JPH03500969A - 発酵法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発酵法 本発明は改良された発酵法、特に、アルブミンを培地に分泌することができるγ ＤＮＡ−含有微生物の発酵により生産する人血清アルブミン（以下アルブミンと 称す）の量を増加する方法に関する。

アルブミンは血漿の主要成分であり、火傷、出血性ショックおよび他の症状を治 療するために、代用血漿又は代用血清として使用することができる。組換えＤＮ Ａ技術により、アルブミンの遺伝子を導入した微生物の発酵により、アルブミン を生産することができる方法が記述されている（ＧＢ−Ａ−２１４７９０３）。

細胞内のアルブミンは多くの異種蛋白質と同様に、不活性な、不溶解性の形態で 生産され、それ等から天然の蛋白質を得ることは非常に困難であるから、周囲の 培養液にアルブミンを分泌するような微生物を構築することが好ましい（例えば 、Ｍ、ＬｍＮｘ等による、１９５８年度、Ｂｉｏ　／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ７　５ 巻、１３０９から１３１４頁参照）。製造法の生産性を最大にするために、高速 で撹拌し、通気した発酵槽内で微生物を増殖して、高濃度の細胞と生成物を得る のが望ましい。残念ながら、これ等の条件は、分泌蛋白質を細胞内媒質において 物理的、化学的および酵素的分解に曝され、その結果発酵槽で生産されるアルブ ミンの量は、温和な条件における微生物の生産から期待される量よりかなり少な い。

或種の化学薬剤の添加は、特に最小培地（即ち、複合有機窒素源を含有しない生 育培地）における分泌アルブミン濃度を上昇さすのに効果的であることが分かっ た。

特に、通常泡の抑制に必要な量より一層多い量で或種の消泡剤を添加すれば、こ の安定化効果を示す。効果的な薬剤にはポリプロピレングリコール（平均分子量 ２，０００）および「ボリリシネー）Ｊ　（Ｃｒｏｄｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ＠よ り製造された、ひまし油脂肪酸とエチレンオキシドとの縮合物）を含む。

適当なポリアルキレンの重合体又は他の化合物との共重合体、例えばポリエチレ ングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリソルベート８０、エチレンオキ シドとプロピレンオキシドとの共重合体、およびエチレンオキシドおよび／又は プロピレンオキシドと、脂肪酸、脂肪族アルコール、糖およびポリオール、例え ばシュガーアルコール（例えばソルビトール）、エチレングリコール、ペンタエ リスリトリトールおよびグリセロールのような他の化合物との共重合体を使用す ることができる。

ポリオキシプロピレン重合体は一般式ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−０）ｎ −Ｈを有する。適当なポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合体は 、Ｘ−（０−（ＣＨ−ＣＨ（ＣＨ３）　−〇）ｍ−（ＣＨ２−ＣＨＯ）　−Ｈ） 　（式中、Ｘが１ヒドロキシ基２　ｎ　Ｌ 含有ポリオールであり、Ｌは２〜６であり、ｍは１０〜３０であり、ｎは０〜１ ０である）を示すことができるものである。他の適当な一連の化合物はポリオー ルとして、２つの利用可能な水酸基を有し、各々は−Ｏ（ＣＨ−ＣＨ（Ｃ１３） −０）　ｎ−Ｈ基によって置換可能であり、各々のｎは同一であるか又は異なる ポリエチレングリコールを使用する。

上記の全ての化合物は、本明細書では「ポリオキシアルキレン化合物Ｊと呼ぶ。

これ等の化合物は通常消泡化合物である。そのような化合物が消泡特性を有しな い場合には、「望ましくない水準の泡の発生を抑制するのに必要な量以上」は、 零より大きな量を意味する。

適当な化合物にはｒＤ＊ｒ＊ｓ目１」という商品名で入手できるもの（例えばｒ 　Ｄｘｒｔｓ＋ｉｌ　８２３１Ｊ　）　（ＧｒｇｃｅＤｅｍｒｂｏｒ＊　Ｌｔｄ 、Ｗｉｄｎｅｓ、Ｃｂｅｓｈｉｒｅ、英国）およびＢｒｅｘ。

ＦＭＴ　３０　（Ｗｘｊｅｒ　Ｍｘ＋ｓｇｅｍｅ＋ｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌ ｔｄ。

Ｋｉｄｄｅｒｍｉｎｓ（ｅｒ、　Ｗｏ＋ｃｓ、英国）を含む。

微生物発酵における高細胞密度は、一般に流加培養により達成される。これ等の 条件下で、発酵槽はその方法の出発時に一部満たされており、少量の炭素基質だ けが含まれている。発酵が進んだ時、炭素基質の濃厚溶液およびその他の栄養素 を漸次添加する。消泡剤はそのような方法においての一般的な加工助剤であり、 泡の制御は発酵槽の最上部近くに取り付けたセンサーにより行われ、泡を感知し た時消泡剤が添加される。発酵槽は出発時には一部満たされているだけであるか ら、発酵の初期段階では、消泡剤はほとんどあるいは全く添加せず、泡の上部が センサーに達して、センサーが作動するのは、工程の終期近くに容器が充満する 時だけである。代表的な使用率は０．０２から０゜２ｇ／ｌの発酵ブロスである 。

対照的に、ここで記載する方法では、安定剤を発酵の出発時（又は初期段階で） から添加する。その薬剤は１回分ずつ発酵の出発時又はその近くで添加すること ができ、或は一連の試料に、工程を通じて徐々に又は間欠的に添加することがで きる。このように、一方は細胞の生物量又はアルブミンそして他方は薬剤の間の 釣合いをほぼ保持することができる。

１種以上の適当な安定剤化合物を使用することができる。この方法の使用割合は 、０．５から：１−０ｇ／／（好ましくは１から５ｇ／＃）の安定剤濃度、（１ つより多く使用する場合には全安定剤の濃度）を生ずるようにする。流化培養の 利用は特に異種蛋白質の生産のための高細胞密度生産に適するけれども、その方 法はこの形式の発酵に限定されるものではない。これ等の濃度でこれ等の薬剤の 使用は単純なバッチ式培養又は連続培養のアルブミンの生産にも適用することが できる。後者の場合、薬剤を連続的又は間欠的に添加して０．５から１０ｇ／ｌ （好ましくは１から５　ｇ　／　ｌ　）の望ましい範囲に濃度を保持することが できる。

本発明の安定剤の使用は比較的収率の低い酵母の菌株に有利であることが分った 。高いアルブミンの収率が得られる或種の酵母の菌株では、高い細胞密度を生ず るような発酵条件の場合、有利な効果は余り認められず、低い細胞密度で生産す るのが目的の場合には、効果を認めることができる。

アルブミンは天然由来のもの又は修飾形、例えばその断片でよいが、但し、化合 物はＨＳＡの少くとも１つの機能性、例えばその腫瘍症の又は配位子結合の特性 又は実験用培地での有用性を保有する必要がある。特にアルブミンはＥＰ−Ａ− ３２２，０９４号の開示される断片のものでよい。分泌は適当なシグナル配列、 例えばｐｒｅ−ＩＳＡ配列又は酵母アルファ因子シグナル配列によって伝達する ことができる。

微生物は適当な細菌の菌株（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ又はＳｌ＋ｅｐｆ、ｏｍｙ ｃｅｓ　ＳＰＰ、　）又は酵母（Ｓｓｃｃｈａ＋ｏｍｙｃｅｔｃｅ＋ｅｖｉｓｉ ａｅ又はＫＩＢｖｅ＋ｏｍ７ｃｅｓ　ｌａｃ口≦等）のような、発酵培地にアル ブミンを分泌する微生物（動物又は植物細胞培養物を含む）でよい。アルブミン 分泌酵母およびそれ等の、アルブミンを生産する発酵については、Ｅｐ−Ａ−３ ２２，０９４号およびＥｐ−Ａ−２０１，２３９号に開示されている。

実験室発酵槽を、５０ｍ１／ｌの塩混合物（１１４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４，１２ ｇ／ｌのＭｇ５ｏ４，３．０　ｇ／ｌのＣａＣｌ２−６Ｈ２０，２，０ｇ／Ｉの Ｎ　ａ　２ＥＤＴＡを含有する）；３ｇ／／のＺｎＳ’０４’７Ｈ２０，１０ｇ ／／ｃ）ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０，３，２ｇ　／　ｌのＭｎＳＯ４−４Ｈ，，０， ７９■／Ｉ（ＤＣｕ　ＳＯ４・５Ｈ２０，１，５ｇ／　／のＨ２ＢＯ３゜０．２ ｇ／ｌのＫ１．０．５ｇ／ｌのＮａ、、Ｍｏｂ４’２ＨＯ，０，５６ｇ／ＩのＣ ｏ　Ｃ１・６　Ｈ２０゜７５ｍ１／／のＨａ　Ｐ　０４を含む１０ｍ１／／の微 量成分の溶液：２０ｇ／ｌのスクロース；１．６ｇ／７のパントテン酸カルシウ ム、１．２ｇ／／のニコチン酸。

１２．８ｇ／Ａ’のｍ−イノシトール、０．３２ｇ／ｌのチアミンＨＣ１，０， ８ｇ／／のピリドキシンＨＣＩおよび８■／ｌのビオチンを含有する５０ｍ１／ ／のビタミン混合物を包含する最初の「バッチ」培地で、公称の作業量の半分ま で満たした。１００　ｍｌ　／　／の塩混合物、２０　ｍｌ　／　ｌの微量成分 溶液、５００ｇ／Ａ！のスクロースおよび１００　ｍｌ／　ｌのビタミン溶液を 含有する等量の「供給」培地を、計量ポンプによって発酵槽に接続する独立した 貯蔵容器に入れた。

５００■／ｌのアルブミンを５ｘｃｃｈｘ＋ｏｍ７ｃｅｓｃｅｎｅｖｉｓｉａｅ を接種した発酵槽に添加した。ｐ）Ｉをアンモニア又は硫酸の自動添加により５ ．７±０．２に保持し、温度を３０℃に保ち、撹拌機の速度を、１１７７７分の 空気流速において２０％の空気飽和度以上の溶存酸素応力（Ｄ　ＯＴ）を示すよ うに調節した。最初の基質が消費された時に、定量ポンプが作動し、約０．１５ ｈ’の生長速度が保持される。この生長速度を保持するため、ポンプの速度を、 撹拌器の速度が最大値に達する迄増加し、その最大値の地点では、最小値が生ず る可能性のある１５％空気飽和度以下にＤＯＴが下がることなく、ポンプ速度を 更に増加することは不可能であった。ＰＰＧ２０００は泡のセンサーの反応に応 じて添加した。５０％以上の供給溶液が添加される迄は何も添加しなかった。

添加の最終の水準は０．２ｇ／ｌであった。発酵の終期における生物量は９３　 ｇ　／　Ｉであった。最初にあったアルブミンの約９０％は、供給の出発時の２ ４時間以内に分解した。

別の同一条件下でその後の実験で、ＰＰＧを発酵の出発時にＩｇ／ｉ’の水準で 添加した。発酵の経過は非常に類似しており、９４　ｇ　／　ｌの最終乾物重量 に達したが、この場合にはアルブミンの分解がその後減少し、その結果発酵の終 期には最初にあったアルブミンの約６０％が分解した。

制御系を使用してＲＱが１．２を越えた場合には供給速度を減するように、ポン プ速度を自動的に増加するような修正をして、一連の実験を上記のバッチ供給の 試料を使用して行なった。この方法は「クラブトリー効果」により起り得る収率 減が避けられる。全ての場合、分泌アルブミン生産をコードするプラスミドを含 有するＳａｃｃｈｘｒｏｍｙｃｅｔ　ｃｕｅｖｉｓｉａｅを発酵槽に接種した。

次のプロトコールは次の結果を伴う消泡剤添加に使用した。

例２Ａ、（比較例） ＰＰＧ２０００を単独で泡センサーの反応によって添加した。発酵の出発時にお ける零は、１０％の供給後０．１ｇ／Ｉ！に増加し、ついで最後の５０％の供給 の間に０．２ｇ／／の最終の水準まで上昇した。最終生物量は８４　ｇ　／　／ であり、アルブミンの水準は任意の基準で１．０単位であることが示された。

例２Ｂ ポリリシネートを発酵の出発時に１．５ｇ／Ａ’添加し、３５％の供給物を添加 した後頁に２．２ｇ／Ｉ増加し、供給が完了した時に２．５ｇ／ｌの水準を保持 するために更に増加した。供給が終った後に更に添加して３．５ｇ／Ｉの最終水 準まで上昇した。最終の生物量は８３ｇ／ｌで、アルブミン水準は３．８１単位 であった。

例２Ｃ ＰＰＧ２０００を１　ｇ　／　ｌの初期の値迄添加し、５０％および８０％の供 給時に更に添加してこの濃度を維持した。最終生物量は８６ｇ／ｌ、アルブミン 濃度は４．２単位であった。

氾　分泌アルブミンの濃度増加（第２事例）異なる菌株のＳ、ｃｅｒｅマ１ｓｉ ｘｅ　（然し分泌アルブミンのプラズマはやはり含有している）を使用した以外 は一連のバッチ供給の発酵を例２の方法により行った。消泡剤を例２Ｃの条件に より添加し、次の結果を得た。

生物量　アルブミン濃度 消泡剤　（ｇ／／）　（任意の単位） 落花生油　９５．４　１．０ Ｃｈｉｌｌ　１　８６．８　Ｇ、８ Ｂｒｅｏ！ＦＭ７３０　ｇｌ、８　３．２Ｄａ＋ａｓｌｉｌ　８２３１　８１． ６　２．５消泡剤（Ｄａ＋ａｓｌｉｌ　８２３１およびＢ＋ｅｏｘ　ＦＭＴ　３ ０）に由来するポリアルケンオキシドはその他のものより高、いアルブミン収率 を与えることが明らかである。

国際調査報告 ＋ａ＋＋、ｍｍｌ　４１１Ｍ１ｍＭ　ｋｌ　ＰＣ！、’Ｃ９＊ロ　ｒ’１ｍＬＡ 国際調査報告　ＰＣＴ／ＧＢ８９１０１０４６ＳＡ　３１２１７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アルブミン分泌性の微生物を適当な培地で発酵して、アルブミンを培地に分 泌させて人血清アルブミンを製造する方法において、ポリオキシアルキレン化合 物を所要量以上培地に添加して、望ましくない水準の泡の発生を抑制することを 特徴とする、上記人血清アルブミンの製造法。 ２．ポリオキシアルキレン化合物を０．２ｇ／ｌ以上の平均水準を示すように添 加する、請求項１記載の方法。 ３．ポリオキシアルキレン化合物を０．５から１０ｇ／ｌの平均水準を示すよう に添加する、請求項２記載の方法。 ４．ポリアルキレン化合物を１．０から５．０ｇ／ｌの平均水準を示すように添 加する、請求項３記載の方法。 ５．ポリオキシアルキレン化合物は消泡化合物である、請求項１から請求項４の 何れか１項に記載の方法。 ５．ポリオキシアルキレン化合物はポリプロピレングリコール、ひまし油脂肪酸 とエチレンオキシドの縮合物、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドとポ リオールとの共重合体、又はプロピレンオキシドとポリエチレングリコールとの 共重合体である、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。 ７．微生物は酵母である、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。 ８．酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項 ７記載の方法。 ９．培地は最小培地である、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。 １０．請求項１から９の何れか１項に記載の方法により製造したアルブミン。