令の若いニワトリのひなにおいて、ｆ ｅｓ遺伝子生成物は、３つの組織−骨髄、肝臓及び肺でのみ高レベルで検出され る（マセイーブレヴオト等、セル２８：８９７（１９８２））。即ち、肺発癌に おいて、ｆｅｓ遺伝子生成物の表現は、肺細胞発達の初期段階への退縮を合図し うる、又、再びこの表現は、巻きたばこ喫煙の発癌物質、例えばＰＡＨｓへの暴 露と特に関係しつる。従って、この研究で、次の論理的段階は、既知の長期間中 間ないシ高しベルのＰＡＨｓへの職場暴露且つ既知高レベルのｆｅｓ　Ｐ　Ａ　 Ｈ−ＤＮＡ付加体を伴い、そして彼等の血清中に終始一貫して高レベルのｆｅｓ 腫瘍遺伝子蛋白生成物を有する２名の労働者が、悪性疾病、特に肺の癌の発達に ついて最もリスクのあるこの群の個人であるがどうかを決定することである。

この及び他の類似の群のさらに長期間の追跡が、癌発達についてのマーカーとし て特異的腫瘍遺伝子蛋白の前兆値が正確に確めることができる前に必要であろう 。しかしながら、最近の結果は、血清腫瘍遺伝子蛋白が、職業的癌の発達につい ての危険を集団監視するための有用な分子疫学的マーカーである。

本明細書に示す実施例はモノクローナルレセプター、他のレセプター、例えばこ こで検討し、使用しつる腫瘍遺伝子関連蛋白及び関連ポリペプチドに対応する核 酸配列の用途を特定するが、そのような製造及び使用の方法は、当分野の技術の 範囲内にある。加えて、他の体試料、例えば組織又は尿の範囲にここに記載した 上記アッセー、これら方法が用いうることは、当分野の技術の範囲内にある。

■、材料及び方法 Ａ、ウィルス及び細胞系統の生長 非感染のミンク肺細胞系統（ＣＣＬ６４）、ネコ肉腫ウィルスのスダニーーセイ レン株（ＳＴ−ＦｅＳＶ）及びネコ白血病ウィルスＢ（ＦｅＬＶ−Ｂ）で生産的 に形質転換された、ＭＳＴＦと呼ばれる同じ系統、ならびにガードナー−アルス ティン　ネコ肉腫ウィルス（ＧＡ−ＦｅＳＶ）で非生産的に感染された、６４Ｆ ３Ｃ１７と呼ばれる同じ系統をセンら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニ スニー、８０．１２４６−１２５０（１９８３）に記載されるように培養した。

トリ骨髄芽球症ウィルスで非生産的に感染された非生産的トリ骨髄芽球細胞系統 をドイスベルクら、ブロク、ナトル、アヵド、サイ、ニーニスニー、ヱユ、５１ ２０−５１２４（１９８０）に記載のように培養した。

サル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）で非生産的感染された、ＮＰＶ／ＳｉＳ■及びＮＰ ＶＩ／５ｉＳＶと呼ばれる非生産的マーモセットセルラインをデバレら、ブロク 、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー、８０．７３１−７３５（１９８３）に 記載のように培養した。フジナミ肉腫ウィルス（Ｆ　Ｓ　Ｖ）で感染されたトリ 繊維芽非生産的形質転換セルラインは、ビー、セフトン・オブ・ザ・サルク・イ ンスティチュート、う、ジョラ、カリホルニア、からの贈与であった。非感染マ ウスＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞及びハーベイマウス肉腫ウィルスで生産的に感染さ れたマウスＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞をトダロら、ジように培養した。ヒトＴ２４ ぼうこう肉腫細胞をブベニツクら、インド、ジェイ、キャンサー、１１．７６５ −７７３（１９７３）記載のように培養した。

Ｂ、ペプチドの合成 ポリペプチドは、マーグリン及びメリフィールド、エイ、レブ、バ用いて合成し 、アミノ酸分析により確認した。配列情報は、ウィルス蛋白のアミノ酸配列又は ヌクレオチド配列比に基づく予言から引き出される。配列情報源は、その配列及 びその癌遺伝子に関する脚注に表示された。

免疫化接種物で用いられた３５個より少い残基を持つポリペプチドの場合、シス ティン残基が、ポリペプチドの対応する癌蛋白配列がそのような残基を含まない ところのポリペプチド各々のアミノ末端又はカルボジル末端に加えられる。Ｃｙ ｓ残基は、下記のように蛋白担体へのカップリングを助けるために用いられた。

上述の固相法で有用な合成ポリペプチドを作る際に、アミノ酸残基はカルボキシ 末端の残基からのエステル結合を介して架橋樹脂（固相）に結合された。ポリペ プチドがＣｙｓ残基を介して担体に結合された場合、このＣｙｓ残基は、樹脂に エステル結合されたカルボキシ末端残基として便利に用いられた。

付加されるアミノ酸各々のアルファアミノ基は典型的に、成長するポリペプチド 鎖にアミノ酸が付加される前に四級ブトキシ力ルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基で保護 された。ｔ　−Ｂ　ＯＣ基は次に、成長するポリペプチド鎮への次のアミノ酸の 付加前に標準的技法により除去された。

反応性アミノ酸側鎖もまた、ポリペプチドの合成の間、保護された。通常の側鎖 保護基が、下記のような残留するアミノ酸残基のために用いられた：チロシンの ために０−（ｐ−ブロムベンジルオキシカルボニル）、スレオニン、セリン、ア スパラギン酸及びグルタミン酸のためにＯ−ペンシル：システィンのためにＳ− メトキンベンジル、ヒスチジンのためにジニトロフェニル：リジンのために２− クロルベンゾキンカルボニル、及びアルギニンのためにトシル。

保護されたアミノ酸は適当な溶媒から再結晶されて、薄層クロマトグラフィーに より単一のスポットを与えた。カップリングは典型的に、当初のＮ−末端アミノ 酸のミリ当量数に対して１００倍モル濃過剰の保護されたアミノ酸及びジシクロ へキンルカルボイミドの両者を用いて実施された。両反応剤の２倍モル濃度過剰 も用いられうる。アスパラキンの場合、等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリ アゾールが保護されたアミノ酸に加えられ、ジメチルホルムアミドが溶媒として 用いられた。総てのカップリング反応は、リジン、アナル、ケム、アクタ、５８ ．２４８−２４９（１９７２）のピクリン酸テストにより９９％を越えて完了し た。

望むポリペプチドの調製後、得た保護されたポリペプチドの一部（約１ｇ）を２ ｍｌのアニソールで処理し、ドライアイス温度で約２０ｍ１の無水フッ化水素を 反応容器内で凝縮させた。得た混合物を約４℃で約１時間攪拌し保護基を解離し ポリペプチドを樹脂から除いた。Ｎ２流で４℃の温度でフッ化水素を気化した後 、残渣を無水ジエチルエーテルで三度抽出してアニソールを除去し、残渣を減圧 で乾燥した。

減圧乾燥した物を５％酢酸水溶液で抽出して（３度５０ｍＡ）、遊離のポリペプ チドを樹脂から分離した。抽出物含有溶液を凍結乾燥し、酸化されていない合成 ポリペプチドを得た。

Ｃ０担体蛋白への合成ポリペプチドのカップリング、４７７及び４７８（１９８ ２）記載のようにカップリング剤として功−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ キシスクシンイドエステルを用いてポリペプチドのシイティン残基（Ｃｙｓ：Ｃ ）を介して担体蛋白キイホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップリン グされた。Ｃｙｓ残基が配列中の末端残基である場合、さらに追加的なシスティ ン残基は付加されなかった。

簡単に述べると、各ポリペプチドのための一般的手順として、ｌＱｍＭのリン酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）の０．２５ｍＡ中の４ｍｇのＫＬＨを、ジメチ ルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）に溶解された０、７１９のＭＢＳと反応させ、得 られる混合物を室温で３０分間攪拌した。ＫＬＨが約３０％以上のＤＭＦ濃度で 不溶なのでＭＢＳ溶液はＤＭＦの局所的濃度が高すぎないことを保証するために 一滴ずつ加えられた。反応生成物であるＫＬＨ−ＭＢを、５ＱｍＭリン酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡したセファデックスＧ−２５（ファルマシア・ ファイン・ケミカルズ、ビスカタウエイ、ＮＪ）で作られたクロマトグラフィカ ラムを通過させ、遊離ＭＢＳを除去した。２８０止でモニターされるカラム溶離 物のピーク分画からのＫＬＨ回収は、約８０％であると推定された。

そのように作られたＫＬＨ−ＭＢを次に、１１の緩衝液に溶解された５即のポリ ペプチドと反応させた。得られた反応組成物のｐＨ値を７〜７．５に調節し、反 応組成物を室温で３時間攪拌した。

Ｄ、免疫化及び融合 に対応するようなポリペプチドをＫＬＨにカップリングし、上述及びナイマンら 、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ、カッ ツ編、（ポカ、ラドン、フロリダ、ＣＲＣプレス社、１９８２）、ｐｐ２１−５ １、に記載されるように１２９ＧＩＸ　マウスを免疫化するために用いた。この 免疫化したマウスからのヒ臓細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５０ ０を用いてＳＰ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させた（ジエイ、ティ、ベー カー・ケムコ、フィルスバーブ、二ニージャーシイ）；融合のだめのＰＥＧ溶液 は、融合効率を高めるために使用前少なくとも一ケ月前に作られた。ＳＰ２１０ −Ａｇ１４細胞はそれ自身の１ｇ分子を作らず、それによりアイソタイプ分析及 び続く精製を容易にし、そのような細胞はまたレトロウィルスを作らない。融合 された細胞は次に、１０％胎児牛血清、１．０Ｘ１．０−’Ｍのピポキサンチン 、ｌＸｌ０−’Ｍのメントレキシテート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘｔａｔｅ）、及び １．６×１０”Ｍのチミジンを含むデュルベツコの高グルコース微量必須媒体（ フロー・ラボラトリーズ・インク・イングルウッド、カリホルニア）の４００ｍ ｒ中に再懸濁した。次に細胞を、ナイマンら、ブロク、ナトル、アカド、サイ、 ニーニスニー、１９８２（前出）、記載のように３０μｌのプレート中に塗り、 生長させた。

２、　ｓｉｓ及びｍｙｂ関連ポリペプチドそのアミノ酸残基が、蛋白質１）２８ ｓｉｓを形質転換するサル肉腫ウィルスの予測された配列の位置１３９−１５５ 及びトリ骨髄芽球症ウィルスの予測された配列の残基２−１８に対応するポリペ プチド（Ｃ）及び（ｄ）を合成し、上述したようにＫＬＨキャリヤーにカップリ ングした。このように調製した接合体を、１２９ＧＩＸ　マウス当り一回注射当 り約５０μｇのポリペプチド量で投与した。

第Ｏ（ゼロ）日に、各接合体を完全フロインドアジュバントと混合し腹膜的注射 した。第１９日に、明ばん１ｍＡ当り５１９の濃度となるように各接合体を明ぽ んと混合した。リン酸塩で緩衝した食塩水中のポリペプチド（Ｃ）の効果促進注 射は、第６２日に静脈内に投与された。オリゴクローナル抗体を含む血清は、第 ６７日に目高刺穿により採られた。第４１日におけるポリペプチド（ｄ）の第二 の明ばん含有免疫化後に、ポリペプチド（ｄ）の効果促進を第１４３日に同様に 与えて第１４８においてオリゴクローナル抗体を同様に作るようにした。そのよ うにした得た血清を、第４図について説明されるように、その受容体の抗原性に ついてテストした。

同様の手段において、ポリペプチド、例えば下に表示されたアミノ酸残基配列が 合成された。

ａｂｌ　ＬＭＲＡＣＷＱＷＮＰＳＤＲＰＳＦｆｍｓ　ＥＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＲ ＲＰＴＦｓｒｃ　ＬＭＣＱＣＷＲＫＤＰＥＥＲＰＴＦＬＧＱＧＣＦＧＥＶＷＭＧ ＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲＲＲＳ ｆｇｒ　ＡＭＥＱＴＷＲＬＤＰＥＥＲＰＴＥ免疫は、ｓｉｓ及びｍｙｂアミノ酸 残基に記載されたと類似の手段で実施された。

３、ｒａｓ及びｅｒｂ　Ｂ関連ポリペプチドキルステンネズミ肉腫ウィルスのｒ ａｓ癌遺伝子の予測された配列からのｒａｓポリペプチドの残基９６−１１８及 びニワトリ赤芽球肉腫ウィルスからのｅｒｂ　Ｂポリペプチドの残基３６６−３ ８１に対するアミノ酸残基配列中に対応するものが、合成され、上述したＫＬＨ キャリヤーにカップリングした。こうして調製された接合体は、１２９ＧＩＸ　 マウス当り一回注射当り約５０μｇのポリペプチド量で投与した。

第０（ゼロ）日に、各接合体を完全フロインドアジュバントと混合し静脈内注射 した。第５日に、オリゴクローナル抗体含有血清を軌道穿刺によりとった。こう して得た血清は、第４図において記載されるようにその受容体の抗原性が試験さ れる。

Ｅ、抗体結合評価 抗ポリペプチド抗体を作るハイブリドーマを、第４図の説明で及びナイマンら、 モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ（前出） に記載のように酵素結合免疫吸着剤評価（ＥＬＳＩＡ）法で検出した。簡単に言 えば、約５０μモルのポリペプチドをマイクロ滴定プレート上で乾燥し、メタノ ールで固定し、ハイプリドーマ組織培養上清でインキュベートした。完全に洗っ た後に、ハイブリドーマ抗体結合を、ラビット抗マウスカッパ鎖抗体（シントン ・パイオネティクス　インク、ケンシントン、メリーランド）を用い次にグルコ ースオキシダーゼ接合ヤギ抗ラビット抗血清により検出した。接合は、ナイマン ら、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ（前 出）記載のようにグルコース及び西洋わさびペルオキシダーゼの存在下で２．２ ゛−アジノージ〔３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホネート（６））（ＡＢ ＴＳ）染料（ベーリンガーーマンハイム、インジアナポリス、インジアナ）によ り可視化された。アイソタイプは、前述したように、種々のラビット抗マウスラ ムダ又は重鎖血清を抗マウスカッパ鎖に置き代えることにより決定された。

Ｆ、電気泳動移動及びニトロセルロース上での免疫学的検出第５図の説明及びナ イマンら、ヴアイロロジイ、１２３．１８７−２０５（１９８２）に記載される ように、細胞抽出物をポリアクリルアミド電気泳動に付し、蛋白をニトロセルロ ース（ノユライヒャー・アンド・ンユエル、インク９．キーン、ニューハンプシ ャー）に移した。

１／１０００希釈されたベルオキシダーゼラベルしたラビット抗マウスＩｇＧ血 清（ダゴ、インク１．バーリンガム、カリホルニア）を、ナイマン及びエルダー 、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・ティ・セル・プロダクツ（前出 ）に記載のように、２５℃で１時間移動物とともにインキュベートし、続いて洗 った。結合した抗体は、１０ｍＭのトリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチ ル）−１，３−プロパンジオール）、ｐＨ７，４，０，００９％Ｈ２Ｏ２、領０ ０２５％　３．３゛−ジメトキンベンシジンジヒドロクロライド（イーストマン ーコダック、コ、、ロチェスター、ニューヨーク）中でのインキュベーションに より可視化された。

Ｃ１精製されたＰＤＧＦの調製 旧式の（ｏｕｔｄａｔｅｄ）血小板の１６単位は、サン・ジェゴ、ブラッド・バ ンク、サンジエゴ、カリホルニア、から得た。ここで用いた精製したＰＤＧＦは 、アントニデスら、ブロク、ナトル、アカドサイ。

ニーニスニー、７６．１８０９−１８１３（１９７９）記載の手順の初めの二つ の段階に従って得られた。

簡単に言えば、血小板は、４℃で２０分間、２８．０００重力（Ｇ）の遠心分離 により集められた血小板は、（ａ）０．１５ＭのＮａＣＡ及び１％のグルコース を含むｐＨ７，４の１７ｍＭのトリス−ＨＣｌの９容積及び、（ｂ）１００ｍｊ 当り０．８ｇのクエン酸−水和物、２．２ｇの無水デキストロース及び２．６ｇ のクエン酸ナトリウム三水和物１容積を含む混合物の４ｏｏｍｚ中に再懸濁する ことにより洗い、更に４℃で１０分間２８，０ＯＯＧで遠心分離した。このよう に洗った血小板を次に、０．００８ＭのＮａＣｌ及び０．　ＯＬＭのリン酸塩イ オンをｐＨ７，４で含む水溶液（Ｎａ（Ｊ’−リン酸塩イオン溶液）の１６ｍ１ に再懸濁し、細胞を溶解（ｌｙｓｅ）するために１０分間沸騰した。

フェニルメチル　スルホニル　フッ化物及びトレイシイロールシグマ・ケミカル ・コ、、セントルイス、シズリー）、プロテアーゼ禁止剤を各々１ｍＭ及び３％ の濃度で、分解した細胞に加えた。分解した細胞混合物を再び遠心分離して、ペ レットと上清を得た。

上清を、ＮａＣ１−リン酸塩イオン溶液中で予め平衡化したＣＭセファデックス Ｃ−５０（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、ビスカタウェーイ、ニュージ ャーシイ）ビーズの８ｒｒ＋１と混合した。上述のＮａＣ７−リン酸塩イオン溶 液のカラム容積の６倍量で洗ったクロマトグラフィカラム（１５Ｘ　１．５ｃｍ ）中に、ビーズ及び液体を注いだ。ＩＭのＮａＣｌのカラム容積の２倍量でカラ ムを溶離することにより、ＰＤＧＦ（最初の溶離物）が得られたトリジロールを 溶離物に加えて３％の最終濃度とし、溶離物を上述のＮａＣｌ−リン酸塩イオン 溶液に対して透析した。

上述で作られた溶解した細胞ペレットを、４℃で２４時時間開ＮａＣ１溶液で抽 出し、遠心分離した。上清を、上述のＮａＣｌ−リン酸塩イオン溶液に対して透 析し、上述のセファデックスに混合しカラムを作った。このカラムを洗い、上述 のように溶離して、上述のように透析された第二の溶離物を得た。この手順で作 られたペレッ三つの透析された溶離物をまとめ、アミコン限外濾過装置（アミコ ン、レキシントン、マサチューセッツ）及び１０にダルトン除外のフィルターを 用いて数ｍｌ容積に濃縮した。そのように精製したＰＤＧＦを次に、第５図につ いて述べたように処理した。

約２．５単位の血小板からの精製ＰＤＧＦ抽出物が、０．５％ドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）及び５％２−メルカプトエタノールを含む最小容量の溶液と混 合された。得られた混合物は２分間煮沸され、次いで５−１７％ポリアクリルア ミドゲルを通じて電気泳動した。蛋白は、その後電気泳動でニトロセルロースに 移動された。（ナイマン及びエルダー、前掲）それは、その後ストリップに切断 され、ウェスターンプロット手段に付された。

こうして調製されたニトロセルロースストリップは、次いでリン酸緩衝食塩水中 、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリオキシエチレン−９−オク チルフェニルエーテル（トリトン（商標）Ｘ−１００）を含む溶液で処理し、非 特異性蛋白結合を阻止した。

４ｍｆのマウス抗血清希釈１：２００を、次いでニトロセルロースストリップと インキュベートした。

ＰＢＳ中０１％トリトン（商標）Ｘ−１００の溶液で３回洗浄後、ニトロセルロ ースストリップを１分当り１０６カウントの１２５工標識スタフイロコツカス・ アウレウス蛋白又はベルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス血清（タロ）の１・１０ ００希釈のいずれかとインキュベートし、再びＰＢＳ中０．１％トリトン（商標 ）Ｘ１００で洗浄した。ペルオキシダーゼ接合物は、７．４のｐＨ価を有する１ ０ｍ１！ｈリス緩衝液中０．０００９％Ｈ２Ｏ２，０，００２５％３，３“−ジ メトキシベンジジン・二塩化水素（イーストマンーコダック、コ、）含有溶液で 発達させた。１２５１標識ストリツプを、マイナス７０℃で４８時間クロネック スハイープラス（イー・アイ・シュポン・ド・ネモウス・アンド・コ、）増感紙 を用いるＸＲＰ−１フイルム（イーストマンーコダック・コ、）上の暴露により 発達させた。

Ｈ８尿評価 図の説明で述べたように供与者（患者）からの尿を集め、集めたまま又はアミコ ン限外濾過装置を用いて４０倍に濃縮して用いた。この液を、ｓｉｓ、　ｆｅｓ 及びＳａＳ癌遺伝子によりコードされる、又はこれに関連する蛋白質についての 評価で体液試料一定量として用いた。

濃縮尿試料は下記の方法で調製された。尿を４℃で１０分間、６０００　ｒｐｍ で明澄化した。上清を次に、１０．０００ダルトン除外のアミコンフィルターを 用いて濃縮した。この濃縮した尿を次に透析して、蛋白分画を分離した。

濃縮床をル−ン当り２５μｌで５〜１７％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し て収集尿Ｌ＋＋１からの等量の蛋白を提供し、次にニトロセルロース上に電気泳 動した。次にニトロセルロース　フィルターを、たとえば３％ウシ血清アルブミ ン、０．１％トリトン（商標）Ｘ−１００及びＰＢＳ中のマウス抗血清の１／２ ００希釈を用いてプローブした。次にニトロセルロース　フィルターを３度洗い 、ＩＱ’ｃｐｍの１２５１標識プロテインＡでインキュベートした。

結合は、第６図前出について述べたように一７０℃で補力スクリーンを用いて可 視化された。

■、癌蛋白及び形質転換細胞 ＮＲＫ及びＳＳ■形質転換ＮＨＫ細胞は、センター・フォー・キャンサー・リサ ーチ、ナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス、バセスダ、ＭＤのニス ・ニー・アーロンラン及びケイ・シー・ロビングにより提供された。細胞は、１ ０％の胎児牛血清、２ｍＭのし一グルタミン、１００　Ｉ　Ｕ／ｍｌのペニシリ ン及び１００μ９／ｍｌのストレプトマイシンを補われたデュルベツコの微量必 須媒体中で生長された。

ＮＲＫ及びＳＳＶ形質転換ＮＲＫの平行培養物を２時間の間隔で３度洗い、次に 媒体中で血清なしで、１５＋＋ｌ／Ｔ７５ｃ＊２フラスコで１８時間インキュベ ートした。このようにコンディションした媒体を遠心分離し、−７０℃で凍結貯 蔵した。

コンディションした媒体を解凍し、１Ｍ酢酸中で透析して５００倍に濃縮し、次 に凍結真空乾燥した。１０％の２−メルカプトエタノールでの可溶化及び還元の 後に、濃縮したコンディションした媒体５０μｌを５〜１７％ドデシル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドゲル中に電気泳動した。分泌された蛋白を次に電気泳 動的にニトロセルロースに移しそして結合した。非特異的結合は、ｐＨ７，４の リン酸塩緩衝した食塩水中の３％ウシ血清アルブミン及び０．１％ポリオキシエ チレン　オクチル　フェニルを含む溶液で細胞抽出物をブレインキュベートして ブロックされた。

免疫学的評価の実施の前に、ＰＤＧＦ−２（１−１８）又はＰＤＧＦ−２（７３ −８９）（前述）で誘発されたマウス抗血清の２０ｕｉを、適当なポリペプチド の１００μ２で１時間３７℃でブレインキュベートした。オリゴクローナル抗体 含有／ポリペプチド反応混合物を次に、上述のブレインキュベーション溶液で１ ：５００希釈した。そのように調製した希釈した溶液を次に４℃で、ニトロセル ロース結合したコンディションした媒体と接触させ、この接触を１５分間維持（ インキュベート）シた。この時間は、抗体（受容体）とニトロセルロース上に結 合した蛋白の免疫反応のために十分な時間である洗ったニトロセルロースを次に １：５００希釈された親和性精製ラビット抗マウスＩｇＧ、抗体（リットン）と ２５℃で接触させた。接触は、抗マウスＩｇＧ、抗体が、コンディンヨンされた 媒体のニトロセルロース結合した分泌蛋白質に結合された抗血清がらの抗体と免 疫反応するのに十分な２時間の間、維持された。ニトロセルロースを次に再び洗 った。

８３（１９８４）に記載のように＋５Ｉ標識スタフイロコツカス　アウレウスプ ロティンＡの１０６カウント／分で可視化された。

Ｊ　新生児及び妊婦の尿試料中の癌蛋白用いられたモノクローナル受容体は、前 述したように調製された。各新生児からの１ｍＡの尿を十分な２−メルカプトエ タノールと混合し、１０容量％溶液とした。得られる溶液を２分間煮沸した。冷 却の上、得られる減少した溶液の一定量を５−１７％ポリアクリルアミドゲル上 で電気泳動した。得られるゲルの蛋白はニトロセルロースに移動され、標準的手 段に付された。各尿試料についてのニトロセルロースプロットは、各々の抗体プ ローブで免疫反応性が個々にスクリーニングされ、かかるウェスタンプロットの 標準的手段に付された。オートラジオグラフィーは、４時間−７０℃でクロネッ クス増感紙を用いた。免疫反応の相対的強度は、その後に決定された。

妊娠の（期待の）母からの尿試料は電気泳動の前に濃縮された。ここに、妊娠（ 最終月経周期を基にして）１６−２０週の期間に取った系列尿収集物からの蛋白 は、２容量（尿容量を基にして）のアセトンと混合することにより尿試料から最 初に沈澱させられて、４℃で保持した。沈澱した蛋白を集めてＰＢＳの元の試料 容量の１／２０を用いて再び懸濁した。宿されている胎児の性は、羊水穿刺又は 出生後、視覚検査のいずれかにより決定した。

ザ・ユナイテッド・ステイク・ガヴアメントは、パブリック・ヘルス・サーヴイ ス・コントラクトＮ０Ｉ−ＣＰ−４１００９、パブリック・ヘルス・サーヴイス ・グランッＣＡ３８１６０及びＣＡ２５８０３に従って本発明に権利を有する。

上述は、本発明を例示することを意図するものであって、限定するものではない 。多数の変化及び修正が、本発明の真の精神及び新規な概念から離れることなく 行われることができる。

ＡＢＣＤ Ａ　［ｘｌＯｌ ＡＢＣＤＥＦ　ＧＨＩＪＫＬ ＡＢＣＤＥ　ＦＧＨＩＪ　ＫＬ　Ｍ　ＰＪＯ鎧、乙 ＡＢＣＤＥＦＧＨ ＦＩＧ、　８゜ ＡＢＣＤ　Ｅ　Ｆ ＡＢＣＤ ７ん−ｒｏｓ９７−１１８ 細胞抽出物　上清 ＡＢＣＤ　ＥＦＧＨ ｈσ／３゜ Ｆ／Ｇ、　／４゜ Ｓａ４＋　−」− んσ／７ ｐ５５ｒａＳ−ツク−，− ｐ２ｉｒａｓ−、− Ｂ　ａｎｔｉ−ｆｅｓ 癌遺伝子　残基位置　ポリペプチド配列魯　− ｆｏｓ　９２７−９３８　１ＧＲＧＮＦＧＥＶＦＳＧＳｒＣ２７３−２８４ＬＧ ＱＧＣＦＧＥＶＷＭＧ二　５５７−５６８　Ｉ、ＧＱＧＣＦＧＥ’Ｓル躬Ｇｈ「 ３１０−３２１　ＬＧＱＧＣＦＧＥ四ＬＧｆｍｓ　６１Ｂ−６２９ＬＧＴＧＡＦ ＧＫＶＹＥＡｅｒｂ　Ｂ　１３Ｂ−１４９ＬＧＴＧＡＦＧＴ工ＹＫＧｍｈｔ　９ １−１０２　工ＧＳＧＳＦＧＴＶＹＧＫｒａｆ　３０−４１　１ＧＳＧＳＦＧＴ ＶＹＧＫａｂｌ　３６Ｂ−３７９ＬＧＧＧＱＹＧＥＶＹＥＧｍｏｓ　１００−１ １．Ｉ　ＬＧＳＧＧＦＧＳＶＹＫＡＥσ２θ 癌遺伝子　残基位置　ポリペプチド配列エフ　０　Ｂ　−７２２ＦＰ　ＩＫＷＴ ＡＰＥＡＡＬＹＧＲＦ／θ２／。

保存され１こキナーゼ部分　３ 拒　１１５２−１１６７　ＬＭＱＲＣＷＥＹＤＰＨえ嘘５Ｆｓｒｃ　４９４−５ ０９　ＬＭＣＱＣＷＲＫＤＰＥＥＲＰＴＦ工　７７０−７９３　ＬＭＫＬＣＷＫ ＫＤＰＤＥだ可Ｆｆａｒ　５３Ｌ−５４６ＡＭＥＱＴＷＲＬＤＰＥＥＲＰＴＦｆ ｍｓ　９１０−９３３　ＦＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＲＲＰＴＦｅｒｂ　Ｂ　３６６ −３８１　工ＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＦｍｈｔ　３１６−３３１　ＬＶＡ ＤＣＬＫＫＶＲＥＥＲＰＬＥｒａｆ　２５５−２７０　ＬＶＡＤＣＶＫＫＶＫＥ ＥＲＰＴＦａｂｌ　５９１−６０６　ＬＭＲＡＣＷＱＷＮＰＳＤＲＰＳＦｍｏｓ 　３４４−３５９　１工ＱＳＣＷＥＡＲＧＬＱＲＰＴＦｒｅｌ　３Ｂ２−３９７ 　ＴＬＨ５ＣＷＱＱＬＹＳＰＳＰＳＡＦ／Ｇ、２２゜ ＦＩＧ、　２６゜ ＦＩＧ、　２？ ＦＩＧ、　２８゜ ＦＩＧ、　２９゜ ＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪにＬ ＦＩＧ、　３０゜ ＡＢＣＤ　Ｅ　ＦＧ　ＨＩＪにＬ ＦＩＧ、　３／。

Ｆ’Ｇ、３２゜ ”　ＢＴＧＦ　ｒｕ　ｅｒｂＡ ＦＩＧ、　３３゜ ２！！　ＢＴＧＦ　ｒａｓ　ｅｒｂＡ Ｆθ、３４゜ ｏＢ　ＢＴＧＦ　ｒａｇ　ｅｒｂＡ ｍ３５゜ ０、！！　ｆ３ＴＧＦ　ｒａｓ　ｅｒｂＡＦＩＧ、　３８゜ ＲＧ、　３９゜ Ｄ７０　１ＹＲ ＦＩＧ　４０゜ ψｏＦＦ、”＞　ｅ％１〜−〜０１〜哨ロロロロず　つつつ！〜−〇へつ哨−〇 〜−唖−Ｇ〜〜−−〜〜〜〜−〜−〜〜　〜〜−〜〜〜〜−〜〜〜〜〜−にロロ ロロロロロ００００００００００ロＱＯロ０ロＯロロロロロ０〜Ｏ手口０ロロ０ ６０　ＣＩ　Ｃｌロロロロ　ロ〜ロロ〜へ０ロロ〜Φ〜〜〜−ロ己 〜０８゜。〜〜〜〜。。。〜〜。〜　〜〜〜〜〜〜。〜。。〜〜〜〜〜〜〜〜〜 〜。。。。。。。−。。６、。。。。−０−０゜。

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Ｆ／Ｇ　４４力。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．発癌物質への暴露の指示物について体試料をアッセーする方法であって、以 下を含む （ａ）該体試料をレセプター分子と接触させること、ここに該レセプターは、（ ｉ）蛋白リガンド及び（ｉｉ）該蛋白の部分に対応する約７ないし約４０のアミ ノ酸を含むアミノ酸残基配列を有するペプチドの両方に結合する、及び、 （ｂ）もしあれば、蛋白／受容体複合体の量を検出することにより該体試料中の かかる蛋白のレベルを決定することここに正常試料中のレベルに比べ高レベルの 該蛋白は、発癌物質への該体試料の暴露を指示する。
2. ２．該体試料が血液、組織及び尿からなる群から選択される、請求項１の方法。
3. ３．該アッセーがイムノブロットである、請求項１の方法。
4. ４．該レセプター分子がポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体及びその断片からなる群から選択される、請求項１の方法。
5. ５．該レセプター分子が（ａ）Ｈ−ｒａｓ腫瘍遺伝子関連ｐ２１及び（ｂ）【配 列があります】及び 【配列があります】 から選ばれた式により示される、左から右に、そしてＮ末端からＣ末端の方向に アミノ酸残基配列を有するポリペプチドの両方に結合する、請求項１の方法。
6. ６．体試料の発癌物質への暴露の指示物についてのアッセー方法であって、 （ａ）該体試料をレセプター分子と接触させること、ここで該レセプターは（ｉ ）Ｈ−ｒａｓ腫瘍遺伝子関連ｐ２１又はこれに対応する核酸配列及び（ｉｉ） 【配列があります】及び 【配列があります】 から選ばれた式により示される、左から右に、そして、Ｎ末端からＣ末端の方向 にアミノ酸残基配列を有するポリペプチド又はこれに対応する核酸配列の両方と 結合する、及び（ｂ）もし必要なら該レセプターと複合体を作った該体試料の量 を検出することにより、該蛋白又はこれに対応する核酸配列のレベルを決定する こと、 ここに、正常試料中の該レベルに比べて、該蛋白又はそれに対応する該核酸配列 の高レベルは、該発癌物への暴露を指示する。 を含む。
7. ７．体試料が由来する個人における癌の臨床症候の明示前、体試料の癌の指示物 についてのアッセー方法であって、（ａ）該体試料をレセプター分子と接触させ ること、ここに該レセプターは（ｉ）蛋白リガンド及び（ｉｉ）該蛋白の部分に 対応する約７ないし約４０のアミノ酸を含むアミノ酸残基配列を有するペプチド の両方と結合する、及び （ｂ）もし必要ならば蛋白／レセプター複合体の量の検出により該体試料中のか かる蛋白のレベルを決定すること；ここに正常個人での該レベルに比べ該蛋白の 高レベルは癌の指示である。 を含む。
8. ８．該体試料が血液、組織及び尿からなる群から選ばれる、請求項７の方法。
9. ９．該アッセーがイムノブロットである、請求項７の方法。
10. １０．該レセプター分子がポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノク ローナル抗体又はその断片からなる群から選ばれる、請求項７の方法。
11. １１．該レセプター分子は（ａ）Ｈ−ｒａｓ腫瘍遺伝子関連ｐ２１及び（ｂ）【 配列があります】及び 【配列があります】 から選択された式により示される、左から右に、そしてＮ末端からＣ末端の方向 にアミノ酸残基配列を有するポリペプチドの両方と結合する、請求項７の方法。
12. １２．体試料が由来する個人における癌の臨床症候の明示前、体試料の癌の指示 物についてのアッセー方法であって、（ａ）該体試料をレセプター分子と接触さ せること、ここに該レセプターは（ｉ）Ｈ−ｒａｓ腫瘍遺伝子関連ｐ２１又はそ れに対応する核酸配列及び（ｉｉ） 【配列があります】及び 【配列があります】 から選ばれた式により示される、左から右に、そしてＮ末端からＣ末端の方向に アミノ酸残基配列を有するポリペプチド又はこれに対応する核酸配列の両方と結 合する、及び（ｂ）該レセプターと複合体を作った体試料成分の量を検出するこ とにより該蛋白又はこれに対応する該核酸配列のレベルを決定すること；ここに 、正常試料に比べて該蛋白又はこれに対応する該核酸配列の高レベルは、該発癌 物質への暴露を示す。 を含む。