JPH03502576A - リポソームへのアフィニティ結合による精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソームへのアフィニティ結合による精製発明の分野 本発明は、一般にはアフィニティ精製に関し、特には、リガンドがリポソームへ 結合されるアフィニティ精製工程に関する。

発明の背景 生物活性な高分子、例えば酵素、抗原、抗体およびホルモンは、典型的には、正 常のまたは遺伝子的に変えられた微生物による発酵ブイヨンにより、低濃度で製 造される。

ブイヨン中の望ましくない不純物としては、大きな生体分子、細胞小器官、膜脂 質、アミノ酸、糖分解性の基質および電解質のホストが挙げられる。現在生物活 性高分子を精製するのに用いられている工業的および実験室規模の精製体系のう ちには、結晶化、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、 電気泳動およびアフィニティクロマトグラフィーがある。一般には、ボネリー（ Ｂａｎｎｅｒ　ｊ　ｅａ）　、　Ｊ　　らのバイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／胆 吐匣江釘）、ユ、　９５５（１９８６）参照。後者の手法であるアフィニティク ロマトグラフィーは、はるかに最大の選択的手法であるが、規模を大きくするの が大変困難であり、アフィニティリガンドを有するゲルビーズの活性化は、制御 が難しい高価な工程である。

最近、マティアソン（Ｍａｔｔｉａｓｏｎ）およびリング（Ｌｉｎｇ）は、溶液 から蛋白質を特異的に精製するために粒子結合アフィニティリガンドを用いた。

バイオプロセス　テクノロジー（Ｂｉｏ　ｒｏｃｅｓｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　　 ）、９９　（ｖクグレガー（ＭｃＧｒｅｇｏｒ）　。

Ｗ、　Ｃ，、編１９８６）　　（マーセル　デツカ−インコーホレーテッド、ニ ューヨーク０１ａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、ＮＹ）　　；また、ヨー ロッパ特許出願公報第０１２７７３７号参照。リガンドは糖の顆粒、または粒状 の黙殺したイースト細胞に固定され、そして続いて溶液と混合された。アフィニ ティ結合を生ぜしめた後、不純物を、固体粒子を保持する膜を通して、限外濾過 により除去した。著者らは、この手法は大規模精製のために規模の拡大が可能で あることを示唆しているが、結合され得る高分子の最大量は、粒子の利用できる 表面積によって制限されることに言及している。さらに、この著者らは、膜の汚 れや詰まりが、この手法に伴う潜在的な問題であることに言及している。最後に 、この著者らは、種々の異なるリガンドが彼等が用いた小粒子に結合され得るい かなる一般的体系についても示唆していない。したがって、本発明の目的は大き な表面積を有する小粒子を用いたアフィニティ精製工程を提供することであり、 該粒子は、フィルターや半透膜の過度の汚れの原因になることはなく、また粒子 は、種々の異なるリガンドのための便利なキャリ先に述べた目的は、ここに開示 されたように、ある化合物を含む粗製溶液から、リガンドにより特異的に結合さ れたその化合物を抽出する方法によって達成される。この粗製溶液は、抽出され るべき化合物および少なくとも１つの汚染化合物を含む。この方法は、多数のリ ポソームを用意することを含み、リポソームはその表面に結合されたリガンドを 有している。リガンドが抽出されるべき化合物に結合するように、リポソームが 粗製溶液と混合される。リポソームは次いで、粗製溶液から分離され、そして抽 出されるべき化合物をリポソームから回収する。

リポソームを粗製溶液から分離する段階は、リポソームに対して不透過性のフィ ルターに粗製溶液を通すことにより行うことができる。リポソームから抽出すべ き化合物を回収する段階は、溶液にリポソームを懸濁させる段階および、リポソ ームを含まないリガンドの追加量を溶液中に混合して、リポソームに結合したリ ガンドから、抽出すべき化合物の解離を促進する段階を含むことができる。しか しながら、リガンドから抽出すべき化合物を除去するためにアフィニティクロマ トグラフィーにおいて慣用される手法、例えば、リポソームが懸濁されている溶 液のｐＨを変化させること、またはイオン強度を変化させることのようないかな る手法もまた使用できる。

脂質小胞とも呼ばれるリポソームは、なめらかな球状であり、長年の間、カプセ ル化された水溶性物質の便利なキャリヤーとして知られてきた。リポソームを作 るために、いくつかの方法が利用できる。例えば、パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ） 等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１３，２３８（１９６５）　；　Ｄ、パパハジョ ボーロス（Ｐａｐａｈａｄ　ｊｏｐｏｕ　１ｏｓ）およびＮ、ミラー（Ｍｉｌｌ ｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏ　ｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１３５．６２４（１９６７）　：ディー　７−　 （Ｄｅａｍｅｒ）およびパンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）　、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ ｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ　４４３．６２９（１９７６）　；パパハジョボーロス（ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃ ｔａ　３９４，４８３（１９７５）　；ドイツ国特許第２、５３２．３１７号； および米国特許明細書第３．８０４．７７６号；第４、０１６．１００号；第４ ．２３５．９７１号；第４．５２２．８０３号；および第４．５８８．５７８号 を参照。ここで引用した米国特許文献のすべての開示は、引用することによりこ こに組み込まれている。

リポソーム壁形成化合物は、その製造方法と同様に、通常良く知られている。例 えば、多数のリン脂質または脂質化合物が小胞壁を形成するのに使用できる。そ のような壁形成化合物の代表的なものは、米国特許第４．２３５．８７１号明細 書に記載のものである。リポソームの製造に有用な適した脂質の具体例はリン脂 質であり、これらに限定されることはないが、例えば、天然のレシチン類または ホスファチジルコリン類（例えば卵レシチンまたは大豆レシチン）および合成レ シチン類、例えば飽和合成レシチン類（例えば、シミリストイルホスファチジル コリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチ ジルコリン）および不飽和合成レシチン類（例えば、ジオレオイルホスファチジ ルコリンおよびシリルオイルホスファチジルコリン）が挙げられる。他のリン脂 質としては、これらに限定されないが、ホスファチジルエタノールアミン、リゾ レシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホス ファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルシオリピン、ホスファチジ ン酸、セラミド類およびセレブロシド類が挙げられる。リポソーム壁は、任意的 にステロイド成分、例えばコレステロール、コレスタノール、コレスタノール、 コレスタン等を含むことができる。リポソーム壁は任意的に重合されて、安定性 を高めることができる。一般に、ランド−（Ｔｕｎｄｏ）ら、リポソームが提供 する大きな表面積から最大の利益を達成するために、本発明において使用するリ ポソームは好ましくは、約５００ナノメーター以下の直径を有する。より好まし くはリポソームは、２０〜１００ナノメーターの直径を有し、最も好ましくは２ ０〜５０ナノメーターの直径を有する。

いくらかのそれより大きい直径のリポソームが、所望の大きさの範囲の小さいリ ポソームと共に、任意的に含まれ得るが、リガンド結合のために増加された表面 積を有利に提供するのは小さいリポソームである。小さな単ラメラ小胞は、その 大きい表面積および時間的安定性の故に、本発明を実施するのに特に好ましい。

粗製溶液からリポソームを分離するのに用いられるフィルターは、市販の入手可 能な限外濾過膜および精密濾過膜でありうる。使用する膜において唯一限定され ることは、膜のボア（孔）サイズがリポソームの直径より小さいことである。約 ２５０ナノメーター以下のボア直径を有する膜が好ましく、約３〜約５０ナノメ ーターのボア直径を有する膜がさらに好ましく、約３〜約２５ナノメーターのボ ア直径を有する膜が最も好ましい。

多種類の標的分子のいずれに対しても結合するりガントは、リポソームに結合さ れて本発明を実施し得る。そのようなリガンドおよびそれによって結合される標 的分子の例示は以下のようである：ビオチンおよびアビジン；モノクローナル抗 体およびインヒビン；プロ力インアミドおよびコリンエステラーゼ；Ｎ−メチル アクリジニウムおよびアセチルコリンエステラーゼ；Ｐ−アミノベンズアミジン およびトリプシン；Ｐ−アミノフェノール−ベーターＤ−チオガラクトーピラノ シドおよびベーターガラクトシダーゼ；キチンおよびリゾチーム；メトトレキセ ートおよびジヒドロフオレートレダクターゼ、　ＮＡＤおよびアルコールデヒド ロゲナーゼ；スルファニルアミドおよびカルボニックアンヒドラーゼ、　ＤＮＡ およびＤＮＡポリメラーゼ、　ＤＮＡおよびｃＤＮＡ　；ＤＮＡおよびＲＮＡ　 　：　ＣＤＮＡおよび遺伝子的に操作されたプラスミド；酸化されたグルタチオ ンおよびグルタチオンレダクターゼ；Ｐ−アミノベンズアミジンおよびウロキナ ーゼ；モノクローナル抗体およびインシュリン；トリプシンおよび大豆トリプシ ンインヒビター；Ｎ６−アミノカプロイル−３″、５−ｃＡＭＰおよびプロティ ンキナーゼ；ペプスタチンおよびレニン；４−クロロベンジルアミンおよびトロ ンビン；モノクローナル抗体およびインターフェノン；　Ｎ−（４〜アミノフエ ニル）オキサミン酸およびインフルエンザビールス；プレアルブミンおよびレチ ナール結合蛋白質；ニューロフィシンおよびバソプレッシン：リジンおよびプラ スミノーゲン；ヘパリンおよびアンチトロンビン；シクロへブタアミロースおよ びヒト血清アミラーゼ；コルチゾールおよびトランスコルチン；ピリドキサール −５−ホスフェートおよびグルタメート−ピルベート　トランスアミナーゼ；キ レート剤および金属イオン；キレート剤−Ｃｕおよびスーパーオキシドジスムタ ーゼ；キレート剤−Ｚｎおよびヒトフィブリノーゲン：補酵素Ａおよびスクシニ ックチオキナーゼ；フラビンおよびルシフェラーゼ；ピリドキサールホスフェー トおよびチロシンアミノトランスフェラーゼ；ポルフィリンおよびヘモベキシン ；リジンおよびリポソームＲＮＡ　、ポリウリジンおよびｍＲＮＡ　；コンカナ バリンＡおよび免疫グロブリン類；３−ホスホ−３−ヒドロキシプロピオネート およびエノラーゼ；Ｄ−マレートおよびフマレートヒドラターゼニアトロピンま たはコブラドキシンおよびコリン作動性レセプター７ローアミノペニシラン酸お よびＤ−アラニンカルボキシペプチダーゼ；植物レクチン類および表皮性成長因 子レセプター；アルプレノロールおよびエピネフィリンレセプター；成長ホルモ ンおよびプロラクチンレセプター；インシュリンおよびインシュリンレセプター ；エストラジオールまたはジエチルスチルベストロールおよびエストロゲンレセ プター；デキサメタシンおよびグルココルチコイドレセプター；ヒドロキシコレ カルシフェロールおよびビタミンＤレセプター；ビールスモノクローナル抗体お よび血液ビールス；ならびにモノクローナル抗体およびバクテリオファージ。本 発明を実施するのに適したキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ　 Ｄ　Ｔ　Ａ）およびイミノニ酢酸基を有する他の化合物、ホスホノ酢酸（Ｈ２０ ３Ｐ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）、ピロホスフェート（例えば二塩基性ピロホスフェート へキサヒトレート）、二塩基性オルトホスフェート、クラウンエーテル類、例え ばジシクロへキサノー１８−クラウン−６、シクロデキストリン類、クリブタン 類が挙げられる。全体的に、適したリガンドは、下記に限定されることはないが 、抗体、ペプチド、ポリ核酸（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、アンチト キシン、キレート剤、酵素阻害剤、レセプター作動物質およびレセプター拮抗物 質が挙げられる。ここで用いる「抗体」という語は、免疫グロブリン、例えばＩ ｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを意味し、起源はポリクローナル、 モノクローナルのいずれであろうとかまわない。これらのリガンドは、リポソー ムを形成するのに使用されるリン脂質に、通常の手法によって、すなわち予備形 成されたリポソームにリガンドを付着させるかまたは、リン脂質にリガンドを結 合させ、そして得られる両親媒性の分子をリポソーム形成中にリポソームに組み 込むことによって、共有結合され得る。例えば、それらに結合した抗体を有する リポソームは、米国特許第４．４８３．９２９号明細書（５ｚｏｋａ）に開示さ れたやり方で製造することができる。

本発明を以下の限定されない実施例でさらに詳細に説明する。これらの実施例は 、説明の目的のためのみにあり、本発明の範囲を限定するものとして用いられる べきではない。

寒皇亘ユ ビオチン化したリン脂質の製造 ベイヤー（Ｂａｙｅｒ）らのＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｈｙｓ、Ａｃｔａ　５５ ０，４６４（１９７９）の方法に従って、ビオチンを、シミリストイルホスファ チジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）に結合させた。

ＤＭＰＥ（４８マイクロモル）を、ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（ＢＮＨ３）６０マイクロモルを含有するクロロホルム／メタノール（ 容積比２：１）溶液１ｍｌ中に溶解させた。トリエチルアミン（１０マイクロリ ツトル）を添加してプロトン受容触媒として作用させ、混合物を室温で３０分間 反応させた。１に厚のシリカゲル板で、展開溶媒系としてクロロホルム／メタノ ール／水（容積比８０：２５：２）を用いた予備薄層クロマトグラフィーによっ て、ビオチン化したＤＭＰＥを未反応のＢＮＨ３から分離した。ビオチン化した リン脂質を、マコーミツク（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）、　Ｄ、およびロス（Ｒｏｔ ｈ）、　Ｊ、、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　ｍｏｌ、１８゜３８３（１９７０）のビオ チン特異的噴霧試薬（ジメチルアミノシンナムアルデヒド、酸性エタノール中０ ．２％）ならびにディット？　−（Ｄｉｔｔｍｅｒ）、　Ｊ、およびレスター（ Ｌｅｓｔｅｒ）、　Ｒ，Ｃ，。

Ｌ」ｊＬ順工Ｒｅｓ工Ｌし１２６（１９６４）のホスフェート特異的噴霧（モリ ブデンブルー試薬）の両方により同定した。生成物を板からかき取り、クロロホ ルム／メタノール（容積比２：１）で抽出した。溶媒を、ロータリーエバポレー ターにて４０℃で蒸発させ、乾燥生成物を秤量して収率を決定した。典型的には 、理論的収量の７５％が得られた。ＤＭＰＥ−ビオチンを一４℃の窒素下で貯蔵 した。

脂質分散物を調製するために、シミリストイルホスファチジルコリン（７４マイ クロモル）およびビオチン化したＤＭＰＥ　（４マイクロモル）を、クロロホル ム／メタノール（容積比２　：　１）２０ｍＡ’に溶解した。完全に混合した後 、この溶液を４０℃でロータリーエバポレーターにて、１時間乾燥し、そして乾 燥したリン脂質を５重量％濃度で緩衝液（０，ＩＭ　　Ｎ　ａ　Ｃ１，０，０１ １［）リスＨ（１、ｐＨ８，５）中に懸濁させた。この分散物を、カップホーン （ｃｕｐ　ｈｏｒｎ）を備えた加熱系超音波処理機（モデルＷ　−３８５’）に て、３３℃で８時間超音波処理した。８時間の超音波処理により、大きな単ラメ ラ小胞が、直径約２０〜約１００ナノメーターの範囲の小さな単ラメラ小胞に転 化された。未分散のリン脂質を８０００ｇで２０分間の遠心分離により除去し、 残った小胞を、セフ７０−スＣＬ−４Ｂ−２００カラム（２Ｘ３０ｃｍ）のサイ ズ排除クロマトグラフィーにより分画した。ハング（Ｈｕａｎｇ）　。

Ｃ，、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　８．３４４（１９６９）参照。３００　ｎｍ での刀ラム溶出物の吸収を、フローセルを備えたボーシュおよびロームスペクト ロニック２１スペクトロホトメーター（Ｂａｕｓｃｈａｎｄ　Ｌａｍｂ　５ｐｅ ｃｔｒｏｎｉｃ　２１　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）により、連続的 に監視した。溶出物をギルランモデル２０３フラクシヨンコレクター（Ｇｉｌｓ ｏｎ　ｍｏｄｅｌ　２０３　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）で集め、 画分を、１００．０００分子量分離膜（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭｌｏｏ） を有するアミコン限外濾過ユニット（モデル８２００）を通した限外濾過により 濃縮した。リポソームは、３５℃の一定温度の水浴中に保存し、５日間以内に使 用した。

実施例３ アビジンの精製および回収 上記の実施例２で述べたように製造した小さな単ラメラリポソーム（１２，５ｍ ｇ／ｍｌ）を、アビジンおよびリゾチームの混合物に添加して、アビジンが特異 的に分離され、不均一な溶液から回収され得ることを証明した。ビオチン化した リポソーム２００マイクロリツトルを、０．０６ｍｇ／ｍｌのアビジンおよび０ ．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームの溶液１０ｍｊ！に添加した。

ＨＰＬＣ分析により、４時間後にアビジンの７３％が結合され、一方、遊離のり ゾチームはすべて溶液中になお存在することが示された。次に、この溶液を炭酸 アンモニウム緩衝液ＩＱｍ　ＩＩで希釈し、アミコン　ＹＭ１００膜を通して限 外濾過してリゾチームおよび残留する非結合アビジンを除去した。膜を通しての 流量は、上流圧４Ｑｐｓｉｇを用いて、限外濾過の間中本質的に一定（０，１４ ｒｙｌ水／Ｃｍ２分）に留−た。

このことは、リポソームがほとんど膜を汚さないことを示す。濾液および保持物 （ｒｅｔｅｎｔａｔｃ）のＨＰＬＣ分析により、リゾチームおよび遊離のアビジ ンのすべてが濾液中にあることが示された。リポソームからアビジンを回収する ために１００倍モル過剰の遊離のビオチンを溶液に添加した。溶液を１晩放置し 、次いでｉｏ、　ｏｏｏ分子量分離膜（ＹＭ　１０）を通し５て濾過して非結合 ビオチンを除去した。濃縮物をｙｍ　ｉｏ。

膜を通して濾過して、リポソームから遊離のアビジン−ビオチン複合体を分離し た。濾液は、リポソームに元々結合していたアビジンの２０％を含んでいた。次 にこの溶液を限外濾過（ＹＭ　１００）して１ｍ／より下に減らし、６Ｎのグア ニジンＨＣＡ’　　（ｐＨ１，５）１０ｍＡを添加してビオチンを除去した。５ 分後にこの溶液を炭酸アンモニウム緩衝液中に戻し、これはアビジン７６％活性 を与えた。この実験をより過剰なビオチンを用いて繰り返した（１０００倍モル 過剰）。このとき、リポソーム結合アビジンの約５０％が回収された。

上述した発明は、広い種類の分離方法のために使用でき、バッチ式および連続流 通装置のいずれをも含む種々の異なった型の装置を用いて実施できる。したがっ て、先の議論は例示であると考えられるべきであり、限定されるものではない。

本発明の範囲は、以下の請求の範囲によって限定される。請求の範囲の均等なも のは、その中に包含されるべきである。

国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．リガンドによって特異的に結合される化合物を、その化合物を含む粗製溶液 から抽出する方法であって、（ａ）多数のリポソームを用意すること、ここでリ ポソームはその表面に結合された該リガンドを有する；（ｂ）リガンドが抽出さ れるべき化合物に結合するように、リポソームを粗製溶液と混合すること；（ｃ ）リポソームを粗製溶液から分離すること；および（ｄ）抽出されるべき化合物 をリポソームから回収することを含む方法。
2. ２．リボソームを粗製溶液から分離する段階が、リポソームに対して不透過性の フィルターに粗製溶液を通すことにより行われる請求項１記載の方法。
3. ３．抽出されるべき化合物をリポソームから回収する段階が、 （ａ）溶液中にリボソームを懸濁させる段階；および（ｂ）リポソームを含まな い該リガンドの追加量を溶液中に混合して、リポソームに結合したリガンドから 抽出すべき化合物の解離を促進する段階 を含む請求項１記載の方法。
4. ４．該リポソームが約５００ナノメーター以下の直径である請求項１記載の方法 。
5. ５．該リポソームが２０〜１００ナノメーターの直径を有する請求項１記載の方 法。
6. ６．該リガンドが抗体である請求項１記載の方法。
7. ７．該リガンドがポリ核酸である請求項１記載の方法。
8. ８．該リガンドがペプチドである請求項１記載の方法。
9. ９．該リガンドがアンチトキシンである請求項１記載の方法。
10. １０．該リガンドがキレート剤である請求項１記載の方法。
11. １１．該リガンドが酵素阻害剤である請求項１記載の方法。
12. １２．該リガンドが、レセプター作動物質およびレセプター拮抗物質からなるク ラスより選ばれる請求項１記載の方法。
13. １３．リガンドによって特異的に結合される化合物を、その化合物を含む粗製溶 液から抽出する方法であって、（ａ）約５００ナノメーター以下の直径を有する 多数のリポソームを用意すること、ここでリポソームはその表面に結合された該 リガンドを有する； （ｂ）リガンドが抽出されるべき化合物に結合するように、リポソームを粗製溶 液と混合すること；（ｃ）リポソームに対して不透過性のフィルターに粗製溶液 を通してリポソームを粗製溶液から分離すること；および（ｄ）抽出されるべき 化合物をリポソームから回収することを含む方法。
14. １４．該リポソームがリン脂質から形成され、かつ該リガンドが該リン脂質に共 有結合している請求項１３記載の方法。
15. １５．該リポソームが２０〜１００ナノメーターの直径を有する請求項１４記載 の方法。
16. １６．該リガンドが抗体である請求項１５記載の方法。
17. １７．該リガンドがポリ核酸である請求項１５記載の方法。
18. １８．該リガンドがペプチドである請求項１５記載の方法。
19. １９．該リガンドがアンチトキシンである請求項１５記載の方法。
20. ２０．該リガンドがキレート剤である請求項１５記載の方法。
21. ２１．該リガンドが酵素阻害剤である請求項１５記載の方法。
22. ２２．該リガンドが、レセプター作動物質およびレセプター拮抗物質からなるク ラスより選ばれる請求項１５記載の方法。