JPH03501019A - 多段階包括／負荷方法による親油性薬物を含有するリポソームの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多段階包括／負荷方法による 親油性薬物を含有するリポソームの調製方法本発明は新規リポソームに包括され た親油性薬物組成物、そのような組成物の調製方法、およびヒトを含む哺乳動物 の体内でカプセル化した薬物を送達する化学療法剤としてのそのような組成物の 使用方法に関する。

より詳細には、本発明は脂質２重層へ分配することが可能な任意のカチオン性、 親油性薬物、ことにヒトを含む哺乳動物の腫瘍、即ち悪性状態を処置するために 使用するアントラサイクリン抗悪性腫瘍剤を、単層膜または多層膜脂質小胞体と して作成されたリポソームミセル粒子内に組み込むための新規多段階包括／負荷 方法に関するものである。この新規包括／負荷方法は脂質膜からリポソーム内の 内部水性空間への薬物の通過を促進し、それによってトラ・ノビング効率、即ち 、体内で送達可能な薬物量、例えば腫瘍組織へ送達可能な抗悪性腫瘍剤の量を増 大する。また抗悪性腫瘍剤の場合、リポソームに包括されたアントラサイクリン 抗悪性腫瘍剤治療に伴なって生じるそれ以外の効果として、薬物送達システムの 生体内安定性の増大、腫瘍組織部位への薬物送達の特異性の増大、心毒性の減少 、およびこれらの薬物の送達システムを大規模に製造し、投与する効果を提供す ることが挙げられる。

発明の背景 アントラサイクリン抗悪性腫瘍剤を腫瘍組織へ指向させ、送達されたアントラサ イクリン薬の効率を増大し、その心毒性を減少させる用途を含む、各種薬物の生 物分解性送達システムとしてのリポソームの使用は最近２０年間に科学文献に報 告され、次第にその数を増加したきた。例えば米国特許第３９９３７５４号、１ ９７６年１１月２３日発行、ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）ら；同第４２１７３４４ 号、１９８０年８月１２日発行、バンラーバーク（Ｖ　ｌｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ ）ら；同第４２３５８７１号、１９８０年１１月２５日発行、ノくノずノ１ジョ ブ−ロス（Ｐ　ａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）ら、同第４２４１０４６号、１ ９８０年１２月２３日発行、パパハジジブーロスら一同第４２６３４２８号、１ ９８１年４月２１日発行、アップル（Ａｐｐｌｅ）ら；同第４３１０５０５号、 １９８２年１月１２日発行、パルデシ二ヴイーラー（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌ ｅｒ）ら；同４３３０５３４号、１９８２年５月１８日発行、サクライ（Ｓ　ａ ｋｕｒａｉ）ら；同第４３３１６５４号、１９８２年５月２５日発行、モーリス （Ｍｏｒｒｉｓ）；同第４３５６１６７号、１９８２年１０月２６日発行、ケリ ー（Ｋｅｌｌｙ）；同第４４１１８９４号、１９８３年１０月２５日発行、シー ランク（Ｓ　ｃｈｒａｎｋ）ら；同第４４１９３４８号、１９８３年１２月６日 発行、ラーマンら；同第４４２７６４９号１９８４年１月２４日発行、ディンゲ ル（Ｄｉｎｇｌｅ）ら；同第４４３８０５２号、１９８４年３月２０日発行、ウ ィーブ−（Ｗｅｄｅｒ）ら；および同第４５１５７３６号、１９８５年５月７日 発行、ディー７−（Ｄ　ｅａａ＋ｅｒ）参照。また国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８ ４１０１４３１号、１９８５年３月４日公開（国際特許出願公開番号ＷＯ３５１ ０Ｏ９６８号）、発明者メヒ−Ｌ　−（Ｍ　ａｙｈｅｗ）ら；国際特許出願ＰＣ Ｔ／１ＪＳ８４１００８５５号、１９８５年１１月２１日公開（国際特許出願公 開番号ＷＯ３５１０５０３０号）、発明者ジャノフ（Ｊａｎｏｒ）ら；ヨーＣｌ ツバ特許出願第０００４４６７号、１９７９年１０月３日公開、発明者アップル ら；ヨーロッパ特許出願第００３６６７６号、１９８１年９月３０日公開、発明 者ハント（Ｈｕｎｔ）ら；ヨーロッパ特許出願第０１６１４４５号、１９８５年 １１月２１日公開、発明者フクシマ（Ｆ　ｕｋｕｓｈｉｍａ）ら；ヨーロッパ特 許出願第０１９８７６５号、１９８６年１０月２２日公開、発明者ラーマン；お よび英国特許出願番号ＧＢ２１４６５２５Ａ号、１９８５年４月２４日公開、発 明者マーガリット（Ｍａｒｇａｌｉｔ）を参照。またライマン（Ｒｙｍａｎ）ら 、「ポジプル・ユーズ・オブ・リポソーム膜・イン・ドラッグ・デリバリ−（Ｐ ｏｓｓｉｂｌｅ　Ｕｓｅ　ｏｒ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌ ｉｖｅｒｙ）Ｊ［［オブティマイゼーション・オブ・ドラッグ・デリバリ−（Ｏ ｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、アルフレッド ・ベンゾン−シンポジウム（Ａ　１ｆｒｅｄ　Ｂ　ｅｎｚｏｎ　Ｓ　ｙｍｐｏｓ ｉｕｍ）　１７　Ｊ、Ｈ，バンドガード（Ｂｕｎｄｇｕａｒｄ）ら編（コペンハ ーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ムンクスガード（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ）、 １９８２年コニフォーセン（Ｆ　ｏｒｓｓｅｎ）ら［ブロシーデイングズ・オブ ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＵＳＡ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、）７８巻、３号、１８７３〜１． ８７７（１９８１年）］；ギャビゾン（Ｇａｂｉｚｏｎ）ら［キャンサー・リサ ーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｃｈ）、４２巻、４７３４〜４７３９（１９８ ２年）］：およびフフォーンら［キャンサー・リサーチ、４３巻、５４８〜５５ ０（１９８３年）］をも参照。

リポソーム薬物送達システムを調製する先行技術方法に関する一つの共通した障 害は、そのような方法により達成可能なリポソーム薬物包括程度（トラッピング 効率）が低いことである。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１５０１号お よびＰＣＴ／ＵＳ８５１０１５０２号（１９８６年２月２７日公開（ＷＯ８６１ ０１１０２号およびＷＯ３６１０１１０３号）、発明者バリー（Ｂａｌｌｙ）ら ）には、包括をほぼ１００％に近づけ、同時にリポソーム運搬体へ薬物が負荷さ れる率を増大する、トラッピング効率の増大が得られる方法が開示されている。

これらの方法はリポソーム膜壁を通して１またはそれ以上の荷電した種（Ｎａ” ／Ｋ”、Ｃａ＋“およびＨ“が開示されている）に対するイオン勾配を生み出す 膜内外電位差を生じることからなる。その名前が意味する様に、ｓ度勾配は、小 胞体の内側（「内相ｊ）および外側（「外相」）で異なった濃度の荷電様を有す るリポソームを作成することから生じる。オストロ（○５ｔｒｏ）Ｌ　ｒリポソ ームズ、フロム・バイオフィジックス・セラピコ−ティックス（Ｌｉｐｏｓ。

ｍｅｓ、　ｆｒｏｍ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃｓ　ｔｏ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓ）ｊにューヨーク（Ｎ　ｅｗＹ　ａｒｋ）、マーセル・デツカ−社（Ｍａｒｃ ｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、）、１９８７年）、６０〜６５頁参照。

特定の脂質混合物から小型の単層膜リポソームを作成するように設計されたプロ セスを実施する間、ｐＨ１節のため、酸、塩基またはその双方を添加する方法が 米国特許第４６１９７９４号（１９８６年１０月２８日発行、ハウザー（Ｈａｕ ｓｅｒ乃に開示されている。しかしこのハウザーの特許は前もって作成した小胞 体へ薬物を負荷する方法を開示していない。

発明の要約 本発明者らは、まず最初に水性媒質中、少なくとも１個のイオン化可能な官能基 を有し、水に極めてよく溶解し得る十分な極性を有し、小胞体膜の全体にわたっ て低い透過性を示す（即ち、リポソームからの漏出率が低い）有機酸の存在下で リポソームを形成することからなる方法によって、脂質２重層へ分配することが できるカチオン性、親油性薬物を標準的なリポソーム薬物送達システム内に速や かに高′ａ度で包括し、負荷できることを見い出した。

包括される薬物は、リポソームが形成される間存在させるか、あるいはリポソー ムの形成に引き続いてリポソームを含有している酸性水性媒質（外相）へ添加す ることができ、そのいずれの場合も、加工中のこの時期に２重層内に内包される ことはあってもこれを透過することはない。

ついで内相および外相にある酸分子を対応するアニオンへ変換させる塩基を添加 する。この塩基はそのカチオンがリボンーム小胞体の脂質２重層を通過できない ものであるべきであり、また個々の塩基の選択は包括される個々の薬物によって 左右される。ある種の塩基はある種の薬物、特にアントラサイクリン抗悪性腫瘍 剤を包括するのに作用しないか、もしくは他の塩基はど十分に作用しないことが 判明した。

塩基カチオン電荷は外水相中の酸アニオンを中和する。しかし塩基力゛チオンは 脂質２重層を通過することができないから、小胞体内の内水相に含有されている 酸アニオンはカチオン性薬物と結合することによってのみ電荷が中和される。従 って、薬物は膜２重層を通過して内水相へ誘導されるようになる。

したがって本発明の目的は、リポソームに包括されたアントラサイクリン抗悪性 腫瘍剤組成物のような、新規カチオン性リポソーム包括親油性薬物組成物を提供 することにある。

本発明はまたリポソームに包括されたアントラサイクリン抗悪性腫瘍剤組成物の ような、リポソーム包括カチオン性親油性薬物組成物を調製する新規多段階包括 ／負荷方法を提供することにあり、この組成物は脂質膜からリポソームの内部水 性空間への薬物通過を促進し、それによってエントラップ効率を増大し、体内の 適切な部位へ送達可能な薬物量を増大させる。

当業者であれば、以下の説明および請求の範囲から本発明のこれらの目的および それ以外の目的ならびに本発明の本質、範囲および利用を容易に理解し得よう。

発明の詳細な説明 脂質２重層へ分配でき、従って本発明を実施する際の使用に好適であるカチオン 性、親油性薬物には下表に示すものが含まれる。

（表つづき） （オストロ、前掲、６４頁） ダウノルビシン（ダウノマイシンとしても知られている）、ド牛ソルビシン（ア ドリアマイシンとしても知られている）、アクラシノマイシンＡ１ビンブラスチ ン、ビンクリスチン、マイトマイシンＣ等、がん組織またはがん細胞に対して抗 悪性腫瘍活性を有するカチオン性アントラサイクリン化合物は、本発明の新規多 段階包括／負荷方法を用いてリポソームミセル粒子内に組み込むのに特に好まし い。構造的にこれらのアントラサイクリン化合物はグリコシド結合によってアミ ノ糖へ結合された疎水性テトラサイタリン環系を含んでいる。

本発明を実施する際に有用なリポソーム２重層膜粒子または小胞体を作成できる 生物学的脂質は、自然に集合して小型の球体、楕円体または長い円筒を形成する か、または両親媒性分子からなる２層またはそれ以上の並列的な層を有する２重 層を形成することができる両親媒性（疎水性および親水性部分を含んだ）分子で ある。水性（極性）媒質中では、両親媒性分子の極性頭部は外方へ向かって周囲 の媒質へ広がる１層を作るが、これらの分子の非極性尾部は互いに会合している ようである。これによって小胞体の壁に極性表面と非極性コアが提供される。そ のような２重層ミセルは、通常、内部水性区間をもった単層膜（１枚の２重層を 有する）または多層膜（実質上、同心円状の複数の２重層を有する）の球形小胞 体の形をとる。

本発明の実施に好適であることが判明したリポソーム２重層膜粒子は、本発明の 方法によりカチオン性、親油性薬物の包括／負荷を最大とし、特異性および組織 ／細胞標的指向性を生じ、それによって得られたリポソーム薬物送達システムの 取り込みが最大となるように設計された、小型（例えば光散乱粒径測定器を使用 して測定した直径が約３０〜約１５０ｒ＋ｍ、好ましくは約４５〜約６０ｎｍ） で中性（非荷電または平衡な電荷をもった、即ち双性イオン）の単層膜または多 層膜のリン脂質小胞体、即ちリポソームである。

本発明を実施する際、使用に好適なリポソームは、グリセリン、ソルビット、マ ンニット等（グリセリンが好ましい）のような脂肪族３価アルコールまたは高級 多価アルコール、またはスフィンゴシンまたは長鎖式不飽和炭化水素鎖を含んだ その他のアミノアルコール（例えばスフィンゴミエリン等のようなジアルキル両 親媒性化合物）のカルボン酸ジエステル類から作成され、ここでそのエステル部 分は、パルミチン酸、ステアリン酸、ｌＯ−メチルステアリン酸、リグノセリン 酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、フィタン酸およびアラキドン 酸等のような少なくとも１４〜約３０個の炭素原子、好ましくは約１８〜約２４ 個の炭素原子を有する飽和またはエチレン型不飽和（１連鎖当たり１〜４個、好 ましくは１〜２個の不飽和部位を有する）の脂肪族モノカルボン酸（長鎖脂肪族 ）から誘導されたものであり、また多価アルコールのヒドロキシ基の１またはそ れ以上（好ましくは１つ）は、２官能性または多官能性化合物、一般にヒドロキ シル基またはアミノ基（置換アミ７基、例えば低級アルキル置換アミン基を含む ）またはその双方を有する、例えばエタノールアミン、コリン、セリンおよびイ ノジット等のような低級脂肪族化合物でそれ自身置換され得るリン酸エステル基 で置換されている。

そのようなリポソーム２重層膜粒子は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、 ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノール アミン、ジステアロイルホスファチジルセリン、シリルオイルホスファチジルイ ノジット、ジステアロイルホスファチジルグリセリン等またはそれらの混合物か ら作られたものである。リポソーム２重層膜粒子はジステアロイルホスファチジ ルコリンのような中性リン脂質、好ましくはコレステロールまたはそれと同様な 作用を有する物質でさらに安定化した中性リン脂質から完全に作られる。例えば ジステアロイルホスファチジルコリン：コレステロールのモル比をそれぞれ約２ ．１にしてアントラサイクリン抗悪性腫瘍剤の送達に使用すると、標的指向効率 の点で特に好適であることが判明した。

これらのリポソームはモーフ（Ｍａｕｋ）らが報告した音波処理法［アナリティ カル・バイオケミストリー（Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃ、　）、９４巻、３０２ 〜３０７（１９７９年）］のような周知の技術または同時係属出願米国特許出願 番号第６９６７２７号（１９８５年１月３１日出願、出願人Ｒ，ギャンブル（Ｇ ａｍｂｌｅ）および本出願の譲渡人）に報告された方法を用いた微粒子乳化法に よって調製される。音波処理装置を使用する均質化の場合は、一般に懸濁液１ミ リリツトル当たり約３０秒〜１分間実施する。均質化したのち、懸濁液を約１ｏ ｏｏｘｉｉ〜約２００００　Ｘ９、好ましくは約５０００　：Ｑで約５〜２０分 間、好ましくは約１０分間、環境混交（通常約２２°Ｃ）で遠心し、ついで細孔 滅菌フィルター、例えば直径領２〜０．４５ミクロンの細孔フィルターで加圧濾 過する。これら２つの操作段階（遠心および濾過）により懸濁していない脂質、 大型の小胞体およびその他混入の可能性がある粒子のような大型粒子物質が除去 される。

本発明でリポソームを調製する際に使用する酸は、上述のように少なくとも１個 のイオン化可能な官能基、好ましくは少なくとも１個のカルボキシル基を有する ものであり、水に極めて可溶性（少なくとも約０．０１モル、好ましくは約０． １０モル以上の溶解度）である十分な極性を有し、かつその存在によって形成さ れたリポソームからの低い透過性または漏出率を示すものである。

透過性または漏出は、ゲル浸透クロマトグラフィー、透析、限外濾過等のような 方法を用いて漏出した任意の物質から小胞体を分離し、既知の方法で任意の漏出 物質について検定することにより測定することができる。透過性は約２４時間ま たはそれ以上の間、包括したもとの物質に対して約１〜約１０％、好ましくは約 ２４時間またはそれ以上の間、包括したもとの物質に対して約１％を越えない範 囲であれば本発明の実施に際し許容し得る。

本発明の実施に当たって一般に使用できる酸は、小胞体形成の際に脂質を加水分 解しないものであって、有機酸、例えばグルクロン酸、グロン酸、グルコン酸、 ガラクツロン酸、グルコヘプトン酸、アクトピオン酸等のような単官能性ピラノ シジル酸、クエン酸、イソクエン酸、ヒアルロン酸、カルボキシポリメチレン類 等のようなα−ヒドロキシポリカルボン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、カ ルボキシアスパラギン酸、カルボキシグルタミン酸等のようなアミノ酸、コハク 酸、グルタル酸、ケトグルタル酸、酒石酸、ガラフタル酸、マレイン酸、フマル 酸、グルカル酸、マロン酸等のような飽和および不飽和の非置換および置換脂肪 族ジカルボン酸、フィチン酸、グルツースリン酸、リボースリン酸等のようなリ ン含有有機酸およびスルホン酸、硫酸、リン酸、ポリリン酸等のような無機酸等 である。

ピラノシジル酸は、本発明の方法によってアントラサイクリン抗悪性腫瘍剤を負 荷するのに最も有効であることが分かり、またこの方法で包括することがダウノ ルビシンより一層困難であることが分かっているドキソルビシンでも、ラクトビ オン酸およびガラクツロン酸によって容易に包括されたが、酢酸では包括されな かった。またクエン酸もドキソルビシンを包括することが判明したが、意外にも 得られた負荷小胞体は遊離薬物よりも一層毒性が強かった。文献に報告されてい る小胞体に包括されたドキソルビシンの殆どすべての例では、負荷された小胞体 は遊離薬物より毒性が低い。

内水相および外水相で酸分子を対応するアニオンへ変換する塩基は、上述のよう にそのカチオンが小胞体の脂質２重層を通過出来ないものであるべきである。そ のような塩基としては例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムおよ びマグネシウムの水酸化物および炭酸塩のようなアルカリおよびアルカリ土類金 属の水酸化物および炭酸塩等の化合物、およびＮ−メチルグルカミン、エチレン ジアミンおよびトリス塩基［アストロメタミン、２−アミノ−２−ヒドロキシメ チル−１，３−プロパンジオール、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ タンとしても知られている二のようなアミンが含まれ、これらはすべて水に対し て高い溶解度を示しく０．０１モル以上）、エタノール、クロロホルム、ジエチ ルエーテル、酢酸エチルのような有機溶媒に対しては溶解度が低く　（０，０１ ｍＭ以下）または不溶性である。

酸の場合と同様に、小胞体の脂質２重層を通過できないカチオンを有するこの基 準に合致したある種の塩基は、本発明の方法によってアントラサイクリン抗悪性 腫瘍剤を負荷するのに他のものより有効であることが判明した。炭酸カルシウム 、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム等のような炭酸塩は包括困難なドキソルビ シンの場合を含め、すべての場合によく作用することが分かった。水酸化ナトリ ウム、水酸化カリウムおよび水酸化カルシウムのような塩基性水酸化物、および エチレンジアミン、トリスおよびＮ−メチルグルカミンを含むアミン類はすべて 本発明の方法によるドキソルビシンの小胞体への負荷に有効ではなかった。

本発明方法を実施するには、小胞体（例えば乾燥粉末の形て貯蔵した場合はその 形で）を、まず水性媒質中、約４０’Ｃ〜約８０’Ｃ１好ましくは約５０’Ｃ〜 約７０″Ｃの温度で、約５ｘ９／ｘ（：〜約１００π９／ＲＱ、好ましくは約２ ０目／Ｘｆｆ〜約４０ｒｈｇ／ｒ、（ｌの小胞体濃度で分散させる。必ずしも必 要ではないが好ましくは脱イオン化した水を単独で（塩化物のような小型アニオ ンは２重層膜を容易に通過でき、包括／負荷操作を妨害し得る）使用するか、あ るいは同時係属出願米国特許出願番号第７８７５３５号（１９８５年１０月１５ 日出願、出願人工リツク・フォーセン（Ｅｒｉｃ　Ｆｏｒｓｓｅｎ）、本出願と 共通の譲渡人）に開示された糖水溶液のようなその他の低イオン性媒質も使用し 得る。

上述のようにコレステロールおよび同様に作用する物質（例えばその他のステロ ール、双性イオン性脂質または荷電した脂質等）を所望により水性小胞体分散へ 添加して、その結果形成される薬物負荷した小胞体の安定性をさらに改善するこ とができる。そのような物質は普通２重層膜の構成成分合計量に対して約０．１ 〜約５０モル％、好ましくは約５〜約３３モル％の範囲の量で添加する。

水性小胞体を含有する媒質を調製する際、選ばれて使用する酸は水和およびホモ ジナイズ（例えば音波処理）の間および負荷する薬物の添加前に存在し、約１０ ミリモル〜約３００ミリモル、好ましくは約５０ミリモル〜約２００ミリモルの 範囲の濃度で使用し、この段階中、懸濁液を約り０℃〜約７０°Ｃ１好ましくは 約５０’Ｃ〜約６０℃の温度に保つ。

薬物（例えばアントラサイクリン系抗悪性腫瘍剤）は、１００％包括にできるだ け確実に近付けるため、乾燥粉末の形または好ましくは濃厚水溶液の形のいずれ かで酸性水性小胞体含有媒質へ約１１９／１００ズ９（脂質）〜約１０ｘ９／　 １００次ｇ（脂質）、好ましくは約１１９／２０１、ＶＣ脂質）〜約１　ｘ９／ 　３０　ｘ９（脂質）の範囲の量で添加する。薬物の小胞体への拡散を促進する ため、薬物添加の温度は一般に小胞体の相転移温度以上、例えば約５０’Ｃ〜約 ８０°Ｃ１好ましくは約５０’Ｃ〜約６５℃の温度とし、薬物を含有する懸濁液 はその後、塩基を添加する間、この温度を維持するのが好ましい。

選ばれた塩基は、酸の正味イオン化および所望の目的ｐＨに基づいて約１／６モ ル当量〜約１モル当量の範囲の量を、薬物を含有する酸性小胞体懸濁液へ添加す る。アントラサイクリン抗悪性腫瘍剤を含有する懸濁液の場合、通常約４．５〜 約６．５の範囲のｐＨが使用される。塩基添加は、通常混合物の加温を続けなが ら例えば約４０℃の温度で、好ましくは急速かつ完全な混合を生じるように、混 合物をかき混ぜながら約１分間〜約１０分間で実施する。塩基を添加したのち、 加温を通常さらに５分間〜２０分間、好ましくは約１０分間続ける。

然しなからこの方法の各段階および包括／負荷操作全体を通じて実施する時間の 長さは必ずしも厳密なものではない。非経口投与のための薬物送達システム、例 えばヒトの静脈注射を提供し、あるいは使用時まで貯蔵するためのその後の処理 操作を含み、全体の方法に要する時間は通常的３０分間〜約１２０分間である。

そのような処理操作としては、何よりもまず酸またはその他のアニオンのリポソ ーム外側の水性環境からの除去およびその置換、例えば糖水溶液、例えば生物学 的に許容し得、薬物を充填する小胞体ト適合スルラクトース、デキストロース、 スクロース、トレハＯ−ス、ラフィノース、マルトース等のような単糖、２糖ま たは３糖類を約５〜約２０（重量）％含有する溶液、またはグリセリン、イノジ ット、ンルビット、マンニット等のような非糖多価アルコールヲ含有する溶液で あって、それに緩衝液として作用するグリシン、トロメタミン、ｎ−メチルグル カミン等のような賦形剤を約０．１〜約２（重量）％含有する溶液と置換するこ とを挙げることができる。酸またはその他のアニオンを外部水性媒質から除去す るこの操作はゲル浸透クロマトクラフィー、限外濾過、減圧透析、タンジェンシ ャルフロー濾過、ホローファイバー濾過またはそれに類する方法を用いて達成で き、特に生成物容量が１００ＩＱまたはそれ以下の場合はゲル浸透クロマトグラ フィーが好ましく、容量がＩＯＭを超える場合はタンジェンシャルフロー濾過が 好ましい。

酸置換のあと、通常再び減圧透析、限外濾過、タンジェンシャルフロー濾過また は水および水性媒質を除去し、一方、脂質小胞体およびその内容物を保持するよ うデザインされたその他の方法を用いて遠心および濃縮を行なう。

本発明が当業者に一層完全に理解できるように、以下の実施例をあげて説明する 。これらの実施例は単に説明のためのものであってこれによって発明の範囲を限 定しようとするものではない。実施例中、特に断らない限り割合および百分率は 重量単位によるものである。

実施例Ｉ　ダウノルビシンのクエン酸および水酸化ナトリウムを使用したジステ アロイルホスファチジルコリン−コレステロール小胞体への包括 均質に分散したコレステロールのジステアロイルホスファチジルコリン分散（モ ル比１：２）を含有する乾燥粉末を作成する。ついでこの分散を４１／２％ラク トース（１２５４リモル当量）および５０ｍＭクエン酸を含有する水溶液でｐＨ 約２，０〜２，５（未補正）で水和させる。得られた懸濁液中の脂質濃度はＩＲ Ｑ当たり２０Ｒ９である。

この混合物を６５℃に加温し、目的とするダウ／ルビシンの約１゜Ｏｒ、９／　 ｙ（ｌ濃度が得られる十分濃厚な水溶液となるようなダウノルビシン量をこれに 添加する。つぎに混合物を引き続き加温しながらクエン酸１モル当たり２１／２ モル当量に等しい量の水酸化ナトリウムを約３分間で混合物へ添加する。ついで 急速に完全な混合液を作成するため懸濁液を激しくかき混ぜる。

水酸化ナトリウム添加ののち、混合物をこれと同じ温度で約１０分間インキュベ ートする。操作のこの段階でダウノルビシンは２重層膜を小胞体の内側へ横断し 、対イオンとしてクエン酸と塩を形成する。インキュベーションのあと、混合物 を環境温度に冷却し、先に説明したように遠心する。つぎにゲル浸透クロマトグ ラフィーによってクエン酸およびナトリウムイオンを含有する外水相を、包括さ れなかったダウ／ルビシンが存在すればこれと一緒に５０＋ｎＭグリシン含有９ ％ラクトース水溶液と交換する。

この交換操作のあと、薬物含有タンジェンシャルフロー濾過を行なう。これは水 および水性溶質を除去するが、脂質小胞体およびその内容物は保持する。濃縮し たこの生成物をついで直径０．４５ミクロンの細孔フィルターで濾過することに よって滅菌する。でき上がった包括したダウノルビシン含有脂質小胞体懸濁液は すぐ使用するか、または４週間またはそれ以上凍結または４℃で貯蔵し得る。

実施例■ 上記の実施例１の操作を１０の主要部分毎に反復し、ただし−水酸化ナトリウム を当量の重炭酸ナトリウムと置き換え、−クエン酸の代わりに当量の酒石酸を使 用し、−９％ラクトース１５ｏｍＭグリシン水溶液の代わりに１１％ラクトース 水溶液で交換操作を実施する。

この場合も包括されたダウノルビシンを含有する脂質小胞体懸濁液が得られる。

実施例■　ドキソルビシンのジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロ ール、ラクトビオン酸および炭酸カルシウムを使用する包括 均質に分散したコレステロールのジステアロイルホスファチジルコリン分散（モ ル比１：２）を含有する乾燥粉末を作成する。ついでこの分散を２００ｍＭラク トビオン酸の水溶液（１リツトル当たり７１．６６如）でｐＨ２，○〜２．５（ 未補正）て水相させる。得られた懸濁液中の脂質濃変はＩＩＣ当たり約２０に？ である。ついでこの混合物を７０°Ｃに加温する。この調製品を前記実施例Ｉの 記載と同様にホモジナイズして遠心し、濾過する。

２００＋ｎＭラクトビオン酸溶液に懸濁した小型の単層膜小胞体懸濁液を作成し たのち、これを６５°Ｃに加温し、目的とするドキソルビシンの約１．０Ｒｇ／ ＋ｆｆ濃度が得られる濃厚水溶液となるようなドキソルビシン量を添加する。つ ぎに混合物を引き続き加温しながら、炭酸カルシウムを１リツトル当たり約２（ ｈとなる量だけ乾燥粉末として添加する。加温をさらに１０分間続け、その間、 調製品を激シ＜カキ混セる。つぎに混合物を遠心して過剰の炭酸カルシウムおよ びその他の沈澱物を除去する。その他の操作段階は実施例■の記載と同様に行な う。

包括されたドキソルビシンを含有する脂質小胞体懸濁液が得られる。

上記の実施例■の操作を主要部分毎に反復し、たたし−ラクトビオン酸の代わり にガラクツロン酸を使用し、−炭酸カルシウムを炭酸ナトリウムと置き換える。

この場合も包括されたドキソルビシンを含有する脂質小胞体懸濁液が得られる。

実施例■ 上記の実施例■の操作を主要部分毎に、ただし１つを除いて反復する。小胞体２ 重層にジステアロイルホスファチジルグリセリン、コレステロールおよびジステ アロイル１５ホスフアチジルコリンをそれぞれ約１．５＋５：１０のモル比で含 有させる。

この場合も包括されたドキソルビシンを含有する脂質小胞体懸濁液が得られる。

実施例■ 実施例Ｉの記載のように作成したダウノルビシン小胞体を凍結貯蔵、４℃で冷蔵 、または室温（２２°Ｃ）で貯蔵した。２週間口および４週間口に、試料を（１ ）薬物および脂質成分の化学的安定性、（２）小胞体内の薬物保持率、（３）抗 腫瘍活性によって測定した生物学的活性（２週間のみ）について検定した。４週 間まででは、薬物または小胞体脂質に何ら有意な分解または喪失を検出できなか った。凍結および融解させた小胞体から恐ら（約５％の薬物漏出を認めた以外、 何ら有意な漏出を認めなかった。生物学的活性は新たに調製した遊離ダウノルビ シンよりも優れており、新たに調製した小胞体（４°Ｃ）よりは僅かに劣ってい た。

実施例■　ダウノルビシン小胞体の抗腫瘍活性実施例Ｉの記載のように作成した ダウノルビシン小胞体をＰ−１７９８リンパ肉腫およびＭａ１６ｃ乳腺がん（い ずれもマウスの充実性腫瘍）で試験した。Ｍａ１６ｃ腫瘍の研究は現在なお進行 中であり、Ｐ−１７９８腫瘍の研究は既に完了した。１０巧／に９〜５０ｕ／に ９の範囲のすべての投与量の処置では、前記のようにして製剤化したダウノルビ シン小胞体は生存期間の増大および腫瘍サイズの縮小による測定で、もとの薬物 と比べて一層強い抗腫瘍活性を示し、毒性は一層低いことが判明した。

実施例■　ドキソルビシン小胞体の生物学的活性実施例■および■の記載のよう に作成したドキソルビシン小胞体の毒性および抗腫瘍活性を試験した。これらの 研究はなお続行中であるが、若干の成績および結論は現在明白である。

ＣＤ２Ｆ１系マウスの処置で、遊離薬物（塩酸ドキソルビシン）の１回静脈内投 与の最大耐容量（ＭＴＤ、非致死量）は約２５　ｕ／　ｋｇである。これは実施 例■の記載のように作成したドキソルビシン小胞体のＭＴＤ約４０１１９／に９ （塩酸塩を標準として）に匹敵する。これに反して実施例■の記載のように、た だしラクトビオン酸をクエン酸に置き換えて作成したドキソルビシン小胞体のＭ ＴＤは遊離薬物のＭＴＤより劣り、僅か約１０＋９／ｋｆ！であった。

高投与量における白血球抑制および生存率により測定した毒性でラクトビオン酸 で作成したドキソルビシン小胞体を遊離薬物と比較し、毒性が少ないことが判明 した。

ドキソルビシン４０ｘｙ／ｋｓ＋（塩酸塩と当ｊｌ）を投与したＣＤ２Ｆ　１マ ウスで白血球数（ｖｂｃ）計数を実施した。遊離薬物を投与したマウスではＷｂ ｃ数の重篤な減少を示し、治療後４日目で治療前値の僅か８．５％であった。こ れに対して本発明の方法（実施例■）によって作成したドキソルビシン小胞体で 処置したマウスではこれと同じドキソルビシン投与量で僅かに中等度のＷｂｃ数 の抑制を示し、治療後４日目で★ｂｅ数は治療前値の７５％であった。

またドキソルビシン小胞体はクエン酸でも作成できる。然しマウスの静脈注射試 験で遊離薬物は２０ｘ９／に９の投与でよく忍容されたが、当量のドキンルビシ ンクエン酸塩小胞体の投与では致死的な毒性を示した。

以上、主として本発明の好ましい態様および実施方法について説明した。当業者 はここに説明した内容から、以下の請求の範囲に記載された本発明の精神および 範囲から逸脱することなく、実際の実施に当たってさらに変更と修飾を容易に加 えることができよう。

国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）少なくとも１個のイオン化可能な官能基を有し、水に極めてよく溶解 し得る十分な極性を有し、小胞体膜に対して低い透過性を示す酸を含有する水性 媒質中でリボソームを作成して、内リボソーム相および外リボソーム相に酸が存 在している酸性リボソームを含有する水性媒質を得（ここでそのリポソームはエ ステル部分が飽和またはエチレン型不飽和の少なくとも１４個の炭素原子を有す る脂肪族モノカルボン酸から誘導された３価または高級官能性脂肪族多価アルコ ールのヒドロキシアミノ（低級）脂肪族置換ホスファチジルカルボン酸ジエステ ルから調製されたものである）、（ｂ）このようにして得られた酸性リポソーム 含有水性媒質にカチオン性、親油性薬物を添加し、 （ｃ）ついで、塩基カチオンがリボソームの脂質２重層を通過できない塩基を添 加して外水相にある酸アニオンを電荷中和し、それによってカチオン性、親油性 薬物をリポソームの内水相へ通過させることからなる、リン脂質に包括されたカ チオン性、親油性薬物組成物の調製方法。
2. ２．該リポソームがジステアロイルホスファチジルコリンから作成される請求項 １記載の方法。
3. ３．該リポソームがジステアロイルホスファチジルグリセリンを含有する請求項 １記載の方法。
4. ４．核酸が有機酸である請求項１記載の方法。
5. ５．該有機酸が単官能性ピラノシジル酸である請求項４記載の方法。
6. ６．該ピラノシジル酸がラクトピオン酸である請求項５記載の方法。
7. ７．該有機酸がアミノ酸である請求項４記載の方法。
8. ８．該有機酸が７−ヒドロキシポリカルボン酸である請求項４記載の方法。
9. ９．該有機酸がジカルボン酸である請求項４記載の方法。
10. １０．該塩基がアルカリまたはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩である 請求項１記載の方法。
11. １１．該塩基が水酸化ナトリウムである請求項１０記載の方法。
12. １２．該塩基が重炭酸ナトリウムである請求項１０記載の方法。
13. １３．該塩基が炭酸カルシウムである請求項１０記載の方法。
14. １４．該塩基がトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンである請求項１０記載 の方法。
15. １５．コレステロールを安定剤として酸性リポソーム含有水性媒質へ添加する請 求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. １６．塩基を添加したのち、酸およびその他のアニオンをリポソーム外部の水性 環境から除外し、水性糖溶液と置き換える請求項１５記載の方法。
17. １７．該糖がラクトースである請求項１６記載の方法。
18. １８．該カチオン性、親油性薬物がアントラサイクリン抗悪性腫瘍剤である請求 項１記載の方法。
19. １９．該アントラサイクリン抗悪性腫瘍剤がダウノルビシンである請求項１８記 載の方法。
20. ２０．該アントラサイクリン抗悪性腫瘍剤がドキソルビシンである請求項１８記 載の方法。
21. ２１．核酸がクエン酸であり、該塩基が水酸化ナトリウムであり、該ジエステル がジステアロイルホスファチジルコリンであり、該カチオン性、親油性薬物がダ ウノルビシンであり、これにコレステロールを安定剤として酸性リポソーム含有 水性媒質へ添加する請求項１記載の方法。
22. ２２．核酸がラクトピオン酸であり、該塩基が炭酸カルシウムであり、該ジエス テルがジステアロイルホスファチジルコリンであり、該カチオン性、親油性薬物 がドキソルビシンであり、これにコレステロールを安定剤として酸性リポソーム 含有水性媒質へ添加する請求項１記載の方法。
23. ２３．該酸がガラクッロン酸であり、該塩基が炭酸ナトリウムであり、該ジエス テルがジステアロイルホスファチジルグリセリンおよびジステアロイルホスファ チジルコリンの混合物であり、該カチオン性、親油性薬物がドキソルビシンであ り、これにコレステロールを安定剤として酸性リボソーム含有水性媒質へ添加す る請求項１記載の方法。
24. ２４．請求項１または２１〜２３のいずれかに記載の方法によって作成したリン 脂質に包括したカチオン性、親油性薬物組成物。