JPH03501331A - ゲノムライブラリーの作製のためのファージベクターλＳＫ９ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゲノムライブラリーの作製の ためのファージベクターλＳＫ９ 技術分野 本発明は生物工学に関し、さらに詳しくはゲノムライブラリーの作製のための新 規ファージベクターλＳＫ９に関する。

従来の技術 ゲノムライブラリーの作製は、生物工学における使用が意図されるものを含めて の遺伝子の構造及び機能の分子生物学的研究における最も重要な最初の段階であ る。

近年、ＥＭＢＬシリーズのファージが上記の目的のために広範囲使用されている （Ｐｒｉｓｃｈａｕｆ　Ａ、Ｍ、、Ｌｅｈｒａｃｈ　Ｈ，、Ｍｕｒｒａｙ　Ｎ、 。

Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１９８３、Ｖｏｌ、１７０．８２７−８５４＞。

これらのファージ（λＥＭＢＬ４．λＥＭＢＬ３．λＥＭＢＬ３Ａ）はＥｃｏＲ Ｉ及びＢａｍ　Ｉ−Ｓｌ−５ａｕ３Ａ（Ｉ＞制限酵素の認識部位に従ってゲノム ライブラリーの作製のために使用される（「古典的」方法）。

しかしながら、これらのベクターは多数の欠点を有し、その主だものはポリリン カー中わずか３種類の制限酵素の認識部位の存在、挿入部のマツピングにおいて 遭遇される困難性、特別な再クローニングなくして挿入セグメント特異的標識が 不可能なこと、再クローニングそれ自体が面倒なことである。

これらのベクターは古典的な常用のそれに属し、モしてｃＤＮＡ特表千３−５０ １３３１（２） 挿入によってさらに操作する（制限酵素地図の作製、配列決定）にはプラスミド ベクター又はＭ１３ファージベクター中にサブクローニングされなければならな い。

一層完全なベクターλＣｈ４０が当業界において知られている（Ｄｕｎｎ　１． Ｓ、、　Ｂｌａｔｔｎｅｒ　Ｆ、Ｒ，、Ｎｕｃｌ、Ａｃａｄ、Ｒｅｓ、、１９８ ７、νｏ１．１５．２６７７−２７９８頁）。このベクターにおいては、１６種 類の制限酵素についてクローニングを行うことができ、そしてすべて既知の方法 により遺伝子のライブラリーを作製することができる。このベクターの主たる区 別できる特徴は、２３５に塩基対の長さを有する約８０反復コピーを含んで成る 挿入断片の構造にある。この反復ユニットは１ａｃ−オペレーター並びに制限酵 素Ｘａｍ　ｍ及びＮａｅ　Ｉの認識部位を含んで成る。１ｃａ−オペレーターの 存在によりファージλＣｈ４０がＸ−ｇａ　１色素の存在下で大腸菌の対応する 株に青のプラークを与えることが可能となる。第一の（古典的な）方法に従うベ クターＣｈ４０中の遺伝子ライブラリーの形成は次のようにして行われる。Ｃｈ ４０のＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　Ｉ及びＮａｃ　Ｉを用いて加水分解し、そして ２３５に塩基対の長さを有する反復ユニットを、プロパツールによる「アーム」 の沈澱により除去する。次に、これらの「アーム」をＭｈｏ　Ｉ（Ｓａ、ｕ　３ ＡＩ）により加水分解されたゲノムＤＭＡの断片と連結する。生ずるライブラリ ー中の組換体の％は色による同定によって容易に決定することができる。組換体 は白色のプラークを与え、他方最初のファージは青のプラークを与える。このベ クターの主たる利点は、宿主として大腸菌ｒｅｃ　Ａ−株の細胞を用いて遺伝子 のライブラリーを作製する可能性を与えることである。他方、ｒｅｃ　Ａ＋株に おいてλＣｈ４０の操作の結果を予測することは困難であり、これは、その中に 存在する８０の反復が不所望の結果を導くからである。さらに、ＤＮＡの完全な 開裂のためには８０倍の量の高価な制限酵素Ｎａｃ　Ｉが必要であるからこのベ クターを用いる操作は経済的に便利ではない。

さらに、当業界においてベクターλＤＡＳＨ及びλＦＩＸが知られている（　ｒ ｓｔｒａｔｅｓｅｎｅ」社、米国、の公告）。ベクターλＤＡＳＨは「古典的」 な方法により遺伝子ライブラリーを形成するにめに意図されている。λＥＭＢＬ ３に対するこのベクターの主たる利点はＤＮＡ挿入部をクローニングしそして切 り出すための追加の部位、並びに酵素ＲＮＡ−ポリメラーゼによりファージアー ムに直接隣接するＤＮＡ挿入部のセグメントを標識することを可能にするプロモ ーターＴ３及びＴ７の存在である。

これらの標識されたセグメントはオーバーラックする挿入部（「染色体にそって の歩行）を含有するファージのサーチのためのサンプルとして使用することがで きる。しかしながらこれらの利点は自明ではない。なぜなら、代表的なライブラ リーを提供するためのポリリンカー中の追加の制限酵素認識部位は特に重要では なく、他方哺乳類植物及び他の生物体のＤＮＡ中の多数の反復ユニットの存在は 、これらの反復ユニットがプロモーターＴ３及びＴ７から標識される高い可能性 を導くからである。標識された反復ユニットが「染色体にそっての歩行」におい て使用するために適当でないことは明らかである。

ベクターλＦＩＸは作製の部位的完成を用いて遺伝子ライブラリーを作製するた めに意図される。しかしながらこの場合、ファージＤＮＡの加水分解はＳａｌ　 Ｉを使用でではく類似の付着末端を与える制限酵素Ｘｈｏ　Ｉを用いて行われる 。これは次の事実と関連する。すなわちファージＦＩＸ（及びＤＡＳ）Ｉ）は５ ｐｉ−表現型を有する。すなわち、これはファージＰ２に関して溶原性である細 胞中で複製することができず、他方Ｓａｌ　Ｉによる加水分解はこの表現型を破 壊しそして他の不所望の結果を導く。λＤ　Ａ　Ｓ　Ｈと類似して、このベクタ ーはλＥＭＢＬ３と比較してポリリンカー中に制限酵素の追加の認識部位並びに プロモーターＴ３及びＴ７を含有する。λＦＩＸ及びλＤＡＳＨは、生じたライ ブラリー中の組換体の存在を迅速に決定できない点において不利である。

発明の開示 本発明の主たる目的は新規なファージベクターを提供することをであり、このベ クターは未組換えファージに対して選択を行うこと、ライブラリーの重感染の可 能性を排除すること、クローニングされるべきＤＮＡセグメントの末端部位に任 意のマーカーを導入すること、及び挿入部をプラスミド又は単鎖形に移行するこ とを可能にする。

この目的はゲノムライブラリーの作製のだめのファージベクターλＳＫ９を提供 することにより達成され、本発明によれば該ベクターは４７．７　ｔ、　ｎ、　 ｐのサイズを有し、そして２０．３　ｔ、ｎ、　ｆ）、のサイズを有する、７７ 一ジλＥＭＢＬ３−　し７トアームのＣｏ５−５ａｌ　ｌ−ＤＮＡ断片：３．８ 　ｔ、　ｎ、ｐ、のサイズを有する、ファスミド５Ｋ２ＡのＳａｌ　Ｉ−Ｂｇｌ 　ｌｌ−ＤＮＡ断片（ＢｃｏＲ１部位は作製の方法の完了により破壊され、該フ ァスミド５Ｋ２ＡはベクターＳＫ１ｇから作製され１これはファージλのＤＮＡ 断片、ファージＭ１３及びニスミドＪ））Ｉｃ　７９から作製される）　； １３、７　ｔ、ｎ、ｐ、のサイズを有する、ファージλＨＭＢＬ３０Ｂａｎ＋　 １−Ｒａｍ　ｌ−ＤＮＡ断片； ０、７　ｔ、ｎ、ｐ、のサイズを有する、前記プラスミド５Ｋ２ＡのＲａｍ　１ −ＢｇＩ　ｎ−ＤＮＡ断片（Ｓａｌ　１部位は方法の完了により除去されている ）： ９．２　ｔ、ｎ、Ｐ、のサイズを有する、ファージλＥＭＢＬ３−ライトアーム のＳａｌ　ｌ−Ｃｏ５−ＤＮＡ断片；制限酵素Ｂａｍ　Ｉ及びＥｃｏＲＩの認ｍ Ｒ位に従って外来ＤＮＡの挿入を可能にする部位；から成り：ベクターの容量は ４．４〜１９、Ｏｔ、ｎ、Ｐ、であり、ベクターの宿主である大腸菌の株のスペ クトルが ＬＥ３９２＝Ｆ’　、　ｈａｄ　Ｒ５１４（ｒｓ＋−、ｍｈ−）ｅ　５ｕｐＥ４ ４．　ｓｕｐ　Ｆ１ａ。

ｌａｃ　Ｙｌ　０２（ｌｃａ　Ｉ　ＺＹ）６．　ｇａｌ　Ｋ２．　ｇａｌ　Ｔ２ ２．　ｍｅｔ　Ｂｌ。

ｔｒｐ　Ｒ５５； Ｊ、　Ｍ、　１０９＝ｒｅｃ　Ａｌ、Δｌａｃ　ｐｒｏ、　ｅｎｄ　ＡＩ、　ｇ ｙｒ　ＡＢ６．　ｔｈｉ−１゜ｈｓｄ　Ｒ１７，ｓｕｐ　Ｅ４４．　ｒｅｌ　Ａ ｌ、　Ｆ’　、　ｔｒａ　０３６゜ｐｒｏ　ＡＢ”、　ｌａｃ　ｌ’Ｚ、６Ｍ１ ５：Ｑ３５９＝ｈｓｄ　Ｒｍ−、ｈａｄ　Ｌ＋”、　ｓｕｐ　Ｆ　、φ８０．　 Ｐ２Ｏ；であり、オール−ユニオン・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・ マイクロオーガニスニス・オブ・ザ・ｌｌ５ｓＲ・リサーチ・インスティチュー ト・フォア・ゼネティクス・アンド・インドストリアル・マイクロオーガニスム ・ブリーディング（Ａｌｌ−ＩＪｎｉｏｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎ ｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｏｆｔｈｅ　ＵＳＳＲＲｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｉｎ ｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）にＰＨＮ（ １６８７として１９８９年７月２１に寄託されている。

ここで提提されるベクターは標準的方法を用いて代表的なゲノムライブラリーの 作製のために意図される。

ここに提案されるベクターは未組換ファージに対して選択することを可能にし、 この性質がライブラリーの賞品を改良し、時間及び材料を節約し；該ベクターは 表現型型質に従って組換ファージの存在を決定することを可能にし、これによっ てライブラリーの品質を常にモニターする可能性を提供し：該ベタターはクロー ニングされるべきＤＮＡセグメントの末端部位に放射性マーカー又は他の任意の マーカーを導入することを可能にし、これは該セグメントのその後の操作のため に非常に重要であり、なぜなら、これは追加の手順を供わないで必要な断片を得 ることを可能にし、これによって研究において最終結果を得るために必要な時間 を劇的に短縮するからであり：必要な場合には該ベクターは迅速且つ効果的にフ ァージ形からプラスミド形に特別の追加のクローニングを伴わないで転換するこ とができ；該ベクターはサンガー法による一次ＤＮＡ構造の決定のために単鎖形 に転換することができる。

上記の性質の内に幾つかの個々のものは従来技術の市販のベクターにおいて遭遇 されるが、それらの組合わせはここに提案されるベクターにおいてのみ本質的で ある。

図面の簡単な説明 次に、本発明をその例示的態様の詳細な記載により添付図面に言及しながら説明 する。これらの図において、第１図（ａ、ｂ）はジファスミド（ｄｉｐｈａｓｍ ｉｄ）　５Ｋ１８’作製を模式的に示し： 第２図はジファスミド５Ｋ１Ｂの作製を模式的に示し：第３図はファスミドｇＳ ＲからのベクターλｇＥＳ７の作製を模式的に示し： 第４図はファージベクターλ５Ｋ９０作製を模式的に示し：第５図はλＳに９中 遺伝子ライブラリーの作製を模式的に示す。

発明を実施するための最良の形態 ここに提供されるファージベクターλＳＫ９は下記のスキームに従って作製され る。まずベクター５Ｋ１８の作製を行う（第１図ａ、ｂ、及び第２図）。

ファージＭ１３ａ＋ｐ１８の［ｌＮＡから１．８６　ｔ、ｎ、　Ｐ、のサイズを 有する断片を制限酵素Ｂａｌ　Ｉ及びＢｇｌ　ＩＩにより切り出し、そして低融 点アガロース中で電気泳動により精製する。この断片は、ファージＭ１３のセグ メントｏｒｉのほかにオペレーター、プロモーター、ラクトースオペロンの遺伝 子１ａｃｉ及びＩａｃｚ、ポリリンカー配列、及びｍｐシリーズのファージ中の 配列についての標準的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的なセグメントを含 んで成る。同時に、ニスミドｐＨｃ７９を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　Ｉに より加水分解する。次に、大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｕ断 片により、ファージＭ１３のセグメン）ｏｒｉを含む精製された断片の付着末端 、及びニスミドｐＨＣ７９の生ずる断片の付着末端を平滑化し、そして連結を行 う。標準的方法を用いて、連結されたＤＮＡを大腸菌ＪＭ　１０９株に導入し、 ＤＮＡを標準的方法に従って単離し、そして制限酵素ＥｃｏＲ１、Ｐｓｔ　Ｉ、 　Ｈｉｎｄ　ｍ　、　Ｂａａｌｌ、　Ｂｇｌｍ、及びＳａｌ　ｌを用いて分析す る。得られるジファスミドＳＫ　１を次の操作のために使用する。サイズを小さ くする観点でＳＫ　１を制限酵素旧ｎｄＩＩ［及びＢｇｌ　ＩＩにより加水分解 し、そして次にアンピシリンの安定性の遺伝子を含有する断片を精製する。同時 に、ファージＭ１３ｍｐ１３のＤＮＡを同じ制限酵素で処理し、低分子断片を単 離し、両断片を連結し、そして大腸菌ＪＭ１０９株の細胞をこうして得られた溶 液を用いて形質転換し、形質転換された細胞をアンピシリン、Ｘ−ｇａ　１及び ＩＰＴＧを含有する培地に接種し、ＤＮＡをそれらから単離し、次に前記ＤＮＡ を制限酵素ＥｃｏＲ１，Ｐｓｔ　ｌ。

）１ｉｎｄＩＩＩ、　Ｂａｏ＋　Ｌ　ＢｇｌＩ［及びＳａｌ　Ｉにより開裂せし め、そして分析する。ファスミドＳＫ２を単離し、これを次の段階に用いる。

ニスミドｐＨＣ７９のＤＮＡを制限酵素Ｂａｌ　ｎで開発せしめ、そしてＣＯＳ セグメントを含有する断片を単離する。ＳＫ２のＤＮＡを加水分解し、そしてｃ ｏｓセグメントを含有する断片と連結する。次に大腸菌ＪＭ１０９株の細胞を前 記の得られた溶液により加水分解し、そしてこれらの細胞をアンピシリンを含む 培地に接種する。増殖したコロニーからニトロセルロースフィルター上にレプリ カを作りそしてセグメントＣＯＳを含有するニスミドｐＨｃ７９のＢｇｌ断片で あってニックトランスレーションにより３２ＰでｅＪしたものとのハイブリダイ ゼーションを行う。ＣＯＳ断片とハイブリダイズするコロニーからの細胞をアン ピシリンを含む培地中で増殖させ、そしてＤＮＡを単離し、これを制限酵素Ｅｃ ｏＲＩ、　Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　Ｂａｍ　Ｉ、　ＢｇｌＩＩ。

Ｓａｌ　Ｉにより開裂せしめそして分析する。単離されたジファスミドの１つ、 ジファスミドＳＫ６を次の段階で用いる。

ジファスミドＳＫ６を制限酵素ＥｃｏＲＩにより加水分解し、付着末端をｄＮＴ Ｒの存在下でＫｌｅｎｏｗ断片を用いて補完し、そして線状のジファスミドを精 製し、そして連結し、そして得られた溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９の細胞を形 質転換し、これをアンピシリンＸ−ｇａ　１及びＩＰＴＧを含有する培地に接種 する。アンピシリンを含む培地中のコロニーから細胞を増殖せしめ、そしてジフ ァスミドＤＮＡを単離する。ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ。

Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　Ｂａｍ　Ｉ、　ＢｇｌＩＩ、　Ｓａｌ　Ｉによ り開裂せしめ、そしてて分析する。分析されたＤＮＡからジファスミド５Ｋ１８ ’を単離する。これを制限酵素Ａｃｃ　Ｉにより加水分解し、そしてポリリンカ ーの外に存在するＡｃｃ　Ｉの部位の付着末端を、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰの存在 下でＫｌｅｎｏｗ断片を用いて満たす。この調製物を緩衝液中ファージＴ４のＤ ＮＡ　ＩＪガーゼで処理し、次に得られる溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株の細 胞を形質転換し、該細胞をアンピシリン、Ｘ−ｇａ　１及びＩＰＴＧを含有する 培地に接種する。このコロニーから細胞をアンピシリンを含む培地中で増殖させ 、そしてＤＮＡを単離し、これをＡｃｃ　Ｉで開裂せしめそして分析する。唯一 のＡｃｃ　１部位を含有するジファスミド５Ｋ１８を単離する。

次に、ジファスミド５Ｋ１８のＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩにより加水分解し 、そして自己連結を行い、連結されたＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株の細胞 を形質転換し、この細胞をアンピシリンを含有する培地に接種する。アンピシリ ンを含有する培地上に増殖したコロニーから細胞を増殖せしめ、これからＤＮＡ をアルカリ溶解により単離し、このＤＮＡをＥｃｏＲＩ、　Ｂａｍ　ｌ（Ｉ。

Ｓａｌ　Ｉ、　ＢｇｌＩＩにより開裂せしめ、そして分析する。これらの分析さ れらファスミドからファスミド５Ｋ２Ａを単離する。

ファスミド５Ｋ２Ａは、ポリリンカーの外側に位置する制限酵素ＥｃｏＲＩ及び Ａｃｃ　ｌの認識部位を欠く点においてファスミドＳＫ２と異る。次に、ファス ミド５ＫＺＡ中の制限酵素Ｓａｌ　Ｉの認識部位の除去を行う。この目的のため 、ファスミド５Ｋ２ＡのＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ　Ｉにより加水分解し、そして ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片により付着末端を［平滑化コする。次 に自己連結を行う、連結されたＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９の細胞に導入する。こ れらのコロニーから標準的方法によりＤＮＡを単離し、制限酵素ＥｃｏＲ１，Ｂ ａｍ　Ｈｌ、　Ｓａｌ　Ｉにより分析する。ＢｃｏＲＩ。

Ｂａｍ　Ｉの制限酵素認識部位を含有するがＳａｔ　Ｉ制限酵素認識部位を含有 しないファスミドＳＫ２ΔＳを単離する。

次に、ファスミドＳＫ２ΔＳ中の制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を除去する。こ れを行うため、ファスミドＳＫ２ΔＳのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより加水 分解し、次に付着末端をＫｌｅｎｏｗ断片により平滑化する。この後、ＤＮＡの 自己連結を行う。連結されたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて開裂せしめ、 そして大腸菌ＪＭ１０９の細胞に導入する。コロニーから標準的方法に従ってＤ ＮＡを単離し、そして制限酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｂａｍ　ｌ及びＳａｌ　Ｉを用い て分析する。Ｂａｍ　Ｉ制限酵素認識部位を含有するがしかしＥｃｏＲＩ及びＳ ａｌ　Ｉの制限酵素認識部位を含有しないファスミドＳＫ２ΔＳＲを単離する。

この後、組換ファスミドｇＳＲの作制を行う。ファージλｇｔのＤＮＡを制限酵 素Ｂａｍ旧により加水分解し、そして酵素を不活性化する。次に、ファージλの 付着末端ををアニールし、そして約６．５　ｔ、ｎ、Ｐ、のサイズを有する中央 Ｂａｍ　Ｉ断片を精製する（調製物Ａ）。前記ファスミドＳＫ２ΔＳＲのＤＮＡ を制限酵素Ｂａｍ　Ｉにより加水分解し、そして酵素の不活性化の後調製物Ａと 連結する。連結されたＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９の細胞に導入し、そしてアンピ シリンを含むし一寒天に接種する。増殖シタコロニーからニトロセルロースフィ ルター上にレプリカを取す、そしてニックトランスレーションにより３２Ｐで標 識されたＤＮＡを含む調製物Ａとのハイブリダイゼーションを行う。、調製物Ａ とハイブリダイズするコロニーからの細胞を増殖せしめ、そしてプラスミドＤＮ Ａを標準的方法により単離する。こうして得られたＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＩ 、　Ｂａｍ　Ｉ、　Ｓａｌ　Ｉによる分析が、セグメントλｇｔ■のファスミド ＳＫ２ΔＳＲ中のクローニングを確認する。得られるファスミドｇＳＲを次の段 階で使用する。さらに、ファージベクターλｇＥＳ７０作製を行う（第３図）。

これを行うため、プラスミドｇＳＲのＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで加水分解 し、そしてこの酵素を不活性化する。

ファージλＥＭＢＬ３のＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　Ｉで加水分解し、そしてこの 酵素を不活性化する。両ＤＮＡ調製物を等モルで混合し、そして連結する。連結 されたＤＮＡをファージ人の蛋白質中に試験内でパッケージし、そして生ずるフ ァージ粒子を０．１％Ｘ−ｇａｌを含有する大腸菌ＬＥ３９２株の細胞のプロッ トに接種する。１０個の青色のプラークからファージを増殖せしめ、ＤＮＡを単 離しそして制限酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｂａｍ　１．　Ｓａｌ　ｌにより分析する。

ファージλｇＥＳ７を単離し、これを次の段階で使用する。

ファージλＥＭＢＬ３のＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　Ｉで加水分解し、そして約１ ３．７　ｋｂｐＯサイズを有する挿入断片を精製する（調製物Ｂ）。ファージλ ｇＥＳ７のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＩで加水分解し、そして「アーム」を精製す る（調製物Ｃ）。調製物Ｂ及びＣを当モルで混合し、そして連結する。連結され たＤＮＡをファージファージλの蛋白質中に試験管内でパッケージし、そしてこ うして得られたファージ粒子を大腸菌ＬＨ３９２株の細胞のプロットに接種する 。６個のプラークからファージを形成せしめ、Ｄ、ＮＡを単離し、そして制限酵 素ＥｃｏＲＩ、　Ｂａｍ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉを用いて分析する。λＳＫ９と称す るファージの１つを単離する。この構造は第４図中に示す通りである。

ここに提案されるファージベクターλＳＫ９は、第５図に示すような「古典的な 」方法で代表的なゲノムライブラリーを得るために便利である。

ファージベクターλＳＫ９のＤＮＡを１０倍過剰の制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａ ｍ　Ｉにより加水分解する。次に、ＤＮＡをプロ）＜ノールなりの部分が上滑液 中に残る。ＤＮＡ沈澱物を溶解した後、付着末端Ｂａｍ　Ｉを有するλＳＫ９の 末端断片（「アーム」）及び付着末端）ｌ！ｃｏＲＩを有する中間断片を得る。

ゲノムＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩ　（又はＭｂｏ　Ｉ）により部分加水分解 し、そして１５〜２０ｔ、ｎ、ｐ、のサイズを有する断片を単離する（ゲル電気 泳動又は遠心分離による）。これらの断片を前記のように処理したファージＤＮ Ａと連結し、連結されたＤＮＡをファージλの蛋白質に試験管内でパッケージし 、そして生ずるファージ粒子を用いて大腸菌の細胞に感染させる。この場合一般 に増殖したファージの約７０％が組換体である。

λＳＫ９選択において組換体ファージが保存され、そして最初の非組換体λＳＫ ９はファージＰ　２　（ｓｐｉ表現型）　Ｑ３５９，８Ｍ５３９株に対して溶原 性である大腸菌の細胞上で複製することができない。

λＳＫ９中のＤＮＡ挿入部は容易にプラスミド形に移行することができる。この 場合に用いられる原理はλＺＡＰと共に用いられるそれとは異る。組換λＳＫ９ のＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ　Ｉ（Ｃ１ａ　Ｉも使用することができる）により加 水分解し、そしてこの酵素を凍結／解凍に３回かけることにより不活性化する。

両制限酵素は親核性ＤＮＡを十分に低い頻度で開裂せしめ（Ｓａｌ　Ｉは平均し て約５０　ｋｂｐ当り１個の認識部位を有し、そしてＣ１ａ　ｌは平均して約２ ０　ｋｂｐ当り１個の認識部位を有する）。

次に、ＤＮＡを稀釈しそして自己連結する。連結されたＤＮＡを大腸菌のコンビ テンス細胞に導入し、これをアンピシリンを含有するし一寒天上に接種する。増 殖したコロニーはプラスミド形に挿入部を有し、このプラスミドはファージλの ヌクレオチド配列を含有しないか、又はその小部分を含有する（Ｃ１ａ　Ｉの場 合）。プラスミド形への移行は迅速に（３〜４時間）そして効果的に（０，１ｇ の組換ＤＮＡが数千のコロニーを与える）実現される。

λＳＫ９及びその組換体についてはまたプラスミド形への移行の他の経路が存在 する。すなわちファージλの細胞溶解複製に耐性な大腸菌細胞へのファージの直 接感染であるが、しかしこの経路は便利ではなく、そして特別な実験のためにの み有用である。

プラスミドを含有する大腸菌細胞のファージＭ１３による重感染において、プラ スミドＤＮＡをＳａｎｇｅｒのよく知られた方法に従って挿入ＤＮＡの配列決定 を行うのに便利な単鎖形で、ファージの蛋白質にパッケージする。

λＳＫ９の容量は１９　ｋｂｐまでであり、これは代表的なゲノムライブラリー を得るのに全く十分である。なぜなら平均挿入部は通常１５　ｋｂｐから成るか らである。

従って、ここに提案されるベクターλＳＫ９は「古典的」な方法によって代表的 なゲノムライブラリーを作製するために使用することができる。ここに提案され るベクターの主たる利点は次の通りである。

・ファージ「アーム」の予備精製を必要としないで遺伝子のライブラリーを得る ことができること；・未組換えファージに対して選択することができること；・ ファージλの「アーム」を含まないプラスミド形への迅速で、効果的で且つ制御 された移行ができること；・Ｓａｎｇｅｔの方法によるＤＮＡの一次構造の決定 のための単鎖形への移行が可能であること： ・λＳＫ９中のライブラリーの重感染が垂恭染カ生じないことが保証されること ； ・標準的な商業的に入手可能な接種調製物の使用により挿入部の５’−３’−及 び他のセグメントの特異的標識化が可能であること。

本発明のより良い理解のためにここに提案されるベクターの作製及びその利用の 例示的な実施例を以下に記載する。

実施例１゜ 最初にジファスミドＳＫ１ｇの作製を行う。作製のスキームを第１図及び第２図 に示す。ファージＭ１３ｍｐ１８のＤＮＡ５ａｇから制限酵素Ｂａｌ　Ｉ及びＢ ｇｌ　ＩＩ　（それぞれ１０活性単位）を用いて１、８６　ｔ、ｎ、Ｐ、のサイ ズを有する断片を切り出し、そして低融点アガロース中での電気泳動により精製 する。この断片は、ファージＭ１３のセグメントｏｒｉに加えてさらにオペレー ター、プロモーター、ラクトースオペロンの遺伝子１ａｃ　ｉ　及びＩａｃ　Ｚ 　ｓポリリンカー配列、並びにｍｐシリーズのファージ中の配列についての標準 的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的なセグメントを含んで成る。次に、ニ スミドｐＨｐＨＣ７９（２を標準的条件下で制限酵素ＥｃｏＲＩ及び５ａｉｌ（ 各２０活性単位）により加水分解する。第二段階において、大腸菌からのＤＮＡ ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片により、２０ｍＭ　Ｔｙｉｓ−ＨＣｊ！　（ ｐＨ７，４）、５ｍＭ　ＭｇＣ１２，１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ ｍＭ　ＮａＣ１゜５に／ｒｒＬｌＤＮＡを含有する緩衝液５Ｉ中で４種類すべて のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（１５ｍ）の存在下で、ファージＭ１ ３のセグメントｏｒｉを含有する精製されたセグメント並びに制限酵素５ｒｏＲ Ｉ及びＳａｌ　Ｉにより開裂されたプラスミドｐＨＣ７９の断片の両者の付着末 端の平滑化を行う。連結を、Ｍ１３のｏｒｉセグメントを含有する断片及びファ ージλのＣＯＳセグメントを含有する断片の等モル比率において、５０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−）ｌｃｊ２　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　２．１０ｍＭ ジチオスレイトール、３ｍＭアデノシントリホスフェート、ファージＴ４のＤＮ Ａリガーゼ２５活性ユニツト及び５０ｑｒ／ｍ１の全ＤＮＡを含んで成る緩衝液 １００Ｉ中で行う。標準的方法を用いて、連結されたＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９ に導入する。この細胞を、２５Ｒ／ｒｎ１のアンピシリン、０．１％のＩＰＴＣ 及び０．１％のＸ−ｇａ１色素を含有する２％Ｌ−寒天を含むペトリ皿に接種す る。１０個の青色コロニーから標準的方法によりＤＮＡを単離しく〜１０７−） 、そして制限酵素ＥｃｏＲ１，ＨｉｎｄＩＩｌ、　Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｂａａ　Ｉ、 　Ｂｇｌ　ＩＩ及びＳａｌ　ｌを用いて分析する。予想通りの制限酵素地図（第 １図ａ）を有しそしてジファスミドＳＫＩと称される構成物を用いてさらに操作 する。サイズを小さくするため、５ＮのＳＫＩを制限酵素旧ｎｄ■及びＢｇｌ　 ＩＩ　（各５活性単位）により加水分解し、そして次にアンピシリンに対する安 定性の遺伝子を含有する断片を低融点アガロースを用いる電気泳動により精製す る。同時に、同じ制限酵素を用いて、ファージＭ１３ｍｐ１８の５ｐｓｔのＤＮ Ａを処理し、そして低分子断片を電気泳動の後に低融点アガロースから単離する 。両断片を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣ １２，１０ｍＭジチオスレイトール、３＋ｎＭアデノシントリポスフエート、フ ァージＴ４のＤＮＡリガーゼ５活性ユニツトを含む溶液０．１ｍ７２中で、ＤＮ Ａ断片の合計濃度５に／ｍｎにて連結する。この溶液１０ｄを用いて大腸菌ＪＭ １０９株の細胞を形質転換し、そして形質転換された細胞を２５ｎ／ｍ１のアン ピシリン、０．１％（ＤＸ−ｇａｌ及び０．１％＜７）ＩＰＴＣを含有するし一 寒天上に接種する。青色コロニーから、細胞をアンピシリン（１０ｋ　／　ｍ７ りを含有するし一培地１０ｍｆ中で増殖せしめ、そしてアルカリ溶解物を用いて ＤＮＡ（〜１０躍）を単離する。

０．５ＲのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　Ｂ ａｍ　Ｉ。

Ｂｇｌ　ＩＩ、　Ｓａｌ　Ｉにより開裂せしめ、そしてアガロースゲル中での電 気泳動により分析する。予想通りの制限地図（第１図ａ）を有しそしてＳＫ２と 称される構成物を次の段階で用いる。

ニスミドｐＨＣ７９０５にのＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩにより開裂せしめ、 そしてｃｏｓセグメントを含有する断片を電気泳動の後に低融点アガロースから 溶出する。またＳＫ２の２にのＤＮＡをＢｇｌ　ｍにより加水分解し、そしてこ の調製物を、５０ｍＭ　Ｔｒｉ−ｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　 ＭｇＣｆ　２．１０ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭアデノシントリホスフェー ト、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ５活性単位を含む緩衝液中で、ｃｏｓセグメ ントを含有する断片と、２倍モル過剰の該断片を用いてそして合計濃度〜５に／ ｒｒＬｌのＤＮＡを用いて連結する。１０ｍのこの溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０ ９株の細胞を形質転換し、次にこの細胞をアンピシリン（２５ｇ／ｍ７’）を含 むし一寒天上に接種する。増殖したコロニーからニトロセルロースフィルター上 にレプリカヲ取り、そしてニックトランスレーションにより３２ｐで標識された ＣＯＳセグメントを含有するニスミドｐＨＣ７９のＢｇｌ　Ｉｆ断片とのハイブ リダイゼーションを行う。このＣＯＳ断片とハイブリダイズするコロニー５個か らの細胞をアンピシリン（〜１００ｎ／ｍｅ）を含有するし一培地１０ｍ１中で 増殖せしめそしてＤＮＡ（〜１０尾）をアルカリ溶解により単離し、０．５ｘの ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１，Ｐａｔ　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　Ｂａｍ　Ｉ、　 ＢｇｌＩＩ、　Ｓａｌ　Ｉにより開裂せしめ、そしてアガロースゲル中での電気 泳動により分析する。５個のジファスミドのすべてが予想通りの制限酵素地図（ 第１図ｂ）を有し、その１つ（ＳＫ６）を次の段階で使用する。

５刀のＤＮＡ（ＳＫ６）を制限酵素ＥｃｏＲＩにより部分的に加水分解し、そし てこの線状のジファスミドを低融点アガロース中での電気泳動により精製する。

生ずる調製物を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，４）　、５＋ｎＭ 　ＭｇＣｆ　２．１０ｒｎＭ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ　ＮａｃＪ、 　１５ｚずつの４種類すべてのデオキシヌクレオシドトリホスフェート、ＤＮＡ ポリメラーゼエのｌ（ｌｅｎｏｗ断片の５活性単位を含有する溶液４５ｎ中で２ ０℃の温度にて２０分間処理する。次に、この溶液に５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ （１？　（ｐＨ７，５）　、１００ｍＭ　ＭｇＣｊ！　２．１００ｍＭジチオス レイトール、３０ｍＭアデノシントリホスフェート及びファージＴ４のＤＮＡリ ガーゼ２０活性単位を含有する緩衝液５Ｉを加える。１６℃にて１４時間連結を 行う。

１０Ｉのこの溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株の細胞を形質転換し、次にこの細 胞をアンピシリン（２５ｘ／ｉｆ）、Ｘ−ｇａ　ｌ　（０，１％）及びＩＰＴＧ 　（０，１％）を含有するし一寒天上に接種する。５個の青色コロニーからの細 胞を、アンピシリン（１０に／　−）を含有するし一培地１０ｍ１２中で増殖せ しめ、そしてジファスミドのＤＮＡを単離しく〜１０Ｒ）、該ＤＮＡを制限酵素 ＥｃｏＲＩ、　Ｐｓｔ　Ｉ。

）１ｉｎｄＩＩ１．　Ｂａｍ　Ｉ、　ＢｇｌＩＩＩ、　Ｓａｌ　Ｉにより開裂せ しめ、そしてアガロースゲル中での電気泳動により分析する。５種類の分析され たＤＮＡの内２種類が最初のＳＫ６と同じであり、そして３種類がテトラサイク ロンプロモーターの前にＥｃｏＲ１部位を含有せず、従ってこれらは予想通りの 制限地図（第」図ｂ）を有することが証明された。

このジファスミドを５Ｋ１８’　と命名した。５Ｋ１８’の０．５にのＤＮＡを 制限酵素Ａｃｃ　ｌにより完全に加水分解し、そしてポリリンカーの外側に位置 するＡｃｃ　１部位の付着末端をｄＡＴＰ及びｄＴＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗ 断片を用いて満たす。この調製物を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ７， ５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ？　２．１０ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭアデ ノシントリホスフェートを含有する溶液５０ｄ中で、ファージＴ４のＤＮＡ　！ Ｊガーゼ（５活性単位）により１６℃にて一夜処理し、１０ｄのこの溶液を用い て大腸菌ＪＭ１０９の細胞を形質転換し、次にこれをアンピシリン（２５ｆｆ　 ／ｍｆ）、Ｘ−ｇａｌ　（０，１％）及びＩＰＴＧ　（０，１％）を含有するし 一寒天上に接種する。６個の青色コロニーからの細胞をアンピシリン（１００ｚ 　／ｍｌ　）を含有するし一培地１〇−中で増殖せしめ、そしてＤＮＡをアルカ リ溶解により単離する（〜１０Ｋ）。０．５にのこのＤＮＡを制限酵素Ａｃｃ　 Ｉにより開裂せしめ、そしてアガロース中で電気泳動により分析する。４個のプ ラスミドが５Ｋ１８’と同じでありそして２個が唯一のＡｃｃ　１部位を含有し ていることが証明された。このジファスミドを５Ｋ１８と命名しくｉ２図）、こ れを次の段階で用いた。

ジファスミド５Ｋ１８のＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩにより加水分解し、そし て６５℃にて１５分間加熱することにより反応を停止させる。次に、ＤＮＡを３ 倍に稀釈し、そして自己連結を行う。

連結されたＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９の細胞を形質転換し、次にこの細胞 を抗生物質アンピシリンを含有するし一寒天上に接種する。１０個の増殖したコ ロニーからの細胞をアンピシリンを含有するし一培地１０ｍ１中で増殖せしめ、 そしてＤＮＡをアルカリ溶解により単離する。０．５にのＤＮＡを制限酵素Ｅｃ ｏＲＩ。

Ｂａｍ　ｌ（Ｉ、　Ｓａｌ　１．　ＢｇｌＩＩにより開裂せしめ、そして１％ア ガロースゲル中での電気泳動により分析する。６個のファスミドは予想通りの制 限地図を有し、これらのファスミドの内の１個を５Ｋ２Ａと称し、λＳＫ９の作 製のために使用する。ファスミド５Ｋ２Ａはポリリンカーの外側に位置する制限 酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃ　ｌ　０）認識部位が存在しないことによりファスミ ドＳＫ２異る。従って、ファスミド５Ｋ２Ａは複製開始のセグメント及びアンピ シリンに対する安定性の遺伝子を有するプラスミドｐＢＲ３２２の断片、並びに ポリリンカー、遺伝子１ａｃｚ及び単鎖ＤＮＡをファージＭ１３の蛋白質にパッ ケージするためのセグメントを含有するファージＭ１３ｍｐ１８の断片を含有す る。５Ｋ２Ａのサイズは約４．５Ｘ　１０００塩基対（ｔ、　ｎ、　ｐ、　）で ある。

次に、プラスミド５ＫＺＡ中の制限酵素Ｓａｌ　Ｉの認識部位の除去を行う。フ ァスミド５Ｋ２ＡのＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ　Ｉにより加水分解し、そして６５ ℃の温度で１５分間加熱゛することにより反応を停止させる。大腸菌からのＤＮ ＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片を用いて４種類すべてのデオキシヌクレオチ ドトリホスフェートの存在下で付着末端を平滑化する。次に、ＤＮＡ溶液を３倍 に稀釈し、そして自己連結を行う。連結されたＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９の細胞 に導入する。細胞を、２５Ｒ／ｍ１２のアンピシリン、０．１％のＩＰＴＧ及び ０．１％のＸ−ｇａｌを含有する２％Ｌ−寒天を含むペトリ皿に接種する。１０ 個の白色コロニーから標準的方法に従ってＤＮＡを単離し、そして制限酵素Ｅｃ ｏＲＩ。

Ｂａｍ　Ｈｌ、　Ｓａｌ　ｌを用いて分析する。ＥｃｏＲ１，Ｂａｍ　Ｉを含む がしかし制限酵素認識部位Ｓａｌ　Ｉを含まず、そしてＳＫ２ΔＳと称されるフ ァスミドを次の段階で用い、ここでファスミドＳＫ２ΔＳの制限酵素ＥｃｏＲＩ の認識部位を除去する。この目的のため、ファスミドＳＫ２ΔＳのＤＮＡを制限 酵素ＥｃｏＲＩにより加水分解し、そして６５℃の温度にて１５分間加熱するこ とにより反応を停止させる。Ｋｌｅｎｏｗ断片を用い、４種類すべてのデオキシ ヌクレオシドトリホスフェートの存在下で付着末端を平滑化する。次に、このＩ ＩＮＡを３倍に稀釈しそして自己連結を行う。連結されたＤＮＡを制限酵素８ｃ ｏＲＩを用いて開裂せしめ、そして大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この細胞を２ ５Ｒ／艷のアンピシリンを含むし一寒天上に接種する。１０個のコロニーから、 標準的方法に従ってＤＮＡを単離し、そして制限酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｂａｍ　Ｉ 及びＳａｌ　Ｉにより分析する。Ｂａｍ　Ｉを含有するがしかしＥＣＯＲＩ及び Ｓａｌ　Ｉを含有しないファスミド（これをＳＫ２ΔＳＲと称する）を用いて組 換ファスミドｇＳＲを作製する。ファージλｇｔｎのＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　 Ｉにより加水分解し、そして加熱により該酵素を不活性化する。次にファージλ の付着末端を４２℃の温度にて１時間のＤＮＡ溶液のインキュベーションにより アニールし、そして約６．５ｋｂｐのサイズを有する中央Ｂａｍ　Ｉ−酵素を０ ．７％低融点アガロース中でのゲル電気泳動により精製する（調製物Ａ）。ファ スミドＳＫ２ΔＳＫのＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　Ｉにより加水分解しそして加熱 により酵素を不活性化した後、該ＤＮＡを調製物Ａと連結する。連結したＤＮＡ を大腸菌ＪＭ１０９の細胞に導入し、そしてアンピシリン（２５ｇｇ／ｍｆ）を 含むし一寒天上に接種する。増殖したコロニーカラニトロセルロースフィルター 上にレプリカを取り、そしてニックトランスレーションにより３２ｐで標識され たＤＮＡを含む調製物Ａとハイブリダイズせしめる。該調製物Ａとハイブリダイ ズする５個のコロニーからの細胞をアンピシリン（１０に／ｍＩりを含有するＬ −培地１０ｄ中で増殖せしめ、そして標準的方法を用いてプラスミドＤＮＡを単 離する。こうして得られたＤＮＡの分析をＥｃｏＲ１，Ｂａｍ　Ｉ、　Ｓａｌ　 Ｉ制限酵素を用いて行い、ファスミドＳＫ２ΔＳＲ中へのセグメントλｇｔ■の クローニングを確認する。ｇＳＲと称するこのファスミドを用いてファージベク ターλｇｅＳ７を作製する（第３図）。ファスミドｇＳＲのＤＮＡを制限酵素Ｂ ｇｌ　ＩＩで加水分解し、そして該酵素を加熱により不活性化する。ファージλ ＥＭＢＬ３のＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　ｌにより加水分解し、そして該酵素を不 活性化する。

両ＤＮＡ調製物を等モル量で混合し、そして連結する。連結されたＤＮＡをファ ージλの蛋白質に試験管内でパッケージし、そして得られるファージ粒子を０． １％のＸ−ｇａｌを含有する大腸菌ＬＥ３９２株の細胞のプロットに接種する。

１０個の青色プラークからファージを生成せしめ、ＤＮＡを単離し、そして制限 酵素ＥｃｏＲＩ、　Ｂａｒｎ　ＩＩ、　Ｓａｌ　Ｉにより分析する。λｇＥＳ７ と称するファージの１つは予想通りの構造（第３図）を有する。このファージを 次の段階で用いる。

ファージλＥＭＢＬ３のＤＮＡを制限酵素Ｂａｏ＋　１により加水分解し、そし て約１３．７　ｋｂｐのサイズを有する挿入断片を０．７％低融点アガロース中 でのゲル電気泳動により精製する（調製物Ｂ）。ファージλｇＥＳ７のＤＮＡを 制限酵素Ｂａｍ　Ｉにより加水分解し、そして「アーム」を低融点アガロース中 でのゲル電気泳動により精製する（調製物Ｃ）。調製物Ｂ及びＣを等モル比で混 合しそして連結する。連結されたＤＮＡをファージλの蛋白質中に試験管内でパ ッケージし、そして生ずるファージ粒子を大腸菌ＬＨ３９２株の細胞のプロット に接種する。６個のプラークからファージを生成せしめ、ＤＮＡを単離しそして 制限酵素ＢｃｏＲ１，Ｂａａ＋　１及びＳａｌ　Ｉにより分析する。ここで提案 されるファージベクターλＳＫ９を単離する。このファージベクターは第４図に 示す機構を有する。

実施例２．　λＳＫ９におけるヒトゲノム［ｌＮＡの断片のクローニング ３にのヒ）　ＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ　Ｉにより標準的条件下で開裂せしめそし て６５℃の温度で１５分間加熱することにより酵素を不活性化する。３にのＤＮ ＡλＳＫ９を制限酵素Ｂａｍ旧及びＥｃｏＲＩにより加水分解し、そして加熱に より該酵素を不活性化する。両調製物を一緒に混合しくベクターＤＮＡとゲノム ＤＮＡとの質量比１　：　１）　、モしてＩＩＮＡの合計濃度〜２５０Ｒ／ｍ１ ２として連結を行う。ｌＸｌ０−’ｇの連結されたＤＮＡをファージλの蛋白質 中に試験管内でパッケージし、そして生ずるファージ粒子の１１５００を大腸菌 ０３５９株のプロットに接種する。無作力に選択された６個のプラークからのフ ァージをＬＥ３９２を含むＬ−培地１０７！中で増殖せしめ、そしてそれらから ＤＮＡを単離する。このＤＮＡの電気泳動分析が示すところによれば、これらす べてが組換体であり、そして１０〜１５　ｋｂｐのサイズを有するＤＮＡ挿入部 を含有する。これらの内の１つのＤＮＡ　（ファージＮ（１１）０．５ＪＱｌ！ を１単位の制限酵素Ｓａｌ　］を用いて３０分間加水分解する。凍結／触凍を３ 回繰り返すことにより酵素を不活性化する。このＤＮＡを稀釈し、そして室温に て１時間連結する。０．１Ｎの連結されたＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９のコンピテ ント細胞に加え、モして０℃の温度にて１０分間インキュベートし、次に３８℃ の温度にて５分間インキコベートし、１ｒｎｌのし一培地を加えた後３７℃の温 度にてさらに４５分間インキュベートする。次に、０．２ｍｊ？の細胞をアンピ シリン（２５に／ｍ１）を含むし一寒天に接種する。３個のコロニーからの細胞 をアンピシリン（５０ｇ　／　ｍｆｆ）を含むし一培地１０ｍ１中で増殖せしめ 、そしてＩ）ＮＡをアルカリ溶出により単離する。ＤＮＡの電気泳動分析が示す ところによれば、プラスミドは最初のファージＮα１と同じＤＮＡ挿入部を有す る。

産業上の利用可能性 ここに提案されるベクターλＳＫ９は「古典的」な方法に従ってゲノムライブラ リーを作製するために意図される。ベクターλＳＫ９はファージλの「アーム」 の容易な除去及び挿入部のプラスミド形への移行の可能性を提供し、プラスミド を含有する大腸菌の細胞のへルバーファージＭ１３による感染の後、該プラスミ ドはファージＭ１３の蛋白質中にパッケージされそして単鎖形に移行する。ベク ターは、商業的に入手可能な接種物を用いることにより、挿入部の５′−及び３ ′−末端を特異的に標識することを可能にし、他方、ポＩＪ　ＩＪノンカー中９ 種類の制限酵素の認識部位の存在は、挿入部の実質的に物理的なマツピングを促 進する。

浄書（円各１こ変更なしン 浄書（内容に変更なし） ／：Ｅ、７ｂ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ／ｉ’　−Ｅにｌ）／？Ｉ、　、ｆｐ　−ｆｐｈ　Ｉ。

Ｉ−ＮｉＩＭ玖χ−乃ｔｚｌ Ｌ尻３ 浄書（内容に変更なし） ｆＥ、５ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＳＵ８９１００２０４ ２、発明の名称 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 平成２年１２月１１日（発送日） ６、補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）図面翻訳文（ＦＩＧ、ｌａ、ｌｂ、２，３．５）７、補正の内容 （１）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面翻訳文（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）　明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）図面翻訳文　１通 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ゲノムライブラリーを作製するためのファージベクターλＳＫ９であって、４７ ．７ｔ．ｎ．ｐ．のサイズを有し、そして；２０．３ｔ．ｎ．ｐ．のサイズを有 する、ファージλＥＭＢＬ３−レフトアームのＣｏｓ−Ｓａｌ　Ｉ−ＤＮＡ断片 ；３．８ｔ．ｎ．ｐ．のサイズを有する、ファスミドＳＫ２ＡのＳａｌ　Ｉ−Ｂ ｇｌ　ＩＩ−ＤＮＡ断片（ＥｃｏＲ　Ｉ部位は方法の完了により破壊され、該フ ァスミドＳＫ２ＡはベクターＳＫ１８から作製され、これはファージλのＤＮＡ 断片、ファージＭ１３及びコスミドｐＨＣ７９から作製される）； １３．７ｔ．ｎ．ｐ．のサイズを有する、ファージλＥＭＢＬ３のＢａｍ　Ｉ− Ｂａｍ　Ｉ−ＤＮＡ断片； ０．７ｔ．ｎ．ｐ．のサイズを有する、前記ファスミドＳＫ２ＡのＢａｍ　Ｉ− Ｂｇｌ　ＩＩ−ＤＮＡ断片（Ｓａｌ　Ｉ部位は方法の完了により除去されている ）； ９．２ｔ．ｎ．ｐ．のサイズを有する、ファージλＥＭＢＬ３−ライトアームの Ｓａｌ　Ｉ−Ｃｏｓ−ＤＮＡ断片；制限酵素Ｂａｍ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉの認識 部位に対して外来ＤＮＡの挿入を可能にする部位；から成り；ベクターの容量は ４．４〜１９．０ｔ．ｎ．ｐ．であり、ベクターの宿主である大腸菌の株のスペ クトルが ＬＥ３９２＝Ｆ′，ｈａｄ　Ｒ５１４（ｒｋ−，ｍｋ−），ｓｕｐＥ４４，ｓｕ ｐ　Ｆ５８，ｌａｃ　Ｙｌ　ＯＺ（ｌｃａ　Ｉ　ＺＹ）６，ｇａｌ　Ｋ２，ｇａ ｌ　Ｔ２２，ｍｅｔ　Ｂｌ，ｔｒｐ　Ｒ５５； Ｊ．Ｈ．１０９＝ｒｅｃΔ１，Δ１ａｃ　ｐｒｏ，ｅｎｄ　Ａｌ，ｇｙｒ　Ａ９ ６，ｔｈｉ−ｌ，ｈｓｄ　Ｒ１７，ｓｕｐ　Ｅ４４，ｒｅｌ　Ａｌ，Ｆ′，ｔｒ ａ　Ｄ３６，ｐｒｏ　ＡＢ＋，ｌａｃ　ＩｏＺ，ΔＭ１５；Ｑ３５９＝ｈｓｄ　 Ｒｋ−，ｈａｄ　Ｍｋ＋，ｓｕｐ　Ｆ，φ８０，Ｐ２；であり； オールーユニオン・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニ スムス・オブ・ザ・ＵＳＳＲ・リサーチ・インスティチュート・フォア・セネテ ィクス・アンド・インドストリアル・マイクロオーガニスム・プリーディング（ Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍ ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅＵＳＳＲ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭ ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）にｐＨＮｏ．６８７として１９ ８９年７月２１に寄託されている； ことを特徴とするベクター。