JPH03503000A

JPH03503000A - サルモネラ菌の検出

Info

Publication number: JPH03503000A
Application number: JP89501420A
Authority: JP
Inventors: レイン・デービット・ジェイ; ラシュシャン，アヨーブ; パロドス，キリアキ
Original assignee: アモコ・コーポレーション
Priority date: 1987-12-01
Filing date: 1988-11-30
Publication date: 1991-07-11
Anticipated expiration: 2013-09-10
Also published as: EP0389564A1; ATE133454T1; DE3854943D1; EP0389564B1; JP2795503B2; US5495008A; WO1989005359A1; AU2932889A; DE3854943T2; EP0389564A4; US5792854A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】サルモネラ菌の検出生咀■皇景本発明は丈上天迷旦（あｌμ胆劇」鱒−属に属する細菌の検出に関する〔ここで使用する用語“並水天生立（鉦諌１山旦”は細菌学分類法のバージエイのマニアルの中で分類されているごとき細菌を意味する〕。友Ｊぞ（ネラー（Ｓａ　１ｍｔ狙１１り一菌の検出は多方面の医学および公衆衛生に関連して重要である。ヒト疾病の観点からは、並水玉生立（Ｓａ１μ狙刺１り一種は最も重要な細菌の１つである。土ヱ至生立（シ１μ狙刺１り一菌は軽い胃腸炎からより重度の病気の範囲の種々の感染症を起こすことができる。

標準的実験室法に従うと、臨床標本（例えば大便）中のｆｅｌｔｉｉｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在は、適切に調製された材料を微生物学的培地上でこれらの微生物の増殖に良好な条件下培養することにより検出される。得られるコロニーは形態学的および生化学的特性が試験され、その方法は典型的には試料を得てから４８時間後に開始され、完了するのに数日かかる。

Ｔａｂｅｒらは（米国特許第４．６８９．２９５号）、食品中の車上天主−ラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌の存在を検出するための丈火ｉ木±旦虹肚肚旦ａｌＤ　Ｎ　ＡＫ特異的なりＮＡプローブの使用について記載している。

Ｋｏｈｎｅらは（１９６８）、バイオフィジカル　ジャーナル８：１１０４−１１１８、ｒＲＮＡ配列のプローブを調製する１つの方法について議論している。

Ｐａｃｅ（１９７１）、ジャーナル　オブ　バクテリオロジ−刊Ｌ：５４３−５４７、およびＣａｍｐｂｅｌ　１　（１９７１）は異った細菌種からのリポソームリボ核酸の相同性およびこれらの相同性の程度を定量化するためのハイブリダイゼーション法について議論している。

Ｓｏｇｉｎ　ラは（１９７２）、ジャーナル　オブ　モレキュラーエポルーシ町ン１　：　１７３−１８４、系統発生論的関係の評価のために異ったリポソームＲＮＡ分子の一次構造特性を用いる論理的および実際的観点について議論している。

Ｆｏｘらは、（１９７７）、インターナショナル　ジャーナル　オブシステマティック　バクテリオロジ−２７：　４４−５７、原核生物分類への比較カタログ化（１６ＳリポソームＩ？ＮＡの）法について議論している。

Ｋｏｈｎｅらは（１９Ｂ３）、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂ、ｅ社の特許出願中で、リポソームＲＮＡ分子に対するプローブとして使用するための核酸断片を得るための戦略について記載している。

本発明は以下の定義を明らかにするとより良く理解されるでＤＮＡ　　−デオキシリボ核酸の略号、糖成分としてデオキシリボースを含む核酸の種類で、遺伝的特性の貯蔵所と考えられている；即ち、遺伝子から構成される遺伝物質。

ＲＮＡ　　−リボ核酸の略号、糖成分としてリポースを含む核酸のａｌｌで、最も一般的にはＤＮＡから転写（コピー）される、　ＲＮＡ分子は情報的（例えばメツセンジャーＲＮＡ）、触媒的（例えばＲＮａｓｅＰ）または構造的（例えばリポソームＲＮＡ、下記参照）細胞機能を果たすであろう。

ｒＲＮＡ−リポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）分子はリポソーム、複合体タンパク質およびＲＮＡ含有“細胞小器官”の鍵となる要素であり、トランスファーＲＮＡと一緒になって転送装置を構成する。リポソームはすべての生物体にとってすごく重要であり、なぜならそれらは生命の主たる構造物であり触媒的要素である細胞タンパク質へ遺伝情報を翻訳する唯一の既知の手段として働いているからである。この重要性の現われは、すべての細胞がリポソームを持っていることが観察されることである。

リポソームは３つの異ったＲＮＡ分子を含んでおり、大腸菌においてはそれらは５Ｓ、　１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡと称されている。これらの名称は歴史的には沈降速度により決定されたＲＮＡ分子の大きさに関連している。しかしながら、それらは生物間では大きさは実質的には実際に変化している。　５Ｓ、　１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡは通常任意の細菌における相同的ＲＮＡ分子のための遺伝子的名前として使用されており、ここでもそのように使用されるであろう。

これら３つのＲＮＡ分子の進化的相同体はすべての生物体のリポソーム中に存在する。真核生物においては、相同的ＲＮＡは５Ｓ、　１８Ｓ、および２８Ｓ　ｒＲＮＡと各々称されている。真核生物は、加えてさらに５．８Ｓ　ｒＲＮＡと名付けられた第４のｒＲＮＡ種を含んでおり、その構造お°よび多分機能的相同体は細菌２３Ｓ　ｒＲＮＡの５′末端に観察され４゜ハイブリダイゼーション−規定された反応条件下、２つの部分的にまたは完全に相補的な核酸が逆平行様式で一緒になり、特異的で安定な水素結合を形成する過程、ハイブリダイゼーション条件の特定の組の厳密さはプローブ／標的複合体の塩基組成同様、２つの核酸の間の誤対合のレベルおよび結合構造によっても規定される。厳密さはまたハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン性種の濃度および種類、存在する変性剤の型および濃度および／またはハイブリダイゼーションの温度により支配される。

ブローブー合成または生物学的に産生される核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で設計または選択により、規定された厳密さで標的核酸配列へ特異的に（すなわち優先的に）ハイブリダイズすることを可能にする特異的ヌクレオチド配列を含んでいる。

標的分子−特定のプローブが優先的にハイブリダイズできる核酸分子。

標的配列−標的分子内の核酸配列で、それに対し特定のブーロブが優先的にハイブリダイズできる。

サルモネラ−特異的配列−標的分子内のヌクレオチド配列で、世」ＣＬ主ｊ−（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ）および非９７１ｚ％ネｉ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）腸内細菌間で著しい配列の相違を示す。

他の定義は本文中でそれらが最初に使用された時に与えられる。

溌１墾ｌ」！本発明は本質的にＤＮＡまたはＲＮＡ配列から成る核酸プローブまたはプローブの組を特徴とし、それらは特定のハイブリダイゼーション条件下、皇酉天生立（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）菌のリポソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子の存在を検出でき、同−条件下試験試料中に存在する非友Ｊケ艷ネｊ−（Ｓａｌ＋５ｏｎｅｌｌａ）菌のｒＲＮＡを検出できない。

本発明はまた前記プローブを利用する検定系も特徴とし、その構成は前記のプローブの望ましい挙動を促進できる８本発明は以下の促進された作業能力を示す：ａ）感度の増加；すなわち、現在利用できる方法より、与えられた任意の試料中のより少ない世ＪＣ１ネｊ−（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ）を検出する能カニｂ）生物学的というより化学的に合成されたプローブの使用により、プローブ生産コストの著しい軽減の可能性。

ｃ）　　ｒＲＮ＾配列特性がそのような同定の基礎を提供することにより生化学的に異常な土上天主立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）さえも正確に同定。

標的分子として並上天冬立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　ｒＲＮＡを使用すると多数の利点があり、その中でも：１）　　ｒＲＮＡは細胞塊のかなりの成分を構成する。細胞リポソーム含量の推定値はバラついているが、活撥に増殖している旦１主ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌は細胞当り５．４　Ｘ　１０’以上のリポソームを、およびそれ故各々のｒＲＮＡのｓ、ｏｘｉｏ’のコピーを（リポソーム中１：１：１の化学当量で存在する）含んでいる。対照的に、はとんどの他の潜在的細胞標的分子（遺伝子またはそのＲＮＡ転写物）はより低い頻度で存在している。

２）　　ｒＲＮＡ（およびそれをコードしている遺伝子）は同時代の生物間の側方伝搬を受けていないようである。それ故、ｒＲＮＡ−次構造は同時代の生物体間の側方伝搬を受けるであろう例えば、プラスミド−運搬遺伝子またはその産生物の場合にありがちな遺伝子−特異的標的というよりも生物体−特異的分子標的を提供している。

上記ｒＲＮＡ検出の固有の利点を提供するのに加え、本発明は相当な数のＵと艶ネｊ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）において十分に類似して−いるため１つまたは２．３のプローブがそれらの並土至主フーＣ旦ハ庶ル１１０−　中の標的領域にハイブリダイズでき、はとんどまたはすべての非土上玉主立（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ）　ｒＲＮＡにおいては十分に相違しているため、プローブ（類）が車上天主ｉ　＜Ｓａｌ論ｏｎ−ｅｌｌａ）　ｒＲＮＡにハイブリダイズするいくつかの条件下、はとんど非−１１ヨＬ木々−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　ｒＲＮＡとはハイブリダイズできないか、非常に弱くしかハイブリダイズできない並上天生立（Ｓａｌｇｍ−ｏｎｅｌｌａ）　ｒＲＮＡ標的配列へのプローブを提供する。これらのプローブ特性は各々包含性および排他性として定義される。

以下に詳細に記載するごとく、すべての土上天主孟（Ｓａｌｍｏｎ−ｅｌｌａ）にハイブリダイズし、非皇ＪｊＬ札ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌にはハイブリダイズしないプローブ（またはプローブの組）と単純に規定するより実際の状況はより複雑である。ある種の興味ある有用な７　（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ）の部分集合に特異的にハイブリダイズする多数のプローブが記載されている：個々にはより低い排外性の性質を示すにもかかわらず適当な検定系に組合わせると全体で望まれる作業特性を示すプローブの組の有益な成分である他のプローブが記載される。以下に記載する新規の検定構成の１つにおいて（二重−特異性、捕捉／検定オリゴ）、各々のプローブの１００％排他性への理想的要求は、もし組となった個々のプローブが望ましくない交差ハイブリダイゼーションの非−重複パターンを持つならば、プローブの組の全体の排他的挙動を犠牲にすることなく和らげられるであろう。

さらに、本発明のプローブは通常の検定条件下プローブが近づく′ことができるようにされた標的領域ヘハイブリダイズする。

本発明の他の特色および利点は以下のその好適な態様の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。

い　　　の− 最初に図を簡単に説明した後、本発明の好適な態様を説明する。

皿図１は大腸菌２３Ｓ　ｒＲＮＡの図式的表示である。

図２は大腸菌１６５　ｒＲＮＡの図式的表示である。

図３は図１の〜１４０５　１５９７ｆＩ域のヌクレオチド配列であり、ある種の関連する菌株の配列およびその領域の一部に対応するプローブを含んでいる０図３−１：この標的領域を通るＳ、チフ土ム丈立Ａ（ｔ■紅艶社腓）　２３　Ｓ　ｒ　ＲＮ　Ａの二次構造０図３−２：この領域に対するヱ上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プローブが２つの一部。

上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）２３Ｓ　ｒＲＮＡ中のその標的配列の下に並べて示されており、この領域を通して観察されたかぎりでは２つの異なった配列パターンがあることを示している。ビーナツツ（ＥａｇｇｌＰＢ）からの対応する領域も示しである０位置番号は大腸菌番号系に対応している。大腸菌と異った位置のみが示しである。使用されている記号は＝（・）は−列整列において他の配列に関して欠失、（−）大腸菌に現われるものと同一のヌクレオチド、小文字 “ａ”または“ｇ”は非相補的塩基を示し、小文字“Ｃ”はビオチン標識を受けることができるシトシン類似体を示し、小文字“ｔ”は後からの“Ｃ″の付加を可能にするための“Ｃ”から５′に位置するチミンを示している。

図４は図１の〜１７００−１７６０Ｓｉ域のヌクレオチド配列で、ある種の関連する菌株の配列およびその領域の一部に対応するプローブが含まれている０図４ −１：この標的領域を通る大腸菌２３ＳｒＲＮＡの二次構造。Ｓ、ア１ゾ　ａｒｉｚｏｎａ）および鉦±２王人１立１−　　Ｂｎ旦ｍｕｒｉｕｍ）　（丸で囲んだ）配列の相違が示されている。

図４−２：この領域に対するｊソトｊ」（旦−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プローブが３つの一４ｊｌｂ％ネ４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）２３Ｓ　ｒＲＮＡ中のその標的配列の下に並べて示されており、この領域を通して観察されたかぎりでは３つの配列パターンがあることを示している０位置番号および記号は図３と同一である。

図５は、図２の〜４３０−５１０ｆｄ域のヌクレオチド配列であり、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株の配列を含む図５−１：この標的領域を通る大腸菌１６ＳｒＲＮＡの二次構造。３−±ユｊ±立社赳匣）およびＳ、チ　　ム！ウム　ｎ■肚虹社岨）（丸で囲んだ）配列間の相違が示されている０図５− ２：この領域に対する二上天迷旦（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）プローブが４つの２３Ｓで観察されたかぎり４つの配列パターンがあることを示している０位置番号および記号は図３のとうりである。

図６は図２の〜９９１−１０４５６！域のヌクレオチド配列を示しており、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株の配列を含んでいる１図６−１：この標的領域を通る大腸菌１６ＳｒＲＮＡの二次構造。図６−２：この領域に対する世」と影主ｊ−（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）プローブがその標的配列の下に並べて示されている。大腸菌位置番号が使用されている。

図７は図１の〜５１２−５８０ｆＩＩ域のヌクレオチド配列であり、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株の配列を含んでいる。図７−１＝この標的領域の位置を通る大腸菌２３Ｓ　ｒＲＮＡの二次構造。図７−２：この領域に対する世Ｊぞ艷ネラー（ＳａｌＩｌｏｎｅｌｌａ）プローブがその標的配列の下に並べて示されている。番号付けおよび記号は図３のとうりである。

図８は１６Ｓおよび／または２３Ｓ　ｒＲＮＡ標的分子の捕捉および検出に利用されるであろう種々の型の二重プローブ戦略を例示している。２つのｉ夾至主立（Ｓａｌｓｇｏｎｅｌｌａ）−特異的（ＡおよびＢ）および１つの非特異的（Ｇ＝一般的）プローブが示されている。ライン１および７は二重特異的構成の２つの最も単純な例である。

図９は二重（特異的／一般的）かまたは二重特異的捕捉／検出プローブ構成を用いる種々の異った可能な結果を例示している。図８を参照すると戦略１はライン２または８に対応している。戦略２は要求される包含性を達成するため、“組” へ多丈７１／−Ｔ−主ｉ　（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）−特異性捕捉プローブを加える考えに図１Ｏは代表的なドットブロットハイプリダイゼーシッンの結果を表にしたものでここに記載されているある種のプローブの排他的挙動を示している。

１旦二ヱ区主監監本発明のプローブの開発の最初の工程は並上天生立（Ｓａｔ園ｏｎ−ｅｌｌａ） −特異性核酸プローブのための標識部位として働くことができる１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡの領域を同定することである。実際的には、前もってどの非−７（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）微生物が試験試料に存在しているであろうかを予測するのは困難である。

多数のそのような潜在的な非−並／ｌｚ％主４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ）　ｉｉｉ菌が与えられたプローブ配列に排他性を示すことは非常に困難であり、労力の無駄である。しかしながら、研究および開発の最初の段階の間にプローブを用いて最終的にスクリーニングされるすべての試験試料中にどの非土止至主１（Ｓａｌ−Ｏｎｅｌｌａ）菌が存在するであろうかを知る必要性を除去できる厳しい基準が適応できる。これには−孟ＡヨＬ主々−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）間およびサルモ１　（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）と他の群の細菌間の系統発生的関係の知識が伴われる。特に、並土至主旦（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）　ｒＲＮＡ中の特定の標的領域が土土至主４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の代表的な進化的に近縁の種のｒＲＮＡ中の相同的領域と十分に異っており、並上玉生立（Ｓａｌｅ卯且■鱒−および近縁種が世ＪダＬ主シー（Ｓａｌ■ｏｎｅｌｌａ）配列に特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションにより区別できることを決定することにより排他的基準が満足されるであろうという作業仮説を採用する。一般的規則として、系統発生（その実際の同一性は必ず知られていなくとも）前述のサルモｉ　（Ｓａｌａｏｎｅｌｌａ）の進化的近縁種より配列の特定の領域で少なくとも異っているごとく予想できる。

この原理はかなり大きな進化的距離にわたって（例えば同量のレベルで）充分に示されてきたが、ここで調べているような近い距離ではいまだ示されていない、事実、平均としてはこの原理は並五至主ｊ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）および近縁種に対し非常に良好に保たれていることが観察されたが、時々標的領域中の無作為な配列変異の例が観察され、原理は予言できずに破られた。

そに故、代表的な並上天生立（Ｓａｌ■ｏｎｅｌｌａ）および非−サルモ主立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の多数の名簿に対するプローブの実験的試験をプローブ作業の最終基準に残さねばならなかった。

ｉ火ｉ朱ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｒＲＮＡの領域を同定する最初の工程が核酸ハイブリダイゼーシ町ンブローブのための標的部位として有用にちがいないので、ツノトｊｊ１ラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の２つの種、Ｓ、チフ　ム！ウム　豆荘肚虹社聾）および針ヱ１ｊ±−ＱＬはｙ徂）からの１６３および２３Ｓの両方のほとんど完全なヌクレオチド配列を決定した。これらは２つの主たる４ｌ−ＪＬｔ工主旦５ａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ　　ＤＮＡ相同群の代表として選択され、それ故それらは二五玉主ｉ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の進化の幅の代表である（６つのそのような群が全体で定義されている。しかし、４つは“不定型のχｉ火ｉ木１（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）の小さなコレクシシンからなっていた）　、　ｒＲＮＡの種々の部分のヌクレオチド配列はクローニング（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２、モレキエラークローニング；実験手引）およびｒＲＮＡを特定している遺伝子の配列決定（Ｍａｘａ−およびＧｆｌｂｅｒｔ、　１９７７、プロシーディング　オプ　ザ　ナショナルル　アカデミ−オブ　サイエンスＵＳＡ　７４：５６０−５６４、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンスＵＳＡ　７４：５４６３− ５４６７）、および／または逆転写酵素を用いるｒＲＮＡ自身の直接配列決定（Ｌａｎｅら、１９８５、プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ− オブサイエンス［ＩＳＡ　８２：　６９５５−６９５９）などによる標準的実験室プロトコールにより決定した。誘導されたヌクレオチド配列は互いにまた他の入手可能なｒＲＮＡヌクレオチド配列、特に腸内細菌である大腸菌に密接に関連した配列と比較する。大腸菌ｒＲＮＡ配列に関して潜在的に有用な排他特性を示す多数の配列の領域が発見された（すなわち、ｆ）Ｌｉ至主ｉ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異性配列を含む）、これらは以下に記載される。

上で議論したごとく、この予備的分析は可能性を示しただけである。上に議論した望まれる特性、即ち：１）はとんどまたはすべての密接に相関する微生物に対する充分な排外性、２）丈灰至生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に関する有用な包含性パターン、および３）実際に用いられるであろう種々の検定条件下における標的領域への到達可能性を厳密に示すには各々の核酸プローブの更なる実験的試験が必要とされる。非常に多数の微生物が試験プローブの排他性（現在約２２の属、約６９の種および２９の種として未分化の“バイオグループから成る、Ｆａｒｍｅｒら、１９８５、ジャーナル　オプ　クリニカル　マイクロバイオロジー２１：　４６−７６）および包含性（２０００の位の並上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種および血清型）特性の定義に潜在的に関連しているので我々は潜在的プローブの試験および精製に関してここに説明した相互活性戦略を適用した。

第一世代のプローブは並上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および非−サー上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の標的領域中に観察されたヌクレオチド配列変異を最大に利用するという原理に基づいて設計され的および排他的性質の予備的試験が実施された。ドツトプロット分析は多くの異った方法で実施できるが、しかし一般的に核酸または核酸の集団のフィルター（例えばニトロセルロース、ナイロンまたは他の誘導膜でそれらは市販されておりこの目的に有用である）上への固定化が含まれる。　ＲＮＡは容易にそのように固定され、任意の種々の核酸ハイブリダイゼーション条件下（すなわち、ストリンジエンシー）、問題とするヌクレオチド配列かどうか証明される０問題とする核酸を最初に精製する必要なく粗（未精製）ＩＩＩ胞溶菌物中に存在するＲＮＡもまたこの技術では利用可能である。この後者の方法は任意の特定の微生物の核酸中に存在するであろう特定のヌクレオチド配列のスクリーニングに必要とされる労力の量を著しく減少させ、多数の微生物の大量スクリーニングに乗り易い、°それ故、それが多数の微生物に対しての潜在的核酸ハイブリダイゼーシヨンプローブの排他性および包含性を試験するのに選択されるべき方法である。

潜在的に土止至生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−含有試料中に存在するであろう細菌の型を例示する非−並上至生立（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）腸内細菌のリストが表１に与えられている。これらは並上天生立７旦吐に最も密接に関連した多くの属も示している。先に議論したごとく、そのような広範囲の１０Ｌルｊし礼う −（Ｓａｌｍｏｎ−曲）近縁種の代表に対し良好な排他性特性を示すプローブは、実際に試験されたものよりも、より広い腸微生物のリストに対し同様に振まうと道理上予想される。

表−」− 可能性のあるプローブのスクリーニングに使用された非−土工ｉ主、４　（Ｓａｌ■ｏｎｅｌ　ｌａ）腸内細菌のリストの一部シニー′モ　ス　エルボ　　　（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ）ｉ土ｉ主４　（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）−特異性プローブが包含的であることが望まれる４）−７Ｌ／−Ｅネｊ−（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）菌を備えた類似のリストは表１にリストされた “排他的パネル”よりも非常に長いものであろう、　ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションのデータは土工ｉ主ｊ−（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）種および血清型に多くの馬肉グループ分けが存在していることを示唆しているが、多くの株、特に新しく記載された株はＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション分析にたよらなければこれらのグループ群の１つに確信をもって帰属できない。我々の土工ｉ主１（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）標準物コレクシランは現在約３４５株があり、すべての主たるおよび従たる病原的、生化学的および血清学的グループ群のみならず多数の分類学的に未同定の世／ｌ、＝％ネラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含んでいる。すべての可能性のある有用なプローブ（またはプローブの組）の包含的−挙動はこのコレクシランに関して特性付けられた。

プローブ設計の次の工程は望まれない（偽）陽性物および見逃された並五至生立（Ｓａｌｗｏｎｅｌ　ｌａ）　（偽陽性）の配列分析である。

各々のプローブの最初のドツトプロットから集められた包含性および排他性情報から時々試験プローブが非常に弱くかまたは少しもハイブリダイズしない４　（ＳａｌｓＩｏｎｅｌｌａ）株およびプローブがハイブリダイスする非−並四天主旦（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）株が同定される。得られるプローブの新しいバージランを無作為に改変および再試験するよりも、問題にする微生物の望ましくないハイブリダイゼーション挙動のもとになる関連するヌクレオチド配列が決定されるより情報に冨んだ方法が応用された。

この目的の為には、問題とするｒＲＮＡｅＩ域へ直接接近するように特異的に設計されている配列決定ブライマーを使用する逆転写酵素配列決定法（Ｌａｎｅら、１９８５　ＨＱｕら、１９８３、ヌクレイックアシッズ　リサーチＩＩ　：　５９０３−５９２０）が用いられた。

次の工程はプローブ幾何構造の洗練化および再試験である。

前記配列決定分析で集められた情報を使用し、標的領域に関して幾何構造が変えられた（例えば、標的領域内のわずかに異ったヌクレオチド配列と相補的な）、および／またはヌクレオチド配列が変えられた（しかし例えば同一の標的領域を標的とする）新しいプローブが設計され、合成された。これらは次に前記ドツトプロット法および／または以下に説明する溶液ハイブリダイゼーション検出により再試験する。プローブ配列および標的配列間の厳密な相補性はプローブ設計の最初の基準では必要とされない。より重要な点は満足できる包含性および排他性の性質である。

プローブ配列の至適設計特性に他の考察も影響を及ぼす。第１にはプローブそれ自身の幾何構造に対する考察である。１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡの可能性のある有用な標的領域はしばしばそれ自身で相補性を示す領域に位置していることが観察されている。

したがって、これらの領域に対するプローブも自己相補性を示すこともできる。

プローブおよび標的配列間の可能な相互作用は標的またはプローブ配列のそれ自身への分子内アニーリングを支配する相互作用と同じ型のものにより支配されているので、特に溶液ハイブリダイゼーション条件下、自己相補性プローブは分子内または分子間プローブ／プローブ相互作用により、それらの標的配列へのハイブリダイゼーションのための接近が不可能になる。それ故プローブ設計の１つの観点はそのような自己−相補性を最小にすることである。このことはｉｋｉ主ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ）−特異性配列の最大利用および受入れ可能なプローブ幾何構造間の妥協をしばしば必要とさせる。

プローブ設計におけるさらなる考察は包含性基準に関して生じてくる。好適なプローブは適当な排他的挙動を示す一方、すべての望まれる土」ソＬ木々−（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）菌のｒＲＮＡヘハイプハイブリダイズものであろう、げシニノｌユニ猛二≧も工上之−（Ｓａ　１曽ｏｎｅｌ　ｌａ）属それ自体かなりの表現型および遺伝型（以下に記載するようなｒＲＮＡ多様性を含む）°を示すので、そのような“理想的なプローブを設計（または発見）することは不可能である。実際的には、“普遍的な′″並土至主４　（Ｓｓｌｍｏｎｅｌｌａ）プローブを要求するより、土土孟生立（Ｓａｌ纏ｏｎｅｌｌａ）−特異性プローブ組（各々は適当な排他性およびいくつかの包含性の有用な水準を示す）が考えられた。

集合体として、プローブの組はほとんどまたはすべての−１ＡＣＬ主ラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を検出するであろうし、非ｉ火至生立（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）はほとんどまたはまったく検出しないであろう、そのような組においては、例えば１つのプローブは１つまたはわずかの重要な土土至主立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を除いて検出でき、別のプローブは第１のプローブにより見逃されたわずかな並土至生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株のみに良好な排他性でハイブリダイズするであろう、それ故、以下に記載するプローブは包含性特性に関しての個々の基準で特徴付けられているが、上に詳述した特異的プローブの“組”の概念は個々のプローブの重要性の決定の際考慮されなければならないことをいつも頭の中に入れておかねばならない。

この組の概念は個々のプローブの排他的挙動の評価にも拡張される０例えば、以下に説明する二重−特異的捕捉／検出型においては、有用なプローブまたはプローブの組による非一旦至主ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌への望ましくないハイブリダイゼーションはプローブの組の組成および用いられる検定法を操作することにより減少または除くことができる。

属−レベルの並上天生立（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）−特異性プローブの“組”の概念の結果は、特定の検定条件下、個々のプローブの挙動が組内の他のプローブの“挙動”と一致しているという必要性を個々のプローブの設計のある種の様相が反映しているであろうという事である。

プローブが溶液ハイブリダイゼーション型で使用される場合プローブ設計に対してさらなる束縛が生じる０種々の応用のなかで、溶液ハイブリダイゼーション型は検定設計の好適な選択にちがいない、溶液ハイブリダイゼーション検定の潜在的利点としては：ａ）固相ハイブリダイゼーション（例えば前に概説したドツトプロット分析）に比べてハイブリダイゼーションの動力学的性質が促進され、ｂ）検定（検出）システムのバックグラウンド減少特性が潜在的に促進され、およびＣ）検定システム試験の末端使用者への“親切”が増す。

溶液ハイブリダイゼーション検定は種々の幾何構造のプローブへ標的領域が到達し易くする。溶液ハイブリダイゼーションにおいてはプローブ／標的領域の相互作用の強さは、プローブ長、標的領域への相補性の程度、自己相補性、プローブ内の標的−配列一相補性の位置決定、新規（例えば誘導体化された）ヌクレオチドの取り入れ、プローブおよび標的配列間の種々の非標準塩基対の取り入れ（例えばグアノシン−ウリジン、アデノシン−グアノシンまたはイノシン−シトシン塩基対）などのごときパラメーターを変化させることによりある程度制御することができる。

特定のプローブ／標的相互作用の強さは検定条件によっても影響できる０例えば前述の検定パラメータに加え、ｒＲＮＡ標的の選択的脱タンパク質、ｒＲＮＡ標的の選択的リボヌクレアーゼ処理、標的／標的相互作用を緩和しおよび／またはプローブ／標的相互作用を促進する第２一部位（皇上天主４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異的である必要はない）プローブの選択的使用、および二重−プローブ捕捉／検出戦略（以下を参照のこと）における第２一部位プローブの選択的使用すべてが検定結果を改善できる。

実際的には、液体パイプリダイゼーション条件下プローブ挙動の分析はここで説明の明瞭さのために示されたごとく、必ずしも分離工程で行われるわけでないが、プローブ開発の方法の間に完全な様式でなされる。

プローブ設計および分析の最終工程は実際の試料（例えば食品／臨床試験物）の試験である。

本発明のプローブは種々の型で使用でき、そのいくつかを以下に議論する。

五迷豊ｌ型１、ある実施１１様においては、低濃度の塩基（例えばＮａ０Ｈ）で処理することにより細菌を溶菌する。

２、溶菌後、溶液はビオチニル化プローブまたはプローブ類を含む緩衝液により約ｐ）１７に中和され、必要なら、０．６モル濃度までナトリウムまたはカリウム塩が添加される。ある実施態様では、中和、塩添加およびプローブ添加がリン酸ナトリウムおよびプローブの濃縮溶液により同時に実施される。

３、放置によりハイブリダイゼーションが起きる。

４、ある実施態様においては、試料は次にプローブ（１りの非−特異的ハイブリダイゼーションによるプローブ／標的複合体を分解させるために、高温にて高濃度のりポヌクレアーゼおよび界面活性剤で処理される。

５、標的−プローブ複合体を含む溶液はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに対して方向付けられた精製抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を含む表面と接触させる。この表面はプラスチックチューブ；マイクロタイタープレートウェル、計量棒、磁気ビーズまたはポリスチレンマイクロまたはマクロビーズの内側または外側にある。標的−プローブ複合体は放置して抗体に結合させ、ハイブリダイズしていないプローブおよび非土土亙ｉｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）標的を室温で緩衝化溶液を用いて洗い流す。

６、ストレプトアビジン−酵素複合体が添加され、インキュベーシッン後過剰の複合体は洗浄して除去する。

７、次に酵素に対する発色物質をプラスチック表面に添加すると溶液に生成物が形成される。

８、チューブ内で発色した色は特異的標的に捕捉された量の関数であり、分光光度計またはＥＬＩＳＡプレート読みとり器を用いて定量する。

ス　レブ　アビジン１、ある実施態様においては、細菌が溶菌され、中和後、前記のごと（ビオチニル化プローブまたはプローブの組でハイブリダイズされる。もしくは、微生物細胞壁が酵素処理により弱くされ、カオトロピック塩（゛例えばグアニジウム　チオシアナート）およびプローブまたはプローブ類の添加により溶菌される。

２、ある実施態様においてはハイブリダイゼーション後、プローブ（類）の非特異的ハイブリダイゼーションによるプローブ／標的複合体を分解するため、高温にて高濃度のりボヌクレアーゼおよび界面活性剤で試料を処理する。

３、ｉＩ的−プローブ複合体を含む溶液はここで結合ストレプトアビジン含有の表面と接触させる。抗体捕捉法におけるごとく、この表面は種々の構造でありえる。標的−プローブ複合体および遊離プローブがビオチン−アビジン架橋を通して表面に結合され、ハイブリダイズされていない核酸は一連の洗浄により除去される。

４、結合標的−プローブ複合体（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）は過剰の表面結合遊離プローブから、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに対して向かう特定の抗体を（ポリクローナルまたはモノクローナル）添加することにより区別される。ある実施態様においては、この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのごとき酵素に直接複合されている。

５、もし抗体酵素複合体がＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドとの結合に使用されたら、次に基質が加えられ、結合酵素−ブローブー標的複合体は前述のごとく着色生成物の発生により検出される。

非複合筒１吹抗体は第１の抗体に対して特異的な第２の抗体−酵素複合体（例えば、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体がモノクローナルに対し）を添加し、続いて基質を添加し、着色生成物を発生させることにより検出される。

ホモボｉマー　　−単一ブ旦二１杢１゜細菌は前述の２つの溶菌法のどちらかで溶菌される。

２．３′末端に酵素的に２Ｏ−２００ｄＡ残基の尾を付けたプローブまたはプローブ類でハイブリダイゼーションを実施する。

３、ある実施、態様においては高濃度のＲＮＡａｓｅおよび界面活性剤を添加し、非特異的にハイブリダイズした標的■＾を消化させる。

４、標的−プローブ複合体を含む溶液は１５−３０００ヌクレオチドの長さの結合ｄＴホモポリマーを含む表面と訂およびプローブのｄＡ“尾”間のハイブリダイゼーションが起こるであろう条件下接触させ、それにより残存する遊離プローブのみでなく標的−プローブ複合体も捕捉する。

５、ハイブリダイズしなかった核酸および細胞被片を洗い流し、ｄＡ−ｄＴホモポリマーを通して結合している捕捉されたＤＮＡ／ＲＮＡ複合体を残す。

６、結合標的−プローブ複合体（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに向かう特定の抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）の添加により表面結合の過剰の遊離プローブから区別する。ある実施態様においては、この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのごとき酵素へ直接複合されている。

７、もし抗体酵素複合体がＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドへの結合に使用されたら、次に基質を添加し、結合酵素−ブローブー標的複合体は着色生成物の発生により検出された。非複合第１の抗体は第１の抗体に対して特異的な第２の抗体−酵素複合体（例えばモノクローナルに対するヤギ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体）を添加し、基質を添加し、着色生成物を発生させて検出できる。

ホモボ１マー　　−ニ　　ロー１、細菌は、前述の２つの溶菌法のいずれかで溶菌する。

２、ハイブリダイゼーションは２つの異ったプローブで実施し、少くともそのうちの１つは（両方である必要はない）良好に土工至主立（Ｓａ１ｍｏｎｅ！Ｉａ）標的分子とアニールしなければならない、捕捉プローブまたはプローブ類は３ ′末端に酵素的に２０たはポリマーＤＮＡまたはＲＮＡ）は化学的または酵素的にビオチンで標識する。

３、標的−プローブ複合体を含む溶液は１５−３０００ヌクレオチド長の結合ｄＴホモポリマーを含む表面と、ｄＴおよびプローブのｄＡ“尾”間でハイブリダイゼーションが起こるであろう条件下接触させ、それにより残存する遊離捕捉プローブのみでなく標的−プローブ複合体も捕捉する。

４、ハイブリダイズされなかった核酸および細胞破片は洗い流し、ｄＡ　−ｄＴホモポリマーを経て結合された捕捉［ＩＮＡ／ＲＮＡ複合体を残す。

５、結合されたビオチニル化レポータープローブは、前記抗体捕捉型で記載されたごとく、ストレプトアビジン−酵素複合体を添加し、インキエベーションして特異的結合をおこさせ、非結合複合体を洗浄して除去し、基質を添加し、続いての発色により検出する。

一特異性および非特異性プローブが用いられるかに依存して、すぐ前に記載した二重プローブ型の異ったバージョンから異った結果が導かれるであろう、いくつかの可能な変異体が図８に例示してあり、１６５および２３Ｓ　ｒＲＮＡの両方が（個々にまたは一緒に）二重プローブ（特異的捕捉／−−的検出）または二重特異的（捕捉／検出）戦略にかけることができることが強調されている０例示された組合せの基本的相違は捕捉／検出プローブの特異的／−一般的たは特異的／特異的な組合せの別個の使用法から導かれる。最も簡単な場合の考察が例示されている。例えば図８のライン１および２を比較せよ。ライン１は特異的／特異的二重プローブ検出スキームを例示しニライン２は特異的／一般般的二重ブローススキーム例示している。

これらの異った戦略を用いたい（っかの可能な仮定の結果が図９に示しである。

例示の結果は仮定のエルｉ生立（Ｓａｌ−０ｎｅｌ　ｌａ）プローブＡおよびＢに対しハイブリダイゼーション陽性および陰性がほとんど無作為に分布するのを反映するように任意に選択しである。実際にはここに記載された多くのｙＪ行Ｌしｊ一旦紅鯨咥且紅一特異性プローブに対する適切な分布は無作為からはかけ離れている。プローブＧは通常検定条件下任意の１６３または２３Ｓ　ｒＲＮＡ標的分子にハイブリダイズするであろう（一般的プローブの特異性に依存して；すなわち１６５のためまたは２３Ｓのため）非特異的（すなわちＧ−一般的）検出プローブを例示している。

結果１は単一の特異的（捕捉）プローブ（Ａ）および一般的検出プローブ（Ｇ）も用いることに基づいている。本質において、結果はプローブへの包含的および非他的性質により規定される。

プローブＧはプローブＡが捕捉したすべてのものを検出する。

結果２は戦略１の拡張であり、特異的捕捉プローブＡおよびＢに付随する包含的および排他的性質の加成性に基づいている。

２の場合には包含性が１より改良されているが排他性は悪（なっていることに注目されたい。

戦略３（二重特異性オリゴ型）の結果は概念的に戦略１または２の結果と異っている。プローブＡおよびＢに付随する包含的および排他的組を加えるというより、ＡおよびＢの両方にハイブリダイズする微生物のみが二重特異的オリゴ型では陽性として含まれている０例えば、微生物Ｎ７の標的分子はプローブＡで捕捉されるがプローブＢでは検出できない。反対に、微生物Ｎ８の標的分子はプローブＢで検出できるのであろうがＡにより捕捉されないので検出するために利用できない。

戦略３は、最初の２つよりも理論的に有用ではないように思われ、なぜなら包含性および排他性のプロフィールは等しくおよび１交互の使用”を相殺しているようである。しかしながら、種々の腸内細菌（−テノに孟ｊ紅う−（Ｓａｌ鍾ｏｎｅ１２ａ）を含む）の１６５および２３Ｓ　ｒＲＮＡ中のヌクレオチド配列のパターンについての我々の観察および異なった標的部に種々の特異性を持つプローブの観察されたハイブリダイゼーシヲンパターンに基づくと：１）異なった潜在的工土ｉ主之（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異的標的領域は土」トＬ主ｊ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）間のみではなく支」ソ艷主う一旦紅虹組旦ａおよび種々の非土」ヨＬ冬う−Ｃ３ａ１ｔａｏｎｅ１１ａ）面間の配列変異の明らかに異なり、しかもランダムではないパターンを示すこと、２）　　！ＰＨ：、：／　　！：！　／＜　　　　　（Ｃｉ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒおよび１詠２Ｌ田べ文叉二　旦旦肛並匹旦拉属に属する細菌（他の腸内属は除く）は種々のさもなくば事実上の土及天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異性プローブへのハイブリダイゼーションに関して最も６間！！”であること、および３）既知の情報に基づくと（系統発生的および／または生化学的特性の情報を含む）、配列変異の観察されたパターンは完全に予測できないことが結論された。

プローブ前述のプローブ選択戦略により、試料中の並四天生立（Ｓａ１ｍｏｎ旦■鱒−菌を同定するのに有用な多くのプローブが得られた。プローブ選択法の最初の工程はＬ」ヒＷ立Ｌ　　豆ｕ紅−ｍｕｒｉｕｍ）および５巳、二どヨｌと二ｆ　（７ −の１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡのヌクレオチド配列分析を実施することである。これらのサルモ主１（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）配列と非工止至主主（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）ｒＲＮＡ配列（特に大腸菌）の比較により排他性基準を満足する配列が同定された、即ち、それらは本質的（ｉ火ｉ主旦（Ｓａｌｍｏｎｅｌｉａ）特異的であり、それ故それらはプローブが方向付けられる潜在的標的領域である。

この分析により有用なまたは潜在的にを用な−ｇ旦ａＪｍｏｎｅ旦吐特異的配列を含むｒＲＮＡの５つの領域を得た（３つは２３Ｓ中であり２つは１６Ｓ中である）、これらの領域の位置は、大腸菌ｒＲＮＡ中の構造および進化的相同体の位置に関連して図１（２３Ｓ　ｒＲＮＡ）および図２　（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）で円で囲んだ領域で示されている。相同的ｒＲＮＡは微生物から微生物でその大きさがいく分異っているため、および、すべての場合で並土至生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｉａ）ｒＲＮへの正確な５′ヌクレオチド（慣例により位置番号１と名付けられる）が証明されていないので、通常行われているごとき大腸菌番号付はシステムを使用すると細菌ｒＲＮＡ配列の領域の呼称のあいまいさが最小となる。

図１および２を参照すると決定的％　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異性配列は：１）領域　〜１４０５−１５９７　；　２３Ｓ　ｒＲＮＡ　；２）領域　〜１７００　１７６０　；　２３Ｓ　ｒＲＮＡ　；３）　　８１域　〜４３０　５１０　；　１６５　ｒＲＮＡである。

さらに図１および２を参照すると可能な世」ヨＬネラー（Ｓａｌｗｏｎ−ｅｌｌａ）−特異性配列は：１）ｓ１域　〜９９７　１０４５　；　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　；２）領域　〜５１２−５８０　ｉ　２３Ｓ　ｒＲＮＡである。

これらのサル％ｉ立（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）−特異的領域および関連するプローブについて以下に詳細に説明する。これらの領域へのプローブを用いる液体ハイブリダイゼーション検定はカオトロピックおよび非カオトロピック条件下、これらの領域中の標的配列の良好な到達可能性を示す。一般に、良好な感度もまた達成された０図中に示したすべてのプローブは議論されないが各々のプローブは本発明に有用であった。さらに、上に議論されたガイドラインを用いて他のプローブも容易に構築されるであろう、これらの実施例は本発明を制限するものではな０゜１）　２　Ｓ　ｒＲＮＡ　”　　１０−１９７　　この領域は図３に示されている。その２３Ｓ　ｒＲＮ＾配列がこの領域を通って調べられたかぎりのｆ）Ｌｙ至主立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株では、１つの構造パターンが観察いて観察されるものと同一であり、それ故定義により並土ｉ主ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異的配列ではない、それにもかかわらず、この配列パターンに相補的なプローブはある種の世Ｊソ艷主ｊ一旦虹ｇｏｎｅ旦ａＪ−ｒ　ＲＮ　Ａと有用で重要な様式で７１イブリダイズする（以下参照）。他のもの（パターン２と称される）はＳ、＋７土人見立人（ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕｍ−株ｅ２３５６６の２３Ｓ　ｒＲＮＡ中に存在すると元々決定されていたものと同一である（図３に示されている）。

パターン２は、この領域を通して大腸菌（パターン１）配列に関して示されたヌクレオチド配列相違に加えて２つのヌクレオチド挿入物を含んでおり、パターン１含有ｒＲＮＡと比較して異った二次構造を採っていることが予想できる。

図３を参照すると、”４１４”と称される合成プローブは鉦至７　１−”）ｌ− （ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕｗ　　２３Ｓ　１４０５　１５９７１１域（図３にまた示しである）の部分と相補的配列を持っている。プローブ４１４は戊」ヨシ（ｉ（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）および非ｆ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を用いるドツトプロット分析において良好な排他的特性を示すことが示されている、即ち、それがパターン２含有ｒＲＮＡにハイブリダイズする条件下、大腸菌または表１にリストした腸内細菌種の代表的株外の６４のほとんどのｒＲＮＡへはハイブリダイズしない、広範囲なドントブロットハイブリダイゼーシ四ン試験によりプローブ４１４が検定または検定に近い条件下ハイブリダイズするであろう若干の− ２」」シコク」−二（Ｃｉｔυ１ｂａｃ　を旦ｄ　およびエン−ロバ　　−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）が明らかにされた。（排他的データは図１０に提供されている）プローブ４１４の包含性特性もまた有用であるのが観察されている；プローブは試験された並及孟生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株の９１％（３１１／３４３）のｒＲＮ＾ヘハイブリダイズしたが、ドットプロットハイプリダイゼーシッン検定においては試験された鉦ヱ１ｊ±釦社組並）株の６６％（２７／４１）　Ｌか検出されず；９４％（２８５／３０３）の非！乙１　（７株がプローブ４１４により検出された。

プローブ４１４（またはその誘導体）が結局利用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合わせる”ためにプローブ４１４の変異体が設計された。それらのいくつかは図３に示しである。

図３を参照すると７９１″と称される合成プローブはＬヱユｊ去（肛江坦吐（および大腸菌）　２３Ｓ　１４０５−１５９７領域（図３に示されている）の部分と相補的な配列を持っている。プローブ７９１は前に使用された同一の７　（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）および非世」とＬ主４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を用いる（また本研究を通して使用される）、ドツトプロット分析において、プローブ４１４により示された包含的特性と相補的な包含的特性を示した。即ち、２つのプローブを合わせると我々の試験パネル中に含まれるすべての並土至生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株のｒｌ？Ｎ＾とハイブリダイズ（検出）した（即ち、 −テＪヨ１ネラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対し１００％の包含性であり、最近記載された新しいサルモネラ群一群■に属する多数の１上天主立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含む）。プローブ７９１のハイブリダイゼーションプロフィールは厳密にはプローブ４１４のものと相補的ではない；プローブ４１４がハイブリダイズしなかったエル元主↓（Ｓａ　Ｉ■ｏｎｅｌ　ｉａ）株にハイブリダイズする（期待されたごとく）一方、プローブ４１４がハイブリダイズするものと同一の多くの菌株ともきわめて強くハイブリダイズした。

このことはこれらの菌株のｒＲＮＡ集団に潜在的な配列不均一性の証拠となるであろう−これまで観測されていない何か、プローブ７９１の貧しい排他特性の為、前述のおよび以下により詳細に記載される二重特異的捕捉／検出戦略を除いて前記のほとんどの検出型での使用は除外される。

プローブ７９１（またはその誘導体）が最終的に使用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合わせる”ためにプローブ７９１の変異体が設計できる。それらのいくつかは図３に示されている。

プローブ４１４および７９１は前述のごとき種々の溶液ハイブリダイゼーション検定型下その標的領域への到達可能を示すために試験された。これらの試験は各々の場合において標的領域はプローブに到達可能であることを示した。

２）　　Ｓ　ｒＲＮＡ６７００−７６　　この領域は図４に示されており、ヌクレオチド１７１２および１７４６の間に濃縮されている″旦ｉ生立（Ｓａ１蒙ｏｎｅ１１ａ）特異的”配列から成っている。

２つの主たる並止至主立（Ｓａｌ−ｏｎｅｌｌａ）特異的配列パターンはこの領域に観察されている。パターン１はＳ、　フ　ム！ウムーΩｍ諌ｕｒｉｕｓ）株ｅ２３５６６から誘導された配列により定義される。

的な′″４１１”と称されるプローブが構築されている。プローブ４１１はドツトプロット（包含性および排他性）および溶液ハイブリダイゼーション（到達性）試験にかけられ、そのすべてがプローブ、その誘導体、変異体および断片の有用性を示している。

ドツトプロット分析において４１１プローブは非常に多数の並土ｉ冬ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株（３１７／３２３−９２％）のｒＲＮＡとハイブリダイズした。これらと同一の条件下４１１プローブは前述のヌクレオチド配列分析から予測されるごとく、試験された多数のＬ１コｙｖ九（ａｒｔｚｏｎａ）株ち二］！ＬＬ九（７株の２２で“失敗した″）のｒＲＮＡとはハイブリダイズしなかった。残りの“失敗”はほとんどＤＮＡＮＡ相同性群馬する“非定型″ヱ及ｉ主ｉ℃ ℃力吠ユＩユ心−の混合物である。

プローブ４１１の排他特性もまたドツトプロット分析により試験された。非支１トｊ匹礼ラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌へのハイブリダイゼーションは若干のら１」ヒ←乙区　ＭＤ狙回上σおよびＬノ〕−エユ土ス（ｄｉｖｅｒｓｕｓ）株に限定されている事が観測され、プローブ４１１の変異体は非常に弱くしかハイブリダイズしなかった（図１０）。

プローブ４４１（またはその誘導体）が最終的に使用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性に“つり合わせる”ためにプローブ４４１の変異体が設計された。それらのいくつかは図３に示されている。

１７００−１７６０ｅＩ域中に観察される第２の配列パターン（パターン２）はＬ］ヲＬＡサー（訂１罎狙搬−株ＲＦ　９０８から由来する配列から定義される（図４）、それはパターン１配列から十分に異っているのでＲＦ　９０８はプローブ４１１により検出されない。

図４を参照すると”　６９０　”、”７９９”および”　８００″と称される合成プローブはムヱユｊ±（肛ｎ匹紅ＲＦ　９０８２３Ｓ　１７００−１７６０　ｆｉＩ域（図」に同様に示しである）の種々の部分と相補的な配列を持っている。前記のプローブ７９１の場合と類似の方法において、すべてがこの標的領域に対するプローブ４１１の包含性プロフィールを補う、即ち、プローブ４１１にプローブ６９０．７９９、または８００の任意の１つを加えると一緒に合わせて、我々の標準コレクション中のすべての並／ｌｚ％主ｉ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対し１００％の包含的である。３つのパターン２−特異的プローブはその排他的挙動において幾分異っており、プローブ８００が（わずかな差で）現在最良の排他プロフィールを示している。これらの種々のプローブを組合せた合計の排他プロフィールは図９に見ることができる０種々のＬヱ旦４７”；　（ｆｒｅｕｎｄｉｉ）およびＬノロ堕ｔｓ、？−ニサノヨ（ｄｉｖｅｒｓｕｓ）株への交差ハイブリダイゼーションは明らかである。いくつかの−隻ＪとＬネ４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）診断検定には、罪悪上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）交差ハイブリダイゼーションのこのパターンは受は入れられるであろう。なぜなら例えば、これらの特定の非世」ｃ１主ｊ−（ＳａｌｍｌＯｎｅｌｌａ）菌は特定の適用においては通常遭遇しない：または本試験の速度、感度；価格効率および／または包含性のため得られたいくつかの陽性物を経済的にも容易に再試験できる。

プローブ４１１（またはその誘導体）が最終的に使用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性“つり合わせる”ためにこれらのパターン２特異性プローブの変異体が設計できる。特に、上述の２つのプローブ組は二重特異性オリゴ捕捉／検出検定型（これも上述されている）に乗りやすい。図１０を参照すると、例えばプローブ４１１にプローブ８００を加えてオリゴアデノシン−尾標的−捕捉ブローブとして、およびプローブ４１４にプローブ７９１を加えて例えばビオチニル化検定プローブとして使用し、この二重特異性型において、集合的にすべてへｉ火ｉ主立ｌｐ山す且１ユＯ−菌を検出しく１００％包含性）、はとんど非号ノ１１オニ４　（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）菌を検出しないプローブ組”が創り出される。（逆もまた働くであろう、即ち、４１４プラス７９１捕捉および４１１プラス８００検出、しかし、プローブ７９１のわずかに広範囲な交差ハイブリダイゼーションのため捕捉効率が多分少し悪くなるであろう、）アル種ノζｌエバユニＸ　（ｄｉｖｅｒｓｕｓ）株への低レベルでのハイブリダイゼーションが予測される。しかし、捕捉および検出プローブ組の両方がち３６ ±！忙二’ｊ　Ｚ　（ｄｉｖｅｒｓｕｓ）にごく弱くしか各々ハイブリダイズしないので合計された捕捉／検出ブローフノチノシＬ笠二相Ｘ　（ｄｉｖｅｒｓｕｓ）へのハイブリダイゼーションのレベルは受は入れられるぐらい小さいであろう。Ｌ交互ユヱ旦（知り五組１ａａ＋畦により示される第３の土Ａヨ≦Ｌｉ　困社鯨−ｎｅｌ　１ａ）−特異性配列パターンもまた図４に示されている。プローブ８０２はこの第３のパターンに相補的である。

３）　　Ｉ　Ｓ　ｒＲＮＡ″４３０　５１　　　この領域は図５に示してあり、４５５−４７７の位置に濃縮された“土工ｉ主ｉ（鉦むｏｎｅｌ　ｌａ）特異性 ”配列からなる。この領域を通してその１６５　ｒＲＮＡ配列が得られている並上天主旦（ＳａＩｓｏｎｅｌｌａ）株には少くとも４つの異った烹ヱ至生立（Ｓａｌｌｌｏｎｅｌｌａ）−特異的構造パターンが観察されている（図５に示されている）、パターン１は最初Ｌｊ二乙工Ｊヨ工立人（ｕｆ住畦わｌ吐ｅ２３５６６からクローン化された１６ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列決定で発見された。このおよび他の、竺。

上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からの１６Ｓ　ｒＲＮＡ中のこの標的領域の続いての配列分析はパターン１は馬肉で広く表現されていることを示した。

図５を参照すると、“６４３　”、１６７６”、“７８８”、“８０６”および “８０７”と称される多数の合成プローブは１６５４３０　５１０８Ｎ域を含むパターンＩの種々の部分に相補的な配列を持っている。

これらのプローブのすべてが、異った効率で“典型的な”旦ｉｉｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の大部分と（３２９／全体は３４３）ハイブリダイズするが、′不定型の”群（群■、■および■）に対しては“むら”に振まい、なお我々のＬ］輩）ＪＪ−（引１遅１０−単離物の５／４３にはハイブリダイズしなかった。

排他的挙動に関しては、これらのパターン１プローブは之上切Ａ酊１搬−およびＬ」葺１黒ま−（腫（韮刀ｄリ−のあるものと交差ハイブリダイズするが全部ではない（図１０）、これらの微生物の１６５ｒＲＮＡからのこの領域の配列分析はこれらの種および“典型的“な−Ｌ７Ｌｚ％五ｊ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）間の進化的関係は現在一般的に認められているよりもより近いことを示している。

この標的領域中に発見された第２の車上天主ｊ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異的配列は影］！ＬＡ丈−−〇Ｌμμ巳）　（ＲＦ　９０８）の１６ＳｒＲＮＡ　（お−よび１６５　ｒＲＮＡ遺伝子）から由来している（パターン２）。

パターン２はヌクレオチド配列がパターン１とは十分に異っており、パターン１に対するプローブが受は入れられる排他的挙動を示すハイブリダイゼーション条件下（ストリンジエンシー）、それらはパターン２含有ｒＲＮＡにはハイブリダイズしない。

これまでこの標的領域パターンに特異的な１つのプローブが構成され（第６７８１０−ブおよび標的配列は図５に与えである）、試験された。それはある種の鉦ヱユｊ±（肛ｎ組吐株のみにしかハイブリダイズしない、プローブ６７８はムヱユヅ±（肛江匹吐株のその亜集団に非常に特異的であり、我々のコレクションの他のｆ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）または非ｆ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のどれともハイブリダイズしない。

この標的領域中に発見された第３の工Ｊソ艶ネラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）− 特異的配列（パターン３）は最初も」二ｃＸ立２−（式■匹吐の１６ＳｒＲＮＡで観察された。他の皇Ｊ」トＬｉ（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）の１６５ｒＲＮＡの続いての配列分析によりＳ、ボンガー（ｂｇＢ５Ｂ）および５−土え久ｉＺ立（わユ肛ジ可搬−のｒＲＮＡを含む多数の他の株中にこのパターンの存在が明らかにされた。パターン３は一次構造においてパターン１に非常に密接に関連しており、パターン１とただ１つの位置が異っている（図５参照）０通常用いられるノ１イブリダイゼーシツン、ストリンジエンシーにおし１て、（即ち、受は入れ可能な排他的挙動を提供するように実験的に決定される）この１つのヌクレオチドの相違はパターン１プローブ（例えば６７６）およびパターン３の標的配列（例えばＳ、ボンガー並並［σ）間の交差ハイブリダイゼーションを消滅させるわけではないが、有意に減少させる（約６倍）のに十分である。非常に高いハイブリダイゼーション　ストリンジエンシーまたはりボヌクレアーゼ処理工程を用いる型においてはこの不適合のレベルは容易に区別できる。

この標的領域中に発見された第４の孟止天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異的配パターン（パターン４）は我々のコレクションからの１つの４　（Ｓａｌ＋５ｏｎｅｌｌａ）種（ＣＤＣｓｔｋ、Ｎ５５１９２５として同定されている株）において観察された。このノ（ターンに特異的なプローブ（プローブ７８４２図５）のハイブリダイゼーションパターンから推定すると、それは土工天主ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）群Ｖの一員である。プローブ７８４はこの群の一員に全く特異的であり、我々のコレクションの他の土上天主旦（Ｓａｌｍｏｎｅｉｌａ）または非友」ヨＬネラー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に有意のハイブリダイゼーションを示さない。それ故、前述のプローブ７８４様プローブ６７８は、！−）Ｅｔ％主４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の限られた小群に対し高度に排他的であり特異的である０両方のプローブは他のより広い特異性のプローブを用いて同定された世／Ｌ＝％ネｊ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のより小さなサブタイプ分けに使用できる。

この１６Ｓ　ｒＲＮＡ標的領域、およびすぐ下で説明される領域（領域９９１− １０４５、図６）は皇Ａケ艷臭う−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で遭遇したものでは最も高い価値を持っている。この高レベルの配列変異性のためそれらはｉ上天生立（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種々の小群の区別に有用であるが、“典型的” 　４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の大部分に特徴的な配列は典型的なｆ　（Ｓａｌ＋５ｏｎｅｌｌａ）と有効に限界を画する多数の一２ｆｌｕグク」−−（Ｃｉ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒ）およびニー区立ｊし伍りづ一部（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種のそれと非常に類似している。それ故、特定の領域中に配列変異体が存在するという決定だけでは（その中およびそれ自身の）微生物または群特異性プローブが得られると予言するには不十分である。

４）　　１６Ｓ”　　　　−１０４５図６を参照すると６７５４″および７５５ ″と称される２つの合成プローブが１６　Ｓ　領域９９１−１０４５中に同定された２つの主たる配列パターンに相補的な配列を持っている。２つのプローブは一緒になって我々のコレクションのほとんどのＪ　（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）とハイブリダイズしたが個々には、確立されたＤＮＡ相同性グループ分けもまたｒＲＮＡ配列を標的とする他の組のプローブにより示されるパターンもまた反映しないハイブリダイゼーションパターンを示す０両方のプローブで多数の７　（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）が見逃されていることは皇ＪヨＬネｊ−（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）の間のこの領域に他の小さい配列パターンが存在することを示唆している。この見逃された一竺一火ｉ主４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に特異的なプローブが設計できた。

プローブ７５４は個々には多くの４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ヘハイブリダイズし、ある種の非土火至主旦（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）とは非常に弱くしかハイブリダイズしないためそれは（またはその誘導体）は他のプローブと共同してｆ）Ｌヨ艷主う−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異的プローブの組の一部として使用できた。プローブ７５５は、多くのおよび全く異った罪悪酉至主主（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）腸内細菌の代表物と強く、広範囲の交差ハイブリダイゼーションを示した。しかしながら、ここに記載した他の非排他的’ｊ」とＬネｊ−５紅鯰匣旦吐”プローブと一緒に、広範囲に特異的な“腸内菌特異的”プローブセットの一部としてプローブ７５５は有益であろう。

５）　　２３Ｓ　ｒＲＮＡ　　　　　−６０この領域は図７に示してあり、ヌクレオチド５４２−５５１に濃縮された“−二１２グーｊ１１オミニ乏−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異性”配列から成っている。この領域の分析は２つの理由から特に困難である。いくつかの（しかも全部ではない）サルモｉｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　ｒＲＮＡ遺伝子は大きなイントロンを含んでおり、それは位置５３２から５６０から成るらせん軸を中断させる。このイントロンはこの遺伝子構造を含む細胞中に観察される２３ＳｒＲＮＡ分子の集団中には現われない、この構造を持つ遺伝子は不活性であるようである（データは示されていない）、第２に、この領域を通る２３Ｓ　ｒＲＮＡの直接逆転写酵素配列決定は、少なくともいくつかの一部Ｊｈ±≦（シー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）には５３２−５６０軸内に位置する多数の位置で点配列不均−性である。それ故ある種の７　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のための多ｒＲＮＡ遺伝子コピーのクローニングおよび配列決定にはこの領域を通るヌクレオチド配列の明瞭な決定が必要とされてきた。ある種の微生物において、この領域は組換え的な“ホットスポット”であろう。

図７を参照すると、２つのｄ　（Ｓａｌ＋＊ｏｎｅｌｌａ）特異的パターンがこれまでこの領域において観察されている。パターン１はＳ、　ｆ　７　１　”７　人（ｔ　　ｈｉｍｕｒｆｕｗ株ｅ２３５６６のｒＲＮＡから誘導される配列により定義された。パターン２はムヱユｊ±ｂ杜胆眩）株ＲＦ９０Ｂのイントロン非含有遺伝子から誘導された。

両方ともこの領域を通る大腸菌配列に関して２つの“余分な”ヌクレオチドを５３２−５６０軸に含み、１つの塩対により軸を効果的に長くしている。この領域のパターン１０部分に相補的な８４８．８４９および８９２と称される一組のプローブが構築された。

プローブ８４８および８４９はドツトプロット型において車止天主ｉ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および非世」ケ艷主シー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌ヘハイブリダイズするその能力が試験された０両方のプローブは試験された４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の６８％（２３３／３４３）ヘハイブリダイズした。これらの “見逃されたもの”の多くは同じｌＪ行艶主ｊ−（Ｓａｌｗｏｎｅｌｌａ）種の多重株であるのでこのパーセントは当てにならない低さである。さらに、見逃されたものの３１がムヱユｊ±（７−株であり、それゆえこの°領域に対するパターン１−＝相補的プローブは非−ヱユｊ±（肛ｎ並紅ｌ」ぞＬネｉ弧虹鮫匹旦蛙種に対してはかなり良く働いている。

さらに図７を参照すると、この領域の部分に相補的な８９３．８９４および８９５と称される別の組のプローブが構築され試験されている。

この領域を通るさらなる配列パターンが種々の悪西天迷旦７旦吐に存在するらしい、パターン１および２に対するプローブを用いたハイブリダイゼーションの結果はこれらの付加的配列パターンが観察される４　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を正確に指摘するであろう、前記の５１２−５６０ｅＪｌ域プローブの変異体はこれらの並酉天主立（Ｓａｌ謡ｏｎｅｌｌａ）を１包含する”ように設計できる。

また、これらのプローブ（またはその誘導体）が最終的に利用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合う”ように５１２−５６０ｆｉＪｌ域プローブの変異体が設計できる。

他の実施態様も以下の請求の範囲に含まれる：ＦＩＧ、２特表平３−５０３０００　（１３）ら′ 手続補正書（ｊ５０１．事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４２６６２、発明の名称サルモネラ菌の検出３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　　平成　３年　３月１２日　（８日）６、補正の対象（１）出願人の代表者者を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文（３）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文（４）図面翻訳文国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種のｒＲＮＡにハイブリダイズできるが、大腸菌のｒＲＮＡにはハイブリダイズできない核酸断片。
２．前記断片がさらにハフニアアルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、タレブツエラニユーモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレプシエラオキシトカ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ）、プロテウスプルガリス（ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウスモルガニ（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウスレトゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、シュードモナスエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、セラチアオドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチアリクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　Ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ　フレキシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ　ゾンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉｉ）、シゲラ　ボイジ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉｉ）シゲラ　デイセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）またはエルシニア　エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）のｒＲｎａとハイブリダイズできない請求の範囲第１項記載の核酸断片。
３．第１のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種のｒＲＮＡにハイブリダイズできるが大腸菌のｒＲＮＡまたはエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂ−ａｃｔｅｒ）属の任意の細菌のｔＲＮＡまたは第２のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ−ｅｌｌａ）種のｒＲｎＡとハイブリダイズできない第１の核酸断片：および前記第２のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種のｒＲＮＡとハイブリダイズできる第２の核酸断片から成る核酸断片の組。
４．前記断片が一緒になって少くとも８０％のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種とハイブリダイズできる請求の範囲第３項記載の核酸断片の組。
５．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）２３ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド７２１および７５７の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１項記載の核酸断片。
６．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）２３ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド１４０５および１５９７の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１項記載の核酸断片。
７．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）２３ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド１７００および１７６０の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１項記載の核酸断片。
８．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）２３ＳｒＲＮａサブユニットのヌクレオチド５１２および５６０の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１項記載の核酸断片。
９．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）２３ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド５３２および５６０の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第８項記載の核酸断片。
１０．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１６ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド４３０および５１０の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１項記載の核酸断片。
１１．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１６ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド４５５および４７７の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１０項記載の核酸断片。
１２．前記断片がＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１６ＳｒＲＮＡサブユニットのヌクレオチド９９１および１０４５の間の１０ヌクレオチドまたはより大きな領域と少くとも７５％が相同である請求の範囲第１項記載の核酸断片。
１３．前記断片が標識されている請求の範囲第１項記載の核酸断片。
１４．試料中のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の存在を検出する方法であって、請求の範囲第１項記載の核酸断片を前記試料中の細菌と前記断片が前記試料中の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌のｒＲＮＡとハイブリダイズ可能な条件下に接触させてハイブリッド核酸複合体を形成させ、および前記ハイブリッド複合体を前記試料中の前記サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の−存在の指標として検出することを特徴とする、上記方法。