JPH0649657B2 - 創傷の治癒 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は創傷の治癒に関する。

増殖因子類は、特定の標的細胞集団を刺激するポリペプ
チドホルモンである。増殖因子の例には、血小板由来増
殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ
−Ｉ）、腫瘍細胞増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮
性増殖因子（ＥＧＦ）、および繊維芽増殖因子（ＦＧ
Ｆ）がある。ＰＤＧＦは、血流中の血小板の顆粒中に見
出される、カチオン性の熱安定性蛋白質であり、繊維芽
細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質合成およびコラーゲンの
生産を刺激することが知られている。この因子は、また
繊維芽細胞、平滑筋細胞およびグリア細胞のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの細胞分裂および化学遊走因子としての作用も
持つことが知られている。

ＰＤＧＦ をｉｎ ｖｉｖｏの創傷治癒に用いることは
既に提案されている。例えば、Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ
（１９８４）Ｊ．Ｔｒａｕｍａ２４；５４９−５２に
は、コラーゲンゲルで含浸させそしてラットの背中に移
植したＨｕｎｔ−Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ金網チャンバーに
ＰＤＧＦを加えたところ、新たに合成されるコラーゲン
の量が増加したことが記載されている。しかしながら、
Ｌｅｉｔｚｅｌら（１９８５）Ｊ．Ｄｅｍａｔｏｌ．Ｓ
ｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１１：６１７−２２によれば、Ｐ
ＤＧＦを単独またはＦＧＦおよびＥＧＦと組み合わせて
用いたとき、ハムスターの通常の創傷の治癒を促進する
ことはできなかった。

Ｍｉｃｈａｅｌｉら（１９８４）は、「柔軟および硬質
組織の修復（Ｓｏｆｔ ａｎｄ Ｈａｒｄ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｒｅｐａｉｒ）」（Ｈｕｎｔ，Ｔ．Ｋ．ら編集）、
Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ニューヨー
ク，３８０〜３９４頁）において、血小板リッチプラズ
マから得た部分精製ＰＤＧＦ調製物を家兎の角膜に移植
したとき、脈管形成を刺激したことを報告している。Ｐ
ＤＧＦは脈管形成性増殖因子ではないから、上記報告者
らは、彼らの部分精製ＰＤＧＦ調製物中の未知因子がこ
の脈管形成効果に関与したものと示唆している。

Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇ．Ｓ．ら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅは、ＴＧＦ−αをブタの皮膚の部分的火傷に適用した
ところ、治療を施さない火傷に比較して上皮の再生が促
進されたことを報告している。

発明の要約 一般に、本発明は、その一態様において、創傷に有効量
の精製ＰＤＧＦおよび精製ＴＧＦ−αを含む組成物を適
用して、哺乳類、例えばヒト患者の外傷を治癒する技術
に関する。好ましくは、ＴＧＦ−αはヒトＴＧＦ−αで
あるが、他の哺乳類のものであってもよく、例えばラッ
トのものでもよい。ＴＧＦ−αは、天然源から単離する
こともでき、またはより好ましくは組換え細胞によりま
たは固相ペプチド合成により製造される。本発明の組成
物は、少なくともその一部において、上皮組織および結
合組織の増殖および全蛋白質およびコラーゲンの合成を
刺激することにより、創傷の治癒に寄与する。本発明の
組成物を用いた創傷の治癒は、そのような治療を行わな
いとき（即ち、外部からの薬剤を用いない時）または純
粋なＰＤＧＦのみまたは純粋なＴＧＦ−αのみを用いた
ときに比べて、一層効果的である。

本発明の好ましい態様では、組成物は薬学的に許容され
る担体物質、例えば市販の不活性ゲルまたは溶液（例え
ば、アルブミンまたはメチルセルロースを添加した塩類
液）中で、精製ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−α（両者ともに
市販品として入手可能である）を混合して、製造され
る。最も好ましくは、精製ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−α
は、重量対重量比で、１：４ないし２５：１、好ましく
は１：２ないし１０：１、そしてより好ましくは１：１
または２：１で混合される。精製ＰＤＧＦはヒト血小板
から、または組換えＤＮＡ技術でえられるであろう。従
って、ＰＤＧＦの用語は、哺乳類、好ましくは霊長類の
血小板または遺伝子組換え材料から由来した両方を意味
し、最も好ましくは、霊長類は人類であるがチンパンジ
ーまたは他の霊長類であってもよい。組換えＰＤＧＦ
は、培養原核または真核細胞に両サブユニットをコード
するＤＮＡ配列を挿入し、次いで翻訳されたサブユニッ
トを細胞で処理してえられた組換えヘテロダイマーでも
よく、あるいは、サブユニットの一方のみ（好ましくは
ベータもしくは「２」チェーン）をコードするＤＮＡを
細胞に挿入し、これを培養してホモダイマーのＰＤＧＦ
（ＰＤＧＦ−１もしくはＰＤＧＦ−２ホモダイマー）を
製造してもよい。

本発明において精製という用語は、他の成分と混合する
前に重量で９５％以上がＰＤＧＦまたはＴＧＦ−αであ
り、即ち天然に付随する他の蛋白質、脂質および炭水化
物が実質的に存在しないことを意味する。

精製蛋白質調製物は、一般にポリアクリルアミドゲル上
でＰＤＧＦまたはＴＧＦ−αの各サブユニットに対して
一本のみの主要バンドを与える。最も好ましくは、本発
明の組成物中に用いられる精製ＰＤＧＦまたはＴＧＦ−
αはアミノ末端アミノ酸配列分析で判定したとき、純粋
なものである。

本発明の組成物は、哺乳類の外傷、例えば褥瘡、裂傷お
よび火傷の治癒のための、迅速且つ有効な方法を提供す
る。この組成物は、自然治癒（即ち外から薬剤を与えな
いとき）または純粋ＰＤＧＦまたはＴＧＦ−αのみに比
較して結合組織の形成を増強する。純粋ＰＤＧＦのみと
異なり、この組成物は新たな結合組織および上皮組織の
増殖を有意に増大する。得られる上皮層は自然治癒また
はＴＧＦ−α単独治癒に比べて厚いだけでなく、それを
新たな結合組織と結合するための上皮突起（ｅｐｉｔｈ
ｅｌｉａｌ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）をより多く含み、
従って一層しっかり結合し、創傷の防護効果も大きい。

本発明の他の態様および利点は、好ましい態様に基づく
以下の記載および請求の範囲から明らかにされる。

好ましい態様の記載 好ましい態様について、説明する。

本発明によれば、精製ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−αの組合
せで製造されたＰＤＧＦ／ＴＧＦ−α混合物を用いて、
外傷、例えば褥瘡および火傷が治療される。化学的に合
成されたヒトＴＧＦ−αおよびラットＴＧＦ−αは、ベ
ルモント，カリホルニアのペニンシュラ・ラポラトリー
ズ社（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）から市販されている。精製組換えＰＤＧＦおよびヒ
ト血小板由来の精製ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ社（ボスト
ン，マサチュセッツ）、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（ウォルサム，マサチュセッツ）お
よびＡｍｇｅｎ社（サウザンド オースク，カルホルニ
ア）から市販されている。精製ＰＤＧＦは次にようにし
て調製することも可能である： 洗浄したヒト血小板ペレット５００ないし１０００単位
を１Ｍ ＮａＣｌ（血小板単位あたり２ml）に懸濁し、
１００℃で１５分間加熱する。上清を遠心分離で分離
し、沈澱を１Ｍ ＮａＣｌで２回抽出する。

抽出物を合わせ、０．０８Ｍ ＮａＣｌ −０．０１Ｍ
リン酸ナトリウムバッファー（pH７．４）に対して透析
し、このバッファーで平衡化したＣＭ−セファデックス
Ｃ−５０と４℃で一夜混合する。次いでこの混合物をカ
ラム（５×１００cm）に注入し、０．０８Ｍ ＮａＣｌ
−０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（pH７．４）
で充分に洗浄し、１Ｍ ＮａＣｌで溶出しそして１０ml
クラクションずつに回収する。

活性フラクションをプールし、０．３Ｍ ＮａＣｌ−
０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（pH７．４）に
対して透析し、遠心分離し、０．３Ｍ ＮａＣｌ−０．
０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（pH７．４）で平衡
化した２．５×２５cmのブルーセファロース（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）に４℃で通過させる。このカラムを同バ
ッファーで洗浄し、部分精製されたＰＤＧＦを１Ｍ Ｎ
ａＣｌおよびエチレングリコールの１：１溶液で溶出す
る。

この部分精製ＰＤＧＦフランクションを１Ｍ ＮａＣｌ
で１：１希釈し、１Ｍ酢酸で透析し、そしてと凍結乾燥
する。凍結乾燥サンプルは０．８Ｍ ＮａＣｌ−０．０
１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（pH７．４）に溶解し
そして同バッファーで平衡化した１．２×４０cmのＣＭ
−セファデックス Ｃ−５０カラムに通過させる。次い
でＰＤＧＦをＮａＣｌ勾配（０．０８ないし１Ｍ）で溶
出する。

活性フラクションを合わせ、１Ｍ酢酸に対して透析し、
凍結乾燥し、そして少量の１Ｍ酢酸に溶解する。その
０．５ml分を１Ｍ酢酸で平衡化した１．２×１００cmの
バイオゲル Ｐ−１５０（１００ないし２００メッシ
ュ）のカラムにのせる。ついでＰＤＧＦを１Ｍ酢酸で溶
出し、２mlずつのフラクションにして回収する。

１００ないし２００mgの蛋白質を含む各活性フラクショ
ンを凍結乾燥し、１００mlの０．４％トリフルオロ酢酸
に溶解し、フェニルボンダパックカラム（Ｗａｔｅｒｓ
社）による逆相高性能液体クロマトグラフィーに付す
る。アセトニトリルの直線勾配（０ないし６０％）によ
り精製ＰＤＧＦが得られる。

組換えＤＮＡ技術でのＰＤＧＦは、次のようにして調製
される： ヒト血小板から得られる血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）は二種のポリペプチド配列（ＰＤＧＦ−１およびＰ
ＤＧＦ−２ポリペプチド）を含む（Ａｎｔｏｎｉａｄｅ
ｓ，Ｈ．Ｎ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．（１
９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０：９６３−９６５）。
ＰＤＧＦ−１はクロモゾーム７中に存在する遺伝子によ
りコードされ（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３２０：６９５−６９９）、そしてＰＤＧＦ−２
はクロモゾーム２２（Ｄａｌｌａ−Ｆａｖｅｒａ，Ｒ．
（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１８：６８６−６８
８）中に存在するｓｉｓオンコジーン（Ｄｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ，Ｒ．ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２１：２７
５−２７７）によってコードされる。ｓｉｓ遺伝子はサ
ル肉腫ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉ
ｒｕｓ：以下ＳＳＶという）の形質転換蛋白質をコード
しており、この蛋白質はＰＤＧＦ−２ポリペプチドに密
接に関係している。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓもまたＰＤＧＦ
−２鎖をコードする（Ｒａｏ，Ｃ．Ｄ．ら（１９８６）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
３：２３９２−２３９６）。これら二種のＰＤＧＦのポ
リペプチド鎖は、別のクロモゾームに存在する異なる遺
伝子によりコードされるので、ヒトＰＤＧＦはＰＤＧＦ
−１およびＰＤＧＦ−２のジスルフィド結合したヘテロ
ダイマーからなるか、または二種のホモダイマー（ＰＤ
ＧＦ−１のホモダイマーおよびＰＤＧＦ−２のホモダイ
マー）の混合物からなるか、または上記ヘテロダイマー
と二種のホモダイマーの混合物よりなる可能性がある。

ＰＤＧＦ−２鎖をコードする遺伝子を含むＳＳＶで感染
した培養中の哺乳類細胞は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチド
を合成しそしてそれをジスルフィド結合したホモダイマ
ーに加工することが知られている。（Ｒｏｂｂｉｎｓ，
Ｋ．ら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，３０５：６０５−６
０８）。さらに、ＰＤＧＦ−２ホモダイマーは、ヒトＰ
ＤＧＦに対して調製した抗血清と反応する。さらにま
た、分泌されたＰＤＧＦ−ホモダイマーの機能的性質
は、培養中の繊維芽細胞のＤＮＡ合成を刺激する点、１
８５kdの細胞膜蛋白質のチロシン残基でのホスホリル化
を誘発する点および特異的細胞表面ＰＤＧＦリセプター
との結合に関してヒト（¹²⁵Ｉ）−ＰＤＧＦと競合する
能力を有する点で、血小板由来ＰＤＧＦのそれと類似し
ている（Ｏｗｅｎ，Ａ．ら８１９８４）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２５：５４−５６）。同様な性質は、培養正常ヒ
ト細胞（例えばヒト動脈内皮細胞）からのｓｉｓ／ＰＤ
ＧＦ−２遺伝子生成物について、またはｓｉｓ／ＰＤＧ
Ｆ−２発現ヒト悪性細胞からの生成物についても示され
ている（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ，Ｈ．ら（１９８５），
Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，３：１４５−１５１）。

組換えＰＤＧＦ−２ホモダイマー（本明細書中で、組換
えＰＤＧＦという）は、ｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝
子のｃＤＮＡクローンを発現ベクターを用いてマウス細
胞に導入して得ることができる。この発現に用いるｃ−
ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２クローンは、正常ヒト培養上皮細
胞からえられる。（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．ら（１９８
５），Ｎａｔｕｒｅ，２１６：７４８−７５０）。

創傷の治癒 創傷の治癒を促進するために、ＰＤＧＦ／ＴＧＦ−α混
合物の有効性を調べるため、次の実験を行った。

体重１０ないし１５kgの幼若白色ヨークシャー種の豚
（Ｐａｒｓｏｎ′ｓ Ｆａｒｍ，ハドレイ，マサチュセ
ッツ）を手術前に少なくとも６時間絶食させ、次いで麻
酔した。麻酔条件下で背中および首の部分を刈り、剃
り、そして穏やかな石鹸および水で洗浄した。次いで、
外傷を付する部分を７０％アルコールで消毒した。

１cm×２cmの大きさの傷を深さ０．５mmに作るため、改
良カストロビーヨエレクトロケラトーム（Ｃａｓｔｒｏ
ｖｉｅｊｏ ｅｌｅｃｔｒｏｋｅｒａｔｏｍｅ）（Ｓｔ
ｏｒｚ製，セントルイス，ミズーリをＢｒｏｗｎｅｌｌ
ｓ，Ｉｎｃ．で改良したもの）を用いた。この創傷は上
皮の完全な除去およびその下層の真皮の部分的除去をも
たらした（第２度の火傷に相当する）。各創傷は少なく
とも１５mmの健全皮膚により隔てた。同一の治療を受け
る創傷はグループにまとめ、他のグループから少なくと
も３cm隔てた。増殖因子での治療を受けない創傷は、治
療を受けるグループから少なくとも１０cm隔てた。

創傷は、生物学上許容されるゲルに分散した次の増殖因
子での一回の塗布により、直接処理した：１）５００ng
純粋ヒトＰＤＧＦ（高性能液体クロマトグラフィーで精
製したもの）または組換えＰＤＧＦのみ：２）各々次の
ものと組み合わせた５００ngの純粋ＰＤＧＦ：(a)５０
０ngのヒトＴＧＦ−α；(b)５００ngのラットＴＧＦ−
α：３）５００ngのヒトＴＧＦ−αまたはラットＴＧＦ
−α単独。

創傷の付与に続いて、３日目から１０日目にかけて、生
検標本を採取した。組織学的評価のための生検標本は、
深さ約３mmの楔状で採取し、１０％ホルマリンに保存し
た。生物化学的分析およびオートラジオグラフィーのた
めの標本は、エレクトロケラトームを用いて採取した。
標本の最終寸法は１．５mm×１０mm×１．５mmであっ
た。生物化学的分析用には創傷当たり３つの標本を採取
し、オートラジオグラフィー用には創傷当たり２つの標
本を採取した。標本は採取した後、冷却したイーグル修
正基本培地（ＥＭＥＭ）に１０％仔牛血清を添加した培
地に保存した。生検標本は、次のように分析した。

組織学的評価 組織学的検討の標本は標準的パラフィン含浸および包理
技術を用いて調製した。４ミクロンの切片を作り、予め
濾過したハリス・ヘマトキシリンおよびアルコール性エ
オシンで染色し、その後顕微鏡で観察した。全ての標本
において、２人の観察者が切片の均一分布点で別個に点
数をつけた。上皮組織層および結合組織層の幅は、顕微
鏡の接眼レンズ内に置いたグリッドを用いて測定し、そ
の結果を同じ条件で観察したミクロメーターの結果と比
較して、mmに換算した。

ＤＮＡおよび蛋白質の測定 ＤＮＡの測定は、Ｌａｂａｒｃａら（１９８０）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：３４４−５２の方法を修
正した方法で行った。濃厚水酸化アンモニウム中の組織
抽出物の５０μｌを、１Ｍのリン酸ナトリウムおよび２
Ｍの塩化ナトリウムを含む４００μｌのバッファー溶液
（pH７．０）に加え、生じた溶液のpHをＨＣｌで７．４
に調整した。その後、pHを７．４に保持したままで最終
溶液量を５００μｌとした。次にこの溶液を、ヘキスト
色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ ｄｙｅ）（１．１４mg／ml）を
含むバッファー溶液（０．０５Ｍリン酸ナトリウム、２
Ｍ塩化ナトリウム，pH＝７．４）２．５mlに添加した。
励起波長３５２nmで蛍光を誘発し、４５４nmで発光の強
さを測定した。標準曲線を得るためには、同様の処理を
施した仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。

濃厚水酸化アンモニウム中の組織抽出物の蛋白質含量
は、ブラットフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７
６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−５４）
によりウシ血清アルブミンを標準物として測定した。

結果 組織学的評価からの結果は、精製ヒトＰＤＧＦまたは組
換えＰＤＧＦと化学合成されたヒトまたはラットのＴＧ
Ｆ−αとの組合せで処置された創傷は、治療をうけなか
った創傷、ヒトまたはラットのＴＧＦ−α単独またはま
たは純粋ＰＤＧＦ単独による治療を受けた創傷に比べ
て、結合組織および上皮層が暑く、且つより多くの上皮
突起がこれらの層を結合していることを示した。

ＰＤＧＦ／ＴＧＦ−αで治療した創傷は、ＤＮＡ、蛋白
質およびコラーゲン含有量が、より大きかった。

用量 精製ＰＤＧＦの適当な用量を決定するため、上記実験を
繰り返したが、創傷の１mm²あたり、生物学的に許容さ
れるゲル３０μｌ中に分散した２．５ng、５．０ng、お
よび１０ngのＰＤＧＦ（精製ＰＤＧＦに換算して）で創
傷を治療した。その結果、最適効果はＰＤＧＦ含量が
５．０ng／mm²またはそれ以上のときに得られた。

精製ＰＤＧＦ＋ＴＧＦ−αの適当な用量を決定するた
め、ＰＤＧＦとＴＧＦ−αの重量対重量比が、１：１０
ないし２５：１の範囲の組み合わせを上記のようにして
評価した。最適の結果は、比較が１：１および２：１の
ときに得られた。

フロントページの続き (72)発明者 アントニアデス，ハリー・エヌ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02158, ニュートン，マグノリア・ドライブ 21 (72)発明者 リンチ，サミュエル・イー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02130, ジャマイカ・プレーン，ジャマイカ・ウェ イ 224，ナンバー ７

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血小板由来の精製された増殖因子および精
   製された腫瘍細胞増殖因子アルファ（transfoming grow
   th factor alpha）を含む傷治癒用組成物。
2. 【請求項２】血小板由来の精製された増殖因子および精
   製された腫瘍細胞増殖因子アルファを、重量対重量比
   １：４ないし２５：１で含む傷治癒用組成物。
3. 【請求項３】比率が１：２ないし１０：１である請求項
   ２記載の組成物。
4. 【請求項４】比率が約１：１または２：１である請求項
   ３記載の組成物。
5. 【請求項５】血小板由来の精製された増殖因子および精
   製された腫瘍細胞増殖因子アルファを、重量対重量比
   １：４ないし２５：１で混合することよりなる、傷治癒
   用組成物の製造方法。