JPH03501973A - 創傷の治癒 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷の治援 一及１１０Ｌ最 本発明は創傷の治癒に関する。

増殖因子類は、特定の標的細胞集団を刺激するポリペプチドホルモンである。増 殖因子の例には、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）　、インシニリン様増殖因 子（工ＧＦ−Ｉ）　、腫瘍細胞増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮性増殖因子 （ＥＧＦ）　、および繊維芽増殖因子（ＦＧＦ）がある。ＰＤＧＦは、血流中の 血小板の顆粒中に見出される、カチオン性の熱安定性蛋白質であり、繊維芽細胞 のｉｎ　ｖｉｔｒｏ蛋白質合成およびコラーゲンの生産を刺激することが知られ ている。この因子は、また繊維芽細胞、平滑肝細胞およびダリア細胞の１ｎＶｉ ｔｒｏでの細胞分裂および化学遊走因子としてあ作用も持つことが知られている 。

ＰＤＧＦをｉｎ　ｖｉｖｏの創傷治癒に用いることは既に提案されている。例え ば、Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ（１９８４）Ｊ、Ｔｒａｕｍａ２４　；５４９−５ ２には、コラーゲンゲルで含浸させそしてラットの背中に移植したＨｕｎｔ−８ ｃｈｉ　１１　ｉｎｇ金網チャンバーにＰＤＧＦを加えたところ、新たに合成さ れるコラーゲンの量が増加したことが記載されている。しかしながら、Ｌｅｉｔ ｚｅｌら（１９８５）Ｊ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｓｕｒｇ、０ｎｃｏ１．１１：６ １７−２２によれば、ＰＤＧＦを単独またはＦＧＦおよびＥＧＦと組み合わせて 用いたとき、ハムスターの通常の創傷の治癒を促進することはできなかった。

Ｍｉｃｈａｅｌｉら（１９８４）は、「柔軟および硬質組織の修復（Ｓｏｆｔ　 ａｎｄ　Ｈａｒｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｐａｉｒ）Ｊ　（Ｈｕｎｔ、Ｔ、に、ら 編集）、Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、＝ユーヨーり、３８０〜３９ ４頁）において、血小板リッチプラズマから得た部分精製ＰＤＧＦ調製物を家兎 の角膜に移植したとき、脈管形成を刺激したことを報告している。ＰＤＧＦは脈 管形成性増殖因子ではないから、上記報告者らは、彼らの部分精製ＰＤＧＦ調製 物中の未知因子がこの脈管形成効果に関与したものと示唆している。

５ｃｈｕｌｔｚ、Ｇ、Ｓ、ら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅは、ＴＧＦ−αをブタ の皮膚の部分的火傷に適用したところ、治療を施さない火傷に比較して上皮の再 生が促進されたことを報告している。

ｌ肌二ｌ立 一般に、本発明は、その−態様において、創傷に有効量の精製ＰＤＧＦおよび精 製ＴＧＦ−αを含む組成物を適用して、哺乳類、例えばヒ、ト患者の外傷を治癒 する技術に関する。好ましくは、ＴＧＦ−αはヒトＴＧＦ−αであるが、他の哺 乳類のものであってもよく、例えばラットのものでもよい。ＴＧＦ−αは、天然 源から単離することもでき、またはより好ましくは組換え細胞によりまたは固相 ペプチド合成により製造されろ。本発明の組成物は、少なくともその一部におい て、上皮組織および結合組織の増殖および全蛋白質およびコラーゲンの合成を刺 激することにより、創傷の治癒に寄与する。本発明の組成物を用いた創傷の治癒 は、そのような治療を行わないとき（即ち、外部からの薬剤を用いない時）また は純粋なＰＤＧＦのみまたは純粋なＴＧＦ−αのみを用いたときに比べて、一層 効果的である。

本発明の好ましい態様では、組成物は薬学的に許容される担体物質、例えば市販 の不活性ゲルまたは溶液（例えば、アルブミンまたはメチルセルロースを添加し た塩類液）中で、精製ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−α（両者ともに市販品として入手 可能である）を混合して、製造される。最も好ましくは、精製ＰＤＧＦおよびＴ ＧＦ−αは、重量対重量比で、１：４ないし２５：１、好ましくは１：２ないし １０：１、そしてより好まし゛くは１：１または２：１で混合される。精製ＰＤ ＧＦはヒト血小板から、または組換えＤＮＡ技術でえられるであろう。従って、 ＰＤＧＦの用語は、哺乳類、好ましくは霊長類の血小板または遺伝子組換え材料 から由来した両方を意味し、最も好ましくは、霊長類は人類であるがチンパンジ ーまたは他の霊長類であってもよい。組換えＰＤＧＦは、培養原核または真核細 胞に両サブユニットをコードするＤＮＡ配列を挿入し、次いで翻訳されたサブユ ニットを細胞で処理してえられた組換えヘテロダイマーでもよく、あるいは、サ ブユニットの一方のみ（好ましくはベータもしくは「２」チェーン）をコードす るＤＮＡを細胞に挿入し、これを培養してホモダイマーのＰＤＧＦ　（ＰＤＧＦ −１もしくはＰＤＧＦ−２ホモダイマー）を製造してもよい。

本発明において精製という用語は、他の成分と混合する前に重量で９５％以上が ＰＤＧＦまたはＴＧＦ−αであり、即ち天然に付随する他の蛋白質、脂質および 炭水化物が実質的に存在しないことを意味する。

精製蛋白質調製物は、一般にポリアクリルアミドゲル上でＰＤＧＦまたはＴＧＦ −αの各サブユニットに対して一本のみの主要バンドを与える。最も好ましくは 、本発明の組成物中に用られる精製ＰＤＧＦまたはＴＧＦ−αはアミノ末端アミ ノ酸配列分析で判定したとき、純粋なものである。

本発明の組成物は、哺乳類の外傷、例えば褥癒、裂傷および火傷の治癒のための 、迅速且つ有効な方法を提供する。この組成物は、自然治癒（即ち外から薬剤を 与えないとき）または純粋ＰＤＧＦまたはＴＧＦ−αのみに比較して結合組織の 形成を増強する。純粋ＰＤＧＦのみと異なり、この組成物は新たな結合組織およ び上皮組織の増殖を有意に増大する。得られる上皮層は自然治癒またはＴＧＦ− α単独治療に比べて厚いだけでなく、それを新たな結合組織と結合するための上 皮突起（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）をより多く含み、従っ て一層しっかり結合し、創傷の防護効果も大きい本発明の他の態様および利点は 、好ましい態様に基づく以下の記載および請求の範囲から明らかにされる。

ましい１、　の言 好ましい態様について、説明する。

本発明によれば、精製ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−αの組合せで製造されたＰＤＧＦ ／ＴＧＦ−α混合物を用いて、外傷、例えば褥癒および火傷が治療される。化学 的に合成されたヒトＴＧＦ−αおよびラットＴＧＦ−αは、ベルモント、カリホ ルニアのベニンシュラ・ラボラトリーズ社（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅＳ）から市販されている。精製組換えＰＤＧＦおよびヒト血小板由来 の精製ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ社（ボストン、マサチュセッッ）、Ｃｏ１１ａｂｏ ｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社（ウオルサム、マサチュセッツ）およびＡｍ ｇｅｎ社（サウザンド　オースク、カリホルニア）から市販されている。精製Ｐ ＤＧＦは次のようにして調製することも可能である： 洗浄したヒト血小板ペレット５００ないし１０００単位をＬＭ　ＮａＣ１（血小 板単位あたり２−）に懸濁し、１００℃で１５分間加熱する。上清を遠心分離で 分離し、沈澱をＬＭ　ＮａＣ１で２回抽出する。

抽出物を合わせ、０．０８Ｍ　ＮａＣ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバッファ ー（ｐＨ７，４）に対して透析し、このバッファーで平衡化したＣＭ−セファデ ックスＣ−５０と４℃で一夜混合する。次いでこの混合物をカラム（５Ｘ１００ ｃｍ）に注入し、０．０８Ｍ　ＮａＣ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバッファ ー（ｐＨ７，４）で充分に洗浄し、ＩＭＮａＣｌで溶出しそして１〇−フラクシ ョンずつに回収する。

活性フラクションをプールし、０．３Ｍ　ＮａＣ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウ ムバッファー（ｐＨ７，４）に対して透析し、遠心分離し、０．３Ｍ　ＮａＣｌ −０゜０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，４）で平衡化した２、５Ｘ ２５ｃｍのブルーセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に４℃で通過させる。

このカラムを同バッファーで洗浄し、部分精製されたＰＤＧＦをＬＭ　ＮａｃＩ およびエチレングリコールの１：１溶液で溶出する。

この部分精製ＰＤＧＦフラクションをＩＭＮａＣｌで１：１希釈し、１Ｍ酢酸で 透析し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥サンプルは０．８Ｍ　ＮａＣ１−０，０ １Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，４）に溶解しそして同バッファーで 平衡化した１、２Ｘ４０ｃｍのＣＭ−セファデックス　Ｃ−５０カラムに通過さ せる。次いでＰＤＧＦをＮａＣ１勾配（０，０８ないしＬＭ）で溶出する。

活性フラクションを合わせ、１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥し、そして少量 の１Ｍ酢酸、に溶解する。その０．５−分を１Ｍ酢酸で平衡化した１、２Ｘ１０ ０ｃｍのバイオゲル　Ｐ−１５０（１００ないし２００メツシユ）のカラムにの せる。次いでＰＤＧＦを１Ｍ酢酸で溶出し、２−ずつのフラクションにして回収 する。

１００ないし２００ｍｇの蛋白質を含む各活性フラクションを凍結乾燥し、１０ ０−の０．４％トリフルオロ酢酸に溶解し、フェニルボンダパックカラム（Ｗａ ｔｅｒＳ社）による逆相高性能液体クロマトグラフィーに付する。アセトニトリ ルの直線勾配（Ｏないし６０％）により精製ＰＤＧＦが得られる。

組換えＤＮＡ技術でのＰＤＧＦは、次のようにして調製される： ヒト血小板から得られる血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は二種のポリペプチド 配列（ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２ポリペプチド）を含む（Ａｎｔｏｎｉａ ｄｅｓ、Ｈ，Ｎ、およびＨｕｎｋａｐ　ｉ　ｌ　Ｉ　ｅ　ｒ、　Ｍ、（１９８３ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２０：９６３−９６５）。

ＰＤＧＦ−１はクロモシーム７吊に存在する遺伝子によりコードされ（Ｂｅｔｓ ｈｏｌ　ｔｚ、Ｃ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２０：６９５−６９９）、そしてＰＤ ＧＦ−２はクロモシーム２２　（Ｄａ　１１ａ−Ｆａｖｅｒａ、Ｒ。

（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６８６−６８８）中に存在するｓｆｓオ ンコジーン（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ，ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２１ ：２７５−２７１つによってコードされる。ｓｉｓ遺伝子はサル肉腫ウィルス（ Ｓｉｒｎｉａｎ　Ｓａｒｃｏｍａ　’ＶＵｒｕｓ：以゛下ＳＳｖという）の形質 転換蛋白質を゛コードしており、この蛋白質はＰＤＧＦ−２ポリペプチドに密接 に関係している。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓもまたＰＤＧＦ−２鎖をコードする（Ｒａ ｏ、Ｃ０Ｄ、ら（１９８６）Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、８３：２３９２−２３９６）。これら二種のＰＤＧＦのポリペプチド鎖は、別 のクロモシームに存在する異なる遺伝子によりコードされるので、ヒトＰＤＧＦ はＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２のジスルフィド結合したヘテロダイマーから なるか、または二種のホモダイマー（ＰＤＧＦ−１のホモダイマーおよびＰＤＧ Ｆ−２のホモダイマー）の混合物からなるか、または上記ヘテロダイマーと二種 のホモダイマーの混合物よりなる可能性がある。

ＰＤＧＦ−２鎖をコードする遺伝子を含むＳＳＶで感染した培養中の哺乳類細胞 は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチドを合成しそしてそれをジスルフィド結合したホモ ダイマーに加工することが知られている（Ｒｏｂｂｉｎｓ。

Ｋ、ら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０５：６０５−６０８）。さらに、ＰＤＧ Ｆ−２ホモダイマーは、ヒトＰＤＧＦに対して調製した抗血清と反応する。さら にまた、分泌されたＰＤＧＦ−ホモダイマーの機能的性質は、培養中の繊維芽細 胞のＤＮＡ合成を刺激する点、１８５ｋｄの細胞膜蛋白質のチロシン残基でのホ スホリル化を誘発する点および特異的細胞表面ＰＤＧＦリセブターとの結合に・ 関、して□ヒト（１２Ｊ）　−Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆと競合する能力を有する点で、血 小板由来ＰＤＧＦのそれと類似している（Ｏｗｅｎ、Ａ、ら（１９８４）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、２２５　：　５４−５６）。同様な性質は、培養正常ヒト細胞（例え ばヒト動脈内皮細胞）からのｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝子生成物について、また はｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２発現ヒト悪性細胞からの生成物についても示されている （Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、Ｈ，ら（１９８５）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、３ ：１４５−１５１）。

組換えＰＤＧＦ−２ホモダイマー（本明細書中で、組換えＰＤＧＦという）は、 ｃ−ｓ　ｉ　ｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝子のｃＤＮＡクローンを発現ベクターを用い てマウス細胞に導入して得ることができる。この発現に用いるＣ−５ｉｓ／ＰＤ ＧＦ−２クローンは、正常ヒト培養上皮細胞からえられる（Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｔ 、ら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ、２１６：７４８−７５０）。

凰ｌ立血里 創傷の治癒を促進するために、ＰＤＧＦ／ＴＧＦ−α混合物の有効性を調べるた め、次の実験を行った。

体重１０ないし１５ｋｇの幼若白色ヨークシャ一種の豚（Ｐａｒｓｏｎ’　ｓ　 Ｆａｒｍ、　ハトレイ、マサチュセッツ）を手術前に少なくとも６時間絶食させ 、次いで麻酔した。麻酔条件下で背中および首の部分を刈り、剃り、そして穏や かな石鹸および水で洗浄した。次いで、外傷を付する部分を７０％アルコールで 消毒した。

１　ａｍ　Ｘ　２　ｃｍの大きさの傷を深さ０．５＋ｎｎ＋に作るため、改良カ ストロビーヨエレクトロケラトーム（Ｃａｓｔｒｏｖｉｅｊｏ　ｅｌｅｃｔｒｏ ｋｅｒａｔｏｍｅ）（Ｓｔｏｒｚ製、セントルイス、ミズーリをＢｒｏｗｎｅｌ Ｉｓ、Ｉｎｃ、で改良したもの）を用いた。この創傷は上皮の完全な除去および その下層の真皮の部分的除去をもたらした（第２度の火傷に相当する）。各創傷 は少なくとも１５ｍｍの健全皮膚により隔てた。同一の治療を受ける創傷はグル ープにまとめ、他のグループから少なくとも３ｃｍ隔てた。増殖因子での治療を 受けない創傷は、治療を受けるグループから少なくとも１０ｃＴｎ隔てた。

創傷は、生物学上許容されるゲルに分散した次の増殖因子での一回の塗布により 、直接処置した：１）５００ｎｇ純粋ヒトＰＤＧＦ　（高性能液体クロマトグラ フィーで精製したもの）または組換えＰＤＧＦのみ：２）各々次のものと組み合 わせた５００ｎｇの純粋Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　：　（１）　５００ｎｇのヒトＴＧＦ −ａ　；（ｂ）５００ｎｇのラットＴＧＦ−ａ：３）５００ｎｇのヒトＴＧＦ− ａまたはラットＴＧＦ−α単独。

創傷の付与に続いて、３日目から１０日目にかけて、生検標本を採取した。組織 学、的評価のための生検標本は、深さ約３ｍｍの楔状で採取し、１０％ホルマリ ンに保存した。生物化学的分析およびオートラジオグラフィーのための標本は、 エレクトロケラドームを用いて採取した。標本の最終寸法は１．５ｍｍＸ１０ｍ ｍＸ１．５ｍｍであった。生物化学的分析用には創傷当たり３つの標本を採取し 、オートラジオグラフィー用には創傷当たり２つの標本を採取した。標本は採取 した後、冷却したイーグル修正基本培地（ＥＭＥＭ）に１０％仔牛血清を添加し た培地に保存した。生検標本は、次のように分析した。

ＪＬＪＬ主ヱｊ１菫− 組織学的検討の標本は標準的パラフィン含浸および包埋技術を用いて調製した。

４ミクロンの切片を作り、予め濾過したハリス・ヘマトキシリンおよびアルコー ル性エオシンで染色し、その後顕微鏡で観察した。全ての標本において、２人の 観察者が切片の均一分布点で別個に点数をつけた。上皮組織層および結合組織層 の幅は、顕微鏡の接眼レンズ内に置いたグリッドを用いて測定し、その結果を同 じ条件で観察したミクロメーターの結果と比較して、ｍｍに換算した。

ＤＮＡおよび　の渭 ＤＮＡの測定は、Ｌａｂａｒｃａら（１９８，０）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １２０：３４４−５２の方法を修正した方法で行った。濃厚水酸化アンモニウム 中の組織抽出物の５０μｍを、１Ｍのリン酸ナトリウムおよび２Ｍの塩化ナトリ ウムを含む４００μｍのバッファー溶液（ｐ）］’７．　０）に加え、生じた溶 液のｐＨをＨＣＩで７゜４に調整した。その後、ｐＨを７．４に保持したままで 最終溶液量を５００μｌとした。次にこの溶液を、ヘキスト色素（Ｈｏｅｃｈｓ ｔ　ｄｙｅ）（１，１４ｍｇ／ｍｅ）を含むバッファー溶液（０，０５Ｍリン酸 ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．４）２．５−に添加した。励起波 長３５２ｎｍで蛍光を誘発し、４５４ｎｍで発光の強さを測定した。標準曲線を 得るためには、同様の処理を施した仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。

濃厚水酸化アンモニウム中の組織抽出物の蛋白質含量は、ブラッドフォード法（ Ｂｒａｄｆｏｒｄ　（１９７６）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２：２４８−５ ４）によりウシ血清アルブミンを標準物として測定した。

亙１ 組織学的評価からの結果は、精製ヒトＰＤＧＦまたは組換えＰＤＧＦと化学合成 されたヒトまたはラットのＴＧＦ−αとの組合せで処置された創傷は、治療をう けなかった創傷、ヒトまたはラットのＴＧＦ−α単独またはまたは純粋ＰＤＧＦ 単独による治療を受けた創傷に比べて、結合組織および上皮層が厚く、且つより 多くの上皮突起がこれらの層を結合していることを示した。

ＰＤＧＦ／ＴＧＦ−αで治療した創傷は、ＤＮＡ、蛋白質およびコラーゲン含有 量が、より大きかった。

ユｌ 精製ＰＤＧＦの適当な用量を決定するため、上記実験を繰り返したが、創傷の１ 　ｍｍ”あたり、生物学的に許容されるゲル３０μｍ中に分散した２　、　５　 ｎｇｓ　５　、　ＯｎｇｓおよびＬｏｎｇのＰＤＧＦ　（精製ＰＤＧＦに換算し て）で創傷を治療した。その結果、最適効果はＰＤＧＦ含量が５．０ｎｇ／ｍｍ ２またはそれ以上のときに得られた。

精製ＰＤＧＦ十ＴＧＦ−αの適当な用量を決定するため、ＰＤＧＦとＴＧＦ−α の重量対重量比が、１：１０ないし２５：１の範囲の組み合わせを上記のように して評価した。最適の結果は、比率が１＝１および２：１のときに得られた。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板由来の精製された増殖因子および精製された腫瘍細胞増殖因子アルフ ァ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ）を含む組 成物の創傷治癒有効量を外傷部に適用することよりなる、哺乳類動物の外傷を治 療する方法。
2. ２．組成物中の血小板由来の増殖因子対腫瘍細胞増殖因子アルファの重量対重量 比が、１：４ないし２５：１の間にある、請求項１または２記載の方法。
3. ３．比率が１：２ないし１０：１である請求項２記載の方法。
4. ４．比率が約１：１または２：１である請求項３記載の方法。
5. ５．血小板由来の精製された増殖因子および精製された腫瘍細胞増殖因子アルフ ァを、重量対重量比１：４ないし２５：１で含む創傷治療用組成物。
6. ６．比率が１：２ないし１０：１である請求項５記載の組成物。
7. ７．比率が約１：１または２：１である請求項６記載の組成物。
8. ８．血小板由来の精製された増殖因子および精製された腫瘍細胞増殖因子アルフ ァを、重量対重量比で１：４ないし２５：１で混合することよりなる、創傷治癒 用組成物の製造方法。